JP2016182123A

JP2016182123A - 核酸配列の同定

Info

Publication number: JP2016182123A
Application number: JP2016097555A
Authority: JP
Inventors: グラハム，ダンカン; Graham Duncan; フォールズ，カレン; Faulds Karen; スミス，イワン; Smith Ewen; リケッツ，アラステア; Ricketts Alastair
Original assignee: Renishaw Diagnostics Ltd
Current assignee: Renishaw Diagnostics Ltd
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-10-20
Also published as: ES2547052T3; EP2188394A1; EP2188394B1; WO2009022125A8; US20120058471A1; JP2015146808A; WO2009022125A1; CN101821411A; JP2010535528A

Abstract

【課題】標的核酸の検出に使用するための方法の提供。
【解決手段】（ｉ）標的核酸が存在する場合、前記標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と、（ｉｉｉ）ラマン分光法によって前記標識を検出する工程と、を含む方法。
【選択図】なし

Description

本発明は核酸配列の同定に関する。より具体的には、本発明は、標的核酸配列とプローブ核酸配列との間に形成された核酸二本鎖を分解することによって標的配列の同定を促進するためのエキソヌクレアーゼ酵素の使用に関し、その結果、標的または核酸二本鎖に結合／会合する場合、識別可能なシグナルがプローブの分解の際に生成され、そのシグナルはラマン分光法によって検出可能である。

現代の分子診断産業は、２００億£と評価されており、１年あたり１０％の割合で増加している。種々の異なる技術に頼っているが、このますます増加する市場は、増幅に基づく方法（主にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイ）によって占められている。この理由は、生物、および実際にヒトのゲノムが特に複雑であり、特定の疾患または診断検査についての目的の領域の単純化を必要とするからである。ゲノムの複雑さを減少させることに加えて、増幅に基づく方法はまた、検出に利用可能な物質の量を増加させる。これは、蛍光または化学発光などの慣例の技術の利用可能性および感度を考慮する場合に重要である。

ＰＣＲは、ＤＮＡ鎖の特定の領域（または遺伝子）を複製および増幅させるために使用される分子生物学的手法である。少量のＤＮＡは、酵母または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの生きた生物を用いずに、指数関数的に増幅することができ、適切に試験すべき十分なＤＮＡを得る。この手法は、感染疾患または遺伝病および病状の検出、遺伝子のクローニング、実父確定試験ならびに科学捜査における遺伝子指紋法などの種々の用途のために使用される。

ＰＣＲプロセスはサイクルで実施される。各サイクルは３工程、すなわち変性、アニーリングおよび伸長からなる。

変性工程において、増幅対象の標的領域または目的の遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡの鋳型を、二本鎖間の水素結合を切断するために加熱する。これにより、それらが分離し、プライマー（増幅対象のＤＮＡの領域の最初および最後に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの短い断片）がアクセス可能となる。

アニーリング工程において、温度を低下し、プライマーが、増幅対象の領域に隣接する標的ＤＮＡの相補配列にハイブリダイズすることを可能にする。大過剰のプライマーがしばしば使用されるため、標的鎖は互いに対向するものとしてプライマーに結合する。

伸長工程において、ＤＮＡポリメラーゼ（目的のＤＮＡ領域の新しいコピーを合成する酵素）は、各プライマーで開始するＤＮＡ鎖をコピーし、５’から３’方向に新しい鎖を伸長する。これにより、次のサイクルのための鋳型を作り出す二本鎖ＤＮＡの２つのコピーが生じる。このように、２倍の量のＤＮＡが各々の新しいサイクルにおいて複製される。２回目のサイクルは、二本鎖標的ＤＮＡ配列の４つのコピーを生成する。３回目のサイクルの後、二本鎖標的ＤＮＡ配列の８つのコピーが存在し、そのうちの２つは単に標的領域からなる。他のコピーはまた、隣接するＤＮＡ領域を含む。典型的に、約２０〜３５サイクルが行われる。

リアルタイムＰＣＲともいわれる定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）は、ＰＣＲの変法である。この技術は一般に、試料内のＤＮＡの特定配列を検出するために使用される。特定配列が存在する場合、ＱＰＣＲは、リアルタイムにおいてＰＣＲ産物の量を迅速に測定できる。従って、これは、存在する出発物質の量を間接的に測定するために使用され得る。ほとんどのＱＰＣＲ法は、ＰＣＲ産物が増幅の各サイクルで蓄積するにつれて増加する蛍光レポーター分子を使用する。

かかる技術の１つはＳＹＢＲＧｒｅｅｎ法である。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ色素は、新規の合成された二本鎖ＤＮＡに結合でき、結果として生じる蛍光強度の増加を測定できる。これにより、その後に最初のＤＮＡ濃度が決定できる。

配列特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブまたは分子ビーコン）もまた一般に、ＱＰＣＲに使用される。ＴａｑＭａｎプローブは、特定のＤＮＡ配列、通常、所望のＰＣＲ産物の断片にハイブリダイズするように設計される。このプローブは、蛍光を発するレポーター色素を含む。このプローブはまた、レポーター色素によって発せられる蛍光を吸収するクエンチャーを含む。レポーター色素に対するクエンチャーの接近は、後の蛍光を阻止する。ＰＣＲサイクルの伸長段階の間、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、別の断片に入り込むプローブを「上書き（ｏｖｅｒｗｒｉｔｅ）」することを可能にする。その際に、クエンチャー分子は、レポーター色素から分離し、蛍光が増加する。

分子ビーコンは、ＴａｑＭａｎプローブと同様の方法で作用する。分子ビーコンは、典型的に、フルオロフォア／クエンチャー対も含むヘアピン型プローブであり、ＤＮＡの特定配列を検出するように設計される。再び、クエンチャーの接近は、フルオロフォアの蛍光を阻止する。しかしながら、プローブが相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、そのプローブは直線状になり、発光のためにフルオロフォアとクエンチャーとの間に十分な距離を導く。それにもかかわらず、蛍光検出は感度に関連し、比較的大きな蛍光シグナルが、走査するための首尾よい検出のために、バックグラウンドに対して必要とされ得る。

放射性標識プローブも、ＤＮＡを検出するために使用されている。それらの使用は、非常に高感度な手法を可能にするのに有利であったが、放射性標識したプローブの安全な取り扱い及び処分の困難性の理由で不利であった。さらに、かかる手法は、連続（均質といわれることもある）アッセイを可能にしなかった。なぜなら、未反応の基質の分離が、任意の定量測定を行う前に必要とされたからである。従って、かかる手法は、分子ビーコンおよびＴａｑＭａｎプローブに関与するものなどの現代の手法ほど頻繁に使用されていない。

Ｓ．Ｃ．Ｈｉｌｌｉｅｒら（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６，１２２７−１２３２，２００４）は、オリゴヌクレオチド配列を標的とする相補的プローブに対するＴ７エキソヌクレアーゼ活性を利用する電気化学的遺伝子検出アッセイを報告し、この方法は、５’−フェロセン標識されたプローブを用いて、特定のＤＮＡ配列を検出するために記載されている。このプローブは標的領域にハイブリダイズし、次いで二本鎖ＤＮＡに対して５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を示すＴ７エキソヌクレアーゼは、フェロセンを遊離するプローブの５’末端において末端ヌクレオチドを切断する。遊離したフェロセンは、電極でフェロセン酸化電流の増加を生じる電極表面に移動する。しかしながら、このアッセイは、いかなる均一な態様も有さない。なぜなら、いくらかの組み込まれていないか、またはハイブリダイズしていないプローブは、それらが他にバックグラウンドシグナルを与えるため、検出前に分離する必要があるからである。

米国特許第５，８５３，９９０号（Ｗｉｎｇｅｒら）は、ＲＮＡプローブを用いることによるヌクレオチド配列の決定を記載している。ＲＮＡプローブは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、そのＲＮＡプローブは、それが、ＴａｑＭａｎアッセイにおいて使用されるものと同様の標識を含むように修飾されている。次いで、酵素ＲＮａｓｅＨは、クエンチャーから標識を放出するようにキメラのＲＮＡ鎖を選択的に分解するために使用される。

本発明は、二本鎖（すなわち、二重らせん）核酸を消化する特定のエキソヌクレアーゼの能力の認識に基づく。かかるプロセシング能力は、提供されるシステムを可能にし、それによって、シグナル伝達分子は、ラマン分光法および特にＳＥ（Ｒ）ＲＳによって検出される核酸二本鎖およびシグナル伝達分子／標識の消化の際に放出され得る。

従って、第１の態様によれば、本発明は、標的核酸の検出に使用するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）標的核酸が存在する場合、プローブ核酸の前記標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションによって前記プローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）任意のプローブ／標的核酸二本鎖をエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化および前記二本鎖から標識分子の放出を生じる工程と、
（ｉｉｉ）ラマン分光法によって前記標識を検出する工程と、
を含む方法を提供する。

好ましくは、エキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド合成能、またはポリメラーゼの能力を有さない。つまり、エキソヌクレアーゼとの接触は、オリゴヌクレオチドの分解のみを生じ、オリゴヌクレオチドの構築を生じない。

標的核酸は、流体、液体、空気、固体表面からの標本などであり得る対象試料から得られる。

さらなる態様によれば、本発明は、
（ｉ）一本鎖プローブ核酸と、
（ｉｉ）二本鎖核酸を消化できるエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉｉ）ラマン検出可能な標識と、
を含む部材キットを提供する。

本発明の一実施形態において、プローブ核酸は標識で標識化される。別の実施形態において、標識は、二本鎖核酸に結合できる。標識は、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）または表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）手法などの方法を用いて、ラマン分光法によって検出され得るようなものである。適切な標識は、後述で参照する先行技術に開示されており、「ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識」と称し、この用語は、ＳＥＲＳおよび／またはＳＥＲＲＳによって検出され得る標識をいう。

ＰＣＲなどの先行技術と対照的に、本発明の特定の利点は、標的核酸の増幅が必ずしも行われなくてもよいことである。なぜなら、特にＳＥ（Ｒ）ＲＳでの検出可能なシグナルは、少量の標的ヌクレオチドで十分な感度を提供するからである。

検出様式としてのＳＥ（Ｒ）ＲＳの使用は、例えば、ＷＯ９７／０５２８０号、ＷＯ９９／６０１５７号およびＷＯ２００５／０１９８１２号ならびに多くの研究論文、特にＤｕｎｃａｎＧｒａｈａｍによって（共）著されるもの（例えば、ＳＥＲＲＳＤｙｅｓ．Ｐａｒｔ２．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｙｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｌａｂｅｌｌｉｎｇｆｏｒＳＥＲＲＳ（ＭｃＨｕｇｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ｆ．Ｔ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００４，１２９，１，６９−７２）；およびＢｉｏｓｅｎｓｉｎｇＵｓｉｎｇＳｉｌｖｅｒＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅＥｎｈａｎｃｅｄＲｅｓｏｎａｎｃｅＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ｇｒａｈａｍ，Ｄ，Ｆａｕｌｄｓ，Ｋ，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．，ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６，４２，４３６３−４３７１）を参照のこと）に開示されている。

ＷＯ９７／０５２８０号、ＷＯ９９／６０１５７号およびＷＯ２００５／０１９８１２号において、特定核酸配列を検出または同定するための方法におけるＳＥ（Ｒ）ＲＳの使用が記載されている。これらの公報において、検出は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳでの標的核酸の結合の直接的作用の測定に基づく。対照的に、本発明が、核酸二本鎖の消化による標識の検出可能な放出によって標的配列の検出を可能にし、その放出が標的配列に結合しているプローブの指標であることは理解されるべきである。

エキソヌクレアーゼが、ハイブリダイズしたプローブ／標的二本鎖からラマン／ＳＥ（Ｒ）ＲＳの検出可能な標識を放出するために使用される、核酸配列の同定とラマンまたはＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出との組み合わせは、本発明者らの知る限り、これまでに報告されておらず、本発明のさらなる態様を示す。この態様によれば、本発明は、標的核酸の検出に使用するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象試料に存在する場合、一本鎖プローブ核酸の標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させ、それによって、プローブ／標的核酸二本鎖を生成する工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じる工程と、
を含み、ここで標識分子はＳＥ（Ｒ）ＲＳによって検出される、上記方法を提供する。

さらに別の態様によれば、本発明は、対象試料中の複数の異なる標的核酸を同時に検出するための方法であって、異なる標識を前記標的核酸の各々を検出するために使用する、標的核酸の検出に使用するための本発明に係る方法の複数を含む方法を提供する。

さらなる態様によれば、本発明は、
（ｉ）プローブ核酸と、
（ｉｉ）二本鎖核酸を消化できるエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉｉ）ＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出可能な標識と、
を含む部材キットを提供する。

特定の実施形態において、そのキットにおけるプローブ核酸は、５’リン酸基を有する一本鎖プローブ核酸であり、エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである。

標的の複製の非存在下において、場合により、少量の標的核酸を検出する能力は、特に本発明の利点であり、本発明のなおさらなる態様を示す。

この態様によれば、本発明は、標的核酸の検出に使用するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）存在する場合、一本鎖プローブ核酸の標的核酸への特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じる工程と、
を含み、工程（ｉ）において、過剰の前記プローブ核酸を対象試料と接触させ、その結果、工程（ｉｉ）における二本鎖の消化は、１回以上、標的核酸を再利用し、それによって、さらなるプローブ分子が、標的に特異的にハイブリダイズでき、さらなる標識分子を放出するために消化されるさらなるプローブ／標的核酸二本鎖を形成する、上記方法を提供する。

また別の態様によれば、本発明は、一本鎖プローブ核酸が特異的にハイブリダイズする鋳型としての標的核酸の使用を提供し、得られるプローブ／標的核酸二本鎖は二本鎖から標識分子を放出するためにエキソヌクレアーゼによって分解され、前記標的核酸は、複数の二本鎖から複数の標識分子を放出するように、複数回、前記鋳型として使用され、前記複数の二本鎖の各々は、同じ標的核酸からなる。

図１（ａ）は、ＳＥＲＲＳ検出を利用する本発明の実施形態を概略的に示す。最初に、増幅していないゲノムＤＮＡを含む試料を採取し、ＤＮＡ一本鎖にするために加熱する。次いで、ＤＮＡの標的配列に特異的に結合するプローブを加える。このプローブは、使用される検出ストラテジーに依存して特異的に設計されている。それは、例えば、発生するλエキソヌクレアーゼ酵素の作用を可能にするための５’リン酸基を有してもよい。ＳＥＲＲＳ検出の場合において、そのプローブは、例えば、プローブに付着するが、ＳＥＲＲＳシグナルを与えない３’ヒドロキシキノリン色素を含んでもよい。しかしながら、酵素の作用およびプローブの消化の際に、色素は溶液に放出されて、ＳＥＲＲＳシグナルが銀ナノ粒子などの適切な基質の添加で得られる。図２は本発明の別の実施形態を示し、ここで、検出プローブは、その表面にプローブ配列が付着された金属ナノ粒子である。それらは、ナノ粒子が静電反発力に起因して凝集するのを防ぐ。プローブ配列は、異なる方法で、特にＳＥＲＲＳ検出および視覚的検出を促進するために修飾されてもよい。システム（ａ）は、３’末端で表面に付着されたプローブを使用し、これは、５’末端でリン酸基により修飾されている。標的配列へのハイブリダイゼーション、およびその後のエキソヌクレアーゼによる消化の際に、ＤＮＡは分解し、粒子の凝集を生じ、それが表面プラズモンのシフトとして、および必要に応じて特有の色の変化として観測され得る。システム（ｂ）において、ＳＥＲＲＳ活性色素は、ナノ粒子の表面で間隔があいているが、しかし、シグナルは、標的に対するハイブリダイゼーション後まで観測されず、酵素による消化および結果として生じる凝集が起こる。凝集が起こった後、ＳＥＲＲＳシグナルが得られる。システム（ｃ）において、使用されるプローブは、図１に使用されるものと同じプローブである。ナノ粒子がハイブリダイズする場合、ハイブリダイゼーションおよび消化の際に、ＳＥＲＲＳ色素は放出され、表面に付着されて、ＳＥＲＲＳシグナルを与える。図３は、本発明に係るアッセイの概略的なフローチャートであり、標的核酸に結合した場合、オリゴヌクレオチドプローブを消化するためにλエキソヌクレアーゼを利用し、未消化のプローブは除去される。図４は、一本鎖が５’リン酸部分を有する二本鎖ＤＮＡが、λエキソヌクレアーゼに曝露される場合の経時的な蛍光の増加、およびλエキソヌクレアーゼの非存在下において実施される同様の実験との比較を示す。図５は、一本鎖が５’リン酸部分を有する二本鎖ＤＮＡが、２つの異なる量のλエキソヌクレアーゼに曝露される場合の経時的な蛍光の増加、およびλエキソヌクレアーゼの非存在下において実施される同様の実験との比較を示す。図６は、λエキソヌクレアーゼに曝露された同じ二本鎖ＤＮＡ上でλエキソヌクレアーゼによってプロセシングする際の蛍光の増加を示し、その結果は図１および図２に示され、基質は５’陥凹（ｒｅｃｅｓｓ）；平滑５’末端および３’尾部；５’ 陥凹および３’尾部を有する修飾されたＤＮＡであり、そして非修飾のＤＮＡとの比較はλエキソヌクレアーゼの非存在下である。図７は、相補配列の存在／非存在下での酵素消化およびその後の精製段階の後のアッセイ反応のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。図８は、λエキソヌクレアーゼ酵素によって消化された後の相補標的配列の存在／非存在下でのＴＡＭＲＡ標識プローブ（ＰＴＢＰＲＯＢＥ）の１６５０ｃｍ^−１での平均主ピーク高さのＳＥＲＲＳ強度を示す。酵素を含まないことを除いて同様の条件下で実施したコントロール反応を比較のために示す。引用した値は、反応の各種類に関して３つの別の複製について実施した３つの測定値の平均である。図９は、消化、不活性化およびビオチン除去工程後のアッセイ反応（点線）と、酵素の非存在下で実施した同様の反応（直線）のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。図１０は、ＦＲＥＴに基づくアッセイの概略図を示す。図１１は、低い標的濃度触媒研究において使用するアッセイ形式を示す。色素標識プローブを８点の星として、副溝結合剤をクロス（×）として、標的を太線として示す。ＦＡＭ標識プローブと相補標的配列との異なる比（１：１；１０：１；１００：１）を、λエキソヌクレアーゼ酵素の存在下で消化した。ＦＡＭ標識プローブおよびＨ３３２５８の濃度を１μＭで一定に維持し、相補配列の濃度を減少させた。反応混合物を、３０分間、３７℃まで加熱し、続いて、酵素不活性化工程で１５分間、７５℃に加熱した。蛍光のレベルは、検出器のもの以下であったため、過剰の標的を、二本鎖形成を試みるために加え、それによって、検知できる量のプローブが未消化のままであった場合、融解曲線を生成した。図１２は、λエキソヌクレアーゼの存在（下の曲線）／非存在（上の曲線）下でのＦＲＥＴ二本鎖の３０分にわたる蛍光強度の変化を示す。蛍光強度の減少により、消化によるＦＲＥＴ系の破壊が示される。標識プローブ：相補体の比（１：１）。図１３は、初期の過剰のプローブを標的配列に対して１００：１で含む試料についての蛍光アニーリング曲線を示す。両方の試料に過剰の標的を添加した。下のトレースは酵素を加えた試料を示し、蛍光強度の主要な変化がないことを示す。上のトレースは酵素を欠き、従って、鋭い蛍光遷移約５８Ｃを示し、これは、この配列についての二本鎖のＴｍと相関する。図１４は、Ｈ３３２５８およびλエキソの存在下でのコントロール一本鎖ＦＡＭプローブ（下の実線）；Ｈ３３２５８を含む二本鎖ＤＮＡ（ハイブリダイズしたＦＡＭプローブ）（上の実線）；Ｈ３３２５８およびλエキソを含む二本鎖ＤＮＡ（点線）の蛍光を示し、３０分内の消化の進行を示す。図１５は、未消化（実線）および消化（点線）ＤＮＡについてのアニーリング曲線を示す。未消化の試料はＴＭ約５７℃を示す。図１６は、ＦＡＭプローブについての異なる相補体を用いるλエキソでの消化の３０分後の強度の変化を示す。全ての対に関して、左側のバーは、酵素を含まない試料の蛍光の変化を示し、右側は、酵素を含む試料を示す（５’オーバーハングは１回の測定値のみであることを除いて３回の測定値の平均を示す）。図１７は本発明の実施形態の概略図を示し、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識およびビオチンを含む一本鎖プローブ核酸が使用され、未反応または過剰のプローブが、ストレプトアビジンコーティング磁石を用いて除去され、エキソヌクレアーゼによる分解の前に、プローブ／標的二本鎖に存在したＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識のみの検出を可能にする。図１８は、本発明の実施例による標的核酸（Ｃ．トラコマチスＤＮＡ）（レーン２〜９）対陰性コントロール（レーン１２〜１９）の検出を示すアガロースＴＢＥゲルを示す。図１９は、陰性コントロール、および種々のプローブ濃度でのＣ．トラコマチスＤＮＡのＳＥＲＲＳ分析の結果を示す。図２０は、試料を含むＣ．トラコマチスＤＮＡ対陰性コントロールのＳＥＲＲＳスペクトルを示す。図２１は、アッセイプロトコルを概略的に示し、標的核酸は、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに結合したビオチン化捕捉プローブ、次いで、ＳＥＲＲＳ活性色素で標識された５’リン酸末端化プローブと連続して接触させ、得られる二本鎖をλエキソヌクレアーゼによって消化し、ＳＥＲＲＳを用いて色素の検出を可能にする。図２２は、図２１に示したアッセイのＳＥＲＲＳ反応（上のスペクトル）と、色素標識されていないプローブを使用した陰性コントロールでのＳＥＲＲＳ反応（下のスペクトル）を示す。図２３は、８−ヒドロキシキノリン誘導色素のＳＥＲＲＳスペクトルを示す。図２４は、２つのプローブ核酸および標的核酸のハイブリダイゼーションの際に形成されたプローブ／標的核酸二本鎖からの標識の放出を含む本発明の方法を示す。図２５は、図２４に示される実施形態の変形を示し、標的ＤＮＡは、ビーズまたはプレートなどの固体表面に固定された捕捉プローブによって捕捉される。

本明細書において、用語「標的」、「試料」または「対象試料」とは、任意の核酸を含む試料、例えば、個体（複数も含む）から単離される核酸を含む試料をいう。「標的核酸」は、ＤＮＡ（任意の供与源、例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、合成など由来）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、合成など）、またはそれらの誘導体（例えば、当該分野において公知である稀少／異常天然由来ヌクレオチド塩基および／または合成ヌクレオチド塩基の含有物）を含む任意の核酸であってよい。試料は、所定の供与源に存在する核酸の全てまたは一部のみを表してもよい。試料は、その試料内の標的核酸を試験プロセスに十分に利用可能とするために、試験する前に調製してもよい。例えば、標的核酸は、完全もしくは部分的に精製されてもよく、および／または断片が生成され、分離されてもよい。試料中の核酸を直接用いることの代替として、またはそれに加えて、コピーを、（例えば、ＰＣＲによって）調製して、使用してもよい。用語「標的核酸」は、これらの可能性の全てを含む。

本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、２−デオキシ−Ｄ−リボースまたはＤ−リボースを含むヌクレオチド、および当該分野において公知のＰＮＡまたはＬＮＡ分子に基づいたポリマーまたはオリゴマーに使用される。従って、これらの用語は、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡならびにｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡを含む。この用語はまた、前述のキメラ混合物の可能性を含み、かかる混合物の例は、ＤＮＡおよびＰＮＡまたはＬＮＡの両方を含む一本鎖オリゴヌクレオチド構築物である。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」との間に意図される差異はなく、これらの用語は交換可能に使用される。

標的核酸は任意の既存または天然の配列から単離された種である必要はないが、調べることが望ましい試料に存在するか、またはその試料内の任意の長さの任意の配列であってもよい。従って、それは、ゲノム、またはサブゲノム核酸、染色体、染色体外ベクター、または遺伝子、またはモチーフ、または非コード配列、または配列タグ付加部位、または発現された配列タグに見られる任意の配列でありうる。この配列は、例えば、公開された物質またはデータベース上のものに従って作製された任意の供与源由来であってもよい。

用語「特異的ハイブリダイゼーション」は、標的の核酸配列と実質的に相補的であるプローブ核酸配列をいうと意図される。これは、一方の配列の５’末端がもう一方の３’末端と対になるように配列された場合に、配列間で少なくとも９５％、典型的に少なくとも９７％、より典型的に少なくとも９８％、最も典型的に少なくとも９９％の同一性（すなわち、ワトソン−クリック塩基対）が存在するオリゴヌクレオチドを指す。一般に、天然の核酸に見られない修飾された塩基類似体が、その核酸に（酵素的または合成的に）組み込まれてもよい。当該分野において公知のように、２つの核酸鎖の相補性は完全でなくてもよい。一部の安定な二本鎖は、ミスマッチした塩基対またはマッチしない塩基を含んでもよく、核酸技術の分野における当業者は、オリゴヌクレオチドの長さならびにオリゴヌクレオチドにおけるシトシンおよびグアニン塩基の濃度および種類以外の多くの変数を考慮することによって仮にそれらの安定性を決定できる。これに関して、任意の所定の場合に使用される溶液のストリンジェンシーは、関連する例の要件に従って変更されてもよいことが理解され、適切なストリンジェンシーの選択は当業者の能力の範囲内である。

当業者は、温度および／または塩濃度の適切なコントロールが、例えば、特定の標的に対する所望の程度の特異性のプローブ配列のみが、その標的にハイブリダイズしたままであり、非特異的プローブは、その標的にハイブリダイズしないことを確実にできることを把握している。当業者は、これが特異的ハイブリダイゼーションに関連することを理解する。

当該分野において公知であるように、塩濃度および／または温度のパラメータは、プローブと標的核酸との間の所望の同一性を達成するように変更してもよい。かかる条件に関する指針は当業者に容易には利用可能であり、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，７．９頁〜７．１２頁（２００１）に見出すことができる。

核酸二本鎖の安定性は、融解温度または解離温度、すなわち「Ｔｍ」によって測定される。特定の反応条件下での特定の核酸二本鎖のＴｍは、塩基対の半分が二本鎖構造に存在し、半分が一本鎖ＤＮＡに存在する温度である。

Ｔｍを決定する主な支配要因は、配列の長さおよびＧ−Ｃ含量である。Ｔｍを決定するための理論的および実験的手順は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＪＳａｍｂｒｏｏｋら，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，第ＩＩ章，セクション４６および５５に開示されている。本質的に、１８ヌクレオチドより短いオリゴヌクレオチドに関して、ハイブリッドのＴｍは、そのハイブリッドにおけるＡ＋Ｔ残基の数に２℃を掛け、Ｇ＋Ｃ残基の数に４℃を掛け、２つを合計することによって評価される。長さが約１４〜７０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに関して、長いＤＮＡ分子のＴＭを決定するためのＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ，（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．４８：１３９０，１９６２）によって考案された以下の式もまた適用可能である：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎは鎖長、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液のイオン強度である）。

Ｔｍを計算するための他の式は当業者に公知である。

上記のように、当業者は、正確なＴｍが、反応温度、塩濃度、ホルムアミドなどの変性剤の存在、およびオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせようとする配列との相補性の程度などの多くの要因に依存することを理解している。

オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションで、最適なハイブリダイゼーション温度は一般に、Ｔｍより２〜１０℃低い条件下で実施される。理想的には、特に、捕捉オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ可能な長さが短く、ハイブリダイズ可能な配列の末端の一方または他方で単一のヌクレオチドのみ異なり得る２つの配列間を識別する必要性が存在する場合、ハイブリダイゼーション温度は正確に、好ましくは±２℃、より好ましくは±０．５℃またはそれより良好にコントロールされる。

ハイブリダイゼーション条件の選択は、プローブと標的核酸との間に形成された二本鎖のＴｍ計算値に可能な限り近接して設計される。使用されるハイブリダイゼーション溶液中の塩の濃度は特に重要である。１ＭＮａＣｌにおいて、Ｇ：Ｃ塩基対が、Ａ：Ｔ塩基対より安定である。同様に、より高いＧ−Ｃ含量を有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、同じ長さであるがより高いＡ−Ｔ含量を有さないものより高いＴｍを有する。わずかに異なる場合、すなわち、標的核酸の中で単一のヌクレオチドの相違と識別する必要性がある場合、最適ハイブリダイゼーション条件を確立することは、特に、オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ可能な長さが短い場合（約３０量体未満）、重要である。ここで、標的ヌクレオチドに加えて、対象試料中のヌクレオチドの種々の組成のため、広範囲のＴｍが存在する。このため、条件は、カオトロピックハイブリダイゼーション溶液を用いることによって、ヌクレオチド組成に対するＴｍの依存性を減少させるように操作してもよい。これは、例えば、第三級または第四級アミドのハイブリダイゼーション溶液への組み込みによって行ってもよい。

本明細書に使用する場合、プローブ核酸または「プローブ」は、標的核酸中の実質的に相補的な配列と二本鎖構造を形成するように設計される核酸配列を含む。従って、プローブ核酸が、例えば、一本鎖または二本鎖標的核酸と二本鎖を形成してもよいことは理解される。後者を用いて、得られる三重鎖構造は、標的核酸の一方の鎖と一本鎖プローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖を含む。当業者は、より高次の二本鎖を含むオリゴヌクレオチド構築物が、例えば、可能な四重構造であることを理解する。

特定の実施形態において、標識は、「プローブ」核酸の１つ以上のヌクレオチド塩基に直接的に、付着、結合または会合される。会合することにより、一部分を形成する元のプローブ核酸にもはや付着されせず、個々のヌクレオチド、またはその一部分が検出可能である実施形態を含むことが理解される。

ラマン／ＳＥ（Ｒ）ＲＳによって検出するための適切な標識は、例えば、ＷＯ９７／０５２８０号、ＷＯ９９／６０１５７号およびＷＯ２００５／０１９８１２号に記載されている。他の適切な標識としては、ＳＥＲＲＳＤｙｅｓ．Ｐａｒｔ２．ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｄｙｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｌａｂｅｌｌｉｎｇｆｏｒＳＥＲＲＳ（ＭｃＨｕｇｈ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｏｃｈｅｒｔｙ，Ｆ．Ｔ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．Ａｎａｌｙｓｔ，２００４，１２９，１，６９−７２）；およびＢｉｏｓｅｎｓｉｎｇＵｓｉｎｇＳｉｌｖｅｒＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅＥｎｈａｎｃｅｄＲｅｓｏｎａｎｃｅＲａｍａｎＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ｇｒａｈａｍ，Ｄ，Ｆａｕｌｄｓ，Ｋ，Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６，４２，４３６３−４３７１）に開示される色素が挙げられる。標識が特定の共鳴周波数を有することも可能であり、その周波数は、多くの標識が近接した場合に変化し得る。

蛍光標識は一般に、種々の検出システムにおいて使用され、種々の蛍光標識は当業者に公知である。本発明はまた、より詳細に以下に記載するように、ＦＲＥＴの技術および／または蛍光シグナルのクエンチングを利用してもよい。

従って、用語「標識」とは、検出可能シグナル、好ましくは定量可能シグナル、好ましくはリアルタイムのシグナルを与えるために使用され得る任意の原子または分子をいう。検出可能な標識は、核酸プローブに付着するか、または核酸プローブの本質的な部分であるか、あるいは、プローブ核酸と標的核酸との間に形成される二本鎖に結合されてもよい。かかる標識は、二本鎖の副溝または主溝に結合してもよいか、あるいは二本鎖核酸内に挿入してもよい。しかしながら、この種類の標識は、二本鎖がプローブと標的核酸との間に形成されない限り、標的核酸に結合できるはずはないことが理解される。多くのかかる標識は公知であり、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｇ．ＴｏｌｕｎおよびＳ．Ｍｙｅｒｓ（Ａｒｅａｌ−ｔｉｍｅＤＮａｓｅａｓｓａｙ（ＲｅＤＡ）ｂａｓｅｄｏｎＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００３，３１：ｅ１１１））を含む。

本明細書に使用する場合、「リアルタイム」とは、シグナルの生成速度の検出をいい、一定の期間にわたってシグナルを特徴付けるために、複数の読み取りを行うことを含む。例えば、リアルタイム測定は、検出可能な生成物の増加の速度の決定を含み得る。あるいは、リアルタイム測定は、標的配列が検出可能なレベルに増幅される前に必要とされる時間の決定を含んでもよい。

一部の実施形態において、プローブ／標的核酸二本鎖に導入／会合されている標識のみの検出を可能にするために、反応物からハイブリダイズしていないプローブを除去する必要があり得る。これを達成する１つの方法は、プローブ核酸上に／プローブ核酸に対して（本明細書で捕捉可能部分ともいわれる）捕捉部分を組み込むことである（例として磁性部分および／またはビオチンが挙げられる）。プローブ核酸が標的に結合しない場合、そのプローブはエキソヌクレアーゼによって消化されず、未消化のプローブは、磁性部分の場合、磁性ビーズなどの磁石によって、またはビオチンの場合、ストレプトアビジンでコーティングされた物質を用いて除去し得る。しかしながら、プローブがプローブ／標的二本鎖を形成する場合、捕捉部分は二本鎖消化の際にプローブから放出されるが、標識は依然として検出可能である。

従って、例えば、ラマン分光法（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）およびビオチンによって検出可能な標識で、例えば、３’末端において、プローブを二重標識することによって、未消化のプローブ（例えば、標的核酸が存在しなかったため）または過剰なプローブは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズの使用によって除去してもよく、これは、シグナルが標的核酸が存在する場合のみ検出されることを意味する。

これは、（例としてＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出およびビオチン／ストレプトアビジン捕捉を用いて）図１７に概略的に示される。

この方法は、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブの使用と類似していると理解され得る。Ｔａｑ−Ｍａｎプローブを用いると、シグナルはクエンチャーの使用により抑制され、これは、ＰＣＲの増幅の間にレポーター色素から分離された後に、もはやレポーター色素の蛍光を抑制せず、蛍光は検出可能である。しかしながら、本発明において、クエンチャーの使用の必要性をなくすことがでる。なぜなら、過剰またはハイブリダイズしていないプローブの結果として他に生じるシグナルは、プローブに付着されているビオチンなどの捕捉可能な部分およびラマンにより検出可能な色素の使用によって除去され得るからである。有利には、検出様式の感度が可能な（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを用いる場合）最小のプローブを、使用することができる。

本発明のまた別の実施形態において、本発明の方法は、必要に応じて、標的核酸に対するプローブと組み合わせて作用する１つより多いプローブ核酸の利用を可能にする。従って、例えば、２つのプローブの使用を配置してもよく、１つは、対象試料に存在する場合、標的核酸を捕捉する作用を有し、もう１つは、（典型的に）検出可能な標識に標的が存在するシグナルを与える。従って、第１のプローブ核酸は、例えば、３’末端でビオチン化されてもよく、それにより、捕捉可能な部分を与える。これは対象試料と接触させ得る。標的核酸が存在する場合、これは、第１のプローブにハイブリダイズし、得られる二本鎖は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁性ビーズを用いて捕捉する。対象試料中の未結合のプローブおよび他の成分は、次いで洗い流してもよい。あるいは、第１のプローブ核酸は、ストレプトアビジンでコーティングされた磁石（または磁性ビーズ）と最初に接触させてもよく、未結合の捕捉プローブは、対象試料への曝露前に洗い流され、その後、対象試料のハイブリダイズしていない成分は、洗い流されてもよい。代替の実施形態は、図２１に概略的に示される。

標的核酸の捕捉後、ラマンにより検出可能な標識は、次いで、第１プローブ核酸の標的核酸へのハイブリダイゼーションから得られる二本鎖に導入されてもよい。これは、本明細書に記載される二本鎖内に挿入できる標識を用いることにより達成されてもよい。あるいは、および典型的に、標識は、すでに第１のプローブ核酸に結合された、標的核酸にハイブリダイズする第２のプローブ核酸を用いて組み込まれる。標的核酸の異なる領域に相補的な第１のプローブ核酸および必要に応じて第２のプローブ核酸の鎖を含む得られる二本鎖は、次いで、ラマンにより検出可能（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性）な標識を放出するためにエキソンクレアーゼによって分解されてもよい。

本発明の全ての実施形態において、例えば、本明細書に記載される捕捉技術を用いることにより、標的核酸から未結合の標識を分離することが可能である場合、標識を含むプローブ中のラマンにより検出可能な標識についてクエンチ部分を含まないことは可能であり、しばしば利点がある。これは、（標的核酸が標識の検出により示される場合には、バックグラウンドの偽陽性結果を他に生じ得る）未結合の標識含有プローブを除去することが可能であるためである。しかしながら、本明細書に記載される捕捉技術を使用しない場合、またはそれらを使用する場合でさえも、プローブ核酸中の標識についてクエンチャーを含むことは利点があり得る。このように、いかなる残余のハイブリダイズしていないが標識を含むプローブも、検出されるいかなるシグナルにも寄与しない。

図２１は、一般用語で上記の実施形態の例を概略的に示し、別個の第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブを特に利用するが、必須ではなく、一連の洗浄段階を示す。このクエンチャーの存在が必須の特徴でないという直前の記載から理解されるが、第２のプローブ核酸が標識およびクエンチャー（クエンチャーは「標識」プローブ中の黒色の円である）を含むことが観測される。「Ｐ」は、λエキソヌクレアーゼの基質として得られた二本鎖核酸を与えるのに役立つ末端の５’リン酸部分を示す。従って、図２１は、ストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに結合した短い捕捉プローブ（３’ビオチン化）を示す。未結合のプローブは洗い流す。次いで、標的配列は、固定された捕捉プローブ（第１のプローブ核酸）にハイブリダイズさせる。未結合の標的核酸は洗い流す。（５’リン酸基を有する）色素標識オリゴヌクレオチド配列は、次いで、捕捉された標的配列にハイブリダイズする。λエキソヌクレアーゼの作用は、ハイブリダイズしたプローブ配列で生じる。酵素は、ハイブリダイズしたプローブＤＮＡをモノヌクレオチドに分解し、色素を遊離する。

標的核酸に対するプローブと組み合わせて作用する１つより多い核酸を利用できる本発明の実施形態のさらなる例として、２つのプローブ核酸を使用でき、第１のプローブが標的核酸に対するプローブとして設計される配列を含む。標的核酸の少なくとも一部と相補的である第１のプローブの部分に加えて、第１のプローブはまた、第２のプローブ核酸に相補的な配列を含む。この第２のプローブ核酸は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳまたは他のラマン活性標識（それは第２のプローブ核酸から切断される場合、少なくともＳＥ（Ｒ）ＲＳまたはラマンにより検出可能である）および必要に応じてクエンチャーを含み得る。あるいは、標識は他のものを与えることができる。例えば、本明細書に記載される（第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸によってこの実施形態の構成要素となる）標的核酸とプローブ核酸との間にハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖内に挿入できる標識である。第１のプローブまたは第２のプローブ、典型的に第２のプローブはまた、５’リン酸基を含んでもよく、使用されるエキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである。図２４は、検出様式がＳＥＲＲＳであり、標的核酸がＤＮＡであり；第２のプローブ核酸がＳＥＲＲＳ活性色素（星として示される）で標識され５’リン酸を有し；エキソヌクレアーゼとしてλエキソヌクレアーゼを使用する本発明のこの実施形態の概略図を示す。

本発明のこの実施形態の１つの利点は、第１のプローブが、標的核酸にハイブリダイズするように設計されるその配列の部分に基づく標的特異的プローブとして機能することを可能にすることである。第２のプローブにハイブリダイズするためのその配列の詳細部分は一般的であってもよく、これは、配列が標的核酸に特異的でないが、むしろ第２のプローブに特異的であることを意味する。従って、第２のプローブは、標的核酸に対していくらかの配列相補性を有することは必要とされず、従って、複数の標的核酸を検出するために使用することができる。これは、示される第２のプローブ核酸が典型的により構造的に複雑であり、典型的に標識および必要に応じてクエンチャーおよび必要に応じて５’リン酸基を含むため、利点がある。第２のプローブは、標的核酸に基づいてオーダーメイドであることを必要とせず、標的核酸に見出される配列上の部分に基づく第１のプローブは、簡単なオリゴヌクレオチド合成によって生成されてもよい。

この方法は、アッセイに使用される一般的なプローブを可能にする。すなわち、第２のプローブの配列（および第１のプローブにおけるその相補配列）は、全ての標的核酸について使用してもよく、作用する酵素、生じるハイブリダイゼーション、および最適な標識構造についての最善の可能な条件を与えるのに最適化してもよい。

第１のプローブ核酸の標的領域は、次いで、標的にハイブリダイズするように変更してもよい。特に有利には、その配列のこの部分はまた、ＬＮＡ塩基などのハイブリダイゼーション効率を増加させる塩基を含むことができる。

本発明のこの実施形態のさらなる利点は、ＰＮＡまたはＬＮＡを含む標的核酸の直線的な検出を可能にすることである。なぜなら、それは、切断される標的と第１のプローブとの間のハイブリダイゼーションによって形成される（必要に応じてキメラの）二本鎖核酸ではないためであり、標的ＤＮＡの構成に基づいて選択されるエキソヌクレアーゼを使用すること、または、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡにのみ結合するプローブ核酸を使用することを必要としないためである。従って、ＬＮＡおよびＰＮＡを利用することによって与えられる改善されたハイブリダイゼーション効率は、（ｉ）第１のプローブの標的領域によって標的化される標的核酸の部分または（ｉｉ）ＰＮＡもしくはＬＮＡを含む標的領域自体の両方またはいずれかによって与えられ得る。

従って、単にＲＮＡまたはＤＮＡに関するというよりも一般的な検出方法である。標的は、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を用いるｄｓＤＮＡ、適切な標的に結合するアプタマーまたは抗体を用いるタンパク質であってもよい。このような実施形態において、検出は、（例えば、第１のプローブ配列および第２のプローブ配列を含むプローブ配列を有する一本鎖ＤＮＡについて）本明細書に記載される同様の方法で実施されてもよい。従って、例えば、標的核酸として二本鎖ＤＮＡを用いて、第１のプローブ核酸は、三重鎖を形成する、すなわち二本鎖ＤＮＡを標的とし、第２のプローブ核酸に相補的な核酸の配列に結合される、特有の配列を有するＴＦＯであってもよい。第２のプローブ核酸のハイブリダイゼーションおよび得られた二本鎖のその後の分解は、融解を少しも必要とせず、所望のｄｓＤＮＡの存在を検出するのに役立つ。

同様に、核酸は、次いで、例えば、固体支持体に固定されていてもよい抗体に結合し得る。（例えば、抗原に対する）結合事象の検出は、標的核酸として役立つ核酸がさらなる抗体に結合することができる（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイと同様のアッセイにおいて）本発明の方法によって達成され得る。固体支持体に結合した抗原の存在は、次いで、本発明の方法に従って標的核酸の検出によって決定され得る。このように、本発明の方法は、任意の所定の研究において生体分子プローブに標的核酸として適切な核酸を結合させることにより任意の結合事象を検出するために使用することができる。次いで、結合は、生体分子プローブ−標的核酸結合体をプローブ核酸に曝露することにより検出し、本発明の方法を実施する。

本発明のこの実施形態のさらなる利点は、単に第２のプローブにおける標識および第１のプローブの標的配列を変化させることによって多重化が容易に可能になることである。エキソヌクレアーゼによって実際に分解された配列は、一定のままとし、それによりエキソヌクレアーゼについて確立された１セットの最適な条件のみを一定に維持する必要があり、複数の標的核酸を検出しようとする多重アレイにおいてさえもエキソヌクレアーゼについて確立されたセットの最適条件のみを許容する。

上記の一般的なエキソヌクレアーゼによって切断可能な配列の使用はまた、本明細書に記載される捕捉方法と併せて使用され得る。従って、例えば、第２のプローブ核酸にハイブリダイズするように設計される第１のプローブ核酸の部分は、例えば、３’末端でビオチンを用いて誘導体化することができ、本明細書に記載され、図２１に参照されるストレプトアビジン−ビオチンベースの捕捉および洗浄方法の使用を可能にする。このように、第１のプローブ核酸は本明細書に記載される捕捉可能プローブとして役立つ。かかる方法の使用は、（所望である場合）本発明の方法の特異性（およびそれによる信頼性）を改善することができる。

特異性を改善する別の方法は図２５に示される。これは、固体表面、例えば、ビーズまたはプレート、あるいはストレプトアビジンコーティング磁石による捕捉を可能にするビオチンで誘導体化された例示的な代替物に結合し得る２つの捕捉プローブの使用を示す。２つの捕捉プローブが示されているが、１つ以上を使用することができる。従って、捕捉方法が、一般にエキソヌクレアーゼにより切断可能な配列からなるような使用が利用されるように誘導される場合には、捕捉プローブ（複数も含む）は、標識プローブにハイブリダイズする同じプローブである必要はない（図２４に示される）。

本発明の一実施形態において、５’リン酸含有プローブ核酸は、５’リン酸含有鎖を分解するために、λエキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼによって消化される標的核酸に特異的にハイブリダイズする。両方の鎖は分解され、消化され得るが、プローブのみの消化とラマン／ＳＥ（Ｒ）ＲＳによる検出可能な標識の放出が本発明の一部の実施形態において十分である。

λエキソヌクレアーゼは、バクテリオファージλによってコードされる２４ｋＤの酵素である。この酵素は、バクテリオファージ遺伝子組み換えに関係があるが、ＤＮＡプロセシング酵素としても商業的に入手可能である。酵素の結晶構造は、ドーナツ型の四重構造を有するホモ二量体であることがわかっている。

λエキソヌクレアーゼは、リン酸化５’末端で開始する二本鎖（ｄｓＤＮＡ）のうちの一つの鎖を消化する。λエキソヌクレアーゼの中心チャネルの寸法は、そのチャネルの一端でｄｓＤＮＡを収容するのみであるようである。酵素は高いプロセッシビティを有し、酵素の中心の細くなったチャネルの中心を介して３’ＤＮＡ鎖を通過させる。５’鎖は消化され、遊離５’モノヌクレオチドを放出する。リン酸化５’末端を有する一本鎖ＤＮＡもまた、消化されることが示されているが、ｄｓＤＮＡと比較して不十分な基質である（Ｐ．Ｇ．ＭｉｔｓｉｓおよびＪ．Ｇ．Ｋｗａｇｈ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２７（１５），３０５７−３０６３（１９９９）およびそれに引用される参照文献を参照のこと）。

本発明の一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである。他の実施形態において、エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼではない。本発明の使用に適切である他のエキソヌクレアーゼは、例えばリン酸化によって５’または３’末端核酸が修飾されるか否かに関わらず、５’または３’方向の核酸二本鎖の一方または両方の鎖を進行的に消化できるエキソヌクレアーゼである。しかしながら、エキソヌクレアーゼは、ほとんどまたは全く一本鎖核酸を消化する能力を有さないはずであることが理解される。他の適切なエキソヌクレアーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＤＮＡポリメラーゼＴ４などのポリメラーゼが挙げられる。

プローブは任意の都合のよい長さであってもよい。その実際の長さは、いかに正確に所定の標的配列を決定することが所望されるかに依存する。しかしながら、典型的に、プローブは、長さが約１０〜５０ヌクレオチド、例えば、長さが２０〜３０ヌクレオチドである。プローブは、エキソヌクレアーゼ、例えば、λエキソヌクレアーゼによるプローブの消化の際に検出すべき標識の環境の変化を可能にするように修飾される。好ましくは、プローブの一部またはプローブが一本鎖核酸として存在および／または標的配列にハイブリダイズするいずれかの場合に、標識は実質的に検出可能ではない。このように、記載されるエキソヌクレアーゼによって好ましくはほとんどプロセシングされない過剰なハイブリダイズしていないプローブは検出可能ではないので、検出可能な標識のみが、プローブ二本鎖核酸に結合する場合に存在し、二本鎖核酸の消化の際に放出されている。このように、検出される標識の変化は、対象試料中の標的配列の存在の指標である。

先行技術の方法と対照的に、プローブ鎖は、本発明の方法の間に伸長されることを必ずしも必要としない。ラマン分光法、特にＳＥ（Ｒ）ＲＳを用いて検出可能な標識を用いる検出の感度は、例えば、極度に低いレベルの標識を検出することができるものである。本発明の特定の実施形態において、さらなる利点は、最初のプローブが消化されると、第２のプローブ分子は標的核酸に結合でき、消化され、λエキソヌクレアーゼなどの特定のエキソヌクレアーゼの非常に高い回転率のために、標的核酸の同じ断片から十分なシグナルが生成する。実際に、シグナルは、これらの実施形態において、例えばＰＣＲにおいて標的と対照的に増幅される。過剰のプローブ配列が使用されてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションに有利な迅速なシグナル生成の動力学を確実にするために、試料中に１０倍以上、または１００倍以上の鋳型が存在するか、あるいは存在すると予測または推定される。この方法はまた、異なって標識されたプローブの使用を介して反応を多重化することを可能にする。

しかしながら、所望の場合、標的の増幅が行われてもよい。増幅の適切な方法は当業者に公知であり、等温増幅およびローリングサークル増幅が挙げられる。

本発明の特定の実施形態において、ラマン分光法によって検出可能な標識が蛍光である場合、検出様式としての蛍光それ自体は、ラマン分光法によって検出を補うことができる。これらの実施形態において、プローブは典型的に、上記の分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブと同様にフルオロフォアおよびクエンチャーを含む。インタクトな場合、クエンチャーは、フルオロフォアからのいかなる蛍光もクエンチする。しかしながら、エキソヌクレアーゼによるプローブＤＮＡの分解の際に、標的核酸へのハイブリダイゼーション後、フルオロフォアはクエンチャーから放出されて、蛍光が得られる。問題のある場合、バックグラウンド蛍光は、共焦点顕微鏡法の使用によって改善され得る。これは、単一分子レベルに近づく超高感度の検出を可能にする。クエンチャー−ドナーと対照的であるＦＲＥＴ配置を使用することも可能であり、蛍光寿命測定の使用も可能である。任意の簡便な蛍光が使用されてもよい。一実施形態において、フルオレセイン−ｄＴ（５１６ｎｍで発光）が使用されてよい。フルオレセイン−ｄＴは修飾された塩基であり、ここで、フルオレセイン（ＦＡＭ）は、６−炭素スペーサーアームによってチミン環の５位に結合される。任意の簡便なクエンチャーが使用されてもよい。例えば、Ｄａｂｃｙｌ（３８０〜５３０ｎｍでクエンチする）。

別の実施形態において、検出様式は、ハイブリダイゼーションの指標としてナノ粒子プラズモン共鳴に頼るプラズモニクスに基づくため、エキソヌクレアーゼの作用後の溶液中のナノ粒子の凝集状態が変化する。この実施形態によれば、個々のナノ粒子は、プローブで官能化され、それによって、末端リン酸（例えば、λエキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼとして使用される場合には５’リン酸）またはヌクレオチド塩基は、ナノ粒子の表面に対して遠位である。官能化される場合、プローブは特定の共鳴周波数を有する。これらのプローブが標的領域にハイブリダイズする場合、末端のリン酸／塩基は、ナノ粒子の表面上のプローブの消化を可能にするためにエキソヌクレアーゼの認識部位として作用する。プローブ配列でコーティングされたナノ粒子を単離し、溶液中で凝集しないが、標的配列へのハイブリダイゼーションおよびその後のプローブ配列の分解の際に、ナノ粒子はもはや離れて保持されず、凝集して検出可能な変化を生じる。

一実施形態において、表面は、プローブ核酸が結合されるように提供される。この表面は、ラマン（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ検出の使用に適切なものであり、銀表面などの粗い金属表面であり得る。この表面は、例えば、ナノ粒子、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ表面などの表面であってもよい。ラマン（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）により検出可能な標識は、核酸二本鎖の消化の際に表面上に落とされてもよい。

同様に、表面がナノ粒子の表面である場合、プローブは、粒子が凝集するのを防ぐが、プローブ消化の際に、粒子は凝集し、それにより、いくらかの検出可能なラマン（例えば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ）シグナルを増強する。

十分に少量のプローブがナノ粒子表面に結合される場合（例えば、１０〜２０％の表面被覆率）、ナノ粒子の凝集状態は、プローブが分解されて、ナノ粒子のプラズモン周波数の変化を生じるので、変化するとが推定され得る。これは、例えば、暗視野顕微鏡検査を用いて測定し得る（例えば、ＨｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｕｎａｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂａｓｅｄｏｎｃｏｌｉｍｅｔｒｉｃｓｃａｔｔｅｒｏｆｇｏｌｄｎａｎｏａｐｒｔｉｃｌｅｐｒｏｂｅｓ（Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２００４，２２（７），８８３−８８７）を参照のこと）。

この実施形態によれば、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性色素（ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識）は、ナノ粒子に直接結合され得るが、プローブがインタクトなままである場合、標識は凝集が存在しないため目に見えない。プローブ／標的二本鎖の消化は、粒子の凝集を発生させ、またＳＥＲＲＳ効果で変換する。

金または銀コロイドを、ナノ粒子として使用してもよい。これらのコロイドは、ゾル、すなわち、水に分散される固体粒子とみなされる。これらの粒子のサイズは、ナノスケールで存在し、従って、この用語ナノ粒子の使用は、典型的に２〜１００ｎｍ、特に１０〜８０ｎｍ、例えば、１５〜４０ｎｍである。コロイド媒体は、オリゴヌクレオチドが金または銀ナノ粒子の表面上に固定化され得るため、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応に十分に適する。

好ましい実施形態において、上記のように、検出様式は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳに基づく。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳについての詳細は、例えば、ＷＯ９７／０５２８０号、ＷＯ９９／６０１５７号およびＷＯ２００５／０１９８１２号ならびにそれに引用される参照文献に記載されている。

当該分野において公知のように、ラマンスペクトルは、検体に対する入射光が、検体における核の動きおよび電子の励起に起因して散乱されるために生じる。スペクトルが記録される検体が、粗い金属表面などの適切な表面と近接して会合している場合、これにより、検出感度の大きな増加が導かれ、その効果は、「活性」表面に対して検体部位が近接するほどより顕著となる（最適な位置は、表面付近、すなわち、表面の約２ｎｍ内の第１の分子層にある）。これはＳＥＲＳといわれる。

感度のさらなる増加は、検体の共鳴周波数を操作することにより得られ得る（この場合、通常、目的の標的に結合された色素である）。色素の最大吸光度に合わせたコヒーレント光源の使用は、感度の１０^３〜１０^５倍の増加を生じる（レーザー励起はまた、表面プラズモン共鳴の最大に設定されてもよく、色素の最大と一致してもしなくてもよい）。表面強化効果および共鳴効果は、ＳＥＲＲＳを与えるために組み合わされてもよく、励起周波数の範囲はなお、組み合わされた強化効果を与える。

従って、ＳＥＲＲＳの技術は、２つの条件が満たされる場合、検体の振動フィンガープリントを提供する。（ｉ）適切な金属表面上への吸着、および（ｉｉ）目に見える発色団の存在である。金属の使用は、さらに、蛍光が効率的にクエンチされることを意味する。これは、標準的なフルオロフォアを含む広範囲の有色分子が、優れたＳＥ（Ｒ）ＲＳシグナルを生じることを意味する。

ＳＥＲＲＳが一般に好まれるので、ＳＥ（Ｒ）ＲＳに対する本明細書の全ての参照文献は、文脈が特に反対を示さない限り、ＳＥＲＲＳと読まれ得る。しかしながら、本発明はまた、一般にＳＥＲＳ、およびラマン分光法で実施され得ることも理解される。ＳＥＲＳは、例えば、赤外線領域における励起周波数を用いることによりバックグラウンド蛍光を最小化する場合に利点がある。

ＳＥ（Ｒ）ＲＳで見えないが、次いで酵素の作用後に視覚化できる標識を生成する方法の例は、例えば、Ｍｏｏｒｅら（２００４ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．，２２，ｐ１１３３−１１３８）に記載されている。この例において、リパーゼは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性となる色素を放出するエステル結合を加水分解するために使用される。これを促進するために、本発明に適用されるように、ヒドロキシキノリンアゾ色素を、色素のフェノール基を介してプローブ核酸の３’リン酸に付着してもよい。これは、色素が、金属表面に付着することをマスクし、色素をＳＥＲＲＳに対して「見えなく」する。この方法において、プローブがその特異的配列にハイブリダイズした後、エキソヌクレアーゼはオリゴヌクレオチドを消化し、次いで、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性表面に付着され得る色素によって、ＳＥＲＲＳにより検出され得るヒドロキシキノリン色素を放出する。

ＳＥ（Ｒ）ＲＳの非常に高い感度に起因して、鋳型の増幅は、このプロセスを実施するために、多くの場合において必要とされなくてもよい。しかしながら、所望される場合、標的の増幅が行われてもよい。増幅の適切な方法は、当業者に公知であり、等温増幅およびローリングサークル増幅が挙げられる。

さらなる実施形態によれば、プローブに付着される５’修飾されたＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性色素を有するプローブを使用してもよい。この色素は、プローブが金属表面上に接着せず、ＳＥＲＲＳを与えるように付着される。プローブ／標的二本鎖の形成およびＴａｑなどのエキソヌクレアーゼの添加後、分解が生じ、標識が放出される。このプローブは、Ｔａｑｍａｎプローブと同様の方法で分解される；しかしながら、蛍光クエンチングの除去および酵素の作用の際の蛍光の増加よりむしろ、本発明のこの実施形態において、金属表面に接着する色素の能力が増加し、それにより、ＳＥＲＲＳシグナルの増加を与える。上記のように、この実施形態は、未結合または過剰のプローブの除去を可能にするために、ビオチンなどの捕捉可能部分の使用と併せて実施されてもよい。本発明のこれら、または他の実施形態のいずれかを用いて、かかるプローブを、例えばＰＣＲにより対象試料に存在する核酸の増幅と併せて配置してもよい。

便利なことに、増幅手法が、ラマンにより検出可能なプローブと併せて使用される場合、使用されるプローブは、例えば、ＰＣＲに使用されるプライマーによりハイブリダイズされる標的核酸の異なる部分にハイブリダイズするように設計されてもよい。このように、ハイブリダイズする場合、プライマーがプローブへ続く際に、エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｔａｑの作用は、ラマンにより検出可能な標識を放出する。

本発明を実施する別の方法は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性挿入剤（インターカレーター）、または好ましくは副溝結合剤（ＭＧＢ）の使用を含み、これは、プローブ配列に付着される場合、ハイブリダイゼーションの特異性を増加させる。プローブ配列が標的にハイブリダイズする場合、挿入剤またはＭＧＢは、ＳＥ（Ｒ）ＲＳが得られないように設計される。しかしながら、エキソヌクレアーゼによる消化の際に、それは溶液中に放出され、金属表面上に吸収され、ＳＥ（Ｒ）ＲＳを与えることができる。

本発明は、以下の非限定的な節を参照してさらに理解され得る：
１．標的核酸の検出に使用するための方法であって、
（ｉ）標的核酸が存在する場合、前記標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と、
（ｉｉｉ）ラマン分光法によって前記標識を検出する工程と、
を含む、方法。
２．前記エキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド合成能力を有さない、節１に記載の方法。
３．存在する場合、前記標的核酸を検出するように、前記標識における検出可能な変化を検出する工程をさらに含む、節１または２に記載の方法。
４．前記対象試料における標的核酸の量を、前記変化の大きさに関連して決定する、節３に記載の方法。
５．前記標識は、前記プローブ核酸に付着、結合または会合される、節１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記プローブ核酸は、前記標識に結合される、節５に記載の方法。
７．前記標識は、前記プローブ／標的核酸二本鎖の消化によって前記二本鎖核酸から放出される場合、ラマン分光法によってのみ検出され得る、節１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．前記標識はＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性色素である、節１〜７のいずれか１つに記載の方法。９．前記プローブ配列は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性基質に付着される、節１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記基質は、ナノ粒子の表面である、節９に記載の方法。
１１．前記プローブ核酸は、ＤＮＡである、節１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記標的核酸は、ＤＮＡである、節１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記標的核酸は、二本鎖核酸である、節１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記標的核酸は、一本鎖核酸である、節１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記プローブ核酸は、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、節１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記エキソヌクレアーゼは、λエキソヌクレアーゼである、節１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記エキソヌクレアーゼは、λエキソヌクレアーゼでない、節１〜１５のいずれか１つの記載の方法。
１８．（ｉ）一本鎖プローブ核酸と、
（ｉｉ）エキソヌクレアーゼと、
（ｉｉｉ）節１〜１７のいずれか１つに記載される方法に使用するためのラマン分光法によって検出可能な標識と、
を含む、部材キット。
１９．標的核酸の検出に使用するための方法であって、
（ｉ）標的核酸が存在する場合、５’リン酸基を有する前記標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをλエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と、
を含む、方法。
２０．標的核酸の検出に使用するための方法であって、
（ｉ）存在する場合、標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と
を含み、
工程（ｉ）において過剰な前記プローブ核酸を前記対象試料と接触させ、その結果、工程（ｉｉ）における二本鎖の消化は、１回以上、前記標的核酸を再利用し、それによって、さらなるプローブ分子が、前記標的に特異的にハイブリダイズでき、さらなる標識分子を放出するために消化されるさらなるプローブ／標的核酸二本鎖を形成する、方法。
２１．存在する場合、前記標的核酸を検出するように、前記標識における検出可能な変化を検出する工程をさらに含む、節１９または節２０に記載の方法。
２２．前記対象試料における標的核酸の量を、前記変化の大きさに関連して決定する、節２１に記載の方法。
２３．前記標識は、前記プローブ／標的核酸二本鎖の消化によって前記二本鎖核酸から放出される場合にのみ検出され得る、節１９〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記検出は、プラズモニクス、蛍光またはＳＥ（Ｒ）ＲＳに基づく、節１９〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記標識は、前記プローブ核酸に付着、結合または会合される、節１９〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記プローブ核酸は、前記標識に結合される、節２５に記載の方法。
２７．前記標識は、ラマン分光法によって検出可能である、節１９〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記標識は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ標識である、節２７に記載の方法。
２９．前記標識は、ＳＥＲＲＳ標識である、節２８に記載の方法。
３０．前記標識は、３’ヒドロキシキノリン色素である、節２９に記載の方法。
３１．前記標識は、フルオロフォアである、節１９〜２６のいずれか１つに記載の方法。３２．前記プローブは、フルオロフォア、および前記消化前に前記フルオロフォアをクエンチするクエンチャーを含む、節３１に記載の方法。
３３．前記標識を工程（ｉ）において前記プローブ核酸および前記対象試料と接触させ、前記標識は、形成される場合、前記プローブ／標的核酸二本鎖内に挿入できる、節１９〜２４のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記標識は、前記二本鎖の副溝または主溝に結合できる、節３３に記載の方法。
３５．前記標識は、主溝結合剤である、節３４に記載の方法。
３６．前記標識は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）である、節３５に記載の方法。
３７．前記プローブ核酸は、ＤＮＡである、節１９〜３６のいずれか１つに記載の方法。３８．前記標的核酸は、ＤＮＡである、節１９〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記標的核酸は、二本鎖核酸である、節１９〜３８のいずれか１つに記載の方法。４０．前記標的核酸は、一本鎖核酸である、節１９〜３９のいずれか１つに記載の方法。４１．前記プローブ核酸は、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、節１９〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記プローブ配列は、基質に付着または吸着されている、節１９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．（ｉ）５’リン酸基を有する一本鎖プローブ核酸と、
（ｉｉ）λエキソヌクレアーゼと、
（ｉｉｉ）節１９〜４２のいずれか１つに記載される方法に使用するための標識と、を含む部材キット。
４４．前記標識は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性標識である、節４３に記載のキット。
４５．一本鎖プローブ核酸が特異的にハイブリダイズする鋳型としての標的核酸の使用であって、得られるプローブ／標的核酸二本鎖は前記二本鎖から標識分子を放出するためにエキソヌクレアーゼによって分解され、前記標的核酸は、複数の二本鎖から複数の標識分子を放出するように、複数回、前記鋳型として使用され、前記複数の二本鎖の各々は、同じ標的核酸からなる、上記使用。

以下の実施例は本発明を例示するが、その範囲を限定することを意図するものではない。

（使用したオリゴヌクレオチド）
オリゴヌクレオチドは、ａｔｄｂｉｏ（英国）およびＭＷＧ（独国）から購入し、ＨＰＬＣ精製した。

（蛍光プローブおよび相補鎖のＵＶ溶解）
フルオレセイン標識オリゴヌクレオチド（ＲＷＦＡＭ）および相補配列（ＲＷＣＯＭＰ１）のＵＶ融解曲線を、Ｃａｒｙ３００ＢｉｏＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて得た。この融解曲線を、二本鎖の融解温度を調べるために使用した。

５４．６μｌのＲＷＦＡＭおよび３１．８μｌのＲＷＣＯＭＰ１を、石英ガラスキュベット中の１９１３．６μｌの０．３ＭＰＢＳに加えた。これにより、各オリゴについて総容積２ｍｌにおいて０．５μＭの総濃度にした。

ＵＶ融解を、各段階の後に１分間保持して４種の勾配で実施した。
・勾配１：２５℃→９０℃
・勾配２：９０℃→２５℃
・勾配３：２５℃→９０℃
・勾配４：９０℃→２５℃

各勾配の第１回目の誘導体曲線を、ＲＷＦＡＭおよびＲＷＣＯＭＰ１の平均融解温度を調べるために使用した。

（蛍光プローブ実験導入）
（概要）
これらの実験は、フルオロフォアおよびクエンチャーで修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することに関する。このプローブは、一連の相補的標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように設計し、そうすることで、λエキソヌクレアーゼの作用の影響を受けやすくした。このプローブの分解を、蛍光の増加により検出した。

（オリゴヌクレオチドの希釈）
以下の表は、これらの実験に使用したオリゴヌクレオチドのストック溶液の希釈を示す。

（酵素の詳細）
・λエキソヌクレアーゼはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｍｂｉｏ）から購入した。
・酵素保存バッファー：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む５０％グリセロール溶液。
・酵素を受領した際に、２５×１０μｌの量にアリコートし、フリーザーに保存した。各１０μｌの量は１００単位の酵素を含んだ。

（λエキソヌクレアーゼ反応バッファー）
・１０×反応バッファー：６７０ｍＭグリシン−ＫＯＨ（ｐＨ９．４）、２５ｍＭＭｇＣｌ_２および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００。
・反応バッファーを１５０μｌの量に分けた。

（機器）
・全ての反応はＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭＸ４０００ＱＰＣＲで実施した。

（試料調製）
・全ての試料を無菌グローブボックス内の清浄環境中で調製した。
・試料を滅菌した２００μｌのチューブストリップに調製した。
・試料を総容積１５０μｌに調製した。
・使用した反応成分のうちの一部の微量容積のために、試料を各段階の間、簡単に遠心した。これにより、全ての試薬が混合し、試料の本体から外に出てチューブの側面に付着しないことを確実にした。

（実験手順）
蛍光プローブを用いる実験を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭＸ４０００ＱＰＣＲワークステーションを用いて実施し、２つの段階を含んだ：
１．酵素を含まない反応混合物を９０℃まで加熱し、１０分間、この温度に維持して、ＤＮＡ鎖の分離を確実にした。プローブおよび標的鎖を、試料を２０℃まで冷却し、５分間、この温度を維持することによってハイブリダイズさせた。温度を第２段階に備えて３７℃に戻した。
２．酵素（またはコントロールとしての水）を反応混合物に加えた。試料を３７℃まで加熱し、蛍光を測定した。３つのわずかに異なるプログラムを使用した：

３連の蛍光測定を各サイクルの終わりに行った。

（蛍光実験）
以下に示したデータを、各データ点から初期の蛍光値を減算することにより正規化した。測定を二連で行った場合、平均値のみを示す。

（実験１：初期試験）
この実験は本手法の実行可能性を確認するために行った。実験２および３にも使用する手順の例として、全体をここに記載する。

以下の試料を、８つのチューブストリップの別個のチューブにおいて二連で調製した：

２つの試験試料を調製して、ハイブリダイズした０．１μＭ濃度のｄｓＤＮＡを得た。ＲＷＦＡＭ（８．２μｌ、１．８μＭ）およびＲＷＣＯＭＰ１（４．８μｌ、３．１μＭ）を、１２１μｌの滅菌水中の１０倍反応バッファー（１５μｌ）に加えた。

二連のコントロール試料を、同じ容量および濃度のオリゴヌクレオチドおよび１２２μｌの滅菌水を用いたが反応バッファーを用いて調製した。

その試料を、この手順のハイブリダイゼーション段階のためにＱＰＣＲ機器に入れた。ハイブリダイゼーション後、その試料を取り出し、１μｌ（１０ユニット）のλエキソヌクレアーゼを２つの試験試料に加えた。その試料をＱＰＣＲ機器に戻し、プログラムＡを用いて蛍光を測定した。

結果を図４に示し、これにより、λエキソヌクレアーゼが加えられた試料においてのみ生じた蛍光の増加が示される。これは、酵素がプローブを分解し、クエンチャーから蛍光を放出できたことを示す。一定レベルの蛍光を５０〜６０分後に得た。コントロール試料を基準値に維持した。

（実験２）
これは、２倍にした濃度のλエキソヌクレアーゼの効果を調べた。

以下の試験試料およびコントロールを二連で調製した。

実験１に記載されるように試料を調製し、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、その試料をＱＰＣＲ機器から取り出した。

１μｌのλエキソヌクレアーゼを試料ＡおよびＢに加えた。
２μｌのλエキソヌクレアーゼを試料Ｃに加えた。
Ｄの試料をコントロールとして使用した。

その試料をＱＰＣＲ機器に戻し、プログラムＣを用いて蛍光を測定した。

図５のグラフにより、再び、コントロール試料において蛍光の変化が生じないことが示される。このデータにより、使用した酵素のユニット数が２倍の場合、生じる蛍光のより急速な増加、およびより短い時間で最大レベルの蛍光に到達することが示される。このデータにより、同じ濃度の蛍光プローブを分解するのにかかった時間は、存在する酵素の濃度にほぼ比例することが示される。０．１μＭ濃度の蛍光プローブに関して、２倍のユニット数のλエキソヌクレアーゼを用いると、最大レベルの蛍光に到達するのにかかる時間が半分になるようである。

（実験３）
これは、プローブ鎖を分解するλエキソヌクレアーゼの能力に対する陥凹した（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）５’末端および３’尾部の効果を調べ、３つの異なる標的鎖を使用した：
・ＲＷＣＯＭＰ２−２０塩基５’陥凹（ｒｅｃｅｓｓ）を与えた。
・ＲＷＣＯＭＰ３−平滑５’末端および２０塩基３’尾部を与えた。
・ＲＷＣＯＭＰ４−２０塩基の５’陥凹および２０塩基の３’尾部の両方を与えた。

２連の以下の試料を調製した。

上記で実施したように試料を調製し、ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、その試料をＱＰＣＲ機器から取り出し、１μｌ（１０ユニット）のλエキソヌクレアーゼを試料Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに加えた。

この実験の目的は、より長い鎖長の標的ＤＮＡにハイブリダイズする場合、λエキソヌクレアーゼが蛍光プローブを分解できるか否かを決定することであった。これにより、プローブの５’末端は標的鎖と比べて陥凹し、長い尾部分も与える。これは、相補標的配列がより長い核酸鎖の部分である実際のＤＮＡ試料を反映することを意図した。

この実験データ（図６に示す）により、プローブと標的鎖との間の二本鎖の形成が、各場合に得た全蛍光の増加と同様であったため、酵素の全活性に実際に影響しないことが示される。

（化学物質および試薬）
化学物質はＳｉｇｍａまたはＡｌｄｒｉｃｈのいずれかから購入し、全て分析グレードであった。

λエキソヌクレアーゼ酵素（２５００ユニット、１０ユニット／μｌ、Ｒｅｆ．ＬＥ０３２Ｋ)およびλエキソヌクレアーゼ反応バッファー（６７０ｍＭグリシン−ＫＯＨ、２５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０倍ストック、Ｒｅｆ．ＬＥ−バッファー）は、ＣａｍｂｉｏＬｔｄ．，Ｕ．Ｋから得た。λエキソヌクレアーゼを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ、１．０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む５０％グリセロール溶液に供給した。

ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから購入した。バッファーを、使用前に０．２μｍの孔サイズのシリンジフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した。

（オリゴヌクレオチド配列）
オリゴヌクレオチドは、ＡＴＤｂｉｏおよびＭＧＷから購入した。
Ａ２０２０／ＰＴＢＰＲＯＢＥ（１８量体）
５’−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
修飾：５’ リン酸
Ｍｉｄ（１０）ｄＴＴＡＭＲＡ
３’ ビオチン

Ａ２０２０／ＰＦＢＰＲＯＢＥ（１８量体）
５’−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴ
修飾：５’ リン酸
Ｍｉｄ（１０）ｄＴＦＡＭ
３’ ビオチン

Ａ０９７７／相補配列（１８量体）−上記の両方の配列について
５’−ＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ

ＣＴ配列
Ａ２０５７／ＣＴＰＲＯＢＥ（２２量体）
５’−ＧＣＴＡＡＡＣＴＴＧＣＴＴＧＣＣＡＣＴＣＡＴ
修飾：５’ リン酸
Ｍｉｄ（１２）ｄＴＦＡＭ

Ａ２０５８／ＣＴＣＯＭＰ（２２量体）
５’−ＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＧＣ
第１の鎖ＣＴ（１００量体アンプリコン）
ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴ

ＦＡＭプローブについての結合部位は太字で示す
５’７塩基オーバーハング
３’７１塩基

（機器）
ＳＥＲＲＳスペクトルを、５１４．５ｎｍおよび３０ｍＷの電力で操作するアルゴンイオンレーザーを備えるＲｅｎｉｓｈａｗＩｎ−ＶｉａＲａｍａｎ顕微鏡システムを用いて収集した。シリコン基準を、５２０ｃｍ^−１ピークの強度を測定することにより機器を較正するために使用した。

蛍光測定を、光源として石英ハロゲンランプを使用するＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭＸ４００Ｑ−ＰＣＲで実施した。帯域通過フィルターは、通常、ＥＸ．３５０ｎｍ、ＥＭＭ．５１６に設定した。全ての他のチャネルは、遮光フィルターを用いることによって遮断した。ＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ分光光度計も、通常の蛍光測定のために使用した。

（λエキソヌクレアーゼを用いるアッセイ）
以下のアッセイは、（図３に示す略図に従って）分解可能なプローブとして５’リン酸、内部ＴＡＭＲＡｄＴ修飾および３’末端ビオチンで標識された市販の１８量体の使用に基づいた。
ＰＴＢＰＲＯＢＥ＝５’リン酸−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ（Ｘ）ＣＡＣＧＡＣＧＴ−ビオチン３’
式中、Ｘ＝隣接ＴのＴＡＭＲＡ修飾

簡単に説明すると、反応混合物（１当量の相補的ｓｓＤＮＡの存在／非存在下における９〜１０μｌ、１ピコモルのＰＴＢＰＲＯＢＥ）を９０℃まで加熱し、２０℃に冷却して、相補配列のハイブリダイゼーションを促進した。次いで、λエキソヌクレアーゼ酵素を加え、反応物を、消化を開始するために３７℃で３０分間、インキュベートした。この酵素は、生成物として５’−モノヌクレオチドおよびハイブリダイズしていない相補的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鎖を放出する、高処理能力を有する５’から３’エキソデオキシリボヌクレアーゼである。ＴＡＭＲＡ標識したモノヌクレオチドは、上記のＰＴＢＰＲＯＢＥの消化の際に放出されるはずである。

消化の後、反応混合物を、１５分間、７５℃まで加熱して、酵素を完全に不活性化し、反応を実質的にクエンチした後、試料を室温まで戻して冷やした。次いで、洗浄および結合バッファー（０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７）中のストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズを、標識されたオリゴヌクレオチド上の３’ビオチン修飾との強い相互作用によって、消化されていないＰＴＢＰＲＯＢＥを除去するために使用した。この工程を、バックグラウンドシグナルを引き起こし得る、消化されていない、色素標識されたプローブを除去するために導入した。磁石をエッペンドルフ側に磁性ビーズを引き寄せるために使用し、次いで、上清を新たなマイクロタイターウェルプレートに移した。凝集剤（２０μｌ）、続いて、クエン酸還元Ａｇコロイド（１００μｌ）を加えた。ＳＥＲＲＳスペクトルを、５１４ｎｍ励起レーザーラインを用いてＩｎＶｉａＲａｍａｎ顕微鏡で銀コロイド添加直後に記録した。

λエキソヌクレアーゼは、生成物として５’−モノヌクレオチドおよびハイブリダイズしていない相補的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鎖を放出する、高処理能力を有する５’から３’エキソデオキシリボヌクレアーゼである。色素標識されたモノヌクレオチドは、消化の際に放出されるはずである。

（ＳＥＲＲＳ検出ストラテジー）
反応混合物は、酵素、完全長オリゴヌクレオチド、切断消化生成物、および多数の化合物の複雑な組み合わせを含む。

ＳＥＲＲＳ分析前の反応混合物（２０μｌ、ビオチン洗浄工程を含む）中の異なる種の適切な濃度を以下に示す：
０．１μＭオリゴヌクレオチド標識プローブ（最初に、消化生成物を加えた）
０．１μＭ相補的オリゴヌクレオチド標的
３３．５ｍＭグリシン．ＫＯＨ
１．２５ｍＭＭｇＣｌ_２
０．０１％ＴＸ−１００（界面活性剤）
０．２５５ＭＮａＣｌ
１２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
０．５０５ｍＭＥＤＴＡ
２．５％グリセロール
０．０５ｍＭＤＴＴ
１０ユニットのλエキソヌクレアーゼ酵素

単純なアミノ酸であるグリシンは、高濃度で存在し、クエン酸還元銀コロイドの表面と相互作用することが知られている（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄＲａｍａｎｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎｍｅｔａｌｃｏｌｌｏｉｄＩＩ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆｇｏｌｄｃｏｌｌｏｉｄａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｆＧｌｙｃｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎｇｏｌｄａｎｄｓｉｌｖｅｒｃｏｌｌｏｉｄｓ：Ｘ．Ｄｏｕ，Ｙ．Ｍ．Ｊｕｎｇ，Ｚ．ＣａｏａｎｄＹ．Ｏｚａｋｉ，Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，１９９３，５３，１１４０）。銀表面との相互作用の程度はｐＨに影響を受け、これは、異なるイオン性種のｐＫａ値と相関する場合もある。
銀および金コロイドにおける安定種のｐＫａ値：
クエン酸：３．１、４．７、６．４
ＥＤＴＡ：２．０、２．７、６．１、１０．２
グリシン：ｐＫ_１＝２．３４（ＣＯＯＨ）、ｐＫ_２＝９．６（ＮＨ_３ ^＋）等電点は５．９７である。

消化反応をｐＨ９．４（緩衝化）で実施したが、クエン酸還元銀コロイド（ｐＨ６〜７）は、ある程度まで全体のｐＨを低下させる場合があった。いかなる場合においても、これは、銀コロイド上のクエン酸基が、これらの条件下で完全に脱プロトン化されることを示唆する。さらに、グリシンの大部分は、分析時に両性イオン（ＮＨ_３ ^＋、ＣＯＯ⁻）であるはずである。

エキソヌクレアーゼ反応バッファーを、（異なる容量だが、実際のアッセイに使用されるものと同じ割合で）銀ナノ粒子に加えた場合、負のゼータ電位の減少が観測された（表１）。これは、粒子の表面電荷の変化を示唆する。しかしながら、粒子は、この段階で凝集の変化が現れないことを示した。

表１．Ｈ_２Ｏおよびエキソヌクレアーゼ反応バッファー中の銀コロイドについてのｐＨおよびゼータ電位値（比較のために含まれるが、この研究において金は使用していない）。

これは、ｐＨの重要性および反応混合物中の異なる種のうちの一部に対するその効果を明らかにするのに役立つ。ｐＨは、金属表面に対する異なる化学物質の親和性を決定づけるようであり、次に、これは、任意の後のＳＥＲＲＳ研究に影響を与える。

ＳＥＲＲＳ粒子を凝集するためのＭｇＳＯ_４の使用は、ＴＡＭＲＡ標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる場合の本発明者らの目的のために成功であると証明された（図７および８）。コントロール試料からの一部のバックグラウンドシグナルも観測されたが、放出されたＴＡＭＲＡ標識のＳＥＲＲＳシグナルを得ることは可能である。しかしながら、一連の３連の反応を用いる研究において、コントロール試料と、標的配列を含む陽性試験反応との間の大きな程度の識別を確立することは可能であった。

（簡単な実験）
ＰＴＢＰＲＯＢＥ（５’リン酸、内部ｄＴ（ＴＡＭＲＡ）、３’ビオチン）を、λエキソヌクレアーゼ反応バッファー（６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、２．５ＭｇＣｌ_２、０．０１％ＴＸ−１００）中でその相補配列と混合し、９０℃まで加熱し、次いで約１５分にわたって２０℃まで冷却した（０．１μＭ、１：１比率、１０μｌ反応スケール、１ピコモルｄｓＤＮＡ）。λエキソヌクレアーゼ（１μｌ、１０ユニット）を加え、消化を、３０分間、３７℃で実施し、続いて不活性化工程を実施した（１５分間、７５℃）。反応混合物を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、ロータリーシェーカーで室温にて３０分間、ストレプトアビジンでコーティングした磁性ビーズ（１０μｌ、４ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを磁性スタンドに置いて、ウェルの側面の方へ磁性ビーズを分離し、次いで上清（２０μｌ）を新たなウェルに移した。凝集剤（２０μｌ、１ＭＭｇＳＯ_４）、続いて、１００μｌのクエン酸還元銀コロイドを加えた。ＳＥＲＲＳスペクトルを、後で即座に獲得した（ＲｅｎｉｓｈａｗｉｎＶｉａＲａｍａｎ，５１４．５ｎｍ、１０倍対物レンズ、１００％電力、１０秒、３蓄積）（図９を参照のこと）。

（Ｆｒｅｔベースのアッセイ）
この種類のアッセイの略図は図１０に示す。

反応を、異なる比率のＦＡＭ標識プローブ（５’リン酸−ＴＴＴＴＣＣＣＡＧ（ＡＴ−ＦＡＭ）ＣＡＣＧＡＣＧＴ−ビオチン）対相補標的配列（１：１、１０：１、１００：１）を用いて１０μｌスケールで実施した。ＦＡＭ標識プローブおよびＨ３３２５８色素（Ｍ．Ｔｅｎｇ，Ｎ．Ｕｓｍａｎ，Ｃ．Ａ．ＦｒｅｄｅｒｉｃｋおよびＨ．Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９８８，１６Ｎｏ．６；Ｄ．Ｅ．Ｗｅｍｅｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９９９，５２，１９７−２１１；ならびにＦ．Ｍ．Ｈｏ＆Ｅ．Ａ．ＨＨａｌｌ，ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２００４，２０，５，１００１−１０１０）の濃度は１μＭであった。λエキソヌクレアーゼ反応バッファー（１μｌ、１０ユニット）を加え、反応混合物を、３０分間、３７℃まで加熱し、続いて、７５℃で１５分間かけて酵素の不活性化工程を行った。相補標的配列を含む溶液（１００μｌ、０．１μＭ）を各反応に加え、融解／アニーリング曲線を調べた（温度範囲１５〜７５℃、１℃ごとのＥＸ_{３５０ｎｍ}、Ｅｍｍ_{５２０ｎｍ}での蛍光のモニタリング変化、３回アニーリング曲線および３回融解曲線）。コントロール試料（加えた酵素なし）は、ＵＶ融解データと一致するＴ_ｍ約５８℃を示した。消化した試料のどれも、ＦＡＭ標識プローブが全ての場合で消化したことを示唆する識別できる融解曲線を示さなかった。

これらの結果を図１２および１３に示す。

（さらなる実施例）
（１．材料）
ＤＮＡ配列はＡＴＤｂｉｏから購入した。使用したＤＮＡ配列は表２に示す。

表２：エキソヌクレアーゼアッセイについての使用したＤＮＡプローブ

Ｈｏｅｃｈｓｔ色素Ｈ３３２５８はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

組み換えλエキソヌクレアーゼおよび１０倍エキソヌクレアーゼ反応バッファーは、Ｃａｍｂｉｏから購入した。１倍希釈した場合、このバッファーの組成は、６７ｍＭグリシン−ＫＯＨ、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２５℃でｐＨ９．４である。種々の化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。実験に使用したリン酸バッファーは、０．３ＭＮａＣｌを含む６ｍＭリン酸であった。

（２．機器）
吸収研究およびＵＶ融解は、ＣＡＲＹ３００ＢｉｏＵＶ可視分光光度計で実施した。発光研究は、ＶａｒｉａｎＣａｒｙＥｃｌｉｐｓｅ蛍光分光計を用いて実施した。両方の場合において、光学的に透明な１ｃｍ経路長および３ｍｌ容積のプラスチックキュベットを使用した。酵素アッセイを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＭ×４０００ＰＣＲ機器を用いて実施した。

（６．エキソヌクレアーゼアッセイ）
試料を、１５０μｌの最終体積で１倍λエキソヌクレアーゼ反応バッファー中で調製した。配列、相補体および／またはＨｏｅｃｈｓｔ色素の濃度は全ての場合において１μＭであった。酵素を含む試料において、１０ユニットのλエキソ（１μｌの１０ユニット／μｌ濃度）を反応混合物に加えた。励起波長は３５０ｎｍ（１０ｎｍ帯域通過）に設定し、発光測定は、ＦＲＥＴ系について５１９ｎｍ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素蛍光について４４０ｎｍ（１０ｎｍ帯域通過）で行った。試料を、調製の間、冷却プレートに置いて、初期の消化を回避した。

試料を、３０分間（消化段階）、３７℃で保持し、１分ごとに蛍光を測定した。次いで、酵素を、１５分間、７５℃で変性させた（不活性段階）。３つの融解段階をその後実施した：７５℃〜２０℃のアニーリング曲線、次いで７５℃まで再び加熱および２５℃まで最後の冷却段階。加熱または冷却速度は１℃／分であり、１分ごとに蛍光を測定した。

同じアッセイを、０．１μＭ濃度のＴＡＭＲＡプローブおよび相補配列および１／１００００希釈のＰｉｃｏＧｒｅｅｎの試料を用いるＰｉｃｏＧｒｅｅｎ−ＴＡＭＲＡ系に使用した。試料をλエキソ反応バッファー中で１５０μｌ容積にした。励起波長４９２ｎｍ（１０ｎｍ帯域）、発光を５１５ｎｍ（１０ｎｍ帯域）で測定した。

（Ｖ．結果および考察）
（４．エキソヌクレアーゼアッセイ）
（４．１．ＦＡＭプローブの消化）
λエキソヌクレアーゼでの消化は、実験の段落に記載されるように実施した。２つのコントロールを使用した：
・コントロール一本鎖ＤＮＡ：酵素の存在下でエキソヌクレアーゼ反応バッファー中に１μＭＦＡＭプローブおよび１μＭＨ３３２５８を含む試料。本発明者らは、１００％の消化したＤＮＡと等しいこのコントロールの蛍光を仮定する。
・コントロール二本鎖ＤＮＡ：エキソヌクレアーゼを含まないが、１μＭＦＡＭプローブ、相補体およびＨｏｅｃｈｓｔを含む試料。これは０％の消化と等しいと仮定する。

図１４は、３０分の消化内で消化したコントロールおよび試料の両方の蛍光を示す（３つの複製のうちの１つからのデータを示す）。コントロール試料に関して、蛍光強度の検知できる変化は存在しない。しかしながら、ハイブリダイズしたＦＡＭプローブの発光は、１００％のレベルの二本鎖ＤＮＡから出発して、一本鎖の値に到達する、優れた崩壊を示す。本発明者らは、時間とともに蛍光強度の段階的減少を見出すことができ、リアルタイムに酵素消化をモニターするこのＦＲＥＴ系の能力が示された。

後に試料で調べたアニーリング曲線（図１５）によって、消化の十分な証拠が得られた。酵素を含まない試料を冷却した場合、再びハイブリダイズし、約５７℃のＴｍを示し、ＦＡＭプローブについての以前の研究において観測されたものと同様であった。λエキソヌクレアーゼで消化した試料は、再びハイブリダイズする能力を示さず、これは、消化が実際に完全に分解されたＦＡＭプローブを有することを意味する。

（４．２．異なる相補体を用いるＦＡＭプローブの消化）
完全な相補体より長い配列とハイブリダイズする場合、ＤＮＡを消化するλエキソヌクレアーゼの能力を調べた。これに関して、同じ酵素反応を以下の試料に関して実施した：・コントロール一本鎖ＤＮＡ（ＦＡＭプローブ）
・完全な相補体：ＦＡＭプローブ、完全な相補体およびＨｏｅｃｈｓｔ色素、λエキソ反応バッファー中に各１μＭ
・３’オーバーハング：同様だが、３’末端相補配列においてより長い１２塩基対を用いる
・５’オーバーハング：同様だが、５’末端においてオーバーハングを有する
・両側オーバーハング：３’および５’末端の両方における１２塩基対オーバーハング

上記の各々について、１セットの反応物（試料の種類ごとに３つの複製）を、コントロール二本鎖ＤＮＡ（酵素を含まない）として使用し、別のセットを上記のようにλエキソヌクレアーゼを用いてアッセイした。

蛍光対時間プロットの出現は、強度の著しい減少を示す全ての場合において、完全な相補体（グラフは示さず）のものと非常に類似している（図１６を参照のこと）。後に作成した融解曲線は、全ての試料が消化されたことを示した。

本発明者らは、これらの結果の後に相補配列がプローブより長い場合でさえもλエキソヌクレアーゼがＤＮＡを消化できるという結論を出すことができる。

（ＳＥＲＲＳによる生物学的試料中のヒト病原体を検出するための二重標識プローブの使用）
ＳＥＲＲＳによる生物学的試料由来のヒト病原体の単一チューブ検出を、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）について実施した。Ｔａｑ−Ｍａｎに類似する技術を用いて、ｏｍｐＡ遺伝子の領域（ＧｅｎＢａｎｋｓｅｑ．ＡＹ５３５１７２）を、二重標識プローブの同時消化を用いてＰＣＲにより増幅させた。以下のデータは、ＳＥＲＲＳシグナルの強度に基づいてＣ．トラコマチス陽性試料とＣ．トラコマチス陰性試料とを区別できることを示す。この実施例において、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性ローダミン色素Ｒ６Ｇを使用した。しかしながら、任意のＳＥ（Ｒ）ＲＳ（または他のラマン）活性標識を使用することができる。このアッセイに使用したプローブ／プライマーセットは、クラミジア感染症の同定に使用した臨床診断用ＰＣＲに基づいた。試料は、種々の濃度のＣ．トラコマチスゲノムＤＮＡを添加した凍結乾燥した尿の形態でＱＣＭＤプログラム（分子診断についての品質管理（ＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌｆｏｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））によって得た。Ｃ．トラコマチスＤＮＡは、収集しかつ熱不活性化させたＭｃＣｏｙ細胞で増殖させた３日の培養物由来のものであった。

（材料および方法）
（試料の再構成）
試料を、凍結乾燥した尿素およびクラミジア・トラコマチスゲノムＤＮＡを含む無菌ゴムで密閉したバイアルとして受け入れた。それらに、１．２ｍＬの滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を注入し、試料を再構成するために３７℃で１時間、振とうした。

（鋳型の調製）
全試料をバイアルから滅菌１．５ｍＬチューブに移し、酵母ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を、１００μｇ．ｍＬ^−１の最終濃度まで加えた。２容量の氷冷エタノールおよび１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムをその試料に加えた。その試料を完全に混合し、１５分間、−２０℃でインキュベートした。その試料を、ベンチ遠心分離において、１５分間、最大で遠心し、上清を捨てた。ペレットを、氷冷７０％ｖ／ｖエタノールで２回、および氷冷エタノールで１回洗浄し、空気乾燥させた。ペレットを、１時間、３７℃で振とうすることによって、６０μＬの無菌ｍｉｌｌｉＱ水に再懸濁した。これを、鋳型としてその後のＰＣＲ反応に使用した。

（増幅）
プローブ／プライマーセット（ＭＷＧＢｉｏｔｅｃｈ）を、クラミジア・トラコマチスｏｍｐＡ遺伝子（Ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，ＰｒｏｆＰａｕｌＷａｌｌａｃｅ）を検出するために使用される臨床診断用ＰＣＲに基づいて使用した。プライマーは、５０１塩基から６００塩基（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ５３５１７２に基づいて）までの１００ｂｐ領域の遺伝子を増幅し、そしてプローブは５９６塩基から５３５塩基にアニールするように設計した。使用したプライマーおよびプローブの配列は以下の５’から３’に記載する：
プライマー１：ｃａｃｔｔｒａｔａｔｔａｃｃｇｃａｇｇａａｃａｇ
プライマー２：ｇｃｔａａａｃｔｔｇｃｔｇｃｃａｃｔｃａｔ
プローブ：ビオチン−ａｇａｇｇｃａｔｃｃｔｔａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｇｃａｇｃ−Ｒ６Ｇ

ＰＣＲを、ホットスタートＮｏｖａＴａｑポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、２５ｐｍｏｌの各プライマー、１００ｐｍｏｌ〜０．１ｐｍｏｌのプローブ、２μＬの鋳型および３ｍＭＭｇＳＯ_４を用いて実施した。反応物の全容積は５０μＬであり、それらを鉱油下で実施した。ＰＣＲは、以下のパラメータを用いて３０増幅サイクルにわたって実施した：
１サイクル９４℃１０分間
３０サイクル９４℃２０秒間、５８℃２０秒間、および７２℃２０秒間
１サイクル７２℃２分間。

（ストレプトアビジンビーズを用いる試料処理）
ストレプトアビジン常磁性ビーズは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから４ｍｇ．ｍＬ^−１で得た。このビーズは、ビオチン化オリゴヌクレオチドについて５００ｐｍｏｌ．ｍｇ^−１のビーズの結合能力を有する。いずれのＰＣＲ反応におけるビオチン化プローブの最大量も１００ｐｍｏｌであったため、０．２ｍｇ（５０μｌ）のビーズが反応あたり必要とされる。

（使用のためのストレプトアビジンの調製）
ビーズを穏やかにボルテックスすることにより再懸濁した。必要とされるアリコート（５０μＬ×アッセイしようとするＰＣＲ反応の数）を取り出し、滅菌１．５ｍＬチューブに置いた。このビーズを、全てのビーズが隔離されるまで、２分以上の間、磁気分離ラックに置いた。ラックにチューブを維持して、上清を取り出し、捨てた。チューブをラックから除去し、ビーズを、２容量の２×Ｂ／Ｗバッファー、［２倍の結合および洗浄バッファー：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ７．５、２ＭＮａＣｌ］に再懸濁した。チューブを分離ラックに再び戻し、２分以上インキュベートした。洗浄プロセスを２回繰り返した。ビーズを、それらの最終濃度が出発体積と同じになるように２×Ｂ／Ｗに再懸濁した。

（試料処理）
５０μｌの調製したビーズを５０μＬのＰＣＲ反応に加え、穏やかに混合した後、時折混合しながら室温で１５分以上の間、インキュベートした。チューブを分離ラックに置いたので、磁石は鉱油の層の上になり、２分以上の間、またはビーズが鉱油の上に移動するまで、室温でインキュベートした。チューブをラックに維持したが、上清は新しいチューブに移した。次いで、この上清を全てのその後のＳＥＲＲＳ分析に使用した。

（ＳＥＲＲＳ検出）
（銀ナノ粒子の調製）
クエン酸還元銀ナノ粒子のコロイド懸濁液を、ＬｅｅおよびＭｅｉｓｅｌ手順の変法を用いて調製した。

（機器）
以下のラマン機器を使用した：レーザービームを、試料を含む１ｃｍプラスチックキュベットに焦点を当てるために、２０倍対物レンズを利用する５１４．５−ｎｍアルゴンイオンレーザーを備えるＲｅｎｉｓｈａｗモデル１００プローブシステム。

（試料調製）
全ての試料を、以下の量の試薬を用いてＳＥＲＲＳ分析のために調製した：１０μＬの検体、１０μＬのスペルミン、２５０μＬの水、および２５０μＬのクエン酸還元銀ナノ粒子。

（アガロースゲル電気泳動）
ＤＮＡを、水平で中性の２．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで視覚化した。ゲルを、慣例通りに調製し、１×ＴＢＥバッファー（Ｓｉｇｍａ）に流した。１００ｂｐのマーカー（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＨｙｐｅｒＶ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）マーカーを、サイズ基準として使用した。大きな１６．５×２３ｃｍ（２００ｍＬ）ゲルを使用して、良好の分離を確実にした。ＤＮＡ試料を、ゲルに負荷する前に、１／１０容量の１０倍ブルージュース（Ｂｌｕｅｊｕｉｃｅ）ローディングバッファー（Ｓｉｇｍａ）と混合した。ゲルを、１０〜２０分間、１×ＴＢＥに溶解したエチジウムブロマイドの０．５μｇ．ｍＬ^−１溶液中で染色した。

（結果および考察）
この技術は、二重標識プローブの同時消化を用いてＣ．トラコマチス由来のｏｍｐＡの特定領域を増幅させるためのプライマーセットを用いるＴａｑ−ｍａｎの適応である。

Ｔａｑ−ｍａｎにおいて、２つのプライマーおよびそれらの間にアニールする二重標識プローブが存在する。このプローブは、一方の末端にクエンチャーおよび他方の末端に蛍光色素を有する。プローブはインタクトであるが、クエンチャーは蛍光標識に十分近接して、発光を防ぐ。ＰＣＲ増幅の間、ポリメラーゼの５’から３’のヌクレアーゼ活性は、プライマーを伸長するようにプローブを消化し、蛍光標識からクエンチャーを効果的に分離し、検出を可能にする。

この実施例において、プローブはビオチンおよびローダミンで標識されている。増幅の間、比例する量のプローブが破壊され、ビオチンおよびローダミンを放出する。両者は少数のヌクレオチドに依然として付着するが、もはや互いに物理的に会合していない。ＰＣＲ後、未反応（インタクト）のプローブと、付着したビオチンおよびローダミン、遊離ビオチンおよび遊離ローダミンの両方との混合物が存在する。

ストレプトアビジンとビオチンとの間のほとんど不可逆的な相互作用において、ストレプトアビジンビーズは、インタクトなプローブおよび遊離ビオチンを容易に捕捉し、上清中には遊離ローダミンのみが残る。このプロセスは、いくらかの未反応のプローブを隔離し、後のＳＥＲＲＳ分析からそれを除去するので、ローダミンシグナルは、Ｃ．トラコマチスについての陽性試験を示す。

ＳＥＲＲＳの極めて感度の高い性質に起因して、使用されるプローブの量は、いくらかのバックグラウンドを減少させ、費用を減少させることが望まれる場合には、最小化してもよい。本発明者らは、１００ｐｍｏｌ〜０．１ｐｍｏｌで、どれが最も効果的であり得るかを調べるためにプローブ濃度の範囲を調べた。この実験を２セットの陽性ＰＣＲおよび２セットの陰性ＰＣＲを実施して、二連で実施した（陰性ＰＣＲはＣ．トラコマチスＤＮＡを含まない）。各ＰＣＲの１０μＬアリコートを、２．５％（ｗ／ｖ）ＴＢＥアガロースゲルで電気泳動して、生成物の存在を調べた（図１８）。全ての陽性反応を十分に増幅させ、陰性反応のどれも生成物を示さなかった。

図１８は、ＰＣＲによる増幅の試験を示す：２．５％（ｗ／ｖ）アガロースＴＢＥゲルは、１００ｐｍｏｌプローブ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌおよび０．１ｐｍｏｌのプローブ希釈範囲について、２つの陽性複製物（レーン２〜９）および２つの陰性複製物（レーン１２〜１９）を示す。レーン１）１００ｂｐマーカー、２）１００ａ、３）１００ｂ、４）１０ａ、５）１０ｂ、６）１ａ、７）１ｂ、８）０．１ａ、９）０．１ｂ、１０）１００ｂｐマーカー、１１）ＨｙｐｅｒＶマーカー、１２）１００ａ、１３）１００ｂ、１４）１０ａ、１５）１０ｂ、１６）１ａ、１７）１ｂ、１８）０．１ａ、１９）０．１ｂ、２０）１００ｂｐマーカー。

ＰＣＲ反応を５０μＬまで戻し、ストレプトアビジンビーズを用いて処理して、インタクトプローブと消化したプローブを分離した。次いで、上清をＳＥＲＲＳ分析について使用した。

ＳＥＲＲＳ分析により、ＰＣＲ陰性試料からのシグナルも存在したが、それらは、陽性コントロールより何倍も強度が低く、陽性反応が強いＳＥＲＲＳシグナルを与えたことを示した。図１９および２０を参照のこと。図１９は、ＳＥＲＲＳによって分析した試料の２つの陽性シリーズ（赤および緑）ならびに２つの陰性シリーズ（青および黒）を示すグラフでのプローブ希釈実験についてのスペクトル示す。プローブ濃度は左から右に増加する。図２０は、反応当たり１００ｐｍｏｌのプローブを用いる陽性試料と陰性試料との間のスペクトルの差を示す。

（エキソＳＥＲＲＳビーズアッセイ）
いわゆるエキソＳＥＲＲＳビーズアッセイを図２１に示す。スキームの始めに、最上部に一本鎖標的ＤＮＡおよび３’末端でビオチン化された短い捕捉プローブが記載されている（大きな灰色の円として示されるストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに結合している小さな薄灰色の長方形の内側の「Ｂ」として記載される）。３’ビオチン化捕捉プローブのストレプトアビジンコーティング磁性ビーズへの結合後、未結合のプローブを洗い流す。示される第１の工程において、標的ＤＮＡは固定化された捕捉プローブにハイブリダイズする。未結合の標的ＤＮＡは洗い流す。ヌクレオチドの５’リン酸標識は、ＳＥＲＲＳ活性色素（５’末端の方に示される薄灰色の円（この場合においてＴＡＭＲＡ））、およびまた必要に応じて３’標識クエンチャー（この場合においてＢＨＱ２は、捕捉された標的ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能になる）を含む。最終的に、標的ＤＮＡ、捕捉プローブおよび色素標識プローブを含む得られた二本鎖ＤＮＡは、ハイブリダイズした色素標識プローブＤＮＡをモノヌクレオチドに分解するλエキソヌクレアーゼの作用に曝露し、色素が遊離し、それにより、ＳＥＲＲＳによる検出が可能となる。

このアッセイを図２１に示し、強いビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用し、短い捕捉プローブ、完全長標的および色素標識プローブを使用する。スプリットプローブアッセイは、以下の組成の上記３つの合成オリゴヌクレオチドを利用する：
捕捉プローブ
３’ＴＣＴＣＣＧＴＡＧＧＡＡ３’ｄＴはビオチン化される
色素標識プローブ
３’ＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＣＧＸＣＧ３’ｄＴはＢＨＱ２で修飾される
ＸはＴＡＭＲＡで修飾されたｄＴである
標的相補体
５’ＡＧＡＧＧＣＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＧＣＡＧＣ

（実験）
１．捕捉プローブは、１倍結合および洗浄（Ｂ／Ｗ）バッファー中の３’ビオチン修飾を介してストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに結合する。未結合プローブはＢ／Ｗバッファーで洗い流すが、結合プローブは磁化により分離する。
２．標的相補配列は、加熱プログラムを用いて結合捕捉プローブにハイブリダイズさせる（９０℃１０分間、２０℃５分間）。未結合の標的は再び、３回以上の洗浄の間、１倍Ｂ／Ｗを用いて洗い流す。
３．色素標識プローブは、次いで、以前の加熱条件を用いて前もって形成された捕捉プローブ／標的二本鎖にハイブリダイズさせる。もう一度、未結合プローブを上記のように洗い流す。
４．スプリットプローブ複合体は、次いで、λエキソヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ反応バッファーに曝露する。消化は、３７℃で３０分間、実施し、続いて、１５分間、７５℃の酵素の不活性段階を実施する。
５．複合体は、９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、銀コロイド、凝集剤および水をＳＥＲＲＳのための調製に加える。
６．ＳＥＲＲＳは、５１４．５ｎｍ、１００％粉末、２０倍対物レンズ、１０秒で３回の蓄積にて、ＲｅｎｉｓｈａｗｉｎＶｉａＲａｍａｎを用いてすぐに収集する。
７．蛍光測定もまた可能である。

（結果）
図２２は、色素標識されたプローブを含まない実験に対するアッセイによる完全な実験のＳＥＲＲＳ反応を示す。ＴＡＭＲＡ反応の形は非常によく見える。コントロールにおいてピークの欠如が明らかである。

（ＳＥＲＲＳ活性プローブの合成）
ＳＥＲＲＳ活性プローブを合成し、これは不活性であるＳＥＲＲＳ標識を含むプローブ配列からなる。すなわち、それがプローブの形態である場合、ＳＥＲＲＳシグナルを与えない。この配列が標的配列にハイブリダイズした後、プローブは、λまたは他のエキソヌクレアーゼの作用後まで、不活性なままであり、ＳＥＲＲＳ標識を放出し、それにより、それをＳＥＲＲＳ活性にする。

ＳＥＲＲＳ活性プローブは、５’リン酸、プローブ配列、次に、酵素開裂後にＳＥＲＲＳ活性になる色素上の３’リン酸結合を有するオリゴヌクレオチドを生成することにより作製され得る。３’リン酸結合は、ＳＥＲＲＳ検出を使用する場合、「オフ」から「オン」に進行するアルカリ性ホスファターゼについての良好な基質であると示されているヒドロキシキノリンアゾ色素に直接結合することを可能にする（Ｆ．Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｎａｌｙｓｔ，２００８，ＤＯＩ１０．１０３９／Ｂ８０８７Ａ）。この方法において、ヒドロキシキノリンアゾ色素は、逆転したオリゴヌクレオチドのホスホルアミダイト合成、すなわち、５’から３’方向の合成（通常のオリゴヌクレオチド合成は３’から５’である）を用いて３’末端に加えられる。これにより、標準的な固相合成の間、ホスホルアミダイトとしてヒドロキシキノリンアゾ色素の付加が可能になる。アゾ色素のさらなる芳香族成分を変化させることにより、異なる色素と、異なる配列、各々異なるＳＥＲＲＳシグナルと共に使用することができる。従って、これにより多重化（マルチプレックス）を可能にする。

（８−ヒドロキシキノリン誘導色素の合成）

８−ヒドロキシキノリン誘導色素（３）を、ｏ−アミノベンゾニトリルのジアゾ化、続く、８−ヒドロキシキノリンとのカップリングにより調製した。色素を精製するために、最初にアセチル化し、それにより、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより出発物質から分離でき、ホスホルアミダイトに変換する前に脱アセチル化し得る。色素の合成を、^１Ｈ、^１３ＣＮＭＲ、質量スペクトルにより確認した。

（実験）
Ｏ−アミノベンゾニトリル（１当量）をＨＣｌ（５０％、１０ｍｌ）中で攪拌し、１０分間、徐々に加熱した。混合物を氷浴中で０℃まで冷却し、それに、２ｍｌの水（蒸留）中のＮａＮＯ_２（１．２当量）を滴下した。反応物を０℃で３０分間、攪拌して放置し、薄黄色の溶液を得た。別に、８−ヒドロキシキノリン（１当量）をＭｅＯＨ（３０ｍｌ）に溶解し、それにＮａＯＨ（１０％、１００ｍｌ）を加えた。８−ヒドロキシキノリン溶液を、１５分にわたって、ジアゾニウム塩溶液に滴下して、一晩、攪拌した。

反応物をＨＣｌ（５０％）の添加により中和し、得られた沈殿物を濾過により収集し、一晩乾燥させた。沈殿物を、触媒量の４−ジメチルアミノピリジンとともに無水酢酸（１００ｍｌ）に溶解した。ＴＣＬ分析により、完全な反応が示された。この混合物を１６００ｍｌの氷／水に注ぎ、３時間放置した。過剰の水を捨てて、十分な氷を赤い油／水混合物に加えて、沈殿を生じさせた。その沈殿物を収集し、乾燥させて、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；溶離液：ＤＣＭ−１％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、３８％収率で脱アセチル化標的生成物３を得た。δ_Ｈ（４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ）３．３１（１Ｈ，ｂｒ，ｓ，ＯＨ），７．２９−７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．０，ＡｒＨ），７．６７−７．７１（１Ｈ，ｔｄ，ＡｒＨ），７．７８−７．８１（１Ｈ，ｑ，Ｊ４．０，ＡｒＨ），７．８７−７．９１（１Ｈ，ｔｄ，ＡｒＨ），８．０６−８．１２（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ×３），９．００−９．０２（１Ｈ，ｄｄ，ＡｒＨ），９．３６−９．３８（１Ｈ，ｄｄ，ＡｒＨ）。

（８−ヒドロキシキノリン誘導色素３のＳＥＲＲＳ）
色素３のＳＥＲＲＳ活性を、凝集剤として１％ポリ−Ｌ−リジンを用いて溶液（０．１μＭ）の分析により確認した。５１４ｎｍレーザー源、１秒獲得、１００％電力、１４００ｃｍ^−１。ＳＥＲＲＳスペクトルを図２３に示す。

（８−ヒドロキシキノリン誘導色素ＤＮＡ修飾）

８−ヒドロキシキノリン誘導色素３のホスフィチル化を、クロロホスフィチル化試薬４を用いて実施して、ホスホルアミダイト５を得た。Ｐ^ＩＩＩホスホルアミダイトの合成を、^３１ＰＮＭＲにより確認した。ホスホルアミダイト５を、逆塩基合成を用いて３’色素標識プローブ配列を生成するために使用し、リン酸ＣＰＧカラムの使用により５’末端にリン酸を導入した。

８−ヒドロキシキノリン誘導色素３のホスフィチル化を、クロロホスフィチル化試薬４を用いて実施して、ホスホルアミダイト５を得た。Ｐ^ＩＩＩホスホルアミダイトの合成を、^３１ＰＮＭＲにより確認した。ホスホルアミダイト５を、逆塩基合成を用いて３’色素標識プローブ配列を生成するために使用し、リン酸ＣＰＧカラムの使用により５’末端にリン酸を導入した。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）標的核酸の検出に使用するための方法であって、
（ｉ）標的核酸が存在する場合、前記標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と、
（ｉｉｉ）ラマン分光法によって前記標識を検出する工程と、
を含む方法。
（２）前記エキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド合成能力を有さない、（１）に記載の方法。
（３）前記プローブ核酸は５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）工程（ｉ）において、過剰な前記プローブ核酸を前記対象試料と接触させ、その結果、工程（ｉｉ）における二本鎖の消化は、１回以上、前記標的核酸を再利用し、それによって、さらなるプローブ分子が、前記標的に特異的にハイブリダイズでき、さらなる標識分子を放出するために消化されるさらなるプローブ／標的核酸二本鎖を形成する、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）存在する場合、前記標的核酸を検出するように、前記標識における検出可能な変化を検出する工程をさらに含む、（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法。
（６）前記対象試料における標的核酸の量を、前記変化の大きさに関連して決定する、（５）に記載の方法。
（７）前記プローブ核酸はＤＮＡである、（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（８）前記標的核酸はＤＮＡである、（１）〜（７）のいずれか１に記載の方法。
（９）前記標的核酸は二本鎖核酸である、（１）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）前記標的核酸は一本鎖核酸である、（１）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１１）前記標識は、前記プローブ／標的核酸二本鎖の消化によって前記二本鎖核酸から放出される場合、ラマン分光法によってのみ検出され得る、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）前記標識はＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性色素である、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
（１３）前記標識はＳＥＲＲＳ標識である、（１）〜（１２）のいずれか１に記載の方法。
（１４）前記標識はフルオロフォアである、（１）〜（１３）のいずれか１に記載の方法。
（１５）前記標識は３’ヒドロキシキノリン色素である、（１４）に記載の方法。
（１６）前記プローブは、フルオロフォア、および前記消化前に前記フルオロフォアをクエンチするクエンチャーを含む、（１）〜（１５）のいずれか１に記載の方法。
（１７）前記ラマン分光法によって検出する工程は、プラズモニクスまたは蛍光に基づいた検出によって補われる、（１）〜（１６）のいずれか１に記載の方法。
（１８）前記プローブ配列は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性基質に付着される、（１）〜（１７）のいずれか１に記載の方法。
（１９）前記基質はナノ粒子の表面である、（１８）に記載の方法。
（２０）前記標識は、工程（ｉ）において前記プローブ核酸および前記対象試料と接触させ、前記標識は、形成される場合、前記プローブ／標的核酸二本鎖内に挿入できる、（１）〜（１９）のいずれか１に記載の方法。
（２１）前記標識は、前記二本鎖の副溝または主溝に結合できる、（２０）に記載の方法。
（２２）前記標識は、副溝結合剤である、（２１）に記載の方法。
（２３）前記標識は、前記プローブ核酸に付着、結合、または会合される、（１）〜（１９）のいずれか１に記載の方法。
（２４）前記プローブ核酸は、前記標識に結合される、（２３）に記載の方法。
（２５）前記プローブ核酸は、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、（１）〜（２４）のいずれか１に記載の方法。
（２６）前記接触させる工程は、第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程を含み、第１のプローブ核酸は、前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列、および標的核酸に対する第１のプローブ核酸のハイブリダイゼーションから得られる二本鎖の捕捉を可能にする捕捉部分を含み、第２のプローブは、第１のプローブ核酸が相補的である部分以外の前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列、および前記標識を含む、（１）〜（１７）のいずれか１に記載の方法。
（２７）前記対象試料を第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程により形成された二本鎖は、前記接触させる工程の後、前記検出する工程の前に前記二本鎖の部分でない他の物質から単離される、（２６）に記載の方法。
（２８）前記接触させる工程は、第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程を含み、第１のプローブ核酸は、前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列および第２のプローブ核酸の一部と相補的な核酸の配列を含む、（１）〜（１７）のいずれか１に記載の方法。
（２９）前記接触させる工程は、捕捉核酸と接触させる工程をさらに含み、前記捕捉核酸は、第１のプローブ核酸が相補的でない前記標的核酸の一部と相補的であり、かつ捕捉可能な核酸複合体の捕捉を可能にする捕捉可能な部分に結合されており、前記捕捉可能な核酸複合体は、前記標的核酸が存在する場合、前記接触させる工程で形成される、（２８）に記載の方法。
（３０）前記捕捉可能な核酸複合体は、前記接触させる工程の後で前記検出する工程の前に、前記二本鎖の部分でない他の物質から単離される、（２９）に記載の方法。
（３１）前記標識は、第２のプローブ核酸に付着、結合、または会合される、（２６）〜（３０）のいずれか１に記載の方法。
（３２）第２のプローブ核酸は前記標識に結合される、（３１）に記載の方法。
（３３）第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸は各々、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、（２６）〜（３２）のいずれか１に記載の方法。
（３４）対象試料における複数の異なる標的核酸を同時に検出するための方法であって、（１）〜（３３）のいずれか１に記載される方法のうちの複数を同時に実施する工程を含み、異なる標識を前記標的核酸の各々を検出するために使用する、上記方法。
（３５）（ｉ）一本鎖プローブ核酸と、（ｉｉ）エキソヌクレアーゼと、（ｉｉｉ）（１）〜（３４）のいずれか１に記載される方法に使用するためのラマン分光法によって検出可能な標識とを含む、部材キット。
（３６）前記エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである、（３５）に記載のキット。

Claims

標的核酸の検出に使用するための方法であって、
（ｉ）標的核酸が存在する場合、前記標的核酸に対する一本鎖プローブ核酸の特異的ハイブリダイゼーションによってプローブ／標的核酸二本鎖を生成するのに有効な条件下で、一本鎖プローブ核酸を対象試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）プローブ／標的核酸二本鎖のいずれかをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖の消化と前記二本鎖からの標識分子の放出を生じさせる工程と、
（ｉｉｉ）ラマン分光法によって前記標識を検出する工程と、
を含む方法。
前記エキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチド合成能力を有さない、請求項１に記載の方法。
前記プローブ核酸は５’リン酸基を有し、前記エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである、請求項１または請求項２に記載の方法。
工程（ｉ）において、過剰な前記プローブ核酸を前記対象試料と接触させ、その結果、工程（ｉｉ）における二本鎖の消化は、１回以上、前記標的核酸を再利用し、それによって、さらなるプローブ分子が、前記標的に特異的にハイブリダイズでき、さらなる標識分子を放出するために消化されるさらなるプローブ／標的核酸二本鎖を形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
存在する場合、前記標的核酸を検出するように、前記標識における検出可能な変化を検出する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記対象試料における標的核酸の量を、前記変化の大きさに関連して決定する、請求項５に記載の方法。
前記プローブ核酸はＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記標的核酸はＤＮＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記標的核酸は二本鎖核酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記標的核酸は一本鎖核酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記標識は、前記プローブ／標的核酸二本鎖の消化によって前記二本鎖核酸から放出される場合、ラマン分光法によってのみ検出され得る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記標識はＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性色素である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記標識はＳＥＲＲＳ標識である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記標識はフルオロフォアである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記標識は３’ヒドロキシキノリン色素である、請求項１４に記載の方法。
前記プローブは、フルオロフォア、および前記消化前に前記フルオロフォアをクエンチするクエンチャーを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
前記ラマン分光法によって検出する工程は、プラズモニクスまたは蛍光に基づいた検出によって補われる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
前記プローブ配列は、ＳＥ（Ｒ）ＲＳ活性基質に付着される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記基質はナノ粒子の表面である、請求項１８に記載の方法。
前記標識は、工程（ｉ）において前記プローブ核酸および前記対象試料と接触させ、前記標識は、形成される場合、前記プローブ／標的核酸二本鎖内に挿入できる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記標識は、前記二本鎖の副溝または主溝に結合できる、請求項２０に記載の方法。
前記標識は、副溝結合剤である、請求項２１に記載の方法。
前記標識は、前記プローブ核酸に付着、結合、または会合される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
前記プローブ核酸は、前記標識に結合される、請求項２３に記載の方法。
前記プローブ核酸は、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記接触させる工程は、第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程を含み、第１のプローブ核酸は、前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列、および標的核酸に対する第１のプローブ核酸のハイブリダイゼーションから得られる二本鎖の捕捉を可能にする捕捉部分を含み、第２のプローブは、第１のプローブ核酸が相補的である部分以外の前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列、および前記標識を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記対象試料を第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程により形成された二本鎖は、前記接触させる工程の後、前記検出する工程の前に前記二本鎖の部分でない他の物質から単離される、請求項２６に記載の方法。
前記接触させる工程は、第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸と接触させる工程を含み、第１のプローブ核酸は、前記標的核酸の一部と相補的な核酸の配列および第２のプローブ核酸の一部と相補的な核酸の配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
前記接触させる工程は、捕捉核酸と接触させる工程をさらに含み、前記捕捉核酸は、第１のプローブ核酸が相補的でない前記標的核酸の一部と相補的であり、かつ捕捉可能な核酸複合体の捕捉を可能にする捕捉可能な部分に結合されており、前記捕捉可能な核酸複合体は、前記標的核酸が存在する場合、前記接触させる工程で形成される、請求項２８に記載の方法。
前記捕捉可能な核酸複合体は、前記接触させる工程の後で前記検出する工程の前に、前記二本鎖の部分でない他の物質から単離される、請求項２９に記載の方法。
前記標識は、第２のプローブ核酸に付着、結合、または会合される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
第２のプローブ核酸は前記標識に結合される、請求項３１に記載の方法。
第１のプローブ核酸および第２のプローブ核酸は各々、約２０〜約３０ヌクレオチドを含む、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
対象試料における複数の異なる標的核酸を同時に検出するための方法であって、請求項１〜３３のいずれか１項に記載される方法のうちの複数を同時に実施する工程を含み、異なる標識を前記標的核酸の各々を検出するために使用する、上記方法。
（ｉ）一本鎖プローブ核酸と、
（ｉｉ）エキソヌクレアーゼと、
（ｉｉｉ）請求項１〜３４のいずれか１項に記載される方法に使用するためのラマン分光法によって検出可能な標識と、
を含む、部材キット。
前記エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである、請求項３５に記載のキット。