CN111879738B

CN111879738B - 一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN111879738B
Application number: CN202010541943.0A
Authority: CN
Inventors: 贾敏; 唐琳; 刘雨婕; 陈爽
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Jiangsu Heyoute Gene Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111879738A

Abstract

本发明提供一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用，属于生物检测分析技术领域。本发明采用SYBR Green I荧光染料对互补碱基进行染色，进行非标记型适配体探针体系的设计，不仅实现信号放大，且成本更加低廉；通过引发链的设计能够引发四种发夹形成大量的四臂连接体，以产生更多的互补配对碱基，可与更多SYBR Green I结合，在减少信号泄露的同时，实现信号的循环放大；同时基于T7核酸外切酶特性，从而对实验中未引发的发夹酶解，降低了背景信号干扰，提高了CAP检测的灵敏度，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

氯霉素(CAP)是一种从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuel)中得到的中性硝基苯衍生物。通常作为一种兽药用来治疗和预防各种病菌引起的感染。然而，CAP在带来益处的同时还潜伏着许多危险，如再生障碍性贫血、白血病和灰色婴儿综合征的产生。因此，基于对人们健康的考虑众多国家和地区都对CAP有了严格的限制和管控。例如，欧盟规定牛奶、肉类和海鲜中的CAP最大残留量为0.3μg/kg。中国规定在动物性食品中CAP不得检出。目前已经开发出众多检测CAP的方法，主要包括微生物学方法，酶联免疫吸附测定(ELISA)，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，高效液相色谱(HPLC)和免疫测定。但是这些方法都存在一定的不足。例如，微生物方法灵敏度低且特异性差，而色谱方法需要昂贵的仪器并且很耗时。尽管免疫测定方法具有良好的敏感性和高特异性，但抗原和抗体难以获得，检测复杂，结果易受基质干扰，导致假阴性和假阳性。因此，迫切需要一种简单，快速且低成本的方法来灵敏地测定动物组织中的CAP。

核酸适配体作为一种新型识别元件，对目标分子具有高亲和力，具有稳定性好，目标广泛，易于合成，修饰方便等优点，是一种优良的抗体替代识别元件。标记型适配体探针用于检测具有显而易见的优势。但发明人发现，所用到的FAM、Cy5等荧光基团需提前进行适配体修饰，可能导致适配体与待测物亲和力不足、结合过程受阻等问题。而无标记适配体利用荧光核酸染料代替荧光团标记，避免了复杂的修饰过程，具有操作简单，成本低的优点。SYBR Green I是一种结合于所有DNA双链双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在溶液中仅存在游离单链时，SYBR Green I发出微弱的荧光，而当其与双链结合时，荧光增强。

发夹自组装反应(CHA)是常用的分子检测方法，主要包括引发链和两个发夹型探针，可以形成大量的双链结构，从而达到信号放大的目的。CHA反应不仅可以提高检测的灵敏度，还能够根据设计生成不同构型的组装体。然而，发明人发现，在反应过程中伴随着双链产生的同时，还会存在信号泄露的不足。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用。本发明采用SYBR Green I荧光染料对互补碱基进行染色，进行非标记型适配体探针体系的设计，不仅实现信号放大，且成本更加低廉；设计四个DNA发夹和相应的引发链，引发链可引发四种发夹的自主装反应，形成大量的四臂连接体，以产生更多的互补配对碱基，可与更多SYBR Green I结合，在减少信号泄露的同时，实现信号的循环放大；另外体系中引入T7核酸外切酶，基于T7核酸外切酶特性，酶解实验中的双链结构与未引发的发夹，降低了背景信号干扰，提高了CAP检测的灵敏度。因此，该方法具有良好的实际应用之价值。

本发明的技术方案为：

本发明的第一方面，提供一种非标记型适配体探针体系，所述非标记型适配体探针体系至少包括引发链、适配体、发夹结构和T7核酸外切酶；

其中，所述引发链和适配体能够发生互补形成双链结构；

所述适配体为待测物对应的适配体；

所述发夹结构至少存在4种，4种发夹结构在引发链引发作用下，可依次互补结合形成特定的四臂连接体结构。

所述非标记型适配体探针体系还包括荧光染料。

所述待测物可以为氯霉素，当所述待测物为氯霉素时；

所述引发链核苷酸序列为如下a)、b)或c)：

a)5’-TTT TTG CCT AAC TAC CAC CGA TT-3’(SEQ ID NO.1)；

b)5’-TTT TTT CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.2)；

c)5’-TTT TTC TGC CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.3)。

所述适配体核苷酸序列为如下d)：

d)5’-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA GTT AGG CAG-3’(SEQ ID NO.4)；

所述4种发夹结构分别命名为H1、H2、H3和H4，核苷酸序列如下：

H1：5’-CTA CCA CCG ATT TGA AAC AAT CGG TGG TAG TTA GGC-3’(SEQ IDNO.5)；

H2：5’-CCG ATT TGA AAC GCC TAA GTT TCA AAT CGG TGG TAG-3’(SEQ IDNO.6)；

H3：5’-TGA AAC GCC TAA CTA CCA TTA GGC GTT TCA AAT CGG-3’(SEQ IDNO.7)；

H4：5’-GCC TAA CTA CCA CCG ATT TGG TAG TTA GGC GTT TCA-3’(SEQ IDNO.8)。

本发明的第二个方面，提供上述非标记型适配体探针体系在检测CAP中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种检测待测样品中CAP的方法，所述方法包括：

向引发链与适配体结合形成的双链结构中加入待测样品进行孵育，接着加入发夹结构进行孵育，然后加入T7核酸外切酶继续进行孵育得混合液。

所述待测样品包括但不限于食品，如蔬菜、水果、肉制品和乳制品等。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

1)上述技术方案建立了一种非标记型适配体探针体系检测CAP的方法。引发链能够引发四种发夹形成四臂连接体，并释放引发链，再次引发发夹形成四臂连接体，结合大量SYBR Green I，最终实现信号的循环放大。其次，将SYBR Green I作为该实验的荧光染料，不仅实现了对四臂连接体的信号表达，同时相较于修饰型荧光染料性质更加稳定，成本更加低廉。

2)上述技术方案基于T7核酸外切酶的特性，四臂连接体由于其结构十分稳定，无法被酶切，但过量的适配体/引发链杂交复合物和发夹结构可以被T7核酸外切酶酶解，从而降低了背景信号干扰，提高了CAP检测的灵敏度。同时，上述技术方案具有检测时间快、检测成本低等优点，因此具有良好的实际推广应用之价值。

说明书附图

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中非标记型荧光适配体探针检测CAP的原理图；

图2为本发明实施例中非标记型荧光适配体探针在不同体系的荧光光谱图；

图3为本发明实施例中非标记型荧光适配体探针在不同体系的凝胶电泳图；

图4为本发明实施例中适配体互补序列的优化图；

图5为本发明实施例中四臂连接体形成时间的优化图；

图6为本发明实施例中发夹浓度的优化图；

图7为本发明实施例中对T7核酸外切酶浓度和时间的优化图；其中，A为T7核酸外切酶浓度的优化图；B为T7核酸外切酶反应时间的优化图；

图8为本发明实施例中SYBR Green I浓度的优化图；

图9为本发明实施例中pH值的优化图；

图10为本发明实施例中非标记型荧光适配体探针检测CAP的研究；其中，A为体系中加入不同浓度CAP的荧光光谱图；B为体系中加入不同浓度CAP的标准曲线；

图11为本发明实施例中基于非标记型荧光适配体探针对抗生素的特异性评价图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，发夹自组装(CHA)反应不仅可以提高检测的灵敏度，还能够根据设计生成不同构型的组装体。然而，在反应过程中伴随着双链产生的同时还会存在信号泄露的不足，即在没有引发链存在时，发夹之间也会互补形成双链结构。为避免这种问题的产生，设计DNA四臂连接体结构，可利用引发链依次引发四个不同的发夹结构形成四臂连接体，循环催化从而实现信号的放大，同时减少信号的泄露。另外，因为其含有丰富的碱基配对，所以DNA四臂连接体可以与更多SYBR Green I的结合，并显示强荧光信号，提高方法灵敏度。

同时，T7核酸外切酶是一类能够沿5’→3’方向酶解双链DNA的核酸外切酶，但是对单链及双链RNA无效。相较于其他外切酶，T7核酸外切酶具有无需特异性识别位点的优点，在DNA序列的设计上更容易。在本实验中所形成的四臂连接体，由于其结构十分稳定，T7核酸外切酶无法酶解，而所使用的DNA发夹和适配体/引发链形成的双链复合物可以被T7核酸外切酶酶解，从而达到降低背景信号，实现目标物定量测定的目的。

有鉴于此，本发明建立了一种基于DNA四臂连接体和T7核酸外切酶的非标记型荧光探针方法。引入SYBR Green I作为荧光报告信号，对CAP进行检测。如图1所示，CAP适配体与引发链Primer互补结合形成适配体/引发链双链复合物，当CAP存在时，由于适配体与靶标的特异性结合，使引发链解离，解离的引发链引发四个发夹依次打开形成大量的四臂连接体，加入T7核酸外切酶消除过量的双链复合物和未引发的发夹。在加入SYBR Green I后，四臂连接体与SYBR Green I结合产生高的信号值。当CAP不存在时，CAP适配体与引发链形成的双链无法打开，无法引发四个发夹，加入T7核酸外切酶后可将双链复合物和发夹酶解，加入SYBR Green I后，产生较低的荧光。另外产生的四臂连接体含有产生更多的荧光信号，更好的实现信号放大效果以用于CAP的高灵敏和高特异性检测。

具体的，本发明的一个典型实施方式中，提供一种非标记型适配体探针体系，所述非标记型适配体探针体系至少包括引发链、适配体、发夹结构和T7核酸外切酶；

其中，所述引发链和适配体能够发生互补形成双链结构。

所述适配体为待测物对应的适配体。

所述发夹结构至少存在4种，4种发夹结构在引发链作用下，基于发夹自组装(CHA)原理可依次互补结合形成特定的四臂连接体结构。

本发明的又一具体实施方式中，所述非标记型适配体探针体系还包括荧光染料，在本发明的一个具体实施例中，所述荧光染料为SYBR Green I作为非标记的荧光染料之一，主要作用于DNA双链，对单链无效。在溶液中仅有游离的单链存在时，几乎无荧光产生，而当双链存在时，荧光增强。因此，本发明利用SYBR Green I双链DNA染色的特性，对所产生的四臂连接体进行染色，实现信号的产生。

本发明的又一具体实施方式中，所述待测物可以为氯霉素。

当所述待测物为氯霉素时，

所述引发链核苷酸序列为如下a)或b)或c)：

a)5’-TTT TTG CCT AAC TAC CAC CGA TT-3’(SEQ ID NO.1)；

b)5’-TTT TTT CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.2)；

c)5’-TTT TTC TGC CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.3)。

所述适配体核苷酸序列为如下或d)：

H1：5’-CTA CCA CCG ATT TGA AAC AAT CGG TGG TAG TTA GGC-3’(SEQ IDNO.5)；

H2：5’-CCG ATT TGA AAC GCC TAA GTT TCA AAT CGG TGG TAG-3’(SEQ IDNO.6)；

H3：5’-TGA AAC GCC TAA CTA CCA TTA GGC GTT TCA AAT CGG-3’(SEQ IDNO.7)；

H4：5’-GCC TAA CTA CCA CCG ATT TGG TAG TTA GGC GTT TCA-3’(SEQ IDNO.8)。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述非标记型适配体探针体系在检测氯霉素中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测待测样品中氯霉素的方法，所述方法包括：

本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法还包括向混合液中加入荧光染料；优选的，所述荧光染料为SYBR Green I，所述SYBR Green I浓度为5～30×；SYBR Green I浓度偏高或者偏低，都会使检测结果产生偏差；通过试验验证，当SYBR Green I浓度为25×后，继续增加SYBR Green I浓度则荧光强度不再发生变化，因此最优选的，所述SYBR GreenI浓度为25×。

本发明的又一具体实施方式中，加入待测样品进行孵育具体条件为震荡充分37℃恒温孵育30min。

本发明的又一具体实施方式中，加入发夹结构进行孵育具体条件为：30～40℃下孵育10～60min，优选为37℃恒温孵育40min，当孵育40min后，引发链引发的四种发夹结构形成四臂连接体的数量趋于平稳，不再增多，因此选择40min作为形成四臂连接体的最佳时间。

加入发夹结构的浓度为2～6μM，如2、3、4、5、6μM，经试验证明，当发夹浓度在2～5μM时，荧光比值呈现逐渐上升趋势，此时随着发夹浓度的逐渐增高，形成的四臂连接体越来越多，在5μM之后，荧光比值保持稳定，因此发夹的最佳浓度为5μM。

本发明的又一具体实施方式中，加入T7核酸外切酶继续进行孵育具体条件为：30～40℃下孵育10～60min，优选为37℃恒温孵育40min，随着时间的逐渐增加T7核酸外切酶不断地将游离的发夹结构逐渐酶解，荧光比值呈现逐渐降低，并在40min达到平台期，因此选择40min作为最佳酶解时间。

所述T7核酸外切酶浓度为1～20U，如5、10、15、20U，优选为10U；T7核酸外切酶浓度与测得的荧光值成反比，说明T7核酸外切酶在将未引发的发夹结构酶解，在10U后保持平稳，表明此时已经将游离的发夹基本完全酶解，因此选择10U作为T7核酸外切酶的最佳浓度。

本发明的又一具体实施方式中，上述反应体系pH为中性或弱碱性，优选为7.0～7.8，如7.0、7.2、7.4、7.6、7.8；最优选为7.2；经试验证明，pH值从7.0到7.2时荧光比值快速攀升，7.2之后逐渐下降，因此该体系的最优pH值为7.2。

本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法还包括对加入荧光染料后的混合液进行荧光测定；具体的，基于荧光染料光学性质调整检测装置(如荧光分光光度计)的激发和发射范围进行荧光测定。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1.试验材料与方法

1.1试剂

表1主要材料与试剂

表2核苷酸序列表

注：表中斜体部分为CAP适配体与引发链Primer互补区域。

(1)PBS缓冲溶液(10μM)

甲液：4.38g氯化钠固体，1.27g氯化镁固体，7.8g磷酸二氢钠固体，500mL。乙液：4.38g氯化钠固体，17.91g磷酸氢二钠固体，500mL，4℃储存备用，使用时将甲液与乙液混匀调至pH值为7.4。

(2)10×TE缓冲溶液

天平称量Tris-Base固体1.21g、EDTA固体0.372g，调节pH值至7.8，定容至10mL，置于4℃待用。

(3)CAP储备液(100mg/L)

天平称量0.01g CAP固体，用缓冲溶液稀释至100mL，4℃冰箱备用。

(4)Primer、CAP适配体及四种发夹用1×TE缓冲液分别稀释至100μM，分装并标号、置于-20℃冰箱。

(5)双链的制备

取100μM的Primer及CAP适配体，用1×PBS缓冲溶液稀释至1μM，并将等体积的两种溶液混匀，孵育后备用。

1.2仪器

表3主要仪器与设备

1.3体系的构建

此荧光体系主要是由CAP适配体、引发链Primer、发夹H1、H2、H3、H4以及T7核酸外切酶构成。首先CAP适配体与Primer互补形成双链复合物，当CAP存在时，由于适配体与靶标的特异性结合使Primer在双链中解离，解离的Primer会引发发夹(H1、H2、H3、H4)依次互补结合形成特定的四臂连接体结构，同时不可避免的会存在部分发夹没有被引发，根据T7核酸外切酶能够酶解双链的特性，将未被引发的发夹结构酶解，而此时由于四臂连接体的稳定结构，T7核酸外切酶无法使其酶解，最后用SYBR Green I对四臂连接体进行染色；当无CAP存在时，由于Primer与CAP适配体始终处于双链结构，无法成为单链也就无法引发四个发夹，当T7核酸外切酶存在时，会酶解游离的四种发夹和适配体/引发链的双链结构，之后用SYBR Green I进行染色。因此，将孵育好的100μL、1μM双链结构以及CAP加入1.5mL的EP管中，充分混匀，37℃孵育30min，接着加入15μL、5μM的发夹(H1、H2、H3、H4)待1h后，把10U的T7核酸外切酶加入管中，放入37℃水浴锅中1h，最后用SYBR Green I染色，置于比色皿中测定其荧光值。

1.4检测CAP的方法及步骤

取100μL双链结构以及配制好的100μL不同浓度的CAP置于1.5mL的EP管中，震荡充分37℃恒温孵育30min；接着加入15μL、5μM的发夹(H1、H2、H3、H4)孵育；然后将10U的T7核酸外切酶加入其中，在37℃下孵育1h，最后将5μL的SYBR Green I(25×)加入上述混合液中。待反应完全后将混合液放入石英比色皿中，根据荧光染料SYBR Green I的光学性质，准确调整F-7000荧光分光光度计的激发和发射范围进行测定。

1.5凝胶电泳方法

经过称量、加热、插梳子等步骤制得1％的琼脂糖凝胶，并加入已经孵育好的四种不同样品及SYBR Green I后插入电极，凝胶电泳的电压设为200V，时间为半小时。最后取出在紫外仪下观察凝胶电泳图像。

1.6检测牛奶样品中的CAP

将购买的纯牛奶取2mL用超纯水稀释至原体积的5倍，接着滴加10％的三氯乙酸调至pH值为4.6，使牛奶中的蛋白质变性产生沉淀。12000r/min离心25min后，用0.22μm滤膜过滤取上清液即为最终样品。在牛奶样品中加入不同浓度的CAP并按1.4步骤进行检测。

2结果与讨论

2.1实验的可行性分析

为了验证非标记型适配体探针体系用于检测CAP的可行性，将SYBR Green I分别与不同的体系结合，在分光光度计下测定相对应的荧光值。图2得出结果，CAP适配体与Primer形成双链结构，CAP的加入会使适配体自适应地折叠成特定的构象结构，进而与CAP结合，使Primer从双链中解离并依次引发四种发夹形成四臂连接体结构，待加入SYBRGreen I后，基于SYBR Green I只染双链的特点，此时显示较高的荧光强度(1曲线)。由于四种发夹本身存在互补结构，以及CAP适配体与Primer也构成双链结构，因此，在没有CAP存在时，产生的荧光值也相对偏高(2曲线)。由于CAP适配体与CAP特异性结合，使Primer脱落，并引发四种发夹依次互补形成四臂连接体结构，加入T7核酸外切酶后，基于T7核酸外切酶能酶解5’单核苷酸的特性，将未能引发的游离在体系中的发夹结构酶解，待加入SYBR GreenI后，相较于未加T7核酸外切酶(1曲线)时的荧光强度有明显的下降(3曲线)，即T7核酸外切酶酶解了未引发的发夹结构，引起荧光信号的降低。基于此，在没有CAP时，Primer始终固定在双链中，当体系中存在发夹结构时，T7核酸外切酶可酶解将双链结构和发夹结构。因此，加入SYBR Green I后的荧光值较低(4曲线)。

在此基础上又通过琼脂糖凝胶电泳进一步验证了该实验的可行性。图3所示，泳道1为双链加入CAP和发夹(H1、H2、H3、H4)之后，由于Primer从双链中解离，从而引发四个发夹形成四臂连接体产生明亮的条带，而未能引发的发夹以及与其碱基数差不多的CAP适配体显示较弱的条带。泳道2为双链加入CAP、四种发夹以及T7核酸外切酶之后，由于T7核酸外切酶可将未引发的游离在体系中的发夹结构酶解，因此看到条带颜色明显变浅，而四臂连接体的条带无变化，说明T7核酸外切酶可酶解发夹，但不能酶解四臂连接体结构。泳道3为双链复合物及发夹存在时的条带图，发现只有在发夹处有明亮的条带出现，即在没无CAP存在时，Primer未解离，无法引发发夹结构形成四臂连接体。泳道4是在3的基础上加入T7核酸外切酶，基于T7核酸外切酶能酶解5’单核苷酸的特性，把双链复合物和未能引发的游离在体系中的发夹结构酶解，因此可以看到相较于泳道2，泳道4在发夹及CAP适配体处无明显的条带。基于荧光光谱实验和电泳图的验证，表明该实验具备可行性。

2.2实验条件的优化

2.2.1适配体与互补序列的优化

为了使适配体最大程度的发挥作用，对CAP适配体的互补序列进行了优化，在此选用了三种不同长度Primer(Primer 1、Primer 2和Primer 3)，与CAP适配体分别有16、14和18对互补碱基，表1所示。分别取100μL加入100μL、50μg/L的CAP中，振荡混匀，孵育30min；将5μL的SYBR Green I(25×)加入上述混合液中。每组实验做三次，同时做对照实验。图4所示，当CAP适配体与Primer 1构成双链结构(1-1)时，此时有16个碱基互补对，荧光差值最为明显，因此选用Primer 1作为最佳互补链。

2.2.2四臂连接体形成时间的优化

四臂连接体形成时间是实验中重要的优化条件之一。首先取100μL先前制备的双链结构，加入100μL、50μg/L的CAP，混合均匀孵育30min，接着将四种发夹加入混合液中，分别孵育0、10、20、30、40、50、60min后，再加入10U的T7核酸外切酶，37℃孵育60min，最后加入SYBR Green I进行测定(F-F₀)/F₀，F₀是四臂连接体孵育0min的加荧光值。如图5所示，随着时间的增加，荧光强度逐渐增高，即Primer引发四种发夹依次形成四臂连接体的数量逐渐增多，在40min后趋于平稳，因此选用40min作为本实验中形成四臂连接体的最佳时间。

2.2.3发夹浓度的优化

对实验中发夹的浓度进行优化，分别配制2、3、4、5、6μM的发夹15μL，分别与不加CAP的体系做对比。每组均做三次平行实验，通过测定无目标物加入时的荧光强度F₀和有目标物加入的荧光强度F，计算(F-F₀)/F₀。如图6所示，当发夹浓度在2～5μM时，荧光比值呈现逐渐上升趋势，此时随着发夹浓度的逐渐增高，形成的四臂连接体越来越多，在5μM之后，荧光比值保持稳定，因此发夹的最佳浓度为5μM。

2.2.4酶浓度和时间的优化

为了提高实验的灵敏度，酶的优化在实验中尤为关键。在此，对T7核酸外切酶的浓度和时间进行了优化。首先，将100μL、50μg/L的CAP加入到100μL制备好的双链混合液中，混匀静置30min后，加入四种发夹孵育60min，接着分别加入不同浓度(0、5、10、15、20U)的T7核酸外切酶，待SYBR Green I加入后，通过分光光度计测量其荧光值。图7A所示，T7核酸外切酶浓度与测得的荧光值成反比，说明T7核酸外切酶在将未引发的发夹结构酶解，在10U后保持平稳，表明此时已经将游离的发夹基本完全酶解，因此选择10U作为T7核酸外切酶的最佳浓度。

基于上述实验步骤，在加入T7核酸外切酶后，又对酶解的时间进行优化，设置0、10、20、30、40、50、60min为酶解时间，每组平行做三次，测定荧光值得到图7B，随着时间的逐渐增加T7核酸外切酶不断地将游离的发夹结构逐渐酶解，荧光比值呈现逐渐降低，并在40min达到平台期，因此选40min作为最佳酶解时间。

2.2.5 SYBR Green I浓度的优化

若在实验中SYBR Green I浓度偏高或者偏低，都会使检测结果产生偏差，因此本发明对实验中SYBR Green I浓度进行优化。依据1.4步骤进行实验，最后分别加入5×、10×、15×、20×、25×、30×的SYBR Green I，通过荧光分光光度计测定荧光值，图8显示，SYBR Green I浓度在5×至25×范围内时，荧光值逐渐增强，并大约在25×时荧光强度不再发生变化。因此，在后续的实验中选用SYBR Green I的浓度为25×。

2.2.6 pH值的优化

pH值影响T7核酸外切酶的活性和四臂连接体的形成，因此对体系的pH值进行了优化。本实验分别配制了五种pH值(7.0、7.2、7.4、7.6、7.8)的PBS缓冲溶液，即将甲液与乙液混合至相应的pH值。首先用每种缓冲溶液分别稀释CAP适配体和Primer至1μM，四种发夹稀释至5μM备用，同时将CAP标准液用不同的缓冲稀释至50μg/L，按照2.3的步骤操作，其中F为无CAP时的荧光值，F₀为加入不同CAP浓度进行测定时的结果，计算(F-F₀)/F₀。图9所示，pH值从7.0到7.2时荧光比值快速攀升，7.2之后逐渐下降，因此该体系的最优pH值为7.2。

2.3 CAP测定的线性范围

根据上述的优化结果，运用该方法对不同CAP的浓度进行测定和分析。在体系中加入不同浓度的CAP(0、0.001、0.005、0.01、0.1、1、10、20、35、50μg/L)反应后，将反应液放入石英比色皿中进行测定。如图10A所示，CAP的浓度与荧光值呈正比，表明形成的四臂连接体逐渐增加。此外CAP浓度在1ng/L～10μg/L时与荧光值呈线性关系(y＝56.983lgx+383.874，R²＝0.995)最低检出限为0.72ng/L，具有良好的灵敏度。

2.4特异性评价

分别选用Kana、GEN、OTC、SM、TET五种类似物进行抗干扰实验，将上述类似物及CAP按1.4的步骤进行操作并测定。图11展示结果，横坐标为不同的抗生素类似物，纵坐标为有无类似物加入后测得荧光强度差值△F，由图11可知，当向体系中分别加入这五种抗生素时，仅有CAP的体系荧光值明显高于其他几种，且对比其他几组变化明显，即只有CAP与适配体能够特异性结合，使Primer从双链解离，并引发四种发夹形成大量的四臂连接体结构。因此，本实验对CAP的测定具有良好的特异性。

2.5牛奶样品中的回收率

处理牛奶样品，得到实验结果如表4，回收率在95.5％～106.6％之间，相对标准偏差为3.27％～6.58％，表明该方法进行检测具有良好的准确性和稳定性。

表4基于非标记型荧光适配体传感器检测牛奶中CAP的加标回收率

此外，选取了几种已经报道过的CAP检测方法与之进行对比。见表5，通过对比它们的线性范围和检测限，可以看出该方法通过CHA进行信号放大实现了对CAP的灵敏检测，检测限明显低于其他几种方法，同时T7核酸外切酶的加入降低了背景信号的干扰。

表5本方法与其它方法的比较

综上，本发明建立了一种非标记型荧光适配体探针，基于DNA四臂连接体和T7核酸外切酶利用SYBR Green I产生荧光对CAP进行检测。CAP的加入使Primer从双链中解离，引发四个发夹(H1、H2、H3、H4)形成四臂连接体，并通过加入的T7核酸外切酶将游离的发夹结构酶解，利用SYBR Green I在双链中产生荧光的特性对形成的四臂连接体进行荧光测定。运用靶向催化四臂连接体的方法检测CAP，最终得出，CAP浓度在0.001-10μg/L时与荧光强度呈线性关系，检测限为0.72ng/L。用于实际牛奶样品中检测，回收率范围95.5％～106.6％之间，证明该方法进行CAP的检测具有良好的准确性和稳定性。该方法仅通过Primer的循环使用及T7核酸外切酶酶解发夹实现了信号放大和检测灵敏度的提高，为CAP的检测提供新方法。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttttgccta actaccaccg att 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttttttctaa ctaccaccga tt 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttttctgcc taactaccac cgatt 25

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag ttaggcag 48

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaccaccga tttgaaacaa tcggtggtag ttaggc 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgatttgaa acgcctaagt ttcaaatcgg tggtag 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgaaacgcct aactaccatt aggcgtttca aatcgg 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcctaactac caccgatttg gtagttaggc gtttca 36

Claims

1.一种非标记型适配体探针体系，其特征在于，所述非标记型适配体探针体系至少包括引发链、适配体、发夹结构和T7核酸外切酶；

其中，所述引发链和适配体能够发生互补形成双链结构；

所述适配体为待测物对应的适配体；

所述发夹结构至少存在4种，4种发夹结构在引发链作用下，基于发夹自组装原理依次互补结合形成特定的四臂连接体结构；

所述待测物为氯霉素时，

所述引发链核苷酸序列为如下a)、b)或c)：

a)5’-TTT TTG CCT AAC TAC CAC CGA TT-3’(SEQ ID NO.1)；

b)5’-TTT TTT CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.2)；

c)5’-TTT TTC TGC CTA ACT ACC ACC GAT T-3’(SEQ ID NO.3)；

所述适配体核苷酸序列为如下d)：

H1：5’-CTA CCA CCG ATT TGA AAC AAT CGG TGG TAG TTA GGC-3’(SEQ ID NO.5)；

H2：5’-CCG ATT TGA AAC GCC TAA GTT TCA AAT CGG TGG TAG-3’(SEQ ID NO.6)；

H3：5’-TGA AAC GCC TAA CTA CCA TTA GGC GTT TCA AAT CGG-3’(SEQ ID NO.7)；

H4：5’-GCC TAA CTA CCA CCG ATT TGG TAG TTA GGC GTT TCA-3’(SEQ ID NO.8)。

2.如权利要求1所述的非标记型适配体探针体系，其特征在于，所述非标记型适配体探针体系还包括荧光染料。

3.如权利要求2所述的非标记型适配体探针体系，其特征在于，所述荧光染料为SYBRGreen I。

4.如权利要求1所述的非标记型适配体探针体系，其特征在于，所述待测物为氯霉素。

5.权利要求1-4任一项所述非标记型适配体探针体系在检测CAP中的应用。

6.一种基于权利要求1-4任一项所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.如权利要求6所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述检测方法还包括向混合液中加入荧光染料。

8.如权利要求7所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述荧光染料为SYBR Green I。

9.如权利要求7所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述SYBR Green I浓度为5～30×。

10.如权利要求6所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，加入待测样品进行孵育具体条件为：37℃恒温孵育30min；

加入发夹结构进行孵育具体条件为：30～40℃下孵育10～60min；

加入T7核酸外切酶继续进行孵育具体条件为：30～40℃下孵育10～60min。

11.如权利要求10所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，加入发夹结构进行孵育具体条件为：37℃恒温孵育40min；加入发夹结构的浓度为2～6μM；

加入T7核酸外切酶继续进行孵育具体条件为：37℃恒温孵育40min；T7核酸外切酶浓度为1～20U。

12.如权利要求6所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，上述反应体系pH为中性或弱碱性。

13.如权利要求12所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，上述反应体系pH为7.0～7.8。

14.如权利要求13所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，上述反应体系pH为7.2。

15.如权利要求6所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述检测方法还包括对加入荧光染料后的混合液进行荧光测定。

16.如权利要求15所述非标记型适配体探针体系检测待测样品中氯霉素的方法，其特征在于，所述待测样品包括食品，所述食品包括蔬菜、水果、肉制品和乳制品。