CN107727624B

CN107727624B - 一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法

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Publication number: CN107727624B
Application number: CN201710957797.8A
Authority: CN
Inventors: 李晓春; 王乐; 张校亮; 于化忠
Original assignee: Taiyuan University of Technology
Current assignee: Taiyuan University of Technology
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2017-10-16
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2037-10-16
Also published as: CN107727624A

Abstract

本发明属于生化分析和水污染检测领域，提出了一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，包括以下步骤：S1、配置用于特定的抗生素检测的适体传感溶液；S2、在适体传感溶液中分别加入含有该种抗生素的不同浓度的标准溶液，测量并计算各个不同浓度的标准溶液的供受体荧光强度比η的值，建立供受体荧光强度比η‑浓度标准曲线；S3、在适体传感溶液中加入将待测溶液，测量并计算待测溶液的供受体荧光强度比η0的值；S4、将待测溶液的供受体荧光强度比η0的值与供受体荧光强度比η‑浓度标准曲线进行对比，计算得到待测溶液中特定的抗生素的浓度。本发明的检测体系稳定，灵敏度高，测量结果精确，可以广泛应用于抗生素检测领域。

Description

一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法

技术领域

本发明属于生化分析和水污染检测领域，更具体地，涉及一种基于适体传感的荧光能量共振转移的抗生素检测方法。

背景技术

近年来，环境污染问题受到人们的广泛关注，特别是抗生素残留更成为关注的焦点问题。抗生素是一种治疗感染性疾病的特效药物，广泛地用在人类医疗和动物疾病治疗中，具有抗菌性强，使用量大的特点。由于抗生素的大量不合理使用，导致抗生素进入水体，对水环境造成污染。抗生素进入体内，在体内蓄积，会使人产生对抗生素的抗性，引起各种组织器官病变，甚至癌变。因此，如何快速、准确地检测抗生素已成为重中之重。

磺胺类抗生素抗菌作用强，不仅应用在人类医疗中，还用于禽畜养殖中，它不能完全被吸收，在禽畜体内长期积累，通过排泄进入土壤和水体中，对环境造成污染。在人体内，磺胺类抗生素使用过量会造成过敏反应、恶心、呕吐等副作用以及一些血液性的疾病，欧美一些国家检测水中抗生素标准中规定，最大残留限量为100 ng/ml，而我国至今还没有国家标准，因此，对磺胺二甲嘧啶的定量检测具有重要意义。

目前，检测抗生素的方法主要包括传统大型仪器检测：毛细血管电泳法（R. Hoff,et al. Sep. Sci. 32 (2009) 854-866）、液相色谱法（Jorge J. Soto-Chinchilla, etal. Journal of Chromatography A, 1095 (2005) 60–67）、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MC)（C.Yu et al. Talanta 90 (2012) 77–84）等。这些方法具有检测准确，快速的特点，但是要求仪器昂贵，样品前处理比较复杂，对实验人员的操作技术要求较高，分析费时而不易推广。一些快检方法包括微生物分析法、酶联免疫法，胶体金免疫层析试纸条法等层出不穷，微生物法方法简单、费用低，但是重现性差，灵敏度低，耗时长，且易受多种因素干扰而影响结果的准确性，在实际应用中受到很大的限制。酶联免疫法可以快速筛选，但是影响因素多，易出现假阳性结果。胶体金免疫层析试纸条具有成本低，快速，高效，高通量检测等特点。但是由于胶体金颗粒信号放大作用有限，所以胶体金免疫层析试纸条灵敏度不高，并且胶体金免疫层析试纸条很难实现定量检测。因此实现特异好、灵敏度高、快速定量的抗生素检测技术，尤为重要。

核酸适配体(aptamer) 是指从人工合成的DNA/RNA 文库中筛选得到的一小段单链寡核苷酸。具有高亲和力、高特异性地和靶标分子结合的特点，它是化学和生物传感器的理想识别分子。如公开号为CN104502585A的专利公开了一种用于抗生素检测的纳米传感器，其特征在于利用高亲和性和高特异性的核酸适配体，以及金纳米颗粒对很宽波谱范围内的荧光物质的强猝灭作用，构建一种新型的纳米传感体系用于食品中抗生素的同步定量检测，该方法所用的是纳米金对荧光的淬灭作用，分析的是单个供体的荧光信号，该荧光信号不够稳定，导致检测体系在测量精度上具有一定缺陷。

发明内容

本发明克服现有技术存在的不足，所要解决的技术问题为：提供一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，以实现

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，包括以下步骤：

S1、配置用于特定的抗生素检测的适体传感溶液；

S2、在所述适体传感溶液中分别加入含有该种抗生素的不同浓度的标准溶液，混合均匀后加入到荧光比色皿中，在所述供体荧光染料对应的激发波长条件下，分别测量各个不同浓度的标准溶液的供体荧光染料和受体荧光染料分别对应的发射波长处的荧光强度，计算各个不同浓度的标准溶液的供受体荧光强度比η的值，其中，η=供体最大发射荧光强度/受体最大发射荧光强度，并建立供受体荧光强度比η-浓度标准曲线；

S3、在所述适体传感溶液中加入将待测溶液，混合均匀后加入到荧光比色皿中，在供体荧光染料和受体荧光染料对应的激发波长条件下，测量待测溶液的供体荧光染料和受体荧光染料分别对应的发射波长处的荧光强度，并计算待测溶液的供受体荧光强度比η0的值；

S4、将所述待测溶液的供受体荧光强度比η0的值与供受体荧光强度比η-浓度标准曲线进行对比，计算得到待测溶液中所述特定的抗生素的浓度。

所述步骤S1具体包括以下步骤：

S101、根据要检测的抗生素类型，选择对应的供体溶液和受体溶液，所述供体溶液是指能与所述特定的抗生素进行特异性结合的核酸适配体溶液，所述核酸适配体在其一端标记了供体荧光染料，所述受体溶液是指能与所述核酸适配体配对的具有合适长度的互补链溶液，所述互补链的一端标记了受体荧光染料；并且所述供体荧光染料和受体荧光染料满足荧光能量共振转移条件；

S102、将选择好的核酸适配体溶液和互补链溶液混合后，加热到80℃，保持10分钟后骤降到室温，立刻加入缓冲盐溶液混合稀释，等待30分钟即可得到可以用于所述特定的抗生素检测的适体传感溶液。

所述互补链是指有6-18个碱基，并且能与适体链互补配对的一小段DNA序列。

所述供体荧光染料和受体荧光染料分别为Cy3和Cy5。

所述抗生素为磺胺二甲氧嘧啶，所述适体链探针序列为Cy3-GGGCAACGAGTGTTTATA-3’，所述互补链探针序列为：Cy5-CCCGTTGCTCAC-5’。

所述步骤S102中，适体链溶液和互补链溶液反应浓度均为：0.1 μM，所述缓冲盐溶液是指含有20~100mM Na⁺, 0~10mM Mg²⁺, 0~10mM K⁺, 10~50mM Tris-HCl的溶液，其pH值在6.5-8.5之间。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明所提供的一种基于适体传感的荧光能量共振转移的水中抗生素检测方法，通过利用两种荧光染料的能量共振转移原理，利用抗生素可特异性地与适体链结合，使得DNA双工结构打开导致荧光能量共振转移效应减弱，通过分析供体荧光和受体发射荧光的相对变化趋势，对荧光信号变化进行放大，使得检测体系更加稳定，灵敏度高，测量结果更加精确。

附图说明

图1为本发明提供的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法的原理图；

图2为供体溶液Cy3的发射光谱与受体溶液Cy5的吸收光谱；

图3为实验4中测量到的不同抗生素浓度下，发射荧光的波长与强度关系图；

图4为实验4中测量到的供体溶液Cy3的发射荧光强度和受体溶液Cy5的发射荧光强度与抗生素浓度的关系图；

图5为实验4中供体最大发射荧光强度/受体最大发射荧光强度与抗生素浓度的关系图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，包括以下步骤：

S1、配置用于特定的抗生素检测的适体传感溶液。其中，配置适体传感溶液的具体步骤为：

其中，所述互补链是指有6~18个碱基，并且能与适体链互补配对的一小段DNA序列。所述供体荧光染料和受体荧光染料满足荧光能量共振转移条件具体是指，供体荧光染料的发射荧光可以作为受体染料的激发光，例如，荧光染料Cy3和荧光染料Cy5，Cy3的激发波长是510 nm，Cy3的发射荧光波长是564 nm，虽然Cy5对应的最强激发波长是640nm，Cy5的发射荧光波长在660 nm，但是，从图2中可以看出，Cy5的吸收光谱与Cy3的发射荧光光谱在560~640nm之间有重叠，也就是说，荧光染料cy3的发射荧光可以作为荧光cy5的激发荧光。此外，供体荧光染料和受体荧光染料还可以为其他Cy 系列荧光染料或Rox 荧光染料或Alexa系列染料或量子点之间能满足荧光能量共振转移条件的染料对均可，例如：（供体)GQD-Cy3（受体）、Alexa488- Alexa555、CFP-YFP等。

其中，混合后加热到80摄氏度是为了防止适体链中间产生二级结构，加热和骤降是为了使结构稳定，重复性更好。

S2、在所述适体传感溶液中分别加入含有该种抗生素的不同浓度的标准溶液，混合均匀后加入到荧光比色皿中，在所述供体荧光染料对应的激发波长条件下，分别测量各个不同浓度的标准溶液的供体荧光染料和受体荧光染料分别对应的发射波长处的荧光强度，计算各个不同浓度的标准溶液的供受体荧光强度比η的值，其中，η=供体最大发射荧光强度/受体最大发射荧光强度，并建立供受体荧光强度比η-浓度标准曲线。

S4、将所述待测溶液的的供受体荧光强度比η0的值与供受体荧光强度比η-浓度标准曲线进行对比，计算得到待测溶液中所述特定的抗生素的浓度。

如图1所示，本发明的检测原理为：在所述适体传感溶液中，含有核酸适配体和互补链，他们均被荧光染料标记，当溶液中没有对应的可以与进行特异性结合的抗生素时，由于供体荧光染料和受体荧光染料满足荧光能量共振转移条件，在供体荧光染料的波长激发下，供体荧光染料的发射荧光有一部分被受体荧光染料吸收，导致测量到的供体荧光染料的发射波长处荧光强度减弱，受体荧光染料的发射波长出荧光强度增加，加入对应的抗生素后，由于抗生素可以与适配体溶液进行特异性结合，导致核酸适配体和互补链的距离变远，被致标记在DNA链上的供体荧光染料与受体染料之间的距离变远，它们之间的荧光共振能量转移作用减弱，引起供体染料发射荧光变强，受体染料发射荧光变弱，抗生素的浓度越大，这种荧光变化越强，因此，供体荧光染料和受体荧光染料发射荧光强度之比，一定程度反应了加入的抗生素浓度，通过对标准溶液和待测溶液的分别测量，可以得到待测溶液的抗生素浓度。

本发明实施例以磺胺二甲氧嘧啶（SDM）为例，提出了一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，对于抗生素磺胺二甲氧嘧啶，需用的适体链的探针序列为Cy3-GGGCAACGAGTGTTTATA-3’，互补链探针序列为：Cy5-CCCGTTGCTCAC-5’。

实验（1）能量共振转移对的选择：

在510nm激发下，测量标记有Cy3 适体溶液的发射光谱，在紫外-可见光分光光度下测量标记有Cy5的互补链溶液的吸收光谱。

实验结果：如图2所示，为供体溶液Cy3的发射光谱与受体溶液Cy5的吸收光谱，从图2中可以看出，供体溶液Cy3的发射光谱与受体溶液Cy5的吸收光谱有重叠区域，验证了Cy3与Cy5可以构成能量共振转移对。

实验（2）适体链、互补链浓度的选择：

为了避免荧光染料浓度过高而发生自淬灭现象，对标记有Cy5荧光染料的互补链溶液进行发射光谱扫描。

实验结果：在溶液浓度为0~0.2 μM之间，溶液发射荧光强度与溶液浓度成线性关系。因此，在此范围内选择体系浓度较为合适。为了节省溶液，并考虑到体系最终的检测限，实验中选择0.1 μM作为最终浓度。

实验（3）适体链溶液与互补链溶液互补配对的时间稳定性测量：

将0.1 μM 适体链溶液与0.1 μM 互补链溶液混合，加热到80℃，10min后骤降到室温，立刻加入缓冲盐溶液，在室温下测量反射荧光光谱。

实验结果：随着加入缓冲盐的时间增长，溶液发射荧光强度在30min后达到稳定。所述缓冲盐溶液是指含有20~100mM Na⁺，0~10mM Mg²⁺, 0~10mM K⁺, 10~50mM Tris-HCl的溶液，其pH值在6.5~8.5之间。

实验（4）不同浓度磺胺二甲氧嘧啶检测

向互补配对后的溶液中加入不同浓度磺胺二甲氧嘧啶，反应时间足够长，测量荧光光谱。

实验结果：如图3~5所示，随着加入SDM浓度的逐渐增加，Cy3荧光发射光谱逐渐增强，Cy5荧光发射光谱逐渐减弱，证明该方法可以实现磺胺二甲氧嘧啶的定量检测。

此外，虽然本发明实施例仅以磺胺二甲氧嘧啶为例，说明了本发明提出的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法的可行性，对于其它种类的抗生素，也可以通过选择其它抗生素的特异性适体及其合适长度的互补链，来实现对其它种类抗生素的检测，例如，对于卡那霉素，可以选择的特异性适体可以为：5’-AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’，互补链可以为：3’-CTCCCGTTGCTCACAAATATCT-5’。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配置用于抗生素检测的适体传感溶液；

S2、在所述适体传感溶液中分别加入含有该种抗生素的不同浓度的标准溶液，混合均匀后加入到荧光比色皿中，在供体荧光染料对应的激发波长条件下，分别测量各个不同浓度的标准溶液的供体荧光染料和受体荧光染料分别对应的发射波长处的荧光强度，计算各个不同浓度的标准溶液的供受体荧光强度比η的值，其中，η=供体最大发射荧光强度/受体最大发射荧光强度，并建立供受体荧光强度比η-浓度标准曲线；

S3、在所述适体传感溶液中加入待测溶液，混合均匀后加入到荧光比色皿中，在供体荧光染料和受体荧光染料对应的激发波长条件下，测量待测溶液的供体荧光染料和受体荧光染料分别对应的发射波长处的荧光强度，并计算待测溶液的供受体荧光强度比η0的值；

S4、将所述待测溶液的供受体荧光强度比η0的值与供受体荧光强度比η-浓度标准曲线进行对比，计算得到待测溶液中所述抗生素的浓度；

所述步骤S1具体包括以下步骤：

S101、根据要检测的抗生素类型，选择对应的供体溶液和受体溶液，所述供体溶液是指能与所述抗生素进行特异性结合的核酸适配体溶液，所述核酸适配体溶液中的核酸适配体在其一端标记了供体荧光染料，所述受体溶液是指能与所述核酸适配体配对的具有合适长度的互补链溶液，所述互补链溶液中的互补链的一端标记了受体荧光染料；并且所述供体荧光染料和受体荧光染料满足荧光能量共振转移条件；

S102、将选择好的核酸适配体溶液和互补链溶液混合后，加热到80℃，保持10分钟后骤降到室温，立刻加入缓冲盐溶液混合稀释，等待30分钟即可得到可以用于所述抗生素检测的适体传感溶液。

2.根据权利要求1所述的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，其特征在于，所述互补链是指有6-18个碱基，并且能与适体链互补配对的一小段DNA序列。

3.根据权利要求1所述的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，其特征在于，所述供体荧光染料和受体荧光染料分别为Cy3和Cy5。

4.根据权利要求1所述的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，其特征在于，所述抗生素为磺胺二甲氧嘧啶，所述核酸适配体溶液中适体链探针序列为Cy3-GGGCAACGAGTGTTTATA-3’，所述互补链溶液中互补链探针序列为：Cy5-CCCGTTGCTCAC-5’。

5.根据权利要求4所述的一种基于适体传感荧光能量共振转移的抗生素检测方法，其特征在于，所述步骤S102中，核酸适配体溶液和互补链溶液反应浓度均为：0.1 μM，所述缓冲盐溶液是指含有20~100mM Na⁺, 0~10mM Mg²⁺, 0~10mM K⁺, 10~50mM Tris-HCl的溶液，其pH值在6.5-8.5之间。