CN110607351A - 一种检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于三通路结构驱动链置换反应及DNA walker技术驱动球形核酸酶的化学发光技术检测尿嘧啶糖基化酶。为了解决以上现有技术中检测尿嘧啶糖基化酶的方法存在操作复杂、灵敏度比较低、成本高的问题，一种基于三通路结构和DNA walker两种纳米技术的生物传感器利用球形核酸酶催化鲁米诺发生化学发光反应进行检测。制备方法：纳米金的制备；球形核酸的制备；均相中形成球形核酸酶用于催化鲁米诺的化学发光反应。利用了尿嘧啶糖基化酶对U碱基的特异性识别和切除，实现目标的特异性检测；同时采用DNA walker纳米技术实现目标的快速、高灵敏性检测。

Description

一种检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器及其制备方 法与应用

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于三通路结构和DNA walker纳米技术检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器及其制备方法，还涉及球形核酸酶技术。

背景技术

DNA的完整性对于维持生物体的功能是至关重要的，当DNA出现自发性损伤时，会启动碱基切除修复机制（BER）进行DNA损伤的修复。BER修复途径主要是由DNA糖基化酶启动的，其中，尿嘧啶糖基化酶（UDG）是通过特异性识别并且去除DNA中胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶U，形成AP位点，在无嘌呤/嘧啶核酸内切酶1（APE1）或者内切酶IV（Endo IV）的作用下切割DNA链，产生链的断裂，通过后续DNA聚合酶和连接酶的共同作用完成DNA链的修复。尿嘧啶糖基化酶在维持基因的完整性方面起到了非常重要的作用，此外，该酶的异常表达与各种疾病的发生相关，包括免疫缺陷病、神经退行性疾病及癌症等。因此，尿嘧啶糖基化酶的早期检测对于一些生物过程的研究及疾病的早期诊断起到了重要的作用。

目前报道的尿嘧啶糖基化酶检测技术有酶联免疫法、比色法、凝胶电泳耦合放射性标记的方法等，这些方法中有些存在抗体的功能化和抗体酶标记等过程，导致检测过程非常复杂，此外，还存在成本高、检测灵敏度差以及重现差等问题。因此，目前需要构建一种高灵敏性、操作简单、高效、可靠的平台用于尿嘧啶糖基化酶的检测。

发明内容

针对目前缺乏一种高效、灵敏便捷的检测尿嘧啶糖基化酶的方法的问题，本发明提供一种基于三通路结构驱动链置换反应及DNA walker技术驱动球形核酸酶的化学发光技术检测尿嘧啶糖基化酶，主要是包括构建三通路结构和球形核酸两种纳米结构，利用尿嘧啶糖基化酶对U碱基的特异性识别和切除，在内切酶IV的辅助下，实现三通路结构的变化和DNA walking反应的驱动，从而形成球形核酸酶用于催化鲁米诺发生反应产生化学发光信号，显著提高了检测的灵敏度和检测速度，更有利于尿嘧啶糖基化酶在实际样本中的检测。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：

UP：AGT CAG TAT GCA CUC GTG TTA AGC GTG SA：TCT TTC GGC CGC GTT CAC GAG TGCATC CGC GCT TGG G(T)₅₀ G CTC GCC CAA GCG CGG BS：TTTCAC GCT TCG CGG CCG AAA GATTT linker：SH-(T)₁₀CA AGC GCG GAT GCA C G-HP：SH-(T)₁₀GG GTA GGG CGG G TT GGG XGA GC T TTT CCC TAC。

在UP链中，有一个尿嘧啶碱基U，UP链中的斜体碱基和SA链中的斜体碱基互补，从而封闭SA链的toehold部分和链迁移部分，UP链中的加粗碱基用于和BS链中的加粗碱基互补配对。在发夹SA链中，下划线的碱基和BS链中的下划线碱基互补配对，SA链中斜体加粗部分部分的碱基和linker加粗碱基是互补配对的，SA链中有连续50个胸腺嘧啶碱基作为间隔用于灵活控制摇摆臂，SA链中的斜体加下划线的碱基和G-HP中的斜体加下划线的碱基互补配对，该斜体加下划线的碱基有一部分被封闭在SA链的茎端。在G-HP链中，X代表AP位点，粗体碱基是能够形成G-四联体DNA酶的序列，该粗体碱基中画下划线的碱基被封闭在发夹G-HP中的茎端，降低背景信号。

体系中包含两种纳米结构：一种是三通路结构（TWJ），另一种是用于进行DNAwalker功能的球形核酸结构（SNA）。球形核酸（SNA）是以纳米金为核心，表面通过巯基修饰有两种链，一种链为包含AP位点并且含有被封闭的可形成G-四联体DNA酶的DNA发夹（G-HP），另一种链为能和三通路结构中的Swing arm（SA）链进行碱基互补的linker链。三通路结构（TWJ）是由发挥DNA walker功能的Swing arm（SA）链、一条目标物尿嘧啶糖基化酶特异性识别的UP探针链及一条基底链BS链三部分组成。UP链中包含一个尿嘧啶碱基U并且包含一段和BS链互补的序列，SA链的3’端包含一段和G-HP发夹中的环形loop端部分碱基互补的序列，一段含有50个胸腺嘧啶（polyT50）的spacer端，一段能和linker链互补的序列以及一段和BS链互补的序列这几部分组成。该SA链被设计为发夹构型，SA链的3’端和G-HP发夹中的环形loop端互补碱基有10对，其中有5对被封闭在发夹的茎端，中间有一个AP位点，这10对碱基杂交温度为23.1℃，因此在37℃反应体系中不能稳定存在，因此SA链不能进行DNAwalker反应。

在存在目标物尿嘧啶糖基化酶时，目标物将UP探针中的U碱基去除，形成AP位 点，此时在内切酶IV(Endo IV)的辅助下，在AP位点处进行切割使得UP探针断裂，从 三通路体系中释放出来，暴露出被UP探针封闭的位于SA链中的toehold端，此时，球形核 酸中linkerDNA和SA链进行杂交，通过toehold介导的链置换反应使得SA链被打开，释 放出用于和G-HP杂交的部分，由于linker序列和SA序列的杂交，使得SA和G-HP的10 对碱基邻近，显著增加了局域浓度，由不稳定的分子间杂交变成稳定的分子内杂交，此时的 杂交温度为55.1℃。在这种情况下，内切酶IV作用于AP位点，将G-HP在AP位点处切 断，使得G-HP发夹结构被破坏，由于此时茎端杂交不再稳定，导致纳米金表面的G-HP仅 剩巯基结合的链，此时，SA链被释放，可以和下一个G-HP杂交进行后续的反应，直到将 纳米金表面的G-HP均切断，使得原先被封闭的可形成G-四联体的部分全部被释放出来，形 成G4-SNA结构，在体系中加入K⁺和血红素，可形成G-四联体球形核酸酶(G4- SNAzyme)，在过氧化氢存在的情况下，G4-SNAzyme可催化鲁米诺的化学发光。由于整个 体系基于尿嘧啶糖基化酶的存在启动了toehold介导的链置换反应及后续的DNA walker反 应，进而形成G-四联体球形核酸酶结构，这种方式相比直接在球形核酸表面事先形成G-四 联体DNA酶而言，有效降低了背景信号，提高反应的信噪比。此外，由于采用DNA walker 纳米技术和球形核酸酶技术，从而使得化学发光信号显著放大。因此，我们设计了一种高 效、高灵敏性、高信噪比的化学发光生物传感器，为尿嘧啶糖基化酶的检测及后续的临床研 究提供了一个有效的技术平台。

本发明中尿嘧啶糖基化酶的检测是在均相溶液中实现的，通过三通路介导的链置换反应及DNA walker驱动的球形核酸酶的形成用于催化鲁米诺产生化学发光信号，从而实现尿嘧啶糖基化酶的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

一种检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器，包括以下原料：SA链、UP探针、BS链、1×Cutsmart缓冲液、内切酶 IV、标记好G-HP 及linker链的球形核酸SNA、尿嘧啶糖基化酶UDG、血红素、鲁米诺、过氧化氢；

所述的UP碱基系列如SEQ No.1所示；所述的UP序列中5’端第十四个与第十五个碱基中间为尿嘧啶碱基U；

所述的SA碱基系列如SEQ No.2所示； 所述的BS碱基系列如SEQ No.3所示； 所述的linker碱基系列如SEQ No.4所示； 所述的G-HP碱基系列如SEQ No.5所示；所述的G-HP序列中5’端第十八个碱基为四氢呋喃脱碱基位点。

所述的标记好G-HP 及linker链的球形核酸为V_G-HP:Vlinker=20:1与纳米金混合物中加入PB缓冲液、 PBS缓冲液，最终溶液中NaCl的浓度为0.3 M。

上述的化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）纳米金的制备；

（2）标记好G-HP 及linker链球形核酸SNA的制备；

（3）化学发光反应；

所述的步骤（1）中的纳米金采用柠檬酸钠还原氯金酸工艺制备，纳米金尺寸为20nm，摩尔消光系数为0.878×109 M^-1·cm^-1。

所述的步骤（2）的标记好G-HP 及linker链球形核酸SNA的制备方法，包括以下步骤：

S1调整纳米金溶液浓度为5nM；

S2将G-HP 及linker链按照V_G-HP:Vlinker=20:1加入到步骤S1的纳米金溶液中，加入PB缓冲液，分批加入 PBS，调整溶液中NaCl的浓度为0.3 M；

S3离心去掉未被标记上的DNA链；

S4将离心后的沉淀物重新溶解超纯水里，置于4℃备用。

所述的步骤（3）的过程为：

J1将SA链、UP探针、 BS链加入到1×Cutsmart缓冲液中形成三通路体系；

J2将内切酶 IV、标记好G-HP 及linker链的球形核酸、尿嘧啶糖基化酶UDG加入到J1三通路体系中；

J3向J2中加入血红素、鲁米诺，形成G-四联体球形核酸酶；

J4向J3中加入过氧化氢立即用于化学发光信号的检测，化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

该发明的检测方式是通过化学发光信号的产生来进行尿嘧啶糖基化酶的检测，尿嘧啶糖基化酶会对U碱基的特异性识别和切除，在内切酶IV的辅助下，使得三通路结构发生变化，通过三通路结构的变化暴露出toehold端引发链置换反应，加入球形核酸后，在内切酶IV的作用下进行DNA walker反应，最终纳米金表面只包含可形成G-四联体的DNA序列（G4-SNA），再加入K⁺和血红素的条件下，可最终形成球形核酸酶（G4-SNAzyme）。该球形核酸酶可在双氧水存在的条件下催化鲁米诺发生化学发光反应。

该传感器具有高效、高灵敏性、高特异性的优点，并且仅需借助内切酶IV这一种酶，可以弥补尿嘧啶糖基化酶现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、本发明利用尿嘧啶糖基化酶对U碱基的特异性识别和切除，在内切酶IV的辅助下可将含有U碱基的DNA链切断，从而引发后续的反应，具有高特异性的特点；

2、本发明借助三通路结构，可实现DNA链的有序组装，借助toehold介导的链置换反应可巧妙地进行DNA链的迁移，加快DNA链迁移的速率；

3、本发明借助DNA walker纳米技术，可显著提高反应的效率并且能显著扩大信号，提高监测的灵敏度；

4、本发明利用球形核酸酶，可实现将G-四联体DNA酶在纳米金表面的高度富集作用，从而实现信号的富集，可扩大信号，提高灵敏度；

5、本发明利用三通路驱动的链置换反应及DNA walker驱动的球形核酸酶的形成相比直接在纳米金表面标记G-四联体DNA链直接形成球形核酸酶而言可显著降低反应的背景信号，提高反应的信噪比；

6、该传感器的反应条件温和，反应速度迅速。

7、本发明的检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速、简单、灵敏的检测；

8、制备方法简单，性能稳定，适用于医疗卫生领域对于尿嘧啶糖基化酶的检测以及为后续肿瘤的治疗打下基础以及生物传感器产业化的实际应用；

9、制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1内切酶IV浓度优化检测结果图；

图3为实施例2血红素优化检测结果图；

图4为实施例3鲁米诺浓度优化检测结果图；

图5为实施例4过氧化氢浓度优化检测结果图；

图6为实施例5传感器检测的标准曲线；

图7为实施例5传感器检测的浓度线性关系曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）纳米金的制备；

（2）球形核酸的制备；

（3）均相中形成球形核酸酶用于催化鲁米诺的化学发光反应；

所述的制备方法中，纳米金的制备：

纳米金的制备是根据柠檬酸钠还原氯金酸的方法来实现的。将500μL的氯金酸（0.04g/mL）加入到200mL超纯水里进行搅拌加热至煮沸后加入3mL的柠檬酸钠（1%）快速加入到煮沸的溶液里。随后，可以观察到溶液颜色由浅黄色变成黑色最终变成酒红色。在变成酒红色后继续加热15min来确保反应的完全进行。之后，纳米金溶液冷却到室温后放到4℃备用。20nm的纳米金紫外吸收峰约在520nm，摩尔消光系数为 0.878×109 M^-1•cm^-1。

实施例1

球形核酸的制备：

首先，纳米金原液在13000r/min，4℃条件下离心20min，之后去掉上清将底部沉淀分散在超纯水中使其浓度为5nM。然后，将150μL 10μM的DNA链（V_G-HP:Vlinker=20:1）加入到纳米金混合物中，加完后放置24小时（4℃）。之后，在该混合物中加入50μL PB缓冲液（10mM PB，pH7.4）和27μL PBS（10mM PB，2M NaCl，pH7.4）。48小时（4℃）后，继续加入62μL的PBS，此时溶液中NaCl的浓度为0.3M。24小时后，将该混合物通过13000 r/min离心15min洗脱3次去掉未被标记上的DNA链。最后，将离心后的沉淀物重新溶解在100μL的超纯水里置于4℃备用。

至此已制备成球形核酸，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

在45μL的反应体系中，事先将3μL Swing arm（SA）链（1μM）、3μL UP探针（1μM）及3μL BS链（1μM）加入到1×Cutsmart缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将1μL内切酶 IV（Endo IV，0.25U/μL、0.5U/μL、0.75U/μL、1U/μL、1.25U/μL）和标记好G-HP 及linker链的球形核酸（SNA，7μL，1nM）及1μL尿嘧啶糖基化酶UDG加入到三通路体系中反应30min。完成DNA walker反应后，向体系中加入2μL血红素（1μM）、2μL鲁米诺（1mM），在37℃下反应30min使其形成G-四联体球形核酸酶，之后加入2μL过氧化氢（10mM）立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

经检测，如图2，检测到的化学信号强度随着内切酶IV浓度的增加，S/N值逐渐增加，在内切酶IV浓度为1U/μL时S/N值最大，之后保持不变，因此选择1 U/μL的内切酶IV用于后续的反应。

实施例2

球形核酸的制备：

首先，纳米金原液在13000r/min，4℃条件下离心20min，之后去掉上清将底部沉淀分散在超纯水中使其浓度为5nM。然后，将150μL 10μM的DNA链（V_G-HP:Vlinker=20:1）加入到纳米金混合物中，加完后放置24小时（4℃）。之后，在该混合物中加入50μL PB缓冲液（10 mM PB，pH7.4）和27μL PBS（10mM PB，2M NaCl，pH 7.4）。48小时（4℃）后，继续加入62μL的PBS，此时溶液中NaCl的浓度为0.3M。24小时后，将该混合物通过13000r/min离心15 min洗脱3次去掉未被标记上的DNA链。最后，将离心后的沉淀物重新溶解在100μL的超纯水里置于4℃备用。

至此已制备成球形核酸，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

在45μL的反应体系中，事先将3μL Swing arm（SA）链（1μM）、3μL UP探针（1μM）及3μL BS链（1μM）加入到1×Cutsmart缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将1μL内切酶IV（Endo IV，1U/μL）和标记好G-HP及linker链的球形核酸（SNA，7μL，1nM）及1μL尿嘧啶糖基化酶UDG加入到三通路体系中反应30 min。完成DNA walker反应后，向体系中加入2μL血红素（0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM）、2μL鲁米诺（1mM），在37℃下反应30min使其形成G-四联体球形核酸酶，之后加入过氧化氢（2μL，10mM）立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

经检测，如图3，检测到的化学发光信号强度随着血红素浓度的增加，阳性样品的化学发光信号显著增加，与此同时，血红素产生的背景信号也随之增加。 当血红素浓度为1μM时，产生的信噪比S/N值最大，因此选择1μM作为血

红素的最佳浓度。

实施案例3

球形核酸的制备：

首先，纳米金原液在13000r/min，4℃条件下离心20min，之后去掉上清将底部沉淀分散在超纯水中使其浓度为5nM。然后，将150μL 10μM的DNA链（V_G-HP:Vlinker=20:1）加入到纳米金混合物中，加完后放置24小时（4℃）。之后，在该混合物中加入50μL PB缓冲液（10mM PB，pH7.4）和27μL PBS（10mM PB，2M NaCl，pH7.4）。48小时（4℃）后，继续加入62μL的PBS，此时溶液中NaCl的浓度为0.3 M。24小时后，将该混合物通过13000r/min离心15min洗脱3次去掉未被标记上的DNA链。最后，将离心后的沉淀物重新溶解在100μL的超纯水里置于4℃备用。

至此已制备成球形核酸，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

在45μL的反应体系中，事先将3μL Swing arm（SA）链（1μM）、3μL UP探针（1μM）及3μL BS链（1μM）加入到1×Cutsmart缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将1μL内切酶 IV（Endo IV，1U/μL）和标记好G-HP 及linker链的球形核酸（SNA，7μL，1 nM）及1μL尿嘧啶糖基化酶UDG加入到三通路体系中反应30 min。完成DNA walker反应后，向体系中加入2μL血红素（1.0μM）、2μL鲁米诺（0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM、2mM、3mM），在37℃下反应30 min使其形成G-四联体球形核酸酶，之后加入过氧化氢（2μL，10 mM）立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

经检测，如图4，检测到的化学发光信号强度随着鲁米诺浓度的增加而逐渐增加，在浓度为1 mM时获得最大的信噪比，选择1mM的鲁米诺用于后续的反应。

实施例4

球形核酸的制备：

首先，纳米金原液在13000r/min，4℃条件下离心20 min，之后去掉上清将底部沉淀分散在超纯水中使其浓度为5nM。然后，将150μL 10μM的DNA链（V_G-HP:Vlinker=20:1）加入到纳米金混合物中，加完后放置24小时（4℃）。之后，在该混合物中加入50μL PB缓冲液（10mM PB，pH7.4）和27μL PBS（10mM PB，2M NaCl，pH7.4）。48小时（4℃）后，继续加入62μL的PBS，此时溶液中NaCl的浓度为0.3M。24小时后，将该混合物通过13000r/min离心15min洗脱3次去掉未被标记上的DNA链。最后，将离心后的沉淀物重新溶解在100μL的超纯水里置于4℃备用。

至此已制备成球形核酸，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

在45μL的反应体系中，事先将3μL Swing arm（SA）链（1μM）、3μL UP探针（1μM）及3μL BS链（1μM）加入到1×Cutsmart缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将1μL内切酶IV（Endo IV，1U/μL）和标记好G-HP 及linker链的球形核酸（SNA，7μL，1nM）及1μL尿嘧啶糖基化酶UDG加入到三通路体系中反应30min。完成DNA walker反应后，向体系中加入血红素（2μL，1.0μM）、鲁米诺（2μL，1mM），在37℃下反应30min使其形成G-四联体球形核酸酶，之后加入过氧化氢（2μL，2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM）立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

经检测，如图5，随着过氧化氢的浓度从2mM到20范围内逐渐升高，化学发光强度值也随之上升。可以看出，在过氧化氢浓度为10mM时该化学发光信噪比最大。因此，选择10mM的过氧化氢用于后续的反应。

实施例5

球形核酸的制备：

首先，纳米金原液在13000r/min，4℃条件下离心20min，之后去掉上清将底部沉淀分散在超纯水中使其浓度为5nM。然后，将150μL 10μM 的DNA链（V_G-HP:Vlinker=20:1）加入到纳米金混合物中，加完后放置24小时（4℃）。之后，在该混合物中加入50μL PB缓冲液（10mM PB，pH7.4）和27μL PBS（10mM PB，2M NaCl，pH7.4）。48小时（4℃）后，继续加入62μL的PBS，此时溶液中NaCl的浓度为0.3M。24小时后，将该混合物通过13000r/min离心15min洗脱3次去掉未被标记上的DNA链。最后，将离心后的沉淀物重新溶解在100μL的超纯水里置于4℃备用。

至此已制备成球形核酸，均相溶液中反应过程的主要步骤如下：

在45μL的反应体系中，事先将3μL Swing arm（SA）链（1μM）、3μL UP探针（1μM）及3μL BS链（1μM）加入到1×Cutsmart缓冲液中在37℃下反应半小时使其形成三通路结构，之后将1μL内切酶IV（Endo IV，1U/μL）和标记好G-HP 及linker链的球形核酸（SNA，7μL，1nM）及1μL尿嘧啶糖基化酶UDG（1×10^-3U/mL、5×10^-3U/mL、1×10^-2U/mL、5×10^-2U/mL、1×10^-1U/mL、5×10^-1U/mL、1×10⁰U/mL、5×10⁰U/mL、1×10¹U/mL）加入到三通路体系中反应30min。完成DNAwalker反应后，向体系中加入血红素（2μL，1.0μM）、鲁米诺（2μL，1mM），在37℃下反应30 min使其形成G-四联体球形核酸酶，之后加入过氧化氢（2μL，10mM）立即用于化学发光信号的检测。化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

经检测，如图6，随着尿嘧啶糖基化酶的浓度从1×10^-3U/mL到1×10¹U/mL范围内逐渐升高，化学发光强度值也随之上升。此外，如图7，尿嘧啶糖基化酶浓度的对数值与荧光强度成线性关系。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器及其制备方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

agtcagtatg caccgtgtta agcgtg 26

<210> 2

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

tctttcggcc gcgttcacga gtgcatccgc gcttgggttt tttttttttt tttttttttt 60

tttttttttt tttttttttt tttttttgct cgcccaagcg cgg 103

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

tttcacgctt cgcggccgaa agattt 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

tttttttttt caagcgcgga tgcac 25

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

tttttttttt gggtagggcg ggttggggag cttttcccta c 41

Claims (7)

1.一种检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器，其特征在于，包括以下原料：SA链、UP探针、BS链、1×Cutsmart缓冲液、内切酶 IV、标记好G-HP 及linker链的球形核酸SNA、尿嘧啶糖基化酶UDG、血红素、鲁米诺、过氧化氢；

所述的UP碱基系列如SEQ No.1所示；所述的UP序列中5’端第十四个与第十五个碱基中间为尿嘧啶碱基U；

所述的SA碱基系列如SEQ No.2所示；

所述的BS碱基系列如SEQ No.3所示；

所述的linker碱基系列如SEQ No.4所示；

所述的G-HP碱基系列如SEQ No.5所示；所述的G-HP序列中5’端第十八个碱基为四氢呋喃脱碱基位点。

2.根据权利要求1所述的检测尿嘧啶糖基化酶的化学发光生物传感器，其特征在于，所述的标记好G-HP 及linker链的球形核酸为V_G-HP:Vlinker=20:1与纳米金混合物中加入PB缓冲液、 PBS缓冲液，最终溶液中NaCl的浓度为0.3 M。

3.权利要求1所述的的化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）纳米金的制备；

（2）标记好G-HP 及linker链球形核酸SNA的制备；

（3）化学发光反应。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的纳米金采用柠檬酸钠还原氯金酸工艺制备，纳米金尺寸为20nm，摩尔消光系数为0.878×109 M^-1·cm^-1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的标记好G-HP 及linker链球形核酸SNA的制备方法，包括以下步骤：

S1调整纳米金溶液浓度为5nM；

S2将G-HP 及linker链按照V_G-HP:Vlinker=20:1加入到步骤S1的纳米金溶液中，加入PB缓冲液，分批加入 PBS，调整溶液中NaCl的浓度为0.3 M；

S3离心去掉未被标记上的DNA链；

S4将离心后的沉淀物重新溶解超纯水里，置于4℃备用。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）的过程为：

J1将SA链、UP探针、 BS链加入到1×Cutsmart缓冲液中形成三通路体系；

J2将内切酶 IV、标记好G-HP 及linker链的球形核酸、尿嘧啶糖基化酶UDG加入到J1三通路体系中；

J3向J2中加入血红素、鲁米诺，形成G-四联体球形核酸酶；

J4向J3中加入过氧化氢立即用于化学发光信号的检测，化学发光信号采集时间间隔是1.5s，化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。

7.权利要求1所述的化学发光生物传感器用于尿嘧啶糖基化酶的早期检测。