RU2733665C1

RU2733665C1 - Набор олигодезоксирибонуклетидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени

Info

Publication number: RU2733665C1
Application number: RU2020120619A
Authority: RU
Inventors: Сергей Александрович Боднев; Татьяна Владимировна Трегубчак; Александр Николаевич Болдырев; Олег Викторович Пьянков; Марина Поликарповна Богрянцева; Елена Владимировна Чуб; Елена Васильевна Гаврилова; Ринат Амирович Максютов
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-10-06

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления генетического материала (РНК) коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV в клинических образцах. Представлен набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Набор содержит одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд. Прямой (F4) и обратный (R5) праймеры имеют последовательности: F4: 5'-GTTGCAACTGAGGGAGCCTTG-3', R5: 5'-GAGAAGAGGCTTGACTGCCG-3' соответственно. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд Pb1: 5'-FAM-TACACCAAAAGATCACATTGGCACCCG-BHQ1-3'. Изобретение обеспечивает чувствительный и специфичный набор средств для детекции коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени в клинических образцах. Представленный набор выявляет генетический материал коронавируса SARS в концентрации 1×10³ копий/мл в 85,7% случаев, чувствительность составляет не менее 50 геном-эквивалентов на реакцию. 5 ил., 4 табл., 4 пр.

Description

Изобретение создано в рамках государственного задания №141-00080-20-01 от 13.02.2020 (на 2019 - 2021 гг.) и относится к средствам для выявления генетического материала (РНК) коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.

Первые случаи заболевания человека пневмонией неизвестной этиологии, были выявлены в городе Ухань (Китай) в декабре 2019 года. В результате исследований было установлено, что заболевание вызвано новым видом коронавируса (2019-nCoV) [Zhao et al., 2020]. После установления причины заболевания, все большее количество подтвержденных случаев заражения коронавирусом 2019-nCoV стало выявляться не только на территории Китая, но и на территории других стран (Таиланд, Япония, Республика Корея, США и др.). Данный факт подтверждает высокие риски регионального и глобального распространения нового вида коронавируса [Leung et al., 2020].

Коронавирусы могут вызывать множественные системные инфекции у различных животных, у людей в результате заражения главным образом поражаются дыхательные пути. До 2002 года коронавирусы не привлекали большого внимания исследователей, пока в Китае не произошла вспышка атипичной пневмонии или тяжелого острого респираторного синдрома, вызванная коронавирусом SARS-CoV (8273 случаев заболевания, 775 летальных исходов). Далее в 2015 году была зафиксирована вспышка ближневосточного респираторного синдрома на территории Южной Кореи, вызванная коронавирусом MERS-CoV (183 случая заболевания, 33 летальных исхода) [Drosten et al., 2003; Yin and Wunderink, 2018]. Следует отметить, что в основном коронавирусы животных не могут инфицировать людей и далее распространятся путем передачи от человека к человеку, за исключением SARS-CoV, MERS-CoV, а теперь и 2019-nCoV. Считается, что распространение от человека к человеку происходит главным образом через дыхательные капли, образующиеся при кашле или чихании зараженного человека, подобно тому, как распространяется грипп и другие респираторные инфекции [https://www.cdc.gov/coronaviras/2019-ncov/about/transmission.html]. В первую очередь появление новых свойств вирусов, в том числе смена круга хозяев (возможность заражать новые виды животных) обусловлена генетической изменчивостью вируса в результате естественной эволюции в природе, что обуславливает необходимость изучения геномов новых вариантов вируса для обеспечения эффективного эпидемиологического надзора.

Анализ опубликованных нуклеотидных последовательностей нового коронавируса 2019-nCoV показал, что новый вариант вируса имеет наибольшее сходство с коронавирусами человека и летучей мыши, которые объединены в «SARS-подобную» группу, то есть гомологичны вирусу, вызвавшему атипичную пневмонию SARS в 2002 году. При этом показано, что в январе 2020 года уже начали выявлять новые варианты вируса, значимо отличающиеся от первоначального варианта (2-8 замен). Полученные данные свидетельствуют о высокой скорости накопления мутаций в геноме в результате циркуляции вируса. Таким образом, в результате естественной циркуляции вируса в природе могут возникнуть новые варианты SARS-подобного вируса, уже отличающиеся от 2019-nCoV, но представляющие эпидемиологическую угрозу для человека. При заражении людей SARS-CoV и 2019-nCoV клиническая картина течения заболевания сходная, вирус способен передаваться от человека к человеку Специфические терапевтические средства отсутствуют, применяется симптоматическое лечение. Таким образом, в настоящее время для назначения лечения не является обязательным дифференцировать принадлежность возбудителя к SARS-CoV и 2019-nCoV, оба вируса сравнимы по своей потенциальной опасности для человека. Однако, разрабатывая диагностические тест-системы только на выявление 2019-nCoV, возникают риски упустить новые потенциально опасные варианты «SARS-подобного» коронавируса, которые могут возникнуть в результате естественной циркуляции вируса в природе.

Таким образом, с целью контроля и предупреждения завоза и распространения новой коронавирусной инфекции чрезвычайно важным является разработка быстрых и эффективных средств диагностики этого опасного заболевания. Среди всех существующих методов диагностики наиболее перспективным является разработка диагностического набора реагентов на основе метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в реальном времени. Метод ОТ-ПЦР в реальном времени представляет собой классическую ПЦР с идентификацией амплифицированных продуктов за счет флуоресцентных красителей и направлен на выявление РНК в образцах. Используя современные методы биоинформатики возможно разработать диагностические наборы реагентов на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени.

При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда возможно выявление генетического материала (РНК) коронавируса 2019-nCoV.

Метод ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени обладает высокой чувствительностью и является основным методом выявления вирусной РНК. Метод ОТ-ПЦР основан на получении комплементарной ДНК (кДНК) на матрице вирусной РНК с последующим многократным избирательным удвоением участка кДНК. Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям кДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и слева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен быть комплементарным участку кДНК, ограниченному олигодезоксирибонуклеотидными праймерами. Правильный выбор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка кДНК. Правильный выбор сочетания пары олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. От правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда зависит специфичность проводимой ОТ-ПЦР, а значит и точность диагностики вирусного заболевания.

Ниже приведены аналоги, представляющие собой наборы олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и зонда, а также наборы реагентов, обеспечивающие детекцию генетического материала коронавируса.

Известен патент Китая № CN 101603096 (опубл. 2009 г.) получен на набор реагентов и готовый ПЦР-набор для детекции вируса гриппа типа А субтипов Н5 и Н7, ТОРС ассоциированного коронавируса, хантавируса, чумной палочки (Yersinia pestis), возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis).

Известна заявка США № US 2009117537 (опубл. 2009 г.), которая касается набора праймеров и набора реагентов, позволяющего детектировать ТОРС-ассоциированный коронавирус, причем праймеры локализуются в гене РНК-полимеразы коронавируса.

Известен патент Сингапура № SG 161740 (опубл. 2010 г.), который касается выявления одного и более неизвестных коронавирусов, в том числе и ТОРС-ассоциированный коронавирус, причем праймеры фланкируют участок гена РНК-полимеразы и ген Nspl.

Известна заявка США № US 2004265796 (опубл. 2004 г.), которая касается набора праймеров фланкирующих участок N-гена и 3'-нетранслируемую область ТОРС-ассоциированного коронавируса.

Известен патент Германии № DE 20315159 (опубл. 2004 г.) касается набора реагентов, позволяющего детектировать ТОРС ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Известен патент Китая № CN 1570139 (опубл. 2005 г.), который касается набора реагентов для выявления ТОРС ассоциированнго коронавируса методом ОТ-ПЦР с электрофоретической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией накопления продуктов амплификации.

Известен патент Китая № CN 1514010 (опубл. 2005 г.), который касается набора реагентов, позволяющего выявлять ТОРС-ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР. Праймеры, использующиеся в этом наборе реагентов, фланкируют ген РНК-полимеразы.

Известен патент Китая № CN 1548550 (опубл. 2005 г.), который касается набора реагентов позволяющего выявлять ТОРС-ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР. Заявка США №20040265796 (опубл. 2004 г.), которая касается набора реагентов, включающего праймеры, фланкирующие участок N-гена коронавируса, ассоциированного с ТОРС.

Однако праймеры, используемые в выше приведенных аналогах, имеют недостаточную гомологию к последовательностям генома коронавирусов, циркулирующих в настоящее время в дикой природе. Кроме того, указанные наборы праймеров не позволяют получить продолжительный амплифицированный фрагмент N(p)-гена (нуклеопротеид), нуклеотидную последовательность которого можно проанализировать и спрогнозировать патогенность и контагиозность выявленного коронавируса. Указанные наборы не могут быть использованы в количественной ПЦР.

Известен «АмплиСенс® SARS-Coronavirus-EPh» (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва) - набор реагентов, включающий праймеры для амплификации кДНК коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, из клинического материала методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле (http://www.pcr.ru/sem_who/shipulin1.pdf).

Однако, указанный набор реагентов был разработан в период вспышки заболеваемости тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом, в 2003 году. За прошедшие годы в ходе эпидемиологических исследований учеными были выделены вирусы, идентичные вирусу ТОРС человека, от пальмовых циветт (Paguma larvata), енотовых собак (Nyctereutes procyonoides), плодоядных летучих мышей (Rousettus, Cynopterus и т.д.). Это говорит о широком распространении в природе коронавирусов, подобных ТОРС-коронавирусу человека, а следовательно, возможности перехода геновариантов коронавирусов, подобных ТОРС-коронавирусу человека, из популяций животных в человеческую. Для этих геновариантов вышеназванные наборы праймеров не будет обладать достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК. Таким образом, праймеры, используемые в вышеприведенном прототипе, имеют недостаточную гомологию к последовательностям генома ТОРС-подобных коронавирусов, циркулирующих в настоящее время в дикой природе. Кроме того, указанный набор праймеров не позволяет получить продолжительный амплифицированный фрагмент N(p)-гена (нуклеопротеид), нуклеотидную последовательность которого можно проанализировать и спрогнозировать патогенность и контагиозность выявленного коронавируса. Указанные наборы не могут быть использованы в количественной ПЦР.

Известен набор зондов, праймеров и способ обнаружения для идентификации SARS-CoV и MERS-CoV (Заявка на патент Китая № CN 108060266, МПК C12Q 1/70, C12N 15/11, опубл. 22.05.2018 г.) на основе исследования с помощью рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA). Набор праймерных зондов для идентификации SARS-CoV и MERS-CoV на основе обнаружения RPA включает праймеры и зонд для нуклеотидных последовательностей SARS-CoV:

ctgttaagag ctttgagatt gacaaaggaa ttt

tctcccatgc atagacagaa gggaatttag ta

cagggttgtt ccctcaggag atgttgtgat atttccctaa tattaca,

а также праймеры и зонд для нуклеотидных последовательностей MERS-CoV:

ccgggaatgg aattaagcaa ctggctccca ggt

tcagtggcgc catcttcatg gacccaaacg atg

ctacactgga actggacccg aagcagcact tcctcattcc gggctgtt

Известен набор праймеров и зонд для обнаружения коронавируса ближневосточного респираторного синдрома и способу обнаружения коронавируса ближневосточного респираторного синдрома с его использованием (патент Респ. Корея № KR 101857684, МПК C12Q 1/70, опубл. 14.05.2018 г.) В частности, праймер и зонд, содержащие специфическую нуклеотидную последовательность, нацеленную на ген нуклеокапсида, имеют более высокую чувствительность в ОТ-ПЦР, чем ранее использованные наборы ПЦР в реальном времени MERS, нацеленные на гены upE и ORF1a, и наборы праймеров и зондов гена N2 для точного обнаружения MERS-CoV, и, таким образом, набор праймеров и зондов по настоящему изобретению может быть использован для обнаружения и диагностики MERS-CoV.

Известен набор для количественного определения четырехкратной флуоресценции для одновременного обнаружения четырех коронавирусов человека (заявка на патент Китая № CN 110144422, МПК C12Q 1/70, опубл. 20.08.2019 г.). Коронавирусами человека являются, в частности, MERS-CoV / HCoV-NL63 / HCoV-OC43 / HCoV-HKUI. Набор для обнаружения, в частности, включает четыре группы пар праймеров и зондов, продукт с положительным контролем качества и продукт с отрицательным контролем качества. Каждая группа пар специфических праймеров и зондов содержит пару специфических праймеров и последовательность зондов; продукт положительного контроля качества представляет собой искусственно синтетическую последовательность-мишень; продукт отрицательного контроля качества - деионизированная вода или стерильная вода. Набор может одновременно обнаруживать четыре коронавируса человека с помощью одного набора, обладает высокой специфичностью обнаружения, высокой чувствительностью обнаружения и быстрым временем обнаружения, а также позволяет избежать проблем, связанных с тем, что обнаружение по одному занимает много времени и увеличивает стоимость, повышает вероятность перекрестного загрязнения и т.д. В настоящее время на рынке нет аналогичных продуктов. Этот набор имеет широкие возможности для выявления заболеваний, профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями.

Однако все выше перечисленные диагностические наборы-аналоги не позволяют идентифицировать коронавирус человека 2019-nCoV.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является анализ нуклеиновой кислоты на коронавирус человека 2019-nCoV (метод флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени) с использованием набора праймеров и зондов для областей гена открытой рамки считывания (ORF1ab) и нуклеопротеина (N) нового коронавируса (http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html).

Набор 1 (ORF1ab):

Прямой праймер (F): CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

Обратный праймер (R): ACGATTGTGCATCAGCTGA

Флуоресцентный зонд (Р): 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

Набор 2 (N):

Прямой праймер (F): GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

Обратный праймер (R): CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

Флуоресцентный зонд (Р): 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

Для экстракции нуклеиновых кислот и флуоресцентной RT-PCR реакционной системы в реальном времени необходимо использовать инструкции соответствующего производителя. Оценка результатов. Отрицательный: нет значения Ct или Ct 40. Положительный: значение Ct <37, можно сообщить как положительное. Подозрительно: значение Ct находится между 37-40, рекомендуется повторить эксперимент. Если значение Ct меньше 40, кривая усиления имеет очевидные пики, образец оценивается как положительный, в противном случае он отрицательный.

Однако известный набор-прототип по сравнению с заявляемым набором праймеров имеет недостаточную чувствительность и специфичность при одновременном выявлении коронавирусов SARS и 2019-nCoV.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание такого набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, который обеспечивал бы высокую специфичность и чувствительность детекции коронавирусов человека одновременно как для SARS так и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени в клинических образцах.

Указанный технический результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, имеющие следующую первичную последовательность:

прямой (F4) и обратный (R5) праймеры

флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Pb1)

Следует отметить, что большинство пар праймеров, рассчитанных с использованием приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США) предназначены для наработки длинных ампликонов, что не совсем удачно для их применения в ПЦР с диагностической целью.

При разработке представленных в заявляемом наборе диагностических праймеров было синтезировано 10 пар праймеров с различной первичной структурой, с каждой из которых были проведены соответствующие исследования. Эмпирическим путем была определена наиболее подходящая пара праймеров, обладающая наибольшей аналитической чувствительностью и 100%-ной специфичностью на панели заявленных образцов. Надо отметить, что структура данных праймеров отличалась от наиболее оптимальной структуры, рассчитанной с использованием приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США). В результате работы создана неизвестная ранее консенсусная последовательность гена коронавируса, полученная путем множественного выравнивания с использованием различных алгоритмов, что требует квалифицированных научных исследований.

В работе, помимо дизайна структуры праймеров и олигонуклеотидного зонда, получены положительные контроли, представляющие из себя рекомбинантные бактериальные плазмиды pJet_1.2 (GSL Biotech LLC, США), включающие вставки ДНК, комплементарные участкам гена N(p) коронавирусов 2019 nCoV и SARS. С использованием положительного контроля эмпирическим путем подобрана оптимальная температура отжига диагностических праймеров, которая отличается от теоретической, рассчитанной с использованием компьютерных программ. Также эмпирическим путем установлена аналитическая чувствительность данной пары праймеров/зонд для идентификации коронавирусов человека 2019-nCoV и SARS. Заявленные диагностические праймеры обладают 100%-ной специфичностью на панели отрицательных образцов. Экспериментальным путем было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд не имеют гомологии с человеческой ДНК и не взаимодействуют с геномной ДНК человека, летучих мышей и других животных.

На панели положительных образцов, состоящей из материала, содержащего генетический материал коронавирусов, произведена оценка чувствительности данной пары диагностических праймеров. С использованием положительного контроля определена аналитическая чувствительность заявляемой пары диагностических праймеров, которая составила не менее 50 геном-эквивалентов на реакцию.

Таким образом, из приведенных выше доводов заявителя следует, что заявленный набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала коронавирусов методом ПЦР в реальном времени соответствует критерию «изобретательский уровень». Материалы и реактивы. В работе были использованы следующие материалы и реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан, диметилсульфоксид (ДМСО), маркеры молекулярных масс белков, 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид, ФИТЦ (F7250), ФИТЦ меченый стрептоавидин (S2313), N-гудроксисукцинимидный эфир биотина (Н1759), EDAC (Е7750), натриевая соль MES (М3058), ("Sigma", США); ПЭГ-20000 ("Merck", США); полиэтиленгликоль м.в. 6000 (ПЭГ-6000), этилендиаминтетрауксусная кислота, глицерин, трипановый синий, сахароза, глицин, твин-20, натрия азид, ("Serva", США); набор для определения концентрации белка "Bio-Rad Protein Assay Kit" ("Bio-Rad", США); акриламид, бисакриламид, натрия додецилсульфат, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД), 2-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий, кумасси G-250, амидочерный 10В ("Bio-Rad" США); казеин, бычий сывороточный альбумин (БСА), яичный альбумин, пластиковая культуральная посуда ("Costar", США).

Вирусные штаммы. В работе были использованы вирусы и вируссодержащий материал из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культуры клеток и среды. Клетки Vero получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовали питательные среды: среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Культивирование вирусов. Культивирование вируса проводили в стационарном режиме на монослое клеток Vero в культуральных флаконах объемом 1 л. Множественность заражения монослоя составляла 0,1 ЛД₅₀ или 0,01 ЛД₅₀ на клетку в зависимости от задачи исследования. Адсорбцию вируса проводили в течение 40 мин при температуре 37°С. После этого монослой заливали питательной средой Игла MEM с двойным набором ингредиентов, в которую добавляли 0,06% глутамина и 0,05%, 0,4% или 2% человеческого сывороточного альбумина (в зависимости от условий эксперимента для получения вакцинного препарата) или 2% эмбриональную сыворотку КРС (для выделения анализа белков вируса) и антибиотиков (бензилпенициллина - 100 ед/мл, стрептомицина - 100 мкг/мл). Объем питательной среды составлял 10-15% емкости культурального сосуда. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД. КВЖ использовали для выделения РНК вируса.

Выделение вирусной РНК. РНК коронавируса выделяли из образцов КВЖ при помощи набора «Рибо-ПРЕП» (ЦНИИ Эпидемиолгии, Россия) или реагента для выделения суммарной РНК/ДНК «Евроген» (Россия) согласно инструкции по применению.

Оптимизацию ПЦР проводили с использованием амплификаторов Rotor Gene 6000 («Corbett Research)), Австралия) и CFX96 («BioRad», США). Электрофоретическую детекцию продуктов амплификации в агарозном геле проводили с использованием электрофоретических камер SE-20 (Хеликон, Россия), источников питания Эльф-8 (ЗАО НПФ ДНК-технология, Россия), системы видеодокументирования Molecular Imager Gel Doc XR System («BioRad», США) с прилагаемым ПО. После проведения ПЦР полученные фрагменты ДНК очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen», США), клонировали в плазмиду pCR2.1. ("Invitrogen", США). Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI Genetic Analyzer 3500x1 (ABI, США). Нуклеотидные последовательности анализировались с использованием базы данных NCBI Mega BLAST.

Нуклеотидные последовательности. Нуклеотидные последовательности были взяты из базы данных GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/].

Статистическая обработка полученного материала проводилась с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2003 for Windows и STATISTICA 6.0 for Windows (Stat Soft, USA). При статистической обработке данных для ненормально распределенных признаков использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Сравнение частот встречаемости проводили по критерию χ2. Для показателей, чьи вариационные ряды приближались к нормальному, применяли дисперсионный анализ. При множественном сравнении средних использовали LSD-тест, а при сравнении 2-х средних - t-критерий Стьюдента.

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили при помощи приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США). Филогенетический анализ штаммов и изолятов вируса гриппа проводили при помощи программы Mega 4 [17]. Филогенетические деревья строили по методу объединения ближайших соседей на основе матриц генетических расстояний, рассчитанных по модели Юкса-Кантора. Индексы поддержки ветвей определяли перестановочным тестом (bootstrep) для 1000 повторов. В работе было использовано лицензионное программное обеспечение Microsoft Office 2010, Vector NTI 11.5, Lasergene 7 и MEGA 7.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ одинаковых разведений синтетических последовательностей фрагмента гена N(p) вирусов nCoV и SARS. На фиг. 2 приведена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Оценка чувствительности с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК. Прослеживается зависимость накопления флуоресцентного сигнала от концентрации матричной ДНК (кДНК коронавируса 219 nCoV). На фиг. 3 представлены данные флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом 219 nCoV пациентов (образец 39, Ct 34) с использованием праймеров рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики коронавирусом 219 nCoV. На фиг. 4 изображен график, где представлены результаты исследования влияния замен на эффективность связывания зонда Pb1 с целевой последовательностью при выявлении вируса SARS в сравнении с эффективностью зонда Pb1 при выявлении вируса 2019-nCoV. На фиг. 5 изображен график, где представлены результаты испытания изделия при концентрациях 1×10³ копий/мл (ниже порога аналитической чувствительности) генетического материала коронавируса 2019-nCoV(pAL2-T/2019-nCoV), генетического материала коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS), вируса SARS.

Пример 1. Технология получения набора реагентов для выявления генетического материала РНК коронавирусов SARS/2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

После выделения РНК из исследуемого материала реакцию проводили с вирусспецифическими праймерами в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

Микропробирки помещали в амплификатор и проводили реакцию по программе (таблица 1).

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборах CFX96 («Bio-Rad», США) и "Rotor Gene 6000" («Corbet», Австралия) по каналам Green (470 nm/ 510 nm).

Для выбора генотип-специфичных праймеров и ДНК-зондов предварительно был проведен анализ всех известных к настоящему моменту последовательностей геномов выбранных вирусов и представленных в базе данных GenBank. С использованием известных последовательностей были построены элайнменты, соответствующие как полногеномным последовательностям, так и отдельным участкам генома вируса. На основе полученных данных для каждого из выбранных вирусов были найдены уникальные замены и отобраны пары праймеров, в максимальной степени отвечающие необходимым требованиям. Последовательности праймеров (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, приложение) для проведения амплификации с последующей гибридизацией полученных ампликонов с зондом (SEQ ID NO: 3, приложение) на поверхности микросфер определенного цвета представлены в таблице 2.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 8 (InforMax).

Положительные контрольные образцы были получены методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli бактериальными плазмидами pJet_1.2 (GSL Biotech LLC, США), включающими вставки ДНК, комплементарные участкам гена N(p) коронавирусов 219 nCoV и SARS с последующим выделением плазмидной ДНК из бактериальных клеток.

Нуклеотидные последовательности вставок в плазмиду приведены в таблице 3.

Условия проведения амплификации и реамплификации оптимизировались по концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси и температуре отжига праймеров. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь вместо положительного контрольного образца добавляли ТЕ-буфер. ПЦР проводили в приборах Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) или CFX96 («BioRad», США). Результаты флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени представлены на фиг. 1. Анализ одинаковых разведений синтетических последовательностей фрагмента гена N(p) вирусов nCoV и SARS. В связи с тем, что в уровни флуоресценции для двух генетических конструкций были равноценны, в качестве ПКО была выбрана генетическая конструкция, несущая участок гена N(p) вируса 2019 nCoV.

Для определения аналитической чувствительности моновариантов систем «праймеры-зонд» для детекции вируса из концентрированных растворов положительных контрольных образцов были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности праймеров осуществляли при помощи коммерческого набора «Quant-iT dsDNA, HS» («Invitrogen», США) и флуориметра QUBIT («Invitrogen», США).

Для контроля повторяемости используют образец СОП ПКО 2019-nCoV разведенный до концентрации 1,0×10⁷ копий/мл (5 образцов). Процедура проводится одним оператором на одном наборе. Коэффициент вариации для повторяемости рассчитывается по формуле: CVp,%=Ct (стандотклон) / Ct (ср.знач.) × 100 % для 5 проб СОП ПКО 2019-nCoV и не должен превышать 3%. (фиг. 2).

Для контроля воспроизводимости использовали образец СОП ПКО 2019-nCoV разведенный до концентрации 5,0×10⁴ копий/мл (10 образцов). Процедура проводится двумя разными операторами с двумя разными наборами одной серии в разные дни. Коэффициент вариации для воспроизводимости рассчитывается по формуле: CVp,%=Ct (стандотклон) / Ct (ср.знач.) × 100% для 10 проб СОП ПКО 2019-nCoV и не должен превышать 6%.

Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое с применением наших праймеров и зондов после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах) в 25 мкл реакционной смеси, составило 5 ГЭ (Ct 37,89).

Специфичность отжига праймеров и зондов проверяли постановкой ПЦР в режиме реального времени с использованием в качестве детектируемых образцов синтетических последовательностей фрагмента гена N(p) вирусов nCoV и SARS, полученные из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Контроль специфичности осуществляли проведением ПЦР с флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов использовали пробы, содержащие генетический материал коронавируса 2019-nCoV и пробы, содержащие генетический материал гетерологичных вирусов (вирус гриппа типа А, аденовирус 5 типа, вирус денге, RSV). Не специфических перекрестных реакций отмечено не было.

На фиг. 3 представлены данные по флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени клинического образца (мазки из зева и носа) инфицированного коронавирусом 219 nCoV пациента (образец 39, Ct 34) с использованием праймеров, рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики коронавирусом 219 nCoV. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выбранных нами праймеров для набора реагентов «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG».

Таким образом, разработан набор реагентов «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG» предназначенный для выявления РНК коронавирусов 2019-nCoV методом, основанным на синтезе кДНК на матрице РНК и последующей амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени.

Пример 2. Исследование влияния замен на эффективность связывания зонда Pb1 с целевой последовательностью при выявлении вируса SARS в сравнении с эффективностью зонда Pb1 при выявлении вируса 2019-nCoV

Для определения эффективности связывания зонда Pb1 с целевой последовательностью при выявлении вируса SARS использовали разведения СОП ПКО SARS/2019-nCoV_SARS (рекомбинантная бактериальная плазмида pJET 1.2/SARS, содержащая фрагмент ДНК, комплементарный участку генома коронавируса SARS (штамм Frankfurt 1), включающий последовательности обоих праймеров и зонда Pb1) с шагом 10 от 2×10⁵ копий/мл до 2×10² копий/мл. (фиг. 4).

Использовали: серию С001-01-2020, дата изготовления 23.01.2020 (2 повтора) и серию С001а-01-2020, дата изготовления 23.01.2020 (1 повтор).

Вывод: зонд Pb1 эффективно связывается с целевой последовательностью при выявлении вируса SARS при концентрации 2,0×10⁴ копий/мл.

Пример 3. Характеристика медицинского изделия (МИ), содержащего заявляемый набор праймеров и зонда

Компоненты набора являются одноразовыми.

Набор реагентов «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG» не требует технического обслуживания и калибровки.

3.1 Состав набора

Набор реагентов состоит из 4 реагентов.

В состав набора входит эксплуатационная документация: инструкция по применению набора и паспорт.

Реагент-1 расфасован по 1,90 мл в микропробирку вместимостью 2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. Состав: 2х-кратный буфер для ОТ-ПЦР-РВ, заявленные олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентный зонд, очищенная вода.

Реагент-2 расфасован по 100 мкл в микропробирку вместимостью 0,5 до 2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. БиоМастер-Микс (25×), состав: M-MuLV-RH ревертаза и HS-Taq ДНК-полимераза в буферном растворе.

Положительный контрольный образец ПКО расфасован по 150 мкл в микропробирку объемом 1,0-2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. Состав: раствор рекомбинантных бактериальных плазмид в ТЕ-буфере, содержащих вставки ДНК, комплементарные участкам генома коронавирусов SARS и 2019-nCoV.

Отрицательный контрольный образец расфасован по 150 мкл в микропробирку объемом 1,0-2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. Состав: очищенная вода.

3.2 Метод исследования

Обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот коронавирусов SARS и 2019-nCoV основано на использовании метода ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Метод основан на многократном увеличении числа копий фрагмента вирусных нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - кДНК), что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации.

3.3 Ограничения метода

В инфицированном материале РНК вирусов может быть не обнаружена по причине, если титр (концентрация) вируса составляет менее 10⁴ копий/мл.

В инфицированном материале РНК вирусов может быть не обнаружена по причине ингибирования обратной транскрипции, ПЦР и/или недостаточной эффективности выделения нуклеиновых кислот. Для достижения показателей аналитической чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность выделения НК на уровне не менее 20%.

Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на этапе выделения НК либо проведения реакции ПЦР. Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контрольных образцов выделения и ПЦР.

Причиной получения ложноотрицательного результата является ингибирование ПЦР и/или недостаточная эффективность выделения НК. Ложноотрицательный результат выявляется с помощью положительных контрольных образцов ПЦР.

3.4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

3.4.1 Аналитические характеристики

Исследования аналитических характеристик набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово, Новосибирской области) в рамках исследования эффективности набора.

3.4.2 Аналитическая чувствительность

Набор реагентов должен выявлять в реакционной смеси 10² копий (2×10⁴ копий/мл) рекомбинантных плазмид, содержащих вставки ДНК, комплементарные участкам генома коронавирусов SARS и 2019-nCoV.

3.4.3. Аналитическая специфичность. Набор реагентов не должен давать положительных результатов с образцами здоровых доноров или образцами, содержащими генетический материал гетерологичных вирусов (вирус гриппа типа А, В, парагриппа 1-4, риновирус человека, аденовирус 5 типа, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), метапневмовирус человека, вирус денге 1).

3.4.4. Диагностические характеристики. Исследования диагностических характеристик набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п.Кольцово, Новосибирской области) и в испытательной лаборатории ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» (г. Москва) в рамках исследования эффективности набора и проведения технических испытаний.

При проведении исследований наблюдалась 100% внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех исследуемых образцов.

3.4.5 Диагностическая чувствительность. Диагностическая чувствительность - 100% (98,1%-100%) с доверительной вероятностью 95% (200/200). При исследовании 50 положительных образцов, содержащих генетический материал коронавируса COVID-19 и 150 положительных образцов, из которых 50 образцов содержат генетический материал коронавируса SARS и 100 образцов содержат вирус SARS (штамм Frankfurt 1) положительный результат в ПЦР получен для всех 200 образцов.

3.4.6 Диагностическая специфичность

Диагностическая специфичность - 100% (98,1%-100%) с доверительной вероятностью 95% (200/200).

При исследовании 200 отрицательных образцов, содержащих НК гетерологичных вирусов: вирус гриппа типа А (субтипов H1, Н3, Н5, Н7, Н9), В, парагриппа 1-4, риновирус человека, аденовирус 5 типа, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), респираторно - синцитиальный вирус, метапневмовирус человека, вирус денге 1 отрицательный ответ в ПЦР получен во всех 100% случаях.

3.5 Подготовка реагентов для анализа

3.5.1 Процедура приготовления реакционной смеси

Приготовление реакционной смеси: в отдельной микропробирке объемом 1,5 мл готовят смесь компонентов следующего состава (из расчета на одну пробу):

Реагент-1	19 мкл
Реагент-2	1 мкл

Смесь перемешивают пипетированием. Все реакционные компоненты добавляют отдельными наконечниками с помощью дозаторов переменного объема: 0.5-10, 2-20 и 20-200 мкл.

3.6 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

3.6.1 Расход каждого реагента (минимальный)

На одно определение расходуются:

Реагент-1	19 мкл
Реагент-2	1 мкл

На каждый анализ расходуются:

- 5 мкл ПКО;

- 5 мкл ОКО;

3.6.2 Последовательность проведения этапов анализа

3.6.2.1 ПЦР-амплификация

Включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Реактивы для проведения ПЦР извлекают из холодильника, размораживают. Перед использованием встряхивают пробирки с реагентами на микроцентрифуге-вортекс и осаждают капли на дно пробирки кратковременным центрифугированием в течение 5 секунд при 3000 об⋅мин^-1.

Для проведения амплификации используют прозрачные микропробирки объемом 0,2 мл в соответствии с количеством исследуемых образцов.

Помещают микропробирки в штатив и маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке пробирки.

Готовят реакционную смесь на нужное количество реакций, для чего смешивают в отдельной пробирке (из расчета на одну пробу):

Реагент-1	19 мкл
Реагент-2	1 мкл

Открывают крышки микропробирок и вносят в них по 20 мкл реакционной смеси.

Используя наконечники с аэрозольным барьером, в микропробирки последовательно вносят соответственно маркировке образцов 5 мкл ОКО, и затем по 5 мкл растворов РНК исследуемых образцов, закрывают крышки данных микропробирок. Вносят (в последнюю очередь) 5 мкл ПКО и закрывают крышки данных микропробирок.

Общий (конечный) объем реакционной смеси в каждой пробирке должен составить 25 мкл.

Перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и центрифугируют 5 секунд при 3000 об⋅мин^-1.

После смешивания компонентов микропробирки сразу устанавливают в амплификатор и запускают реакцию.

а) При использовании прибора роторного типа (например, Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия)) задают следующие параметры в соответствующих диалоговых окнах:

- ротор 36-луночный;

- объем реакционной смеси - 25 мкл;

- температурно-временные режимы:

После чего запускают программу амплификации и фиксируют в рабочем журнале название файла с результатом работы прибора.

б) При использовании прибора планшетного типа (например, CFX 96 (BioRad, США)) задают следующую программу амплификации:

3.6.2.2 Процедура измерения и оценки результатов анализа

ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводят в приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX 96 (BioRad, США).

а) Для приборов роторного типа (Rotor Gene Q)

Анализ результатов амплификации РНК коронавирусов SARS/COVID-19 проводят по каналу FAM/Green:

1) нажать в меню кнопку «Analysis» в открывшимся окне выбрать «Cycling A Green» и затем «Show». В появившимся окне включить вкладки «Dynamic Tube» и «Slope Correct»;

2) На вкладке «Outlier Removal» установить параметр на 20%. В окне Threshold установить значение пороговой линии 0,02;

3) в таблице результатов (окно «Quant. Results»/Количественные Результаты») появятся значения Ct.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла "Ct" в соответствующей графе в таблице результатов).

б) Для приборов планшетного типа (CFX 96)

Результат подлежит учету в случае:

а) появления пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией на канале FAM/Green в пробах с положительными контрольными образцами (ПКО);

б) отсутствия положительного сигнала на канале FAM/Green в пробах с отрицательными контрольными образцами (ОКО).

Результат считать положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца должно быть менее 35. Амплитуда сигнала при этом не имеет значения.

Результат считать отрицательным, если значение Ct на канале FAM/Green отсутствует. Если значение Ct больше 35, то ОТ-ПЦР необходимо повторить и считать положительным в случае повторения результата или при значении Ct меньше 35.

Пример 4. Испытание изделия при концентрациях 1×10³ копий/мл (ниже порога аналитической чувствительности) генетического материала коронавируса 2019-nCoV (pAL2-T/2019-nCoV), генетического материала коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS), вируса SARS.

Испытания медицинского изделия (МИ) проведены с использованием генно-инженерной конструкции, содержащей вставку комплементарную последовательности генома коронавируса 2019-nCo (pAL2-T/2019-nCoV), включающую последовательности используемых праймеров и зонда, генно-инженерной конструкции, содержащей вставку комплементарную аналогичной последовательности генома коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS) и вируса SARS (штамм Frankfurt 1) из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Было использовано 14 положительных образцов, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV (pAL2-T/2019-nCoV) в концентрации 1×10³ копий/мл, и 28 положительных образцов, из которых 14 образцов содержали генетический материал коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS) в концентрации 1×10³ копий/мл и 14 образцов содержали вирус SARS (штамм Frankfurt 1):

14 положительных образцов, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV (pAL2-T/2019-nCoV);

2 образца мазков из ротоглотки, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образца мазков из носоглотки, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образцов мокроты, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образца эндотрахеального аспирата, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образца сыворотки крови, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образца мочи, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

2 образца аутоптата легких, содержащих pAL2-T/2019-nCoV;

14 положительных образцов, содержащих генетический материал коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS):

2 образца мазков из ротоглотки, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца мазков из носоглотки, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца мокроты, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца эндотрахеального аспирата, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца сыворотки крови, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца мочи, содержащих pJET 1.2/SARS;

2 образца аутоптата легких, содержащих pJET 1.2/SARS;

14 положительных образцов, содержащих коронавирус SARS (штамм Frankfurt 1) из Государственной коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

2 образца мазков из ротоглотки, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца мазков из носоглотки, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца мокроты, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца эндотрахеального аспирата, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца сыворотки крови, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца мочи, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1);

2 образца аутоптата легких, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1).

При исследовании 14 положительных проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации 1×10³ копий/мл, положительный результат получен в 14 случаях.

При исследовании 14 положительных проб, содержащих генетический материал коронавируса SARS (pJET 1.2/SARS) в концентрации 1×10³ копий/мл, положительный результат получен в 12 случаях.

При исследовании 14 положительных проб, содержащих коронавирус SARS (Frankfurt 1) в концентрации 1×10³ копий/мл, положительный результат получен в 12 случаях (фиг. 5).

Вывод: «Набор реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS и 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG» по ТУ 21.20.23-089-05664012-2020» выявляет генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации 1×10³ копий/мл в 100% случаев (14 проб из 14 заведомо положительных).

«Набор реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS и 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-OneStepПЦР-CoV-RG» по ТУ 21.20.23-089-05664012-2020» с пользованием заявляемого набора праймеров и зонда выявляет генетический материал коронавируса SARS в концентрации 1×10³ копий/мл в 85,7% случаев (12 из 14 заведомо положительных проб, содержащих генетическую конструкцию pJET 1.2/SARS, 12 из 14 заведомо положительных проб содержащих коронавирус SARS (штамм Frankfurt 1).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Перечень последовательностей

<110>Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)

<120>Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом От-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

<160>SEQ ID NO: 3

<210>SEQ ID NO: 1

<211>21

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV (прямой (F4).

<400>1

F4: 5'-GTTGCAACTGAGGGAGCCTTG-3'

<210>SEQ ID NO: 2

<211>20

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV (обратный (R5) праймер.

<400>2

R5: 5'-GAGAAGAGGCTTGACTGCCG-3'

<210>SEQ ID NO: 3

<211>27

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Последовательности олигонуклеотидов видоспецифические к коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV (флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Pb1).

<400>3

Pb1: 5'-FAM - TACACCAAAAGATCACATTGGCACCCG -BHQ1 -3'

Claims

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, имеющие следующую первичную последовательность:
прямой (F4) и обратный (R5) праймеры
F4: 5'-GTTGCAACTGAGGGAGCCTTG-3' 21
R5: 5'-GAGAAGAGGCTTGACTGCCG-3' 20
флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Pb1)
Pb1: 5'-FAM-TACACCAAAAGATCACATTGGCACCCG-BHQ1-3' 27.