CN112763463A - 一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,属于激光技术与光子学领域。具体包括以下步骤:(1)回音壁模式微腔的选取(2)具有荧光共振能量转移效应的荧光物质对的选取(3)利用FRET提高WGM微腔传感灵敏度的具体实施方法。此方法的传感检测范围涉及到不同种类的细胞、蛋白质、生物分子等众多特定的生物物质以及一些化学分子,但不限于这些物质;可以实时对细胞内某些低浓度的特定物质进行传感检测。
Description
技术领域
本发明涉及到光学回音壁微腔及荧光基团,是一种利用荧光共振能量转移效应来提高回音壁微腔传感灵敏度的技术,属于激光技术与光子学领域。
背景技术
作为一种特殊的光学谐振腔,光学微腔是指通过边界连续的全反射,将光子长时间的局域在微腔内形成回音壁模式(Whispering Gallery Mode,WGM)的一类介质谐振腔。由于其特有的回音壁模式,使其具有超高的Q值、极小的模式体积、超高的能量密度和极窄的线宽等优越特性,从而成为目前世界前沿学科研究所使用的重要光学器件之一。
荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)则是指充当受体和供体的两个荧光发色基团在足够靠近时,供体荧光发色基团在吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体荧光发色基团转移。FRET通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态,使供体荧光强度降低,而受体可以发射更强于本身的特征荧光,同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。作为一种高效的光学“分子尺”,荧光共振能量转移在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面具有广泛的应用。在分子生物学领域,其克服了一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如免疫沉淀法、酵母双杂交等可能丢失某些信息,从而无法正确地反应活细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的动态变化过程的问题。为在活细胞的生理条件下完成对生物物质进行实时动态研究提供了便利。
本发明是基于上述技术的背景下产生的。
发明内容
本发明是一种利用荧光共振能量转移来增强WGM光学微腔传感的方法。这种传感方法包括以下几点:(1)回音壁模式微腔的选取(2)具有荧光共振能量转移效应的荧光物质对的选取(3)利用FRET 提高WGM微腔传感灵敏度的具体实施方法(4)此方法的传感检测范围涉及到不同种类的细胞、蛋白质、生物分子等众多特定的生物物质以及一些化学分子,但不限于这些物质(5)可以实时对细胞内某些低浓度的特定物质进行传感检测
具体包括以下步骤:
步骤1:回音壁模式微腔的选取
本发明所使用的回音壁模式微腔,具有微球腔、微盘腔、微环腔等多种形状结构的腔型。微腔的材料可以是硅基氧化物、聚合物、玻璃等材料。微腔尺寸大约在纳米至微米级别。一般都会在形成的微腔内部掺杂荧光物质,当使用特定波长的激光器对其进行泵浦时,符合条件波长的光会在微腔内部形成谐振,当产生的增益大于损耗时,会产生相应波段的激光。
步骤2:具有荧光共振能量转移效应的荧光物质对的选取
将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为实验所使用的荧光物质对。荧光物质A的发射光谱和荧光物质B的吸收光谱重叠,因此,当荧光物质A和B之间在距离足够近(<10nm)的情况下,就会发生荧光共振能量转移(FRET)。其中,将作为供体的荧光物质A掺杂在步骤1中的回音壁模式微腔中,另一种荧光物质B作为受体。在选择荧光物质对时要注意,供体荧光分子的发射光谱要与受体荧光分子的吸收光谱有最大程度的重叠,并且只有当两者间距小于10nm时,才会发生荧光共振能量转移效应。例如:在实验案例中采用聚苯乙烯微球-Dragon Green(DG)作为荧光共振能量转移的供体。这种微球具有较大的折射率(n=1.59),高品质因子(Q)和低模式体积,能够产生良好的荧光效率。其在空气中产生的光谱信息如图 1所示。选用罗丹明6G(Rhodamine 6G,R6G)作为荧光共振能量转移的受体。这种荧光具有很高的光稳定性,荧光量子产率高达95%,并且R6G的吸收光谱与DG微球的辐射光谱具有很大程度的重叠,能够产生良好的荧光共振能量转移效应,R6G与DG微球的光谱如图 2所示。
步骤3:证明FRET可以提高WGM微腔传感灵敏度的具体实施方法
将回音壁模式微腔悬浮于一定浓度的荧光物质B溶液后加入到 Ep管中。之后,将Ep管放置于涡旋振荡器上充分震荡,使得微腔和荧光物质B溶液混合均匀。取一定体积的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面。为了避免产生气泡,用指甲油密封四周。最后,将其置于如图3所示的光路中。
调整光路,使光斑聚焦于微腔上,用相应波段的脉冲激光器进行激光泵浦。由于微腔的发射光谱与荧光物质B的吸收光谱有很大程度的重叠,并且微腔表面带负电荷,所以阳离子荧光物质B很容易的吸附在了微腔表面,这极大地满足了产生FRET效应的条件。当微腔被脉冲激光器激发时,其作为供体会将自身能量转移给荧光物质B,当激发能量大于阈值时,荧光物质B也会被激发。这个发生非辐射能量转移的过程,即为荧光共振能量转移效应。在这个过程中,作为供体的微腔峰值波长会因为能量转移给荧光基团而快速改变,而作为受体的荧光基团峰值波长则会出现并迅速移动。最终,产生两种不同波段的激光,通过光谱仪可以观察到这两组辐射峰。其中,第一组辐射峰是微腔的激发峰,第二组辐射峰是荧光物质B的激发峰。根据荧光物质B和微腔激发峰的中心波长,计算出平均波长差Δλ并绘制相应的波长-浓度依赖曲线。最后,利用Δλ、波长-浓度依赖曲线(标准曲线)和公式(1)计算出FRET-WGM传感的检测极限。
其中,λ1为回音壁模式微腔在水中的中心峰波长,λ2为回音壁模式微腔在含有荧光物质B溶液中的中心峰波长,δλ为模式线宽。
之后,对无FRET存在下的WGM传感能力进行检测,将其检测极限与FRET-WGM的检测极限进行对比。为了尽量减少其他非FRET 因素的影响,例如分子大小、偶极矩的影响等,采用荧光物质B的异构体物质C。其中,物质C的分子量与荧光物质B的分子量差别不大,但是物质C的吸收光谱与回音壁模式微腔的发射光谱没有重叠,即两者之间不存在能量传递。
重复上述步骤,将回音壁模式微腔悬浮于相同浓度的物质C溶液中。由于物质C在可见光区域没有吸收和辐射,所以物质C与荧光物质A之间不存在FRET效应。取一定混合均匀的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面。为了避免产生气泡,用指甲油密封四周,最后将其置于相同的光路中。
调整光路,使光斑聚焦于微腔上,用相应波段的脉冲激光器进行激光泵浦。由于微腔与荧光物质C之间没有荧光共振能量转移效应,所以只出现微腔的激发峰。该激发峰的中心波长随着荧光物质C浓度的升高逐渐移动,并且随着荧光物质C浓度的增加其移动量逐渐变大。根据微腔的中心激发波长变化,绘制相应的波长-浓度依赖曲线。之后,利用浓度的依赖曲线(标准曲线)和公式(1)计算出无 FRET下WGM传感的检测极限。最后,通过比较有无FRET下WGM 传感的检测极限来证明FRET可以极大地提高WGM微腔传感的灵敏度。
在WGM微腔传感系统中引入FRET效应,可以提高系统的传感灵敏度,如果FRET的受体能够辐射激光,检测灵敏度会更高。目前人们已经提出了很多提高WGM微腔传感灵敏度的方法,除了利用等离子激元效应外,还包括提高微腔Q值、锁模、减小光学谐振腔尺寸等方法。本发明利用FRET效应来提高WGM微腔的传感灵敏度效果显著,目前国内外未有报道,是一种新型的提高微腔传感检测性能的方法。
与现有技术相比,本发明具有如下的优势:
1.检测灵敏度高。例如实验中使用的微腔尺寸为微米量级,当微腔直径越小时,就会具有越大的品质因子(Q)和越小的模式体积。由于所使用的微腔是聚苯乙烯的聚合物,具有较大的折射率,所以形成的回音壁模式谱线质量高,谱线线宽窄,有着尖锐的峰值。另外,在微腔传感系统中加入了FRET效应,使得系统的传感灵敏度在原有的基础上大大提高,其灵敏度远高于其他生物传感机制。
2.不仅仅局限于体外对样品中受体荧光浓度进行高灵敏度识别和检测,也可以在细胞内完成对受体荧光进入细胞浓度的大小进行实时检测以及对细胞内某种特定分子进行定量检测。这是因为WGM微腔有良好的生物相容性,可以通过细胞自然的胞吞进入,这样不会影响细胞的正常生理过程。并且由于FRET效应的存在,大大提高了WGM微腔传感的检测极限,能够对细胞内低浓度物质进行实时检测,这是其他生物传感机制所做不到的。
3.回音壁模式微腔和荧光物质之间可以形成双腔结构,其结构如图4所示。从而通过激光泵浦和荧光共振能量转移激发出激光。如果只激发出荧光,很难实现对细胞内物质的检测,这是由于荧光本身具有自吸收和漂白作用。一段时间后,荧光信号就会大大减弱直至消失,检测灵敏度就会大大降低。而回音壁模式微腔和荧光物质形成的双腔,会使微腔和荧光物质都产生激光,使得信号大大增强并延长了跟踪检测的时间。最后,通过检测微腔和荧光物质中心谐振峰的波长差就可以轻松完成对细胞内物质浓度的检测。
4.相比于其他通过场效应管检测分析物的技术相比,利用回音壁模式微腔与荧光物质进行荧光共振能量转移来进行特异性检测能够有效地避免双电层(“德拜长度”限制)所产生的屏蔽限制,具有更广的适用性。
附图说明:
图1.掺杂Dragon green荧光染料的微球在空气中的输出光谱。
图2.R6G与DG微球的吸收和辐射光谱图。
图3.实验装置图。
图4.回音壁模式微球与荧光物质形成的双腔结构示意图。
图5.DG在不同R6G浓度下的WGM谐振位移。a)DG和R6G辐射谱;b) 频移-浓度依赖关系;c)两组谐振峰的平均波长差。
图6.R6GH与DG微球的吸收和辐射光谱图。
图7.DG在R6GH中的谐振情况。a)DG辐射谱;b)浓度-波长依赖关系。
图8.DG在RB溶液中的光谱情况。a)RB吸收和辐射谱,插图为 RB分子结构;b)DG在不同RB浓度中的谐振峰;c)波长-浓度依赖关系。
图9.R6G和DG在细胞内的共聚焦荧光图像。a)R6G进入细胞内; b)含有DG微球和R6G的细胞。
图10 DG和R6G在细胞内传感。a)DG在10μM R6G-细胞中的辐射谱。
图11.细胞内三种不同浓度R6G的中心波长差对应匹配图。
具体实施方式
下面结合实验案例对本发明做进一步说明,但本发明并不限于以下实验案例。
实验案例1:使用FRET-WGM传感检测R6G溶液浓度
本实验采用波长为473nm的脉冲激光器,也可以是其他波段(脉冲激光器的波长主要由荧光的激发波长所决定),待检测的物质为不同浓度的R6G荧光物质。
具体实验步骤如下:
(1)由于掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因子、低模式体积的特点。更为重要的是,掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球的激光发射谱和R6G荧光物质的吸收谱具有良好的重叠性,可以使R6G分子和DG微球之间产生优越的荧光共振能量转移效应。所以,在该实验中,我们选择待测浓度的R6G以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对。DG荧光染料作为供体,待测浓度的R6G荧光分子作为受体。
(2)取相同体积的DG微球分别悬浮于不同浓度的R6G溶液后 (0μM,1μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM,300μM,500μM),加入到Ep管中。之后,将Ep管放置在涡旋振荡器上充分震荡,使得DG微球和荧光物质R6G溶液混合均匀。取一定体积的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面。为了避免产生气泡,用指甲油密封四周。最后,将其置于上述的实验光路中。
(3)使用473nm的脉冲激光器进行泵浦,调节三维调整架使得激光光斑聚焦在掺DG荧光染料的微球上。在这个过程中,可以通过CCD相机准确找到激光光斑的位置是否聚焦在微球的中心,信号光由具有光纤探头的光谱仪收集。结果观察到DG微球和 R6G荧光物质的激发峰会随着R6G浓度的改变产生谐振位移,如图5a)所示。可以发现随着R6G浓度的增加,DG激发峰的中心波长移向了短波长的方向,即发生了蓝移,从纯水中的 535nm移动到了500μMR6G溶液中的518nm。与此同时,R6G 激发峰的中心波长向长波长方向移动,即发生了红移,从1μM 浓度下的545nm,移动到了500μM浓度下的574nm。图5b) 显示了DG中心发射短波长(λ1)和R6G中心发射长波长(λ2) 随着R6G浓度变化的移动。最后根据两者激发峰的中心平均波长差,绘制频移-浓度相关曲线(标准曲线)。图5c)显示了在不同R6G浓度下的平均波长差(Δλ=λ2-λ1)随浓度的变化曲线。当R6G浓度为500μM时,两个中心峰波长之间的距离Δλ=55nm;当浓度为1μM时,Δλ=13nm。通过观察曲线变化趋势,可以发现R6G浓度较低时(0-100μM),波长变化率较大,因此浓度的微小变化导致的频移是一种高灵敏度识别样品中受体染料(R6G)浓度的有效手段。依据Δλ和浓度的依赖曲线(标准曲线)和公式(1)计算出检测极限为4.04nM。
(4)选取待测浓度的R6G溶液,重复步骤(2)中的处理后,放置于光路中,分别得到DG微球和R6G荧光物质的激发峰。计算出平均波长差Δλ,最后根据标准曲线和平均波长差Δλ完成对待测R6G溶液的浓度检测。
(5)采用无FRET存在下的WGM传感作为对照。为了尽量减少其他非FRET因素的影响,选择与R6G分子量差别不大的异构体非荧光螺内酯(R6GH)。其在可见光区域不吸收也不发射荧光, R6GH和DG微球吸收辐射谱如图6所示。因此,DG微球与 R6GH之间不存在能量传递。
(6)重复步骤(2)、(3)中的过程,将DG微球嵌入不同浓度的R6GH 溶液中,用473nm的脉冲激光器激发,最终得到如图7a)所示的结果。发现随着R6GH浓度的升高,DG的激发峰发生红移,而且红移量随着R6GH浓度的增加而变大,如图7b)所示。根据波长-浓度依赖曲线以及公式(1)得到WGM微腔对R6GH 的检测极限为1.13×104nM。
可见,没有FRET存在下WGM微腔对R6GH的检测限比FRET 存在下WGM微腔(FRET-WGM)对R6G检测限高出了接近四个数量级。FRET辅助的WGM传感系统检测极限比单独WGM传感系统检测极限大大降低。由此可见,在WGM系统中引入FRET可以极大地提高其传感能力和检测灵敏度。
实验案例2:使用FRET-WGM传感检测罗丹明B浓度
罗丹明B(Rhodamine B,RB)又称玫瑰红B,或碱性玫瑰精,是一种具有仙桃红色的人工合成染料。易溶于水、乙醇,微溶于丙酮、盐酸和氯仿等溶液,并且在水溶液中呈蓝红色,稀释后有强烈荧光。经老鼠实验发现,罗丹明B会导致皮下组织生瘤,是一种潜在的致癌、致畸和致突变的荧光物质。目前已经被各个国家归属为非法食品添加剂。所以,如何开发出一种对罗丹明B能够进行准确、高灵敏的检测技术意义重大。在这里,我们采用FRET-WGM传感方法完成对不同浓度RB溶液的检测,通过检测极限来证明该传感检测方法的高灵敏度。
具体实验步骤如下:
(1)由于掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因子、低模式体积的特点。更为重要的是,掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球的激光发射谱和RB荧光物质的吸收谱具有一定的重叠性,可以使RB分子和DG微球之间产生荧光共振能量转移效应,吸收辐射谱如图8a)所示。所以,在该实验中,我们选择待测浓度的RB以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对。DG荧光染料作为供体,待测浓度的RB荧光分子作为受体。
(2)取相同体积的DG微球分别悬浮于不同浓度的RB溶液后 (0μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM),加入到Ep管中。之后,将Ep管放置在涡旋振荡器上充分震荡,使得DG微球和荧光物质RB溶液混合均匀。取一定体积的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面。为了避免产生气泡,用指甲油密封四周。最后,将其置于上述的实验光路中。
(3)使用473nm的脉冲激光器进行泵浦,调节三维调整架使得激光光斑聚焦在掺DG荧光染料的微球上。在这个过程中,可以通过CCD相机准确找到激光光斑的位置是否聚焦在微球的中心,信号光由具有光纤探头的光谱仪收集。可以发现只出现了DG 微球的激发光谱,无任何RB的激光辐射,如图8b)所示。但是,DG微球的激发中心波长随着RB浓度的增大而发生蓝移,如图8c)所示。考虑到两种荧光之间的辐射吸收谱存在一定程度上的重叠,所以DG染料和RB荧光溶液之间发生的能量转移机制也为荧光共振能量转移。在WGM微腔下,当两种荧光分子之间发生FRET效应时,供体谐振峰会发生蓝移;当无 FRET效应时,供体谐振峰会由于浓度的增加而发生红移。RB 之所以没有出现激光辐射,是因为两者之间能量转移效率极低,导致RB荧光物质接收到的DG能量无法达到自身模式的激发阈值。所以,在光谱仪上无法观察到RB的激发峰。根据波长- 浓度依赖关系和公式(1)计算出DG-WGM微腔传感的检测极限为7.67×102nM。
(4)采用无FRET存在下的WGM传感作为对照。为了尽量减少其他非FRET因素的影响,选择非荧光螺内酯(R6GH)作为对照试验的受体,其在可见光区域不吸收也不发射荧光。因此,DG 微球与R6GH之间不存在能量传递。重复步骤(2)、(3)中的过程,将DG微球嵌入不同浓度的R6GH溶液中,用473nm的脉冲激光器激发,最终得到如图7a)所示的结果。发现随着R6GH浓度的升高,DG的激发光谱发生红移,而且红移量随着 R6GH浓度的增加而变大,如图7b)所示。根据波长-浓度依赖曲线以及公式(1)得到WGM微腔对R6GH的检测极限为 1.13×104nM。
(5)可见,没有FRET存在下WGM微腔对R6GH的检测极限比 FRET存在下WGM微腔(FRET-WGM)对罗丹明B的检测极限高出了接近一个数量级。并且相比于其他传感机制,基于FRET-WGM的检测灵敏度也远远高于这些传感机制,例如拉曼光谱法对罗丹明B的检测极限为2.087×103nM。由此可见,在 WGM系统中引入FRET可以极大地提高其传感能力和检测灵敏度,并且具有其他生物传感机制无法比拟的优势。
实验案例3:使用FRET-WGM用于细胞内R6G的传感检测
生命科学发展至今,众多科学成果显示生物的生殖发育、遗传、神经活动等重大生命现象的研究都必须以细胞作为基础。它是生物体结构和功能、遗传和代谢的基本单位,一切有机体(除病毒)都是由细胞和细胞产物所构成。细胞中各种生物物质都有着特殊的生理功能,对生命过程起着至关重要的影响。如果要阐述这些生物物质在生命过程中发挥的作用、所引起的各种生物学效应和生物学功能,就必须对他们进行准确实时地检测。但是由于生物本身环境的多样性和复杂性,很多生物传感技术均存在着比较大的局限,无法完成有选择且高灵敏地有效检测。在这里,我们采用FRET-WGM传感方法完成对细胞内不同浓度R6G的检测,来证明该传感方法的优越性。
具体实验步骤如下:
(1)由于掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因子、低模式体积的特点。更为重要的是,掺杂DG荧光染料的聚苯乙烯微球的激光发射谱和R6G荧光物质的吸收谱具有良好的重叠性,可以使R6G分子和DG微球之间产生优越的荧光共振能量转移效应。所以,在该实验中,我们选择待测浓度的R6G以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对。DG荧光染料作为供体,待测浓度的R6G荧光分子作为受体。
(2)在一定大小的培养皿中放置相应尺寸的盖玻片后,将适量的微球和生长健康的细胞混合滴在盖玻片上,使得微球和细胞均匀分布在上面。之后,将其放置于培养箱中共同孵育一定的时间,使得大部分微球经过细胞自然的胞吞进入细胞。加入一定浓度的R6G溶液,再次放回培养箱等待一定时间后取出样品,用 PBS轻轻冲洗三次,目的是将未被胞吞的微球以及细胞外的 R6G洗出,防止游离态的微球和R6G溶液对实验结果产生影响。将样品放置于共聚焦显微镜下观察,得到如图9a)所示的共聚焦图像,红色部分为R6G,发现只有细胞呈现红色,外界环境无任何荧光,表明细胞与外界环境达到一个平衡状态,R6G在短时间内不会溢出细胞。取出盖玻片,然后将另一片规格相同的盖玻片盖于上方,指甲油密封,最后将样品置于光路中。胞吞微球并吸收R6G的细胞如图9b)所示,细胞膜经过DP染色,呈现蓝色,黄色部分为DG微球,红色部分为吸收R6G的细胞质。
(3)使用473nm的脉冲激光器进行泵浦,调节三维调整架使得激光光斑聚焦在掺DG荧光染料的微球上。在这个过程中,可以通过CCD相机准确找到激光光斑的位置是否聚焦在微球的中心以及微球是否是在细胞内,信号光由具有光纤探头的光谱仪收集。通过实验发现,用473nm激光器对DG-10μM R6G-细胞样品进行泵浦,在泵浦能量为871nJ时,观察到两组激发峰如图10 所示:一组激发峰的中心波长在523nm左右,属于DG辐射;而第二组激发峰的中心波长在571nm左右,属于R6G辐射,这与在细胞外环境中获得的数据非常相似。所以,在之后细胞内检测R6G溶液浓度的实验中,我们选用细胞外检测R6G浓度的频移-浓度依赖曲线作为该实验的标准曲线。
(4)之后,对细胞内不同浓度的R6G浓度进行检测。样品的制备与步骤(2)相同。之后,将样品放置于实验光路中,使用473nm 的脉冲激光器进行激发,结果观察到DG微球作为供体会随 R6G溶液浓度发生频移。两组激发峰展现的规律和细胞外基本一致,细胞内环境会影响两组激发峰的位移,但不会影响两组激发峰的中心波长差,因为它只受FRET效应的影响。这表明细胞内FRET-WGM传感依旧可以像细胞外一样对不同浓度的 R6G进行检测。在实际中,不同类型的细胞在不同的时期对R6G 溶液的吸收量是不同的。因此,在实验中,我们直接对胞吞DG 微球和未知量R6G的细胞进行激光激发,计算出两组激发峰的中心波长差去匹配标准曲线中纵轴代表的数值Δλ,Δλ所对应的横轴数值即为此时细胞内R6G浓度。图11表示了细胞内三种不同浓度的计算结果(黑色圆点对应浓度值为2.94μM、蓝色圆点对应浓度值为17.54μM、紫色圆点对应浓度值为37.77μM)。
用此方法可以实时跟踪细胞内R6G的浓度,并且具有与细胞外检测一样的检测极限(4.04nM),这是其他技术所无法比拟的(例如: SERS的检测极限一般为5μM左右)。这为以后的细胞内特定分子定量检测提供了一种便捷有效的探测工具。对于细胞内的微腔传感,未来可以探索更多具有细胞兼容性的FRET对,如在细胞质中表达的 CFP-YFP,而不是DG-R6G的结合;同时荧光来标记细胞内的物质,如蛋白质、DNA等,通过FRET效应观察它们之间的相互作用,完成对细胞内生物物质的动态检测。
Claims (5)
1.一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,其特征在于,
步骤1:回音壁模式微腔的选取
本发明所使用的回音壁模式微腔,具有微球腔、微盘腔、微环腔等多种形状结构的腔型,微腔尺寸为纳米至微米级别;一般都会在形成的微腔内部掺杂荧光物质,当使用特定波长的激光器对其进行泵浦时,符合条件波长的光会在微腔内部形成谐振,当产生的增益大于损耗时,会产生相应波段的激光;
步骤2:具有荧光共振能量转移效应的荧光物质对的选取
将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为实验所使用的荧光物质对;荧光物质A的发射光谱和荧光物质B的吸收光谱重叠,当荧光物质A和B之间在距离足够近<10nm的情况下,就会发生荧光共振能量转移(FRET);其中,将作为供体的荧光物质A掺杂在步骤1中的回音壁模式微腔中,另一种荧光物质B作为受体;在选择荧光物质对时,供体荧光分子的发射光谱要与受体荧光分子的吸收光谱有尽可能大程度的重叠,并且当两者间距小于10nm时,发生荧光共振能量转移效应;
同时使得微腔表面带负电荷;
步骤3:FRET提高WGM微腔传感灵敏度的具体实施方法
将回音壁模式微腔悬浮于一定浓度的荧光物质B溶液后加入到Ep管中,之后,将Ep管放置于涡旋振荡器上充分震荡,使得微腔和荧光物质B溶液混合均匀;取一定体积的上述混合均匀的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面;最后,将其置于激光光路中;调整光路,使光斑聚焦于微腔上,用相应波段的脉冲激光器进行激光泵浦;由于微腔的发射光谱与荧光物质B的吸收光谱有很大程度的重叠,并且微腔表面带负电荷,所以阳离子荧光物质B很容易的吸附在了微腔表面,满足了产生FRET效应的条件;当微腔被脉冲激光器激发时,其作为供体会将自身能量转移给荧光物质B,当激发能量大于阈值时,荧光物质B也会被激发;这个发生非辐射能量转移的过程,即为荧光共振能量转移效应;在这个过程中,作为供体的微腔峰值波长会因为能量转移给荧光基团而快速改变,而作为受体的荧光基团峰值波长则会出现并迅速移动;最终,产生两种不同波段的激光,通过光谱仪可以观察到这两组辐射峰;其中,第一组辐射峰是微腔的激发峰,第二组辐射峰是荧光物质B的激发峰;根据荧光物质B和微腔激发峰的中心波长,计算出平均波长差Δλ并绘制相应的波长-浓度依赖曲线;最后,利用Δλ、波长-浓度依赖曲线和公式(1)计算出FRET-WGM传感的检测极限R;
其中,λ1为回音壁模式微腔在水中的中心峰波长,λ2为回音壁模式微腔在含有荧光物质B溶液中的中心峰波长,δλ为模式线宽;
之后,对无FRET存在下的WGM传感能力进行检测,将其检测极限与FRET-WGM的检测极限进行对比。为了尽量减少其他非FRET因素的影响,采用荧光物质B的异构体物质C;其中,物质C的分子量与荧光物质B的分子量差别不大,但是物质C的吸收光谱与回音壁模式微腔的发射光谱没有重叠,即两者之间不存在能量传递;
重复上述步骤,将回音壁模式微腔悬浮于相同浓度的物质C溶液中;由于物质C在可见光区域没有吸收和辐射,所以物质C与荧光物质A之间不存在FRET效应;取一定混合均匀的样品小心滴于盖玻片上后,轻轻盖上另一个盖玻片,使得混合溶液均匀铺在上面。为了避免产生气泡,用指甲油密封四周,最后将其置于相同的光路中;调整光路,使光斑聚焦于微腔上,用相应波段的脉冲激光器进行激光泵浦;由于微腔与荧光物质C之间没有荧光共振能量转移效应,所以只出现微腔的激发峰;该激发峰的中心波长随着荧光物质C浓度的升高逐渐移动,并且随着荧光物质C浓度的增加其移动量逐渐变大。根据微腔的中心激发波长变化,绘制相应的波长-浓度依赖曲线;之后,利用浓度的依赖曲线和公式(1)计算出无FRET下WGM传感的检测极限;最后,通过比较有无FRET下WGM传感的检测极限来证明FRET可以极大地提高WGM微腔传感的灵敏度。
2.按照权利要求1所述的一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,其特征在于,在WGM微腔传感系统中引入FRET效应,可以提高系统的传感灵敏度,如果FRET的受体能够辐射激光,检测灵敏度会更高。
3.按照权利要求1所述的一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,其特征在于,微腔的材料选自硅基氧化物、聚合物、玻璃中的一种或几种。
4.按照权利要求1所述的一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,其特征在于,用于不同种类的细胞、蛋白质、生物分子的检测。
5.按照权利要求1所述的一种提高回音壁模式微腔传感灵敏度的方法,其特征在于,对细胞内物质进行传感检测。
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