RU2772130C1 - Набор праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот, набор зондов и набор для выявления нового типа коронавируса covid-19 и способ его выявления - Google Patents
Набор праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот, набор зондов и набор для выявления нового типа коронавируса covid-19 и способ его выявления Download PDFInfo
- Publication number
- RU2772130C1 RU2772130C1 RU2021114769A RU2021114769A RU2772130C1 RU 2772130 C1 RU2772130 C1 RU 2772130C1 RU 2021114769 A RU2021114769 A RU 2021114769A RU 2021114769 A RU2021114769 A RU 2021114769A RU 2772130 C1 RU2772130 C1 RU 2772130C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- detecting
- seq
- coronavirus
- kit
- new type
- Prior art date
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 54
- 200000000015 coronavirus disease 2019 Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 41
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 14
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 10
- 230000000171 quenching Effects 0.000 claims description 10
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N Texas Red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 17
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 9
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 241000008910 Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 229910019101 CoV Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028735 Nasal congestion Diseases 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 1
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic shock Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding Effects 0.000 description 1
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000008286 diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области вирусологии. Описан набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающий две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности: пару специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса: ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1, ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2; пару специфических праймеров для сегмента гена N вируса: N-F: как показано в SEQ ID NO: 3, N-R: как показано в SEQ ID NO: 4. Также описан набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающий указанный набор праймеров для выявления нового типа коронавируса, а также пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта, из них нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом: RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7, RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8; нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом: RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9. Изобретение расширяет арсенал средств выявления SARS-CoV-2. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к области техники выявления вируса и, в частности, к набору праймеров (реагентов) для обнаружения нуклеиновых кислот, набору зондов, набору для выявления нового типа коронавируса COVID-19 и к способу его выявления.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Новый тип коронавируса относится к роду β-коронавирусов, при этом он включает оболочки, частицы округлой или овальной, зачастую плеоморфной формы диаметром 60-140 нм, и его геномная последовательность представляет собой одноцепочечную РНК (29903bp), а его генетические характеристики безусловно отличаются от характеристик SARSr-CoV и MERSr-CoV. Результаты последних исследований продемонстрировали, что степень гомологии с SARS-подобным коронавирусом, который заражает летучих мышей (bat-SL-CoVZC45) составляет более 85%. На основе последних эпидемиологических исследований было установлено, что инкубационный период заболевания составляет 1-14 дней, в большинстве случаев 3-7 дней, сопровождаемый повышенной температурой, слабостью и сухим кашлем в качестве основных симптомов его проявления. У некоторых пациентов может отмечаться заложенность носа, боль в горле, диарея и т.д. У тяжёлых пациентов зачастую развивается одышка и (или) гипоксемия через одну неделю после проявления болезни. В тяжелых случаях проявление указанных симптомов сопровождается развитием острого респираторного дистресс-синдрома, септического шока, трудно устранимого метаболического ацидоза, нарушением свертываемости крови и т.д.
[0003] Новый тип коронавируса (COVID-19) вызывает острое респираторное инфекционное заболевание, при этом заболевание было отнесено к инфекционным заболеваниям Класса B, предусмотренным в «Законе Китайской Народной Республики о профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями», и лечение данного заболевания относится к инфекционным заболеваниям Класса B. Во всем мире складывается тяжелая ситуация, характеризующаяся прогрессированием пневмонии, вызываемой новым типом коронавируса, число подтвержденных и предполагаемых случаев заболевания постоянно растет, огромная нагрузка ложится на лечебно-диагностические учреждения, при этом новый тип коронавируса может представлять угрозу заражения в течение продолжительного периода времени. В этой связи разработка высокочувствительной системы для выявления нового типа коронавируса способствует принятию мер профилактики и контроля заболевания, вызываемого новым типом коронавируса, эффективной охраны здоровья и обеспечения безопасности людей, а также содействует общей экономической и социальной стабильности.
[0004] С начала 2020 года также публиковались материалы, содержащие информацию о наборах праймеров для выявления нового типа коронавируса (COVID-19). Например, в заявке № CN111057797A, поданной 19 января 2020 г. и опубликованной 24 апреля 2020 г., были раскрыты праймеры и зонды, наборы и способы количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени для выявления нового типа коронавируса 2019-nCoV; например, в заявке № CN111118228A, поданной 31 марта 2020 г. и опубликованной 8 мая 2020 г., раскрывался набор для обнаружения нуклеиновой кислоты нового типа коронавируса COVID-19 и способ его применения, а также были
2
опубликованы аналогичные заявки. Тем не менее, с точки зрения применения в клинической практике степень точности является низкой, и существует вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Цель настоящего изобретения заключается, по меньшей мере, в разрешении проблем предшествующего уровня техники, связанных с необходимостью повышения точности обнаружения и снижения вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов.
[0006] В той связи первая цель настоящего изобретения заключается в создании набора праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот нового типа коронавируса COVID-19, содержащего две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
[0007] пара специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0008] ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1,
[0009] 5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′;
[0010] ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2;
[0011] 5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′;
[0012] пара специфических праймеров для сегмента гена N вируса:
[0013] N-F: как показано в SEQ ID NO: 3,
[0014] 5′-ATTGCACAATTTGCCCCCAG-3′;
[0015] N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.
[0016] 5′-CATCCAATTTGATGGCACCTG-3′.
[0017] Набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, предлагаемый настоящим изобретением, обладает, по меньшей мере, нижеприведенными преимуществами.
[0018] Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Обнаружение фрагментов гена ORF1ab и гена N может помочь в диагностировании инфекции, вызванной новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность выявления нового типа коронавируса, а также может быть предотвращена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов. В соответствии со стандартной кривой могут быть обнаружены положительные пробы с минимальной концентрацией 15 копий/мл.
[0019] Вторая цель настоящего изобретения заключается в создании набора зондов, используемых в комбинации с набором праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, включающего следующие зонды:
[0020] зонд для фрагмента гена ORF1ab вируса:
[0021] ORF1ab-P: как показано в SEQ ID NO: 5,
[0022] 5′-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′;
[0023] зонд для фрагментов гена N вируса:
[0024] N-P: как показано в SEQ ID NO: 6,
[0025] 5′-TTCTTCGGAATGTCGCGCATTG-3′.
[0026] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждый 5’-конец зонда мечен флуоресцентной репортерной группой, и каждый 3’-конец зонда мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0027] В процессе амплификации в ПЦР, если зонд является интактным, ввиду того, что флуоресцентная тушащая группа расположена в
непосредственной близости от флуоресцентной репортерной группы, флуоресценция, излучаемая флуоресцентным репортерным геном, поглощается тушащей группой, в результате чего флуоресцентный сигнал не излучается. При удлинении праймера зонд, связанный с матрицей, обрезается ферментом Taq (5'→3' экзонуклеазная активность), флуоресцентная репортерная группа отделяется от флуоресцентной тушащей группы, в результате чего генерируется флуоресцентный сигнал. Прибор для проведения количественной ПЦР с флуоресцентной детекцией автоматически вычерчивает кривую амплификации в реальном времени на основе детектированного флуоресцентного сигнала, с целью выявления нового типа коронавируса на уровне нуклеиновых кислот. Результаты теста могут быть качественными или количественными, и качественное выявление нового типа коронавируса может быть осуществлено путем непосредственного определения наличия или отсутствия соответствующей кривой амплификации. Соответствующая стандартная кривая может быть вычерчена в соответствии с значением порогового цикла различных стандартных градиентов концентрация, в то время как количественные результаты могут быть получены путем вычисления значения порогового цикла пробы. Кроме того, основываясь на общем понимании в данной области техники, флуоресцентные репортерные группы различных зондов могут различаться таким образом, чтобы амплификация различных фрагментов генов в одной реакционной пробирке обеспечивала генерирование флуоресцентных сигналов различных диапазонов длин волн для упрощения процесса выявления нового типа коронавируса.
[0028] В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец зонда для фрагмента гена ORF1ab-P вируса мечен флуоресцентной репортерной группой FAM, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1; 5’-конец зонда для фрагмента гена NP мечен флуоресцентной репортерной группой HEX, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ1.
[0029] Третья цель настоящего изобретения заключается в создании набора для выявления нового типа коронавируса COVID-19, при этом набор для выявления нового типа коронавируса включает вышеупомянутый набор праймеров и вышеупомянутый набор зондов.
[0030] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса дополнительно включает пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта;
[0031] из них, нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0032] RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7,
[0033] 5′- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3′;
[0034] RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8,
[0035] 5′-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3′;
[0036] нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
[0037] RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9,
[0038] 5′-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3′.
[0039] Внутренним стандартом, используемым в наборе, является рибонуклеотид человека P (РНаза P, рибонуклеопротеин (RNP)). Внутренний стандарт используют для определения того, получена ли ткань подходящего пациента или проба секреции. Весь экспериментальный процесс сбора, транспортировки и экстракции тестируемых проб находится
под полным контролем во избежание получения ложноотрицательных результатов теста.
[0040] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой.
[0041] Флуоресцентная репортерная группа зонда внутреннего стандарта также может быть группой, отличающейся от флуоресцентной репортерной группы вышеупомянутого зонда выявления нового типа коронавируса, например, TEXAS RED, и BHQ2 выбран для флуоресцентной тушащей группы. Таким образом, обеспечивается детектирование флуоресценции в канале (красителе) TEXAS RED/ROX.
[0042] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает смесь фермента ОT-ПЦР и буфера для ОТ-ПЦР.
[0043] В предпочтительном варианте осуществления набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемый настоящим изобретением, дополнительно включает пробу положительного контроля и пробу отрицательного контроля. Проба положительного контроля способна полностью амплифицировать фрагмент гена-мишени, соответствующий праймеру, в процессе амплификация, такой как стандартный штамм инактивированного вируса, плазмиды, содержащие соответствующей фрагмент гена-мишени (фрагмент гена ORFlab, фрагмент гена N, фрагмент гена RNP) и т.д. Проба отрицательного контроля представляет собой воду, используемую для растворения матричной РНК, например, воду, обработанную диэтилпилокарбонатом.
[0044] В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для выявления нового типа коронавируса, предлагаемого настоящим изобретением, дополнительно включает реагент для экстракции нуклеиновых кислот. Экстракция вирусных нуклеиновых кислот в пробе осуществляется с помощью соответствующего реагента для экстракции нуклеиновых кислот с целью обеспечения проведения последующих процессов амплификации и обнаружения.
[0045] Четвертая цель настоящего изобретения заключается в создании способа выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутого набора для выявления указанного вируса.
[0046] Способ выявления нового типа коронавируса включает следующие этапы:
[0047] выделение тотальной РНК из тестируемых проб;
[0048] использование тестируемых проб тотальной РНК в качестве матрицы; использование вышеупомянутого набора праймеров для амплификации и для выявления набора зондов в ПЦР после обратной транскрипции;
[0049] проведение анализа продуктов амплификации и определение того, содержат ли тестируемые пробы новый тип коронавируса в зависимости от появления кривой амплификации.
[0050] В соответствии со способом выявления нового типа коронавируса в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программа реакции амплификации в ПЦР составляет 50°С, 5 мин; 95°С, 10 сек; 95°С, 5 сек; 60°С, 30 сек; с 40 циклами.
[0051] Способ ОТ-ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией занимает только 1 час и 10 минут, начиная от экстракции нуклеиновых кислот до завершения выявления нового типа коронавируса. Способ является легким в использовании, характеризуется высокой
чувствительностью и представляет собой оперативный и эффективный лабораторный способ выявления нового типа коронавируса для диагностики инфекционного заболевания.
[0052] Две пары специфических праймеров соответственно нацелены на высококонсервативную область гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. Выявление фрагментов гена ORF1ab и гена N позволяет диагностировать инфекцию, вызываемую новым типом коронавируса. При этом путем оптимизации последовательности праймеров может быть повышена чувствительность обнаружения нового типа коронавируса, снижена вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов тестов и вероятность необнаружения нового типа коронавируса.
[0053] Вышеупомянутые способы выявления нового типа коронавируса с использованием вышеупомянутых наборов могут найти применение для дополнительной диагностики нового типа коронавируса, в результате чего может быть обеспечено оперативное получение информации о вспышках эпидемии, вызываемой новым типом коронавируса, и оказано надежное техническое содействие, направленное на проведение профилактических мер и мер по борьбе с эпидемией, вызываемой новым типом коронавируса. Этот фактор имеет первостепенное значение для предотвращения будущих вспышек заболевания, вызываемых неизвестными новыми типами коронавируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0054] На Фиг. 1 проиллюстрированы результаты амплификации с использованием набора мультиплексного ПЦР-анализа (Multiplex PCR Kit) для выявления нового типа коронавируса в соответствии с примером настоящего изобретения.
[0055] На Фиг. 2 проиллюстрирована стандартная кривая и кривая амплификации одной и той же пробы при различных концентрациях разведения. На Фиг. 2-1 представлена стандартная кривая, основанная на кривой амплификации Фиг. 2-2, при этом концентрация положительных плазмид составляет 4 мкг\мл, и соответствующее количество копий составляет 1* 1010 копий/мл, C1~C7 соответствует 1*102~8 копий/мл после многократного разведения; взяв значение порогового цикла (Ct)<40 в качестве отрицательного критерия, предел выявления нового типа коронавируса с использованием разработанного набора составляет 15 копий/мл.
[0056] На Фиг. 3 проиллюстрировано, что для экстракции РНК использовали исходный раствор положительной пробы D с применение соответственно разработанных наборов, набора A (Фиг. 3-1), набора B (Фиг. 3-2) и набора C (Фиг. 3-3), произвольно выбранных на рынке. Условия амплификации соответственно амплифицировали согласно инструкциям к наборам A, B и C. Пробу D протестировали как положительную для всех наборов. Значение порогового цикла набора настоящего изобретения ниже по сравнению с произвольно выбранными наборами, и при этом его чувствительность выше.
[0057] На Фиг. 4-1 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы и использовали разработанный набор и набор A, произвольно выбранный на рынке. Реакционная система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору A; разработанный набор отличался максимальным значением порогового цикла чувствительности (Ct), составлявшим 36,2, что рассматривалось как положительная проба.
Значение порогового цикла набора A достигало 38,3, и это определялось как сомнительная проба в соответствии с инструкциями к набору.
[0058] На Фиг. 4-2 проиллюстрировано, что положительную пробу D разбавляли для экстрагирования РНК в качестве матрицы, и соответственно использовали разработанный набор (набор настоящего изобретения) и набор B, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-2). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору B, максимальное значение порогового цикла чувствительности разработанного набора составляло 36,4, что рассматривалось как положительная проба. Значение порогового цикла набора B превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
[0059] На Фиг. 4-3 проиллюстрировано, что исходный раствор положительной пробы D разводили 8 раз для экстрагирования РНК в качестве матрицы. Соответственно использовали разработанный набор и набор C, произвольно выбранный на рынке (Фиг. 4-3). Система ПЦР и условия амплификации представляли собой условия протекания реакции, предусмотренные инструкцией к набору C. Максимальное значение пороговое цикла чувствительности разработанного набора составляло 38,2, и это определялось как сомнительная проба. Значение порогового цикла чувствительности набора C превысило 40, и это определялось как отрицательная проба в соответствии с инструкциями к набору, что приводило к ложноотрицательным результатам.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0060] Ниже приведено ясное и полное описание идеи настоящего изобретения и достигаемые технические эффекты со ссылкой на варианты осуществления для полного понимания целей, характерных особенностей и эффектов настоящего изобретения. Безусловно, описанные варианты осуществления настоящего изобретения являются лишь частью вариантов осуществления настоящего изобретения, а не всеми из них. Исходя из вариантов осуществления настоящего изобретения, другие варианты осуществления настоящего изобретения, созданные специалистами в данной области техники без осуществления изобретательской деятельности, относятся к объему правовой охраны настоящего изобретения.
[0061] Пример 1
[0062] В примере предлагается набор праймеров и зондов для выявления нового типа коронавируса. На основе технологии TaqMan с использованием флуоресцентных зондов, соответствующие специфические праймеры для выявления нового типа коронавируса и зонды Taqman могут быть разработаны на основе высококонсервативных областей гена ORF1ab и гена N нового типа коронавируса. При этом, при использовании РНП человека в качестве внутреннего стандарта могут быть разработаны соответствующие пары праймеров и зонды внутреннего стандарта. Детальная информация приведена в Таблице 1 ниже:
[0063] Таблица 1: Информация о праймерах и зондах
| Наименование последовательности | Последовательность |
| ORF1ab-F | 5′-TTTAGTTCCCTTCCATCATATGCA-3′ |
| ORF1ab-R | 5′-ATTCAGATTTAGCCACATTCAAAGA-3′ |
| ORF1ab-P | 5′FAM-TTTTGCTACTGCTCAAGAAGCTTATGAGC-3′BHQ1 |
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ХУЧЖОУ СЕНТРAЛ ХОСПИТЕЛ
ХУЧЖОУ СЕНТЕР ФОР ДИЗИЗ КОНТРОЛ ЭНД ПРИВЕНШН
<120> НАБОР ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ,
НАБОР ЗОНДОВ И НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ НОВОГО ТИПА КОРОНАВИРУСА COVID-19
И СПОСОБ ЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ
<141> 2020-12-02
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(24)
<223> ORF1ab-F
<400> 1
tttagttccc ttccatcata tgca 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(25)
<223> ORF1ab-R
<400> 2
attcagattt agccacattc aaaga 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(20)
<223> N-F
<400> 3
attgcacaat ttgcccccag 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(21)
<223> N-R
<400> 4
catccaattt gatggcacct g 21
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(29)
<223> ORF1ab-P
<400> 5
ttttgctact gctcaagaag cttatgagc 29
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(22)
<223> N-P
<400> 6
ttcttcggaa tgtcgcgcat tg 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(19)
<223> RNP-F
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(20)
<223> RNP-R
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> искусственная последовательность
<220>
<222> (1)..(23)
<223> RNP-P
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<---
Claims (22)
1. Набор праймеров для выявления нового типа коронавируса COVID-19, отличающийся тем, что он включает две пары специфических праймеров, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
пару специфических праймеров для фрагмента гена ORF1ab вируса:
ORF1ab-F: как показано в SEQ ID NO: 1,
ORF1ab-R: как показано в SEQ ID NO: 2;
пару специфических праймеров для сегмента гена N вируса:
N-F: как показано в SEQ ID NO: 3,
N-R: как показано в SEQ ID NO: 4.
2. Набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19, отличающийся тем, что набор включает набор праймеров по п. 1 для выявления нового типа коронавируса, пару праймеров внутреннего стандарта и зонд внутреннего стандарта,
из них нуклеотидная последовательность пары праймеров внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
RNP-F: как показано в SEQ ID NO: 7,
RNP-R: как показано в SEQ ID NO: 8;
нуклеотидная последовательность зонда внутреннего стандарта выглядит следующим образом:
RNP-P: как показано в SEQ ID NO: 9.
3. Набор для выявления нового типа коронавируса COVID-19 по п. 2, отличающийся тем, что набор дополнительно включает два зонда, включающие нижеприведенные нуклеотидные последовательности:
зонд для фрагмента гена ORF1ab вируса:
ORF1ab-P: как показано в SEQ ID NO: 5;
зонд для фрагментов гена N вируса:
N-P: как показано в SEQ ID NO: 6.
4. Набор по п. 2, отличающийся тем, что 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой.
5. Набор по п. 4, отличающийся тем, что 5’-конец RNP-P мечен флуоресцентной репортерной группой TEXAS RED, и 3’-конец мечен флуоресцентной тушащей группой BHQ2.
6. Набор по п. 5, дополнительно включающий смесь ферментов ОТ-ПЦР и буфера для ОТ-ПЦР.
7. Набор по п. 6, дополнительно включающий положительную контрольную пробу и отрицательную контрольную пробу.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020113883766 | 2020-12-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2772130C1 true RU2772130C1 (ru) | 2022-05-18 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2797000C1 (ru) * | 2022-11-18 | 2023-05-30 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363860A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-07-03 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用 |
| RU2732608C1 (ru) * | 2020-04-09 | 2020-09-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени |
| RU2733665C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-10-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Набор олигодезоксирибонуклетидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
| CN111763769A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-13 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732608C1 (ru) * | 2020-04-09 | 2020-09-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени |
| CN111363860A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-07-03 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | 一种检测新型冠状病毒covid-19的核酸组合物及应用 |
| RU2733665C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-10-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Набор олигодезоксирибонуклетидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
| CN111763769A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-13 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Сизова Е.Н., Шмакова Л.Н., Видякина Е.В., МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ SARS-CoV-2 (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ), Вятский медицинский вестник, No 3 (67), 2020, стр. 98-103. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2797000C1 (ru) * | 2022-11-18 | 2023-05-30 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для видоспецифичного обнаружения коронавируса SARS-CoV-2 по фрагменту гена Е |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111394511B (zh) | 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒 | |
| CN111004870B (zh) | 新型冠状病毒n基因核酸检测试剂盒 | |
| CN105624335B (zh) | 一种基因检测中东呼吸综合征冠状病毒的试剂盒 | |
| CN111808989A (zh) | 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法 | |
| CN107034309B (zh) | 快速检测猪伪狂犬病毒的实时荧光rpa试剂盒、试纸条rpa试剂盒及其用途 | |
| CN113005226A (zh) | 检测SARS-CoV-2的寡核苷酸和试剂盒 | |
| CN111206121A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒orflab和S基因的试剂盒 | |
| CN103255232B (zh) | 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| Zeng et al. | Molecular detection of genotype II grass carp reovirus based on nucleic acid sequence-based amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay (NASBA-ELISA) | |
| WO2023279042A2 (en) | Compositions and methods for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 variants | |
| CN101550454B (zh) | 人偏肺病毒实时荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN103966356A (zh) | 人类免疫缺陷病毒1型一步法荧光定量pcr检测试剂盒 | |
| CN110699492A (zh) | 一种永安河病毒实时荧光定量pcr检测引物和探针、检测试剂盒、检测方法及其应用 | |
| CN112695134A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法 | |
| CN112662808A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN112662809A (zh) | 一种用于新型冠状病毒covid-19检测的核酸组合物及其应用 | |
| CN111471800B (zh) | 检测新型冠状病毒的试剂盒及其扩增引物组合物 | |
| CN112226539A (zh) | 一种诺如病毒核酸检测试剂盒 | |
| RU2772130C1 (ru) | Набор праймеров для обнаружения нуклеиновых кислот, набор зондов и набор для выявления нового типа коронавируса covid-19 и способ его выявления | |
| CN116445659A (zh) | 用于检测新型冠状病毒及Omicron变异株分型的试剂盒及应用 | |
| CN109321683A (zh) | 一种a型塞尼卡病毒检测引物、试剂盒、病毒检测方法和应用 | |
| CN111549175B (zh) | 一种检测口岸输入2019新型冠状病毒多重荧光rt-pcr检测试剂 | |
| CN105734172B (zh) | 一种快速检测猪瘟病毒/猪繁殖与呼吸综合征病毒/猪伪狂犬病毒/猪细小病毒的试剂盒 | |
| CN115820927A (zh) | 一种猴痘病毒荧光pcr检测试剂盒及其引物探针组合 | |
| CN103014180A (zh) | 一种人星状病毒核苷酸的检测引物和探针及检测方法 |