CN111763769A - 适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法 - Google Patents

适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法，属于检测试剂盒制造技术领域，该制造方法以环介导的恒温扩增技术为基础，在引物设计方面采用了独特的设计，使得其扩增产物能够在纳米技术帮助下以肉眼可辨的多色变化展示检测结果，比传统单色肉眼检测相比更加灵敏，也同样无需依赖外部电子设备辅助读取数据并判定结果，更加适用于非专业技术人员做出快速判断。本发明制备的检测试剂盒通过试剂盒内自带的相变等温工作垫提供60℃以上的扩增环境，避免了样品变温等复杂步骤及变温仪器的支持，同时不依赖恒温加热设备，既适合于临床现场快速诊断，也适用于个人或家庭在非医疗场所进行病毒感染的自我判定。

Description

适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂 盒及其制造方法
技术领域
本发明属于检测试剂盒制造技术领域，具体涉及一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒(COVID-19)核酸检测试剂盒及其制造方法。
背景技术
新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为COVID-19。这种病毒易发生感染率极高的人传人现象，并且目前尚无有效的治疗药物，一旦被感染，患者的生命将受到严重威胁。在病毒爆发初期，大量疑似感染人员聚集于医疗场所，排队等待核酸检测，这使得医疗场所需要在短时间内投入大量的人力和物力来维持检测，压力巨大、不堪重负，与此同时，大量疑似感染人员的聚集会导致严重的交叉感染，加重疫情的恶化。当前，许多已经投放市场的病毒核酸检测试剂盒都是针对临床需求，对于仪器配备和操作人员的技术水平均有苛刻的要求。因此，研发不仅仅适用于临床现场诊断，更适用于个人在非医疗场所(如家庭、办公室、户外)完成自我筛查的病毒核酸检测试剂盒对于避免聚集感染和减轻医护人员及场所的压力至关重要。
目前COVID-19基因序列信息已经公布(GenBank，NC_045512.2)，为开发其诊断工具奠定了相应的基础。绝大多数正在研发或已投入临床使用的COVID-19 核酸检测试剂盒的检测原理均是基于各种核酸扩增技术，如聚合酶链反应(PCR) 的核酸扩增技术或环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)等，这些技术均依赖于精密的控温设备和高级复杂的分析仪器。此外，当前的病毒检测试剂盒对最终检测结果的读取依然需要依赖各种电子设备的支持，如荧光成像或浊度检测仪。这就意味着以上试剂盒都只适合于配备相应设备的医疗场所使用，并且需要具备一定技术水平的专业人员操作。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒(COVID-19)的核酸检测试剂盒及其制造方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒的核酸检测试剂盒的制造方法，包括以下步骤：
步骤1、纳米显色颗粒的合成
制备金银核壳结构纳米粒子；
步骤2、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液的配置
A液的配置
配置含醋酸钠、柠檬酸和过氧化氢溶液的水溶液；
B液的配置
配置含乙二胺四乙酸二钠盐、柠檬酸、丙三醇及3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)的水溶液；
将A液与B液混匀，即为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；
步骤3、LAMP扩增反应体系的配置
N基因或者ORF1ab基因的特异性引物均包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP 内引物和一对Loop F/Loop B环引物，并且在一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序i-motif序列；
N基因引物序列如下：
外引物：
F3:AAGATCTCAGTCCAAGATGGTA；
B3:TTTGGCAATGTTGTTCCTTG；
内引物：
FIP:CAACCCATATGATGCCGTCTTTTCTACTACCTAGGAACTGGG；
BIP:GGGAGCCTTGAATACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGAAGTTGTAGCACGATTG；
环引物：
Loop F:TGTTAGCACCATAGGGAAGT；
Loop B:CAATCCTGCTAACAATGCTG；
ORF1ab基因引物序列如下：
外引物：
F3:ATACCTACAACTTGTGCTAATG；
B3:TAGATGTCAAAAGCCCTGTA；
内引物：
FIP:GCGGAGTTGATCACAACTACAGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACACAGTCTGTACCGTC；
BIP:TTTTAAACGGGTTTGCGGTGTACGACATCAGTACTAGTGC；
环引物：
Loop F:CCATAACCTTTCCACATACCG；
Loop B:TAAGTGCAGCCCGTCTTA；
i-motif序列：CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA；
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LoopF引物及LoopB引物，加灭菌双蒸水，得到10×引物混合液；接着取10×引物混合液加入10×Bstbuffer、dNTP、Bst4.0 DNA/RNA聚合酶、模板，最后加灭菌双蒸水；使用相变等温工作垫加热反应体系40-45min。
在上述技术方案中，优选的是：步骤1的纳米显色颗粒的合成包括以下步骤：
①金纳米棒的制备：
首先，制备金晶种溶液：在洁净的圆底烧瓶中加入7.5mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，250μL 10mM的氯化金(HAuCl4)水溶液，加水至总体积为9.4mL，搅拌均匀之后迅速加入0.6mL 0.01M的硼氢化钠 (NaBH4)水溶液(0.01M的NaBH4需冰水浴中恒温15min，继续磁力搅拌3 min；将金晶种置于30℃水浴中两小时，待NaBH4消耗完全后可以使用；
然后，生长金纳米棒：100mL 0.1M的CTAB水溶液、2.04mL 0.024M的 HAuCl4水溶液、2mL 0.5M的硫酸(H2SO4)溶液、1mL 10mM的硝酸银 (AgNO3)水溶液和552μL 0.1M的抗坏血酸(AA)水溶液混合均匀后，取 120μL金晶种溶液加入到上述生长溶液中；放入30℃水浴中，12h后加入55.2 μL 0.1M的AA水溶液，40min后再加入55.2μL 0.1M的AA水溶液，然后再放置于30℃水浴中24h，即形成金纳米棒；
最后，将所得的金纳米棒溶液在9200rpm的转速下离心10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的CTAB溶液和杂质；
②金银核壳结构纳米粒子(Au@Ag)的制备：
首先，通过紫外可见分光光度仪将步骤①制备的金纳米棒溶液在波长400 nm处吸收值调整为0.2OD(即金原子的浓度为0.1mM)，取50μL该浓度的金纳米棒溶液和300μL 0.1MCTAB水溶液加入到2.65mL水中，放置于30℃水浴中30min；
然后，向上述金纳米棒溶液中加入6μL 10mM的L-半胱氨酸(L-Cysteine) 水溶液，放置于30℃水浴中30min；
最后，取36μL 10mM AgNO3水溶液和36μL 0.1M的AA水溶液加入到孵育过L-Cysteine的金纳米棒溶液中，混匀后放置于70℃水浴中生长30min。至此，得到纳米显色颗粒。将所得的纳米显色颗粒溶液在9200rpm的转速下离心 10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的CTAB 溶液和杂质，用300μL双蒸水重悬纳米显色颗粒，备用。
在上述技术方案中，优选的是：步骤2的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液的配置包括以下步骤：
A液(50mL水溶液)：取1.36g醋酸钠(CH3COONa)、0.16g柠檬酸(C6H8O7) 和30μL30％过氧化氢(H2O2)溶液，充分溶解；
B液(50mL水溶液)：取0.02g乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)、0.095 g柠檬酸(C6H8O7)、5mL丙三醇(C3H8O3)、0.02g TMB(用DMSO溶解为10 mg/mL后再加)，充分溶解，避光保存；
使用时将A液与B液按照1:1的体积比混匀(现用现混)。
在上述技术方案中，优选的是：步骤3的LAMP扩增反应体系的配置具体包括以下步骤：
①根据文献报道选取COVID-19N基因或者ORF1ab基因的特异性保守区 (GenBank，NC_045512.2)，并确定基因序列的准确性；
②根据步骤①确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页 (http:// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)分别针对N基因或者ORF1ab基因的特异性保守区设计多组特异性引物，这些引物分别针对N基因或者ORF1ab基因特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP内引物和一对Loop F/Loop B环引物，并且在一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序列i-motif序列；分别对N基因和ORF1ab的多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；N基因和ORF1ab 基因LAMP引物的序列如下：
N基因：
外引物：
F3:AAGATCTCAGTCCAAGATGGTA；
B3:TTTGGCAATGTTGTTCCTTG；
内引物：
FIP:CAACCCATATGATGCCGTCTTTTCTACTACCTAGGAACTGGG；
BIP:GGGAGCCTTGAATACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGAAGTTGTAGCACGATTG；
环引物：
Loop F:TGTTAGCACCATAGGGAAGT；
Loop B:CAATCCTGCTAACAATGCTG；
ORF1ab基因：
外引物：
F3:ATACCTACAACTTGTGCTAATG；
B3:TAGATGTCAAAAGCCCTGTA；
内引物：
FIP:GCGGAGTTGATCACAACTACAGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACACAGTCTGTACCGTC；
BIP:TTTTAAACGGGTTTGCGGTGTACGACATCAGTACTAGTGC；
环引物：
Loop F:CCATAACCTTTCCACATACCG；
Loop B:TAAGTGCAGCCCGTCTTA；
i-motif序列：CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA
③优化后的LAMP体系为：
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：100μmol/L的F3和B3引物各2μL、 100μmol/L的FIP和BIP引物各16μL、100μmol/L的LoopF和LoopB引物各4 μL，加灭菌双蒸水至100μL，混匀，此为10×引物，取2.5μL；10×Bst buffer 2.5 μL；10mmol/L的dNTP 3.5μL；8U的Bst4.0DNA/RNA聚合酶0.5μL；模板1μL；加灭菌双蒸水至25μL；相变等温工作垫加热反应体系40-45min。
在上述技术方案中，优选的是：所述相变等温工作垫外包裹一层脱脂棉。
本发明还提供一种由上述制造方法制造的核酸检测试剂盒。
本发明制备的核酸检测试剂盒还可以应用于由甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒、H9N1流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人星状病毒、腺病毒或者HIV病毒引发的疾病的病原体检测。
本发明制备的核酸检测试剂盒还可以应用于由结核分枝杆菌、百日咳杆菌、肺炎链球菌、溶血链球菌、新型隐球菌、大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、淋病奈瑟菌、或者炭疽芽胞杆菌引发的疾病的病原体检测。
本发明制备的核酸检测试剂盒还可以应用于由隐孢子虫、疟原虫、弓形虫和或血吸虫引发的疾病的病原体检测。
本发明制造的适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒的核酸检测试剂盒检测样本的方法，包括以下步骤：
步骤1、LAMP扩增反应：
(1)引物混合液(10×引物)配置：
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：100μmol/L的F3和B3引物各2μL； 100μmol/L的FIP和BIP引物各16μL；100μmol/L的LoopF和LoopB引物各4 μL，加灭菌双蒸水至100μL，混匀备用。
(2)反应体系混合液配置
10×引物混合液2.5μL，10×Bst buffer 2.5μL、10mmol/L的dNTP 3.5μL、 8U的Bst4.0 DNA/RNA聚合酶0.5μL、模板1μL，加灭菌双蒸水至25μL。
(3)相变等温工作垫温度升至60℃后包裹步骤(2)中装有样品的离心管加热40-45min(相变等温工作垫外包裹一层脱脂棉，使相变等温工作垫的温度维持在60℃以上)。
步骤2、生成G四联体DNA模拟酶，氧化TMB：
向步骤1LAMP扩增产物加入1μL 3M KCl、3μL 0.2M磷酸盐缓冲液、1μL 0.3mMHemin二甲基亚砜溶液、10μL TMB溶液，室温避光20min。
步骤3、纳米粒子配制：
取10μL Au@Ag、40μL 0.3M CTAB、40μL双蒸水，混合均匀备用。
步骤4、样品检测：
将步骤3配制好的纳米粒子加入到步骤2的溶液中，室温作用5min，观察混合溶液颜色变化(红→紫→绿)，判定检测结果。
本发明的有益效果是：
本发明提供的用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒(COVID-19)的快速便携式核酸检测试剂盒的制造方法以环介导的恒温扩增技术(LAMP)为基础，在引物设计方面采用了独特的设计，使得其扩增产物能够在纳米技术帮助下以肉眼可辨的多色变化展示检测结果，比传统单色肉眼检测相比更加灵敏，也同样无需依赖外部电子设备辅助读取数据并判定结果，更加适用于非专业技术人员做出快速判断。本检测试剂盒通过试剂盒内自带的相变等温工作垫提供 60℃以上的扩增环境，避免了样品变温等复杂步骤及变温仪器的支持，同时不依赖恒温加热设备，既适合于临床现场快速诊断，也适用于个人或家庭在非医疗场所进行病毒感染的自我判定。以上两大特点使得这一试剂盒突破了核酸检测对于环境场所和检测人员技术方面的限制，推动了病毒诊断的前移和下移，实现“全民抗疫”。此外，本发明所涉及的不依赖恒温加热设备的加热扩增方式结合脱离检测仪器判定结果的形式同样适用于病毒(包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒、H9N1流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人星状病毒、腺病毒和HIV病毒等)、细菌(包括结核分枝杆菌、百日咳杆菌、肺炎链球菌、溶血链球菌、新型隐球菌、大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、淋病奈瑟菌和炭疽芽胞杆菌等)、寄生虫(如隐孢子虫、疟原虫、弓形虫和血吸虫等)等引发的疾病的临床和非医疗环境下的病原体诊断检测。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为Au@Ag纳米粒子透射电镜照片。
图2为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热30min，模板COVID-19DNA)。
图3为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热40min，模板COVID-19DNA)。
图4为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热40min，模板COVID-19RNA)。
图5为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热45min，模板COVID-19RNA)。
图6为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热40min，模板COVID-19假病毒颗粒)。
图7为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热45min，模板COVID-19假病毒颗粒)。
具体实施方式
本发明的发明思想为：本发明的适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒(COVID-19)的核酸检测试剂盒的制造技术，根据GenBank公布的COVID-19 的基因序列，选取COVID-19ORF1ab基因和N基因的特异性保守区，分别设计 LAMP引物6条(包括2条外引物、2条内引物和2条环引物)，并且在其中一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序列(i-motif序列)。其中等温扩增过程依靠试剂盒自带的相变等温工作垫(5×5厘米)来实现，无需电源或任何外部的恒温电子设备维持，特别适用于条件受限的非医疗场所使用。等温扩增结束后，利用i-motif酸响应特性，打开LAMP扩增产物DNA双链中的i-motif序列部分，暴露G四联体序列，在K+存在的环境中形成G四联体，进而G四联体与Hemin结合，生成大量的G四联体DNA模拟酶，氧化TMB。反应结束后，向体系中加入表面包裹银的金纳米棒，氧化的TMB刻蚀包裹银的金纳米棒，反应体系溶液出现不同的颜色，肉眼直接判定检测结果，不依赖于任何设备对检测结果进行分析。通过敏感性试验证明：以带有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的质粒、新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因体外转录得到的RNA和含有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的假病毒颗粒为模板均能达到1copy/mL的检测敏感度。通过对比恒温金属浴加热LAMP扩增反应和相变等温工作垫加热LAMP扩增反应后的显色试验证明：本检测试剂盒能够脱离恒温加热仪器仅依靠相变等温工作垫加热实现对COVID-19的检测，具有显著的民用性，有助于实现“全民抗疫”。
下面结合附图对本发明做以详细说明。
实施例
本发明提供的一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒 (COVID-19)的核酸检测试剂盒的制造方法，具体步骤如下：
1、纳米显色颗粒的合成：
①金纳米棒的制备：首先，制备金晶种溶液：在洁净的圆底烧瓶中加入7.5 mL0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，250μL 10mM的氯化金 (HAuCl4)水溶液，加水至总体积为9.4mL，搅拌均匀之后迅速加入0.6mL 0.01M的硼氢化钠(NaBH4)水溶液(0.01M的NaBH4需冰水浴中恒温15min)，继续磁力搅拌3min。将金晶种置于30℃水浴中两小时，待NaBH4消耗完全后可以使用。然后，生长金纳米棒：100mL 0.1M的CTAB水溶液、2.04mL 0.024M的HAuCl4水溶液、2mL 0.5M的硫酸(H2SO4)溶液、1mL 10mM的硝酸银(AgNO3)水溶液和552μL0.1M的抗坏血酸(AA)水溶液混合均匀后，取120μL金晶种溶液加入到上述生长溶液中。放入30℃水浴中，12h后加入 55.2μL 0.1M的AA水溶液，40min后再加入55.2μL 0.1M的AA水溶液，然后再放置于30℃水浴中24h，即形成金纳米棒。最后，将所得的金纳米棒溶液在9200rpm的转速下离心10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的CTAB溶液和杂质。
②金银(Au@Ag)核壳结构纳米粒子的制备：首先，通过紫外可见分光光度仪将步骤①制备的金纳米棒在波长400nm处吸收值调整为0.2OD(即金原子的浓度为0.1mM)，取50μL该浓度的金纳米棒溶液和300μL 0.1M CTAB水溶液加入到2.65mL水中，放置于30℃水浴中30min。然后，向上述金纳米棒溶液中加入6μL 10mM的L-半胱氨酸(L-Cysteine)水溶液，放置于30℃水浴中 30min。最后，取36μL 10mM AgNO3水溶液和36μL 0.1M的AA水溶液加入到孵育过L-Cysteine的金纳米棒溶液中，混匀后放置于70℃水浴中生长30min。至此，得到纳米显色颗粒。将所得的纳米显色颗粒溶液在9200rpm的转速下离心10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的 CTAB溶液和杂质，用300μL双蒸水重悬纳米显色颗粒，备用。
2、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液的配置：A液(50mL水溶液)：分别取1.36g醋酸钠(CH3COONa)、0.16g柠檬酸(C6H8O7)和30μL 30％过氧化氢(H2O2)溶液，充分溶解；B液(50mL水溶液)：取0.02g乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)、0.095g柠檬酸(C6H8O7)、5mL丙三醇(C3H8O3)、0.02 g TMB(用DMSO溶解为10mg/mL后再加)，充分溶解，避光保存。使用时将 A液与B液按照1:1的体积比混匀(现用现混)。
3、LAMP扩增反应体系
①根据文献报道选取COVID-19N基因和ORF1ab基因的特异性保守区 (GenBank，NC_045512.2)，并确定基因序列的准确性；
②根据步骤①确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)分别针对N基因和ORF1ab基因的特异性保守区设计多组特异性引物，这些引物分别针对N基因和ORF1ab基因特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP内引物和一对 Loop F/Loop B环引物，并且在一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序列(i-motif序列：CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA)。分别对N基因和ORF1ab的多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增。N基因和ORF1ab基因LAMP引物的序列如下：
N基因：
外引物：
F3:AAGATCTCAGTCCAAGATGGTA；
B3:TTTGGCAATGTTGTTCCTTG；
内引物：
FIP:CAACCCATATGATGCCGTCTTTTCTACTACCTAGGAACTGGG；
BIP:GGGAGCCTTGAATACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGAAGTTGTAGCACGATTG；
环引物：
Loop F:TGTTAGCACCATAGGGAAGT；
Loop B:CAATCCTGCTAACAATGCTG；
ORF1ab基因：
外引物：
F3:ATACCTACAACTTGTGCTAATG；
B3:TAGATGTCAAAAGCCCTGTA；
内引物：
FIP:GCGGAGTTGATCACAACTACAGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACACAGTCTGTACCGTC；
BIP:TTTTAAACGGGTTTGCGGTGTACGACATCAGTACTAGTGC；
环引物：
Loop F:CCATAACCTTTCCACATACCG；
Loop B:TAAGTGCAGCCCGTCTTA；
③优化后的LAMP体系为：
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：100μmol/L的F3和B3引物各2μL、 100μmol/L的FIP和BIP引物各16μL、100μmol/L的LoopF和LoopB引物各4μL, 加灭菌双蒸水至100μL，混匀，此为10×引物，取2.5μL；10×Bst buffer 2.5μL； 10mmol/L的dNTP 3.5μL；8U的Bst4.0DNA/RNA聚合酶0.5μL；模板1μL；加灭菌双蒸水至25μL。相变等温工作垫(5×5厘米)(购自小林日化)加热反应体系 40-45min。
图1为Au@Ag纳米粒子透射电镜照片，该图说明用此种方法可以成功的合成 Au@Ag纳米粒子。
图2为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热30min，模板COVID-19DNA)。以含有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的质粒为模板，图2a显示新型冠状病毒N基因检测结果，图2b显示新型冠状病毒ORF1ab基因检测结果。图2a从左到右新型冠状病毒N基因(DNA)的copy数分别为0、1、10、 100、103、105/mL。图2b从左到右新型冠状病毒ORF1ab基因(DNA)的copy数分别为0、1、10、100、103、105/mL。从图中可以看出以含有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的质粒为模板，恒温金属浴65℃加热30min，单copy模板量将 Au@Ag溶液由红色刻蚀为紫色，实现对COVID-19的超敏检测。
图3为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热40min，模板COVID-19DNA)。以含有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的质粒为模板，图3a显示新型冠状病毒N基因检测结果，图3b显示新型冠状病毒ORF1ab基因检测结果。图3a从左到右新型冠状病毒N基因(DNA)的copy数分别为0、1、10、 100/mL。图3b从左到右新型冠状病毒ORF1ab基因(DNA)的copy数分别为0、1、 10、100/mL。从图中可以看出以含有新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的质粒为模板，相变等温工作垫加热40min，单copy模板量即能达到恒温金属浴加热的检测效果，不依赖仪器设备实现超敏单copy检测。
图4为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热40min，模板COVID-19RNA)。以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因体外转录的RNA模板，图4a显示新型冠状病毒N基因RNA模板检测结果，图4b显示新型冠状病毒 ORF1ab基因RNA模板检测结果。图4a从左到右新型冠状病毒N基因(RNA)的 copy数分别为0、1、10、100、103、105/mL。图4b从左到右新型冠状病毒ORF1ab 基因(RNA)的copy数分别为0、1、10、100、103、105/mL。从图中可以看出以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因体外转录的RNA模板，恒温金属浴65℃加热40min，单copy模板量将Au@Ag溶液由红色刻蚀为紫色，实现对COVID-19的超敏检测。
图5为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热45min，模板COVID-19RNA)。以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因体外转录的RNA模板，图5a显示新型冠状病毒N基因RNA模板检测结果，图5b显示新型冠状病毒 ORF1ab基因RNA模板检测结果。图5a从左到右新型冠状病毒N基因(RNA)的 copy数分别为0、1、10、100/mL。图5b从左到右新型冠状病毒ORF1ab基因(RNA) 的copy数分别为0、1、10、100/mL。从图中可以看出以新型冠状病毒N基因或 ORF1ab基因体外转录的RNA模板，相变等温工作垫加热45min，单copy模板量即能达到恒温金属浴加热的检测效果，不依赖仪器设备实现超敏单copy检测。
图6为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(恒温金属浴65℃加热40min，模板COVID-19假病毒颗粒)。以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的假病毒颗粒为模板，图6a显示新型冠状病毒N基因假病毒颗粒检测结果，图6b显示新型冠状病毒ORF1ab基因假病毒颗粒检测结果。图6a从左到右新型冠状病毒N基因(假病毒)的copy数分别为0、1、10、100、103、105/mL。图6b从左到右新型冠状病毒ORF1ab基因(假病毒)的copy数分别为0、1、10、100、103、105/mL。从图中可以看出以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因假病毒颗粒为模板，恒温金属浴65℃加热40min，单copy模板量将Au@Ag溶液由红色刻蚀为紫色，实现对 COVID-19的超敏检测。
图7为Au@Ag检测LAMP扩增产物显色图(相变等温工作垫加热45min，模板COVID-19假病毒颗粒)。以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因的假病毒颗粒为模板，图7a显示新型冠状病毒N基因假病毒颗粒检测结果，图7b显示新型冠状病毒ORF1ab基因假病毒颗粒检测结果。图7a从左到右新型冠状病毒N基因(假病毒)的copy数分别为0、1、10、100/mL。图7b从左到右新型冠状病毒ORF1ab 基因(假病毒)的copy数分别为0、1、10、100/mL。从图中可以看出以新型冠状病毒N基因或ORF1ab基因假病毒颗粒为模板，相变等温工作垫加热45min，单copy模板量即能达到恒温金属浴加热的检测效果，不依赖仪器设备实现超敏单 copy检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其制造方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagatctcag tccaagatgg ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttggcaatg ttgttccttg 20
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacccatat gatgccgtct tttctactac ctaggaactg gg 42
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggagccttg aatacacccc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaacc ctaaggaagt 60
tgtagcacga ttg 73
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgttagcacc atagggaagt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caatcctgct aacaatgctg 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atacctacaa cttgtgctaa tg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagatgtcaa aagccctgta 20
<210> 9
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcggagttga tcacaactac agccctaacc ctaaccctaa ccctaaccct aaccctaaca 60
cagtctgtac cgtc 74
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttttaaacgg gtttgcggtg tacgacatca gtactagtgc 40
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccataacctt tccacatacc g 21
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taagtgcagc ccgtctta 18
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccctaaccct aaccctaacc ctaaccctaa ccctaa 36

Claims (9)

1.一种适用于临床现场及非医疗环境下新型冠状病毒的核酸检测试剂盒的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、纳米显色颗粒的合成
制备金银核壳结构纳米粒子；
步骤2、3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的配置
A液的配置
配置含醋酸钠、柠檬酸和过氧化氢溶液的水溶液；
B液的配置
配置含乙二胺四乙酸二钠盐、柠檬酸、丙三醇及3,3',5,5'-四甲基联苯胺的水溶液；
将A液与B液混匀，即为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液；
步骤3、LAMP扩增反应体系的配置
N基因或者ORF1ab基因的特异性引物均包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP内引物和一对Loop F/Loop B环引物，并且在一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序i-motif序列；
N基因引物序列如下：
外引物：
F3:AAGATCTCAGTCCAAGATGGTA；
B3:TTTGGCAATGTTGTTCCTTG；
内引物：
FIP:CAACCCATATGATGCCGTCTTTTCTACTACCTAGGAACTGGG；
BIP:GGGAGCCTTGAATACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGAAGTTGTAGCACGATTG；
环引物：
Loop F:TGTTAGCACCATAGGGAAGT；
Loop B:CAATCCTGCTAACAATGCTG；
ORF1ab基因引物序列如下：
外引物：
F3:ATACCTACAACTTGTGCTAATG；
B3:TAGATGTCAAAAGCCCTGTA；
内引物：
FIP:GCGGAGTTGATCACAACTACAGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACACAGTCTGTACCGTC；
BIP:TTTTAAACGGGTTTGCGGTGTACGACATCAGTACTAGTGC；
环引物：
Loop F:CCATAACCTTTCCACATACCG；
Loop B:TAAGTGCAGCCCGTCTTA；
i-motif序列：CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA；
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LoopF引物及LoopB引物，加灭菌双蒸水，得到10×引物混合液；接着取10×引物混合液加入10×Bstbuffer、dNTP、Bst4.0 DNA/RNA聚合酶、模板，最后加灭菌双蒸水；使用相变等温工作垫加热反应体系40-45min。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤1的纳米显色颗粒的合成包括以下步骤：
①金纳米棒的制备：
首先，制备金晶种溶液：在圆底烧瓶中加入7.5mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，250μL 10mM的氯化金水溶液，加水至总体积为9.4mL，搅拌均匀之后迅速加入0.6mL0.01M的硼氢化钠水溶液，将金晶种置于30℃水浴中两小时，待硼氢化钠消耗完全后使用；
然后，生长金纳米棒：100mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化铵水溶液、2.04mL 0.024M的氯化金水溶液、2mL 0.5M的硫酸溶液、1mL 10mM的硝酸银水溶液和552μL 0.1M的抗坏血酸水溶液混合均匀后，取120μL金晶种溶液加入到上述生长溶液中，放入30℃水浴中，12h后加入55.2μL 0.1M的抗坏血酸水溶液，40min后再加入55.2μL 0.1M的抗坏血酸水溶液，然后再放置于30℃水浴中24h，即形成金纳米棒；
最后，将所得的金纳米棒溶液在9200rpm的转速下离心10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的十六烷基三甲基溴化铵溶液和杂质；
②金银核壳结构纳米粒子的制备：
首先，通过紫外可见分光光度仪将步骤①制备的金纳米棒溶液在波长400nm处吸收值调整为0.2OD，取50μL该浓度的金纳米棒溶液和300μL 0.1M十六烷基三甲基溴化铵水溶液加入到2.65mL水中，放置于30℃水浴中30min；
然后，向上述金纳米棒溶液中加入6μL 10mM的L-半胱氨酸水溶液，放置于30℃水浴中30min；
最后，取36μL 10mM硝酸银水溶液和36μL 0.1M的抗坏血酸水溶液加入到孵育过L-半胱氨酸的金纳米棒溶液中，混匀后放置于70℃水浴中生长30min，得到纳米显色颗粒；将所得的纳米显色颗粒溶液在9200rpm的转速下离心10min，弃去上层清液，将沉淀重新分散在水中；如此重复两次洗去多余的CTAB溶液和杂质，用300μL双蒸水重悬纳米显色颗粒，备用。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤2的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的配置包括以下步骤：
A液：取1.36g醋酸钠、0.16g柠檬酸和30μL 30％过氧化氢溶液，加水至50mL；
B液：取0.02g乙二胺四乙酸二钠盐、0.095g柠檬酸、5mL丙三醇、0.02g3,3',5,5'-四甲基联苯胺，加水至50mL；
使用时将A液与B液按照1:1的体积比混匀。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤3的LAMP扩增反应体系的配置具体包括以下步骤：
①根据文献报道选取COVID-19N基因或者ORF1ab基因的特异性保守区，并确定基因序列的准确性；
②根据步骤①确定的序列，利用LAMP primer explorer在线网页分别针对N基因或者ORF1ab基因的特异性保守区设计多组特异性引物，这些引物分别针对N基因或者ORF1ab基因特异性保守区的6个区域，每组引物包括一对F3/B3外引物，一对FIP/BIP内引物和一对Loop F/Loop B环引物，并且在一条内引物上插入形成G四联体序列的互补链序列i-motif序列；分别对N基因和ORF1ab的多组特异性引物进行筛选，最后确定出特异性最强、灵敏度最高的引物进行扩增；N基因和ORF1ab基因LAMP引物的序列如下：
N基因：
外引物：
F3:AAGATCTCAGTCCAAGATGGTA；
B3:TTTGGCAATGTTGTTCCTTG；
内引物：
FIP:CAACCCATATGATGCCGTCTTTTCTACTACCTAGGAACTGGG；
BIP:GGGAGCCTTGAATACACCCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAGGAAGTTGTAGCACGATTG；
环引物：
Loop F:TGTTAGCACCATAGGGAAGT；
Loop B:CAATCCTGCTAACAATGCTG；
ORF1ab基因：
外引物：
F3:ATACCTACAACTTGTGCTAATG；
B3:TAGATGTCAAAAGCCCTGTA；
内引物：
FIP:GCGGAGTTGATCACAACTACAGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACACAGTCTGTACCGTC；
BIP:TTTTAAACGGGTTTGCGGTGTACGACATCAGTACTAGTGC；
环引物：
Loop F:CCATAACCTTTCCACATACCG；
Loop B:TAAGTGCAGCCCGTCTTA；
i-motif序列：CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA
③优化后的LAMP体系为：
分别取N基因或者ORF1ab基因的引物：100μmol/L的F3和B3引物各2μL、100μmol/L的FIP和BIP引物各16μL、100μmol/L的LoopF和LoopB引物各4μL，加灭菌双蒸水至100μL，混匀，此为10×引物，取2.5μL；10×Bst buffer 2.5μL；10mmol/L的dNTP 3.5μL；8U的Bst4.0 DNA/RNA聚合酶0.5μL；模板1μL；加灭菌双蒸水至25μL；相变等温工作垫加热反应体系40-45min。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的制造方法，其特征在于，所述相变等温工作垫外包裹一层脱脂棉。
6.一种权利要求1-4任意一项所述的制造方法制造的核酸检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒还应用于由甲型流感病毒、乙型流感病毒、单纯疱疹病毒、H9N1流感病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人星状病毒、腺病毒或者HIV病毒引发的疾病的病原体检测。
8.根据权利要求6所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒还应用于由结核分枝杆菌、百日咳杆菌、肺炎链球菌、溶血链球菌、新型隐球菌、大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌、淋病奈瑟菌、或者炭疽芽胞杆菌引发的疾病的病原体检测。
9.根据权利要求6所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒还应用于由隐孢子虫、疟原虫、弓形虫和或血吸虫引发的疾病的病原体检测。
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