CN106198673B - 基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 - Google Patents

基于核酸适体/纳米银探针与exo i酶的电化学生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适体/纳米银探针与EXO I酶的电化学生物传感器，使用兼备目标物的识别与电化学信号产生的功能的核酸适体修饰的银纳米粒子作为探测靶生物分子的生物探针，在目标物引发下，互补探针与EXO I酶循环剪切放大辅助下，利用DNA的互补配对原理,该探针可在金电极表面聚集，浓度越大的靶生物分子所诱导的核酸适体/纳米银探针聚集程度越大，同时在目标物的识别过程中引入EXO I核酸外切酶目标循环放大机制，使得该电化学生物传感器可以对靶生物物质灵敏高效检测。

Description

基于核酸适体/纳米银探针与EXO I酶的电化学生物传感器
技术领域
本发明涉及电化学检测技领域术，具体涉及一种基于核酸适体/纳米银生物探针与EXO I酶目标循环放大策略的电化学生物传感器及其制备方法。
背景技术
电化学生物传感器是一种以生物活性物质(如酶，抗体，核酸，细胞等)为生物敏感基元，通过电极作为信号转换器将生物化学信号转化为电化学信号从而实现检测目的生物传感器。电化学生物传感器以电极上得到的电势、电流或电容等电信号为特征检测信号，在具有高灵敏度和选择性的同时具备仪器简单、造价低廉，易微型化，能做到现场即时检测等独特优点，已被广泛应用于生物医药，食品分析，环境监测等诸多领域。
传统的电化学生物传感器按照电化学信号产生方式可分为标记型与免标记型。标记型电化学生物传感器因需要在DNA链上标记亚甲基蓝、二茂铁等电活性物质，操作复杂，成本高，已逐步被免标记型电化学生物传感器取代。免标记型电化学生物传感器免去了标记步骤，直接利用底液中的电活性物质进行检测，使得其成本和操作复杂程度得以大幅降低。然而由于底液的使用，使得免标记型电化学生物传感器的使用范围受到限制，且背底信号大，灵敏度低，稳定性差。
因此，目前亟需一种免标记型且灵敏度高、稳定性好的生物分子的检测方法。
发明内容
本发明根据现有技术的不足，本发明目的是提供一种基于核酸适体/纳米银生物探针的电化学生物传感器及其制备方法与应用，利用该电化学生物传感器对生物分子进行检测，具有选择性好、灵敏度高等优点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种兼备目标物的识别与电化学信号产生功能的探测靶生物分子的生物探针(以下部分内容称为生物捕获探针)，该生物探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的探针本体，所述探针本体包含有对目标物具有特异性识别功能的核酸适体片段(以下部分内容称为目标物适体)和与该核酸适体片段形成部分碱基互补序列的核酸片段(以下部分内容称为捕获探针DNA)，所述核酸适体片段与所述核酸片段杂交形成所述探针本体，其中所述核酸片段3’端硫醇化；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标物杂交核酸适体片段的能力。
本发明的第二个目的是提供一种包含所述探测靶生物分子的生物探针的电化学生物传感器，是由以下方法制备得到：所述探测靶生物分子的生物探针在目标物的引发下，通过竞争反应，所述核酸适体片段脱离所述探针本体并与目标物特异性结合；
加入EXO I酶，EXO I酶水解所述单链形式存在的核酸适体片段，此时目标物游离并继续与所述探针本体中的核酸适体片段特异性结合，形成水解和特异性结合的目标信号放大的循环反应，最终得到连接所述核酸片段(捕获探针DNA)的纳米银；
加入互补探针(以下部分内容称为生物互补探针)，所述互补探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的并与所述核酸片段碱基互补的核酸片段(以下部分内容称为互补探针 DNA)，其中，该核酸片段3’端硫醇化；
利用碱基互补配对原理，得到的与所述互补探针碱基互补后的纳米银在修饰有所述互补探针DNA的金电极表面聚集，得到的金电极即为电化学生物传感器。
其中，连接所述核酸片段(捕获探针DNA)的纳米银：一种情况是，纳米银上只连接上述核酸片段(捕获探针DNA)，另外一种情况是，纳米银上不仅连接上述核酸片段(捕获探针DNA)，还连接所述探针本体。
本发明的基于核酸适体/纳米银生物探针与EXO I酶目标循环放大策略的电化学生物传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)生物捕获探针的制备：
将打开二硫键的捕获探针DNA与目标物适体互补配对，形成探针本体溶液(双链DNA溶液)；将所述探针本体溶液与纳米银胶体混合反应，得到生物捕获探针；其中，所述捕获探针DNA的3’端硫醇化；
(2)生物互补探针的制备：
将打开二硫键的步骤(1)中所述的捕获探针DNA的碱基互补探针DNA与纳米银胶体混合反应，得到生物互补探针；其中，所述互补探针DNA的3’端硫醇化；
(3)生物捕获探针的识别与酶辅助目标循环剪切信号放大：
将步骤(1)中得到的生物捕获探针、目标物和EXOI核酸外切酶混合反应；
(4)制备电化学生物传感器：
将步骤(3)中所得溶液加入步骤(2)中得到的生物互补探针，然后将修饰有所述互补探针DNA的金电极浸入上述反应溶液中混合反应，取出电极，即为电化学生物传感器。
以上步骤的顺序根据实际情况进行调整。
步骤(1)中，目标物适体与目标物特异性结合，优选的，当所述目标物为溶菌酶时，所述捕获探针的DNA序列为：5’-A CTC TTT AGC CCT GAT-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：1所示；溶菌酶适体序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，其序列如SEQID NO：2所示。
当所述目标物为γ干扰素(IFN-γ)时，所述捕获探针的DNA序列为：5′-CC AACACA ACC AAC CCC-C6-SH-3′，其序列如SEQID NO：4所示；γ干扰素适体序列为：5′-GGG GTTGGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C-3′，其序列如SEQID NO：5所示。
优选的，捕获探针DNA的浓度为100μM，目标物适体的浓度为100μM。所述捕获探针DNA、目标物适体与纳米银胶体的体积比例为(0.5～1.5):(0.5～1.5)：100。
打开探针的二硫键可以采用硫醇类还原剂等方法，优选的，所述打开二硫键的捕获探针DNA的制备方法为：将捕获探针DNA与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键，其中，所述含有三(2-羧乙基)膦的溶液中三(2-羧乙基)膦(TCEP)的浓度为0.01M，PB的浓度为0.01M，NaCl的浓度为0.1M，反应时间为0.5～1.5h(优选1h)。
所述探针本体溶液(双链DNA溶液)的具体反应步骤为：在35～40℃反应1.5～2.5小时，优选为37℃反应2h。
所述混合反应的条件为：密封避光，在35～40℃搅拌反应5～6h，并在2～6℃反应10～14h。
为了进一步使得到的生物捕获探针更加稳定，在2～6℃反应10～14h后，在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH，再加入NaCl溶液，密封避光搅拌2～4h，密封避光 2～6℃过夜反应(反应时间为10～24h)后用PBS离心洗涤，得到生物捕获探针。
步骤(2)中，当目标物为溶菌酶时，互补探针DNA序列为：5’-ATC AGG GCT AAA GAGT-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：3所示，当目标物为γ干扰素时，互补探针DNA序列为：5′-GGG GTT GGT TGT GTT GG-C6-SH-3′，其序列如SEQID NO：6所示，其浓度为 100μM。所述互补探针DNA与纳米银胶体的体积比例为0.5～1.5:100。
打开探针的二硫键可以采用硫醇类还原剂等方法，优选的，所述打开二硫键的互补探针DNA的制备方法为：将互补探针DNA与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键，其中，所述含有三(2-羧乙基)膦的溶液中三(2-羧乙基)膦(TCEP)的浓度为0.01M，PB的浓度为0.01M，NaCl的浓度为0.1M，反应时间为0.5～1.5h(优选1h)。
所述混合反应的条件为：密封避光，在35～40℃搅拌反应5～6h，并在2～6℃反应10～14h。
为了进一步使得到的生物互补探针更加稳定，在2～6℃反应10～14h后，在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH，再加入NaCl溶液，密封避光搅拌2～4h，密封避光 2～6℃反应(反应时间为10～24h)后用PBS离心洗涤，得到生物互补探针。
步骤(1)(2)中，所述纳米银的制备方法：冰水浴中，剧烈搅拌条件下，以每次一毫升的滴加速度将0.002M的硝酸银缓慢加入到2～2.5倍体积的0.003M硼氢化钠中，硝酸银全部滴加完毕后持续剧烈搅拌5分钟。将所得反应物移入沸水浴中，加热3～5分钟，立即加入设定量的0.003M的硼氢化钠溶液，移出热水浴剧烈搅拌冷却至室。将制得的纳米银胶体转入用王水浸泡过的棕色瓶中，4℃避光储存。
步骤(3)中，所述目标物为设定浓度的待测物或未知浓度的待测物，所述混合反应的条件为35～40℃反应0.5～1.5h，优选为37℃反应1h。
所述步骤(1)中得到的生物捕获探针和目标物的体积比例为1：1～2，EXOI核酸外切酶的添加量为15～25U，优选的，所述步骤(1)中得到的生物捕获探针和目标物的体积比例为1：1，EXOI核酸外切酶的添加量为20U。
步骤(4)中，步骤(3)中所得溶液与步骤(2)中得到的生物互补探针的体积比例为1：1～2，优选为1：1。
所述金电极需进行抛光处理，处理步骤为：将金电极采用氧化铝粉末打磨，打磨后采用二次水冲洗，再在乙醇和二次水中分别超声清洗，干燥得到抛光处理后的金电极。更进一步，其抛光处理步骤：在麂皮上用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉末依次打磨；打磨后先二次水冲洗，再在乙醇和二次水中分别超声清洗20-25s，氮气吹干。
修饰有所述互补探针DNA的金电极的制备方法包括以下步骤：所述互补探针DNA用TCEP反应2小时打开二硫键，其中，使互补探针DNA打开二硫键的反应体系中，DNA的浓度为1μM，TCEP的浓度为0.01M，PB的浓度为0.01M，NaCl的浓度为0.1M，然后将打开二硫键的互补探针DNA浸入抛光处理好的金电极24小时，即得到修饰有所述互补探针DNA的金电极。
所述混合反应的条件为35～40℃反应1.5～2.5h，优选为在37℃震荡反应2h。
本发明的第三个目的是提供上述电化学传感器在检测生物分子浓度的应用，所述生物分子包括ATP、氨基酸、核苷酸、毒素、酶、生长因子、细胞黏附分子、病毒、细菌和细胞或其他能作为适体筛选的生物分子。根据本发明的发明构思可以检测各种生物分子的浓度，例如溶菌酶、γ干扰素、ATP或其他生物分子。其应用方法包括以下步骤：
(1)电化学检测：将各个标准浓度的目标物的电化学生物传感器进行LSV检测，得到不同标准浓度目标物的LSV峰电流；
(2)标准曲线的绘制：将步骤(1)中的LSV峰电流对目标物浓度的对数做线性回归方程，得到该方法的标准曲线；
(3)实际样品的检测：取实际样品的电化学传感器进行电化学检测得到相应的LSV峰电流，将LSV峰电流代入步骤(2)中标准曲线，得到实际样品中的目标物的浓度。
步骤(1)中，LSV检测条件为：以金电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对比电极构成三电极系统进行LSV检测。
LSV检测液为PBS缓冲液，具体是：0.2M PBS，其配制方法如下：1.78g Na2HPO4·2H2O 溶于1000mL水中，得到Na2HPO4水溶液； 1.38g NaH2PO4·H2O溶于1000mL水中，得到NaH2PO4水溶液；将810mL Na2HPO4水溶液、190mL NaH2PO4水溶液和11.69g NaCl混匀，得到pH为7.4的0.2M PBS。
上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：
(1)本发明中基于核酸适体/纳米银生物探针与EXO I酶目标策略的电化学生物传感器是一种新型的免标记电化学生物传感器，使用兼备目标物的识别与电化学信号产生的功能的核酸适体修饰的银纳米粒子作为探测靶生物分子的生物探针，在目标物引发下,互补探针与EXO I酶循环剪切放大辅助下,利用DNA的互补配对原理,该探针可在金电极表面聚集，浓度越大的靶生物分子所诱导的核酸适体/纳米银探针聚集程度越大，同时在目标物的识别过程中引入EXO I核酸外切酶目标循环放大机制，使得该电化学生物传感器可以对靶生物物质灵敏高效检测。
(2)本发明与其他工作相比较，首次在电化学生物传感器中使用了具备识别和信号产生两种功能的核酸适体/纳米银生物探针，省去了传统免标记检测方法所使用的信号底物，使得该生物传感器操作简便，稳定性好，检测限低，灵敏度高，选择性强。
(3)本发明利用电化学检测方法还使其具备了操作简便、成本低廉，快速高效，易微型化等优点，能做到现场即时快速检测。因此，基于核酸适体/纳米银生物探针的电化学生物传感器为生物分子的检测提供了一个灵敏高效的新方法。
附图说明
图1是本发明的原理图；
图2是本发明检测溶菌酶的线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实验中所使用的仪器及试剂为：(1)仪器：CHI650电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；采用饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为对电极；(2)试剂：溶菌酶适体、γ干扰素适体与报告探针(上海生工生物工程股份有限公司)，其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
实施例1
一种用于检测溶菌酶的电化学生物传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
(1)纳米银制备。冰水浴中将100ml 0.003M硼氢化钠加入250ml三口圆底烧瓶中，密封左右两口，剧烈搅拌。用移液枪以每次一毫升逐滴将50mL 0.002M硝酸银缓慢加入到硼氢化钠中，每加10ml需间隔等待2分钟，硝酸银完全加入后持续剧烈搅拌5min。将圆底烧瓶移入沸水浴中，加热3～5分钟，立即快速加入10ml 0.003M硼氢化钠溶液。将烧瓶移出热水浴，继续剧烈搅拌冷却至室温。将制得的纳米银胶体转入用王水浸泡过的棕色瓶中， 4℃避光储存。
(2)捕获探针制备。取10μL捕获探针DNA(5’-A CTC TTT AGC CCT GAT-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：1所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP (0.01MPB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。再在其中加入10μL溶菌酶适体(5’- ATC AGGGCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，其序列如SEQID NO：2所示)在水浴锅中37℃反应2小时，形成双链。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入1ml纳米银胶体，再向其中加入双链DNA密封避光慢速搅拌5～6小时，取出磁子后4℃反应12小时。12小时后，向反应瓶中加入122μL0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(3)互补探针制备。取10μL互补探针DNA(5’-ATC AGG GCT AAA GAG T-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：3所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP (0.01MPB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入 1ml纳米银胶体，再向其中加入打开二硫键的10μL互补探针DNA密封避光慢速搅拌5～6 小时，取出磁子后4℃反应12小时。12小时后，向反应瓶中加入122μL 0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3 小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(4)标准浓度溶菌酶溶液配置。超纯水配置100uM母液，用0.1M PBS的缓冲溶液稀释母液配制成0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM浓度梯度的溶菌酶溶液。
(5)捕获探针的识别与酶辅助目标循环剪切信号放大。取2mL离心管加入100μL捕获探针和梯度浓度的溶菌酶100uL，再加入20U EXO I核酸外切酶，水浴锅中37℃1小时。
(6)修饰有互补探针DNA的金电极的制备。
金电极抛光处理：金电极在麂皮上依次用0.3um和0.05um Al2O3打磨成镜面，依次用乙醇、二次水超声清洗20-25秒；之后在0.5M硫酸溶液中循环伏安，扫速为0.1V/s至稳定后二次水冲洗干净，氮气吹干；
所述互补探针DNA用TCEP反应2小时打开二硫键，其中，使互补探针DNA打开二硫键的反应体系中，DNA的浓度为1μM，TCEP的浓度为0.01M，PB的浓度为0.01M， NaCl的浓度为0.1M，然后将打开二硫键的互补探针DNA浸入抛光处理好的金电极24小时，即得到修饰有所述互补探针DNA的金电极。
(7)电化学生物传感器的制备。
分别将将步骤(5)中所得的各个溶液加入步骤(3)中得到的生物互补探针，然后将修饰有互补探针DNA的金电极浸入上述反应溶液中混合反应，取出电极，即得到各个浓度梯度下的电化学生物传感器。
实施例2
(1)捕获探针制备。取10μL捕获探针DNA(5’-A CTC TTT AGC CCT GAT-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：1所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP (0.01MPB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。再在其中加入10μL溶菌酶适体(5’- ATC AGGGCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3’，其序列如SEQID NO：2所示)在水浴锅中37℃反应1.5小时，形成双链。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入1ml纳米银胶体，再向其中加入双链DNA密封避光慢速搅拌5～6小时，取出磁子后5℃反应13小时。13小时后，向反应瓶中加入122μL0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(2)互补探针制备。取10μL互补探针DNA(5’-ATC AGG GCT AAA GAG T-C6-SH-3’，其序列如SEQID NO：3所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP (0.01MPB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入 1ml纳米银胶体，再向其中加入打开二硫键的10μL互补探针DNA密封避光慢速搅拌5～6 小时，取出磁子后5℃反应13小时。13小时后，向反应瓶中加入122μL 0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3 小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(3)标准浓度溶菌酶溶液配置。超纯水配置100uM母液，用0.1M PBS的缓冲溶液稀释母液配制成0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM浓度梯度的溶菌酶溶液。
(4)捕获探针的识别与酶辅助目标循环剪切信号放大。取2mL离心管加入100μL捕获探针和梯度浓度的溶菌酶100uL，再加入20U EXO I核酸外切酶，水浴锅中35℃1.5小时。
(5)电化学生物传感器的制备。
分别将将步骤(4)中所得的各个溶液加入步骤(2)中得到的生物互补探针，然后将实施例1中步骤(6)互补探针DNA修饰的金电极浸入上述反应溶液中混合反应，取出修饰后的电极，即得到各个浓度梯度下的电化学生物传感器。
实施例3
采用实施例1中制备得到的电化学生物传感器测溶菌酶浓度的应用方法，包括以下步骤：
(1)电化学检测。将实施例1中得到的各电极取出后用0.01M PB冲洗干净2-3次，将电极浸入0.2M PBS的检测液中与甘汞参比电极和铂丝对比电极构成三电极系统进行 LSV检测。
(2)标准曲线的绘制。将与标准浓度的溶菌酶识别后的LSV峰电流对溶菌酶浓度的对数做线性回归方程，即得该方法的标准曲线，如图2所示，该线性回归方程为 I＝0.5068lgC+0.67798，R2＝0.997，线性范围：1.5pM-10nM，检测限：290fM(S/N＝3)。
(3)实际样品检测。取实际样品按照实施例1中的方法进行操作，将得到的峰电流代入标准曲线可得到实际样品中溶菌酶的浓度。
对溶菌酶检测结果显示，对不同浓度溶菌酶峰电流曲线均变化明显，溶菌酶在浓度为 1.5pM-10nM内成良好的线性关系，本发明的电化学生物传感器对溶菌酶的检测限度可低至 290fM。
实施例4
一种用于检测γ干扰素的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)纳米银制备：同实施例1中的纳米银制备步骤。
(2)捕获探针制备。取10μL捕获探针DNA(5′-CC AAC ACA ACC AAC CCC-C6-SH-3′，其序列如SEQID NO：4所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP(0.01MPB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。再在其中加入10μLγ干扰素适体(5′-GGG GTTGGT TGT GTT GGG TGT TGT GTC CAA CCC C-3′，其序列如 SEQID NO：5所示)在水浴锅中37℃反应2小时，形成双链。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入1ml纳米银胶体，再向其中加入双链DNA密封避光慢速搅拌5～6小时，取出磁子后 4℃反应12小时。12小时后，向反应瓶中加入122μL 0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(3)互补探针制备。取10μL互补探针DNA(5′-GGG GTT GGT TGT GTT GG-C6-SH -3′，其序列如SEQID NO：6所示)于2mL离心管中在捕获探针DNA中加入2μL 0.01M TCEP(0.01M PB,0.1M NaCl)溶液静置1小时打开二硫键。取3mL玻璃反应瓶，向其中加入 1ml纳米银胶体，再向其中加入打开二硫键的10μL互补探针DNA密封避光慢速搅拌5～6 小时，取出磁子后4℃反应12小时。12小时后，向反应瓶中加入122μL 0.1M PBS缓冲溶液调节pH，慢速搅拌。以每次1μL的速度加入21μL 2M NaCl溶液后密封避光慢速搅拌3 小时，密封避光4℃过夜后用0.1M PBS离心洗涤。
(4)标准浓度γ干扰素溶液配置。超纯水配置100uM母液，用0.1M PBS的缓冲溶液稀释母液配制成0.01nM、0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM浓度梯度的γ干扰素溶液。
(5)捕获探针的识别与酶辅助目标循环剪切信号放大。取2mL离心管加入100μL捕获探针和梯度浓度的γ干扰素100uL，再加入20U EXO I核酸外切酶，水浴锅中37℃1小时。
(6)修饰有互补探针DNA的金电极的制备。
金电极抛光处理：金电极在麂皮上依次用0.3um和0.05um Al2O3打磨成镜面，依次用乙醇、二次水超声清洗20-25秒；之后在0.5M硫酸溶液中循环伏安，扫速为0.1V/s至稳定后二次水冲洗干净，氮气吹干；
所述互补探针DNA用TCEP反应2小时打开二硫键，其中，使互补探针DNA打开二硫键的反应体系中，DNA的浓度为1μM，TCEP的浓度为0.01M，PB的浓度为0.01M， NaCl的浓度为0.1M，然后将打开二硫键的互补探针DNA浸入抛光处理好的金电极24小时，即得到修饰有所述互补探针DNA的金电极。
(7)电化学生物传感器的制备。
分别将将步骤(5)中所得的各个溶液加入步骤(3)中得到的生物互补探针，然后将修饰有互补探针DNA的金电极浸入上述反应溶液中混合反应，取出电极，即得到各个浓度梯度下的电化学生物传感器。
将实施例4中的电化学生物传感器进行LSV检测，经过试验验证，本发明中的实施例 4中制备得到的电化学生物传感器能够检测γ干扰素的浓度，对不同浓度γ干扰素峰电流曲线均变化明显，本发明的电化学生物传感器对γ干扰素的检测限度可低至fM级。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种基于探测靶生物分子的生物探针的电化学生物传感器，是由以下方法制备得到：
生物探针在目标物的引发下，通过竞争反应，核酸适体片段脱离所述探针本体并与目标物特异性结合；
加入EXO I酶，EXO I酶水解单链形式存在的核酸适体片段，此时目标物游离并继续与所述探针本体中的核酸适体片段特异性结合，形成水解和特异性结合的目标信号放大的循环反应，最终得到连接所述核酸片段的纳米银；
加入互补探针，所述互补探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的并与所述核酸片段碱基互补的核酸片段，其中，该核酸片段3’端硫醇化；
利用碱基互补配对原理，得到的与所述互补探针碱基互补后的纳米银在修饰有所述互补探针DNA的金电极表面聚集，得到的金电极即为电化学生物传感器；
所述生物探针包括纳米银和若干连接在纳米银表面的探针本体，所述探针本体包含有对目标物具有特异性识别功能的核酸适体片段和与该核酸适体片段形成部分碱基互补序列的核酸片段，所述核酸适体片段与所述核酸片段杂交形成所述探针本体，其中所述核酸片段3’端硫醇化；所述核酸片段竞争性杂交所述核酸适体片段的能力弱于所述目标物杂交核酸适体片段的能力。
2.权利要求1所述的电化学传感器，其特征是：所述生物探针的制备方法包括以下步骤：将打开二硫键的所述核酸片段与核酸适体片段互补配对，形成探针本体溶液；将所述探针本体溶液与纳米银胶体混合反应，得到探测靶生物分子的生物探针。
3.如权利要求2所述的电化学传感器，其特征是：打开二硫键的所述核酸片段是由以下方法得到：将所述核酸片段与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键，得到打开二硫键的所述核酸片段；所述探针本体溶液的具体反应步骤为：在35～40℃反应1.5～2.5小时；所述混合反应的条件为：密封避光，在35～40℃搅拌反应5～6h，并在2～6℃反应10～14h。
4.如权利要求3所述的电化学生物传感器，其特征是：所述混合反应，在2～6℃反应10～14h后，在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH，再加入NaCl溶液，密封避光搅拌2～4h，密封避光2～6℃反应10～24h后用PBS离心洗涤，得到探测靶生物分子的生物探针。
5.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是：所述互补探针是由以下制备方法制备得到：将打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段与纳米银胶体混合反应，得到互补探针；所述打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段是由以下方法制备得到：将与所述核酸片段碱基互补的核酸片段与含有三(2-羧乙基)膦的溶液进行反应打开二硫键，得到打开二硫键的与所述核酸片段碱基互补的核酸片段。
6.如权利要求5所述的电化学生物传感器，其特征是：所述混合反应的条件为：密封避光，在35～40℃搅拌反应5～6h，并在2～6℃反应10～14h。
7.如权利要求6所述的电化学生物传感器，其特征是：所述混合反应的条件为：在2～6℃反应10～14h后，在搅拌条件下向反应物中加入PBS缓冲液调节pH，再加入NaCl溶液，密封避光搅拌2～4h，密封避光2～6℃反应10～24h后用PBS离心洗涤，得到互补探针。
8.权利要求1或5所述的电化学生物传感器在检测生物分子浓度的应用，所述应用不包含以疾病诊断为目的的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是：所述生物分子包括ATP、氨基酸、核苷酸、毒素、酶、生长因子、细胞黏附分子、病毒、细胞作为适体筛选的生物分子。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是：所述细胞包括细菌。
11.如权利要求8或10所述的应用，其特征是，所述应用方法包括以下步骤：
(1)电化学检测：将各个标准浓度的目标物的电化学生物传感器进行LSV检测，得到不同标准浓度目标物的LSV峰电流；
(2)标准曲线的绘制：将步骤(1)中的LSV峰电流对目标物浓度的对数做线性回归方程，得到该方法的标准曲线；
(3)实际样品的检测：取实际样品的电化学传感器进行电化学检测得到相应的LSV峰电流，将LSV峰电流代入步骤(2)中标准曲线，得到实际样品中的目标物的浓度。
12.如权利要求11所述的应用，其特征是，LSV检测条件为：以金电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对比电极构成三电极系统进行LSV检测。
13.如权利要求12所述的应用，其特征是：LSV检测液为PBS缓冲液。
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