CN112630198A - 一种基于回音壁模式光学微腔的传感检测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于回音壁模式光学微腔的传感检测方法，属于检测技术领域。这种检测方法包括了以下几点：(1)回音壁模式微腔的选取，(2)微腔与具有二级结构核酸适体的结合，(3)具有荧光共振能量转移效应的荧光物质对的选取，(4)对待测生物物质及化学分子检测的具体实施方法。此探测方法的探测范围涉及到核酸、蛋白质、DNA、RNA、外泌体，细胞及微生物等众多生物物质以及一些化学分子，但不限于这些物质该方法也适用于细胞内物质传感检测。

Description

一种基于回音壁模式光学微腔的传感检测方法

技术领域

本发明涉及到光学回音壁微腔及核酸适体，一种利用回音壁模式 微腔和荧光共振能量转移对生物物质及化学分子进行检测的技术，属 于激光技术与生物光子学领域。

背景技术

作为一种特殊的光学谐振腔，回音壁模式光学微腔将光约束在环 形边界上使其发生连续的全反射，当光束绕几何结构边界传播一圈的 光程满足波长的整数倍时，会产生共振现象。其中用来约束光场的环 形结构即被称为回音壁模式光学微腔。由于其特有的光学微腔结构可 以将谐振光子长时间限制在微米尺度，使得光子可以与谐振模式范围 内的物质多次相互作用。因此，回音壁模式光学微腔具有极小的微腔 尺寸、超高的品质因子(Q)、较小的模式体积和极高的内部能量密度 等特点，成为了人们进行前沿学科研究所使用的重要光学器件之一。

目前，回音壁模式光学微腔已广泛应用于众多领域，由于其具有 极高的传感灵敏度，这使得其在生物传感和检测方面的应用尤为引人 注意，也是目前国内外前沿研究的热点领域。当光在回音壁模式微腔 表面发生全反射时，会在表面产生具有一定深度的倏逝波，当被检测 物质处于倏逝场内时，就会导致微腔周围的有效折射率发生变化，使 得其光谱发生频移。所以在实验中通过测量光谱的频移量来达到检测 的目的。2011年，美国宾夕法尼亚州立大学Svetlana V.Boriskina和 SvetlanaV.Boriskina等人首次将回音壁模式光学微腔的高灵敏度与 基于金属纳米颗粒的检测相结合，通过Au-NPs与BSA蛋白混合孵育形成BSA-Au-NPs,并利用聚乙烯亚胺溶液增强Au-NPs与AAO膜的粘 附，使得AAO膜捕获大量的Au-NPs。之后，采用锥形光纤将回音壁 模式微腔与层内Au-NPs进行短暂的耦合，通过测量和记录空气中以 及与NPs层接触后回音壁模式微腔的共振波长，成功证明了回音壁模式可以探测被等离子体金纳米颗粒吸附的BSA蛋白。本发明是基于此 背景产生的。

发明内容

本发明是一种基于回音壁模式光学微腔、核酸适体的二级结构和 荧光共振能量转移对生物物质和化学分子进行检测的方法。这种检测 方法包括了以下几点：(1)回音壁模式微腔的选取(2)微腔与具有 二级结构核酸适体的结合(3)具有荧光共振能量转移效应的荧光物 质对的选取(4)对待测生物物质及化学分子检测的具体实施方法(5) 此探测方法的探测范围涉及到核酸、蛋白质、DNA、RNA、外泌体，细 胞及微生物等众多生物物质以及一些化学分子，但不限于这些物质(6) 该方法也适用于细胞内物质传感检测。

具体包括以下步骤：

步骤1：回音壁模式微腔的选取，包括材料和结构；

本实验所使用的材料为能够形成回音壁模式微腔的物质，例如, 硅基氧化物、聚苯乙烯、发光半导体、球形钛酸钡粉体等所有能够产 生回音壁模式的材料，通过聚合、熔融、纳米加工等手段制作而成。 微腔的结构可以是球形、环形和盘型等，其一般尺寸大约在纳米至微 米级别。

步骤2，将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为 荧光物质对，其中一种荧光物质A作为供体掺杂到步骤(1)中的回 音壁模式微腔内，另一种荧光物质B作为受体；

一般都会在形成的微腔内部掺杂荧光物质(例如：荧光燃料、荧 光蛋白、以及量子点等等)，荧光物质会对微球本身的发光效率以及 遇到强光后的荧光淬灭产生一定的影响。符合条件波长的光会在微腔 内部形成谐振，当产生的增益大于损耗时，会产生相应波长的激光。 例如：在实施案例中可以采用聚苯乙烯微球，这种微球具有较大的折 射率(n＝1.59)，高品质因子(Q)和低模式体积，能够产生良好的荧 光效率并且经过大量的实验研究表明这些微球具有良好的生物相容 性，不影响生物的正常活动。由于微球具有极高的品质因子(Q), 使得微球发出的谱线线宽非常的窄，这样就算谱线一个很微小的位移 也可以被检测到。微球在空气中所产生的光谱信息如图1所示，其中 微球也可以不掺杂荧光物质。

步骤3：对微腔表面进行功能化处理，使其可以与特异性识别待 检测物质的核酸适体进行连接；

微腔表面被羧基、氨基或者其他能与核酸适体结合的官能团修饰， 使得微腔可以与待测的物质结合进行特异性识别检测；并且由于在所 述的核酸适体具有二级结构(发夹状或环状等)，5’端与3’端的碱 基可以互补配对，5’端与3’端进行荧光修饰，其中一端修饰或标 记步骤2所述的荧光物质B，另一端修饰或标记荧光淬灭物质，能够 使5’端与3’端修饰的所述的荧光物质B与所述的荧光淬灭物质之 间发生荧光淬灭，掺杂荧光物质A的微腔与荧光物质B之间能够发生 荧光共振能量转移(FRET)；

步骤4：对待测生物物质及化学分子的检测

荧光物质B和掺有荧光物质A的微球分别作为对应的受体与供体 进行检测时，通过设计使核酸适体一端被荧光淬灭物质标记，另一端 通过官能团分别依次与荧光物质B、微腔相连(见实施案例1-3)，且 同一个核酸适体荧光物质B与荧光淬灭物质的距离十分接近，荧光淬 灭剂会淬灭荧光物质B的荧光；用激光器对掺荧光染料的微球进行泵 浦，使其产生相应波段的激光，由于荧光物质B与荧光淬灭物质的距 离十分接近，荧光淬灭剂会淬灭荧光物质B的荧光，使得荧光物质A 不被激发，此时没有能量转移产生，只有微腔的激光发射峰；当待测 物质(如生物物质和化学分子)自适应地与核酸适体结合时，核酸适 体的二级结构遭到破坏，荧光淬灭物质远离了激发态的微腔和荧光物 质B，此时，由于荧光物质B与荧光淬灭物质的距离变远，荧光物质 B恢复荧光，同时由于荧光物质B和微腔的距离十分接近，处于激发 态的微腔作为供体会把一部分能量转移给荧光物质A，使得荧光物质 A被激发，发生一种非辐射能量转移，即荧光共振能量转移,在这个 过程中，作为供体的微腔峰值波长会因为能量转移给荧光基团而发生 改变，而作为受体的荧光基团峰值波长则会出现并迅速移动，最终产 生两种不同波段的激光；通过测量未发生能量转移和发生能量转移时 微腔产生激光的频谱漂移差值可以检测出该生物物质以及化学分子。

或者采用另一方法，具体步骤如下：

(1)选择无荧光的微腔；同上述第一种方法的步骤1；

(2)将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为荧 光物质对，其中一种作为荧光供体记为荧光物质A，另一种作为荧光 受体记为荧光物质B；将上述两种荧光物质标记或修饰到与适配体两 端，将上述适配体分别被荧光物质A和荧光物质B修饰或标记的两端 通过官能团与无荧光的微腔相连，使得荧光物质A和荧光物质B距离 接近能够产生荧光共振能量转移；

(3)用激光器对微腔进行泵浦，使供体荧光物质A产生相应波 段的激光，由于荧光物质A和荧光物质B之间的距离接近，所以会产 生荧光共振能量转移，在这个过程中，作为供体的荧光物质A峰值波 长会因为能量转移给荧光物质B受体而发生改变，而作为受体的荧光 物质B峰值波长则会出现并迅速移动，最终产生两种不同波段的激光； 当待测物质(如生物物质或化学分子)自适应地与适体结合时，适体 结构遭到破坏，作为受体的荧光物质B远离供体荧光物质A，使得荧 光共振能量转移的条件被破坏，激光输出模式发生改变,激发态的荧 光物质A不再作为供体，其峰值波长逐渐移动直至稳定，作为受体的 荧光基团由于距离无法接受供体的转移能量，其频谱逐渐移动直至消 失，通过测量发生能量转移和未发生能量转移时荧光基团产生激光的 频谱漂移差值可以检测出该生物物质以及化学分子，进行能量转移后 光谱信息变化如图2所示。

在整个光学系统中，连接了一台光谱仪和一个CCD装置，分别用 于接收光谱变化和实时对微腔和适体进行成像检测，实验装置结构示 意图如图3所示。

用该发明方法可以检测不同种类的生物物质以及化学分子，通过 观察供体荧光基团或者微球发生荧光共振能量转移前后谐振波长的 变化量达到检测的目的；同时，不同谐振波长的变化量对应于不同的 检测物质浓度和种类。

上述两种方法中的荧光物质为独立的荧光物质分子或荧光基团。

所述的适体与待测物质具有特异性结合且能破坏原有的适体结 构。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1.检测灵敏度高。例如实验中使用的微球均具有亚微米级尺寸， 当直径越小时，微球具有的品质因子(Q)越大，模式体积越小。同 时，由于所使用的微球都是聚苯乙烯的聚合物，具有较大的折射率， 所以形成的回音壁模式谱线质量高，谱线线宽窄，有着尖锐的峰值。 因此，发生能量转移或者微球周围环境发生微小变化时而引起的频漂 可以实时地被观察到，灵敏度远高于其他生物传感机制。

2.不仅仅局限于体外生物分子物质的检测，同时也可以在细胞内 实现检测。不同种类的微腔通过细胞自然的胞吞作用进入到细胞内， 由回音壁模式产生激光输出，通过能量转移产生不同程度的频谱漂移， 实现不同种类细胞的识别，同时还可以充当细胞激光器的作用，实时 地追踪细胞的动态过程。而且由于微球具有良好的生物相容性，对细 胞影响很小。

3.对于目前利用荧光标记进行生物物质检测的方法，荧光本身具 有自吸收作用和漂白作用。当检测时间过长时，荧光信号会大大减弱， 并且使用强光进行照射时，会引起荧光淬灭，荧光信号逐渐消失，使 得检测灵敏度大大降低，不适用于长时间地检测。而回音壁模式会使 得荧光在微腔内形成谐振，产生灵敏的激光信号，并且微球结构不易 被破坏，使得信号大大增强，有利于长时间的生物检测。

4.相比于其他通过场效应管检测分析物的技术相比，利用微球与 特定生物分子物质结合以及微球之间能量转移来进行特异性检测能 够有效地避免双电层(“德拜长度”限制)所产生的屏蔽限制，具有 更广的适用性。

附图说明：

图1不同微球在空气中的输出光谱图

图2微球之间发生能量转换时的输出光谱图

图3本发明实验装置结构示意图。

图4不同荧光基团在物质与适体结合前后的位置示意图；

说明：图中不同的颜色表示微腔产生激光所对应的波段范围，其中， 灰色表示没有产生激光或者无荧光对微腔进行处理的情况。由氢键连

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以 下实施案例。

实施案例1：检测蛋白质

本实验所使用的激光光源波长为473nm,也可以是其他波段的脉 冲激光器(脉冲激光器的波长主要由荧光的激发波长所决定)，待检 测的物质为蛋白质。

具体实验步骤如下：

(1)由于Rh6G可以有效地和Dragon Green(DG)发生荧光共振能 量转移效应，并且掺DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因 子、低模式体积的优点。所以，在该实验中，我们选择Rh6G 以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对，DG荧光染料作为 供体，Rh6G作为受体。

(2)首先，选取对蛋白质具有很高特异性与亲和力的寡核苷酸序列， 将基于上述寡核苷酸序列的脱氧核糖核酸适体稀释于TE缓冲 液里，适体的一端同时用Rh6G和氨基修饰，另一端用荧光淬灭 剂修饰。取适当羧基化的DG荧光染料微球，将微球悬浮于MES 缓冲液中，加入EDAC使得微球表面上的羧基活化。将活化后的 微球与稀释于TE缓冲液中的核酸适体充分混合，使得核酸适体 与微球之间通过氨基-羧基的官能团相连。之后进行清洗，去除 游离态的微球和核酸适体，防止其对实验结果产生干扰。

(3)用移液枪吸取一部分已经被核酸适体修饰的微球溶液滴在载玻 片上，因为要观察不同样品的光谱信息，所以将载玻片密封后 放置于三维调整架上。用激光波长为473nm的脉冲激光器进行 泵浦，调节三维调整架使激光光斑聚焦在单独的掺DG荧光染料的微球上。在这个过程中，通过CCD相机可以准确的看到微球 的位置和光斑是否聚焦在微球的中心，信号光由具有光纤探头 的光谱仪收集。可以看到由于荧光淬灭剂淬灭了Rh6G的荧光， 微球和荧光基团之间不存在荧光共振能量转移，只有微球的激 光发射峰。待光谱信息稳定以后，记录微球激光峰值波长的位 置。

(4)取步骤(2)中被核酸适体修饰的微球溶液与待测蛋白质分子在 试管中混合，将混合好的试管溶液放置于摇床中，使得蛋白质 分子与微球上的核酸适体能够充分结合。之后，用移液枪吸取 一部分溶液滴在载玻片上，并其载玻片密封后放置于三维调整 架上。

(5)使用473nm的脉冲激光器对微腔进行泵浦，调节三维调整架使 激光光斑聚焦在单独的掺DG荧光染料的微球上。由于核酸适体 与蛋白质分子进行了结合，其自身的二级结构遭到了破坏，连 接在核酸适体一端的荧光淬灭剂就会远离Rh6G和掺DG荧光染 料的微球。由于与荧光淬灭剂之间的距离变远，Rh6G的荧光得 到恢复。同时由于Rh6G和掺DG荧光的微球之间的距离十分接 近，两者之间存在着荧光共振能量转移。此时，掺DG荧光染料 的微球所激发的峰值波长发生改变，Rh6G所激发的激光峰值波 长出现并发生移动，并最终产生了两组激光发射峰。待荧光共 振能量转移稳定以后，记录微球峰值波长的位置，并与未发生 能量转移时对应的峰值波长位置作差，通过测量峰值波长位移 量的大小，可以计算出蛋白质浓度，完成对蛋白质的最终检测。

本实验由于是在细胞外完成对蛋白质分子的检测，从而并不会受 细胞内复杂环境的影响，并且由于微球良好的性质，可以实现极低蛋 白质浓度的检测，具有很好的实用性。

实施案例2：检测外泌体

通过对细胞外泌体的检测，完成对不同细胞的识别。

由于外泌体作为细胞间信使的独特功能、改变受体细胞生物活性 的能力，以及在疾病诊和靶向药物递送方面的潜力，近年来人们对外 泌体的研究兴趣急剧增加。但是如何通过对不同细胞的外泌体进行检 测来实现对不同细胞的识别一直是个难题。因此本发明基于回音壁模 式和能量转移，以MDA-MB-231(乳腺癌细胞)、Huh7(肝癌细胞)以 及骨髓间质干细胞为例，设计了对上述不同细胞的检测方案，这一方 案的成功实施，将对如何通过外泌体对特定细胞进行载药治疗提供了 有力的工具和研究方向。

具体实验步骤如下：

(1)由于Rh6G可以有效地和Dragon Green(DG)发生荧光共振能 量转移效应，并且掺DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因 子、低模式体积的优点。所以，在该实验中，我们选择Rh6G 以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对，DG荧光染料作为 供体，Rh6G作为受体。

(2)采用差速离心的方式进行外泌体的分离。首先，低速离心以除 去细胞和细胞凋亡碎片。之后，通过高速离心来沉淀外泌体并 去除上清液。最后，分别将不同细胞的外泌体标记放置于EP 管中。在该实验中，我们选用具有很高特异性与亲和力的寡核 苷酸序列，将基于上述寡核苷酸序列的脱氧核糖核酸适体稀释 于TE缓冲液中,适体的一端同时用Rh6G和氨基进行修饰，另一 端用荧光淬灭剂修饰。

(3)取适当掺DG荧光染料的微球放置于MES缓冲液中，活化其表面 的羧基官能团，加入核酸适体并放置在摇床上充分混合振荡， 使得核酸适体与微球之间通过氨基-羧基官能团连接在一起。之 后进行清洗，去除游离态的微球和核酸适体，防止其对实验结 果产生干扰。

(4)用移液枪吸取一部分已经被核酸适体修饰的微球溶液并将其滴 在载玻片上。经过密封，将滴有样品的载玻片放置于三维调整 架上进行观察。使用473nm的脉冲激光器对微腔进行泵浦，调 节三维调整架使激光光斑聚焦在单独的掺DG荧光染料的微球 上。在这个过程中，通过CCD相机可以准确的看到微球的位置 和光斑是否聚焦在微球的中心，信号光由具有光纤探头的光谱 仪收集。可以看到由于荧光淬灭剂淬灭了Rh6G的荧光，微球和荧光基团之间不存在荧光共振能量转移，只有掺DG荧光染料微 球的激光发射峰。待光谱信息稳定以后，记录微球激光峰值波 长的位置。

(5)将等量的微球溶液分别与不同细胞的外泌体溶液在试管中进行 混合，并放置于摇床上进行振荡，使得两者充分结合。之后， 使用移液枪吸取上述溶液并滴于载玻片上。最终，将载玻片进 行密封处理后放置于三维调整架上。

(6)使用473nm的脉冲激光器对微腔进行泵浦，调节三维调整架使 激光光斑聚焦在单独的微球上。由于外泌体通过核酸适体与微 腔相连，导致核酸适体的二级结构被破坏，连接在核酸适体一 端的荧光淬灭剂就会远离Rh6G和掺DG荧光染料的微球。由于 与荧光淬灭剂之间的距离变远，Rh6G的荧光得到恢复。同时由 于Rh6G和掺DG荧光的微球之间的距离十分接近，两者之间存 在着荧光共振能量转移。此时，掺DG荧光染料的微球所激发的峰值波长发生改变，Rh6G所激发的激光峰值波长出现并发生移 动。待荧光共振能量转移稳定以后，记录微球激光峰值波长的 位置，并与未发生能量转移时对应的峰值波长位置作差，通过 测量结合外泌体前后发生的频移差值，实现对不同外泌体种类 的检测，从而完成对不同细胞的识别。

本实验不仅可以检测到外泌体是否存在，而且还可以实现对不同 外泌体种类的检测和识别，对不同种类外泌体如何实现同时检测提供 了一种新的思路，具有良好的实用性。

实施案例3：检测葡萄糖

葡萄糖是一种单糖，可被人体直接吸收，是人体营养物质和基体 能量的主要来源。同时，其可以直接参与人体的新陈代谢。在消化道 中，葡萄糖比任何其他单糖都更容易被吸收，并且被吸收后的葡萄糖 可以直接被人体组织利用。葡萄糖作为一种主要的生理物质影响着人 们日常生活的方方面面，因此在各个领域(如医疗、环境监测以及食 品分析)中寻求一种快速、可靠的葡萄糖检测方法及其重要。本发明 基于回音壁模式和荧光共振能量转移，设计了一种对葡萄糖的检测方 案。这一方案的成功实施，为在生理条件下实时对葡萄糖及其浓度进 行识别检测提供了有力的工具和研究方向。

具体实验步骤如下：

(1)由于Rh6G可以有效地和Dragon Green(DG)发生荧光共振能 量转移效应，并且掺DG荧光染料的聚苯乙烯微球具有高品质因 子、低模式体积的优点。所以，在该实验中，我们选择Rh6G 以及掺DG荧光染料的微球作为荧光物质对，DG荧光染料作为 供体，Rh6G作为受体。

(2)首先，选取对葡萄糖具有很高特异性与亲和力的寡核苷酸序列， 将基于上述寡核苷酸序列的脱氧核糖核酸适体稀释于TE缓冲 液中，适体的一端同时用Rh6G和氨基修饰，另一端用荧光淬灭 剂修饰。取适量羧基化的DG荧光染料微球，并将微球悬浮于 MES缓冲液中，加入EDAC使得微球表面上的羧基活化。将活化 后的微球与稀释于TE缓冲液中的核酸适体充分混合，使得核酸 适体与微球之间通过氨基-羧基的官能团相连。之后进行清洗，去除游离态的微球和核酸适体，防止其对实验结果产生干扰。

(3)用移液枪吸取一部分已经被核酸适体修饰的微球溶液，并将其 滴在载玻片上。因为要观察不同样品的光谱信息，所以将载玻 片密封后，放置于三维调整架上进行观察。用激光波长为473nm 的脉冲激光器进行泵浦，调节三维调整架使激光光斑聚焦在单 独的掺DG荧光染料的微球上。在这个过程中，通过CCD相机可 以准确的看到微球的位置和光斑是否聚焦在微球的中心，信号 光由具有光纤探头的光谱仪收集。可以看到由于荧光淬灭剂淬 灭了Rh6G的荧光，微球和荧光基团之间不存在荧光共振能量转 移，只有掺DG荧光染料微球的激光发射峰。待光谱信息稳定以 后，记录微球激光峰值波长的位置。

(4)取适量的微球溶液与待测的葡萄糖分子在试管中进行混合，并 将试管溶液放置于摇床上，使得葡萄糖分子与微球上的核酸适 体充分结合。待一段时间后，用移液枪吸取一部分已经结合了 待测葡萄糖分子的微球溶液并将溶液滴在载玻片上。通过对载 玻片密封处理后，将其放置于光学系统中。

(5)通过473nm的激光器进行泵浦，由于核酸适体与葡萄糖分子进 行了结合，其自身的二级结构遭到了破坏，连接在核酸适体一 端的荧光淬灭剂就会远离Rh6G和掺DG荧光染料的微球。由于 与荧光淬灭剂之间的距离变远，Rh6G的荧光得到恢复。同时由 于Rh6G和掺DG荧光的微球之间的距离十分接近，两者之间存 在着荧光共振能量转移。此时，掺DG荧光染料的微球所激发的 峰值波长发生改变，Rh6G所激发的激光峰值波长出现并发生移动，并最终产生了两组激光发射峰。待荧光共振能量转移稳定 以后，记录微球激光峰值波长的位置，并与未发生能量转移时 对应的峰值波长位置作差，可以计算出葡萄糖浓度，完成对葡 萄糖的最终检测。

本实验不仅可以检测到葡萄糖分子是否存在，而且还可以实时反 应出葡萄糖浓度的大小。由于微球良好的性质，可以实现极低葡萄糖 浓度的检测，具有很好的实用性。

实施案例4：无标记检测肿瘤细胞中的microRNAs

microRNA(miRNA)是长度在18～25个核苷酸左右的内源性非编 码小分子RNA。miRNA在进化上高度保守，具有转录后基因调控功能。 越来越多的研究表明，在人类大多数的肿瘤细胞中均发现miRNA异常 表达，起到原癌基因活抑癌基因的作用。使得miRNA越来越多的应用 于肿瘤标记，成为诊断和治疗不同肿瘤组织和细胞的手段之一。尽管 miRNAs非常重要，但是缺乏灵敏有效的检测手段，目前常用的荧光 定量PCR更多是用来检测核酸等大分子物质，对于miRNAs的检测常 常由于灵敏度达不到要求而得不到广泛的应用。因此，本发明基于回 音壁模式微腔，以miR-375为例，设计了一种对细胞中miRNAs进行 无标记实时动态检测的方案。这一方案的成功实施，将为单个细胞中 miRNAs的实时动态分析和诊断提供了有力的工具。

具体实验步骤如下：

(1)在该实验中，我们选择无荧光掺杂的钛酸钡微球作为激光泵浦 的微腔，这是由于钛酸钡微球具有较高的折射率，使得微腔传 感灵敏度更高，满足miRNAs的需要。选择Cy3和Cy5作为发生 荧光共振能量转移效应的荧光物质对。其中，Cy3作为供体， Cy5作为受体。

(2)选用并合成可以特异性识别miR-375的反义单链DNA，其3’端 端通过氨基修饰(该反义单链DNA简称为Recognition-375)， 核苷酸序列如表1所示。将合成的miR-375的反义单链DNA稀 释于TE缓冲液中。将配制好的Cy3加入其中，并放置于摇床上 振荡，使得作为供体的Cy3连接在反义单链DNA被氨基修饰的 3’端。之后，进行清洗，防止游离态的Cy3对最终实验产生干 扰。

(3)合成与Recognition-375预杂交的短片段DNA(该DNA序列简 称为Reportflare-375),其核苷酸序列如表1所示。将合成 的Report flare-375稀释于TE缓冲液中，将配置好的Cy5加 入其中，并放置于摇床上振荡，使得作为受体的Cy5连接在短 片段DNA的5’端。之后，进行清洗，防止游离态的Cy5对最 终实验产生干扰。最后，通过碱基互补配对原则使得修饰好Cy5 的Report flare-375与修饰好Cy3的Recognition-375相结合。

(4)用钛酸钡粉末和超纯水配置一定浓度的钛酸钡悬浊液，并使用 羧基等官能团对钛酸钡表面进行修饰。最终，将修饰好羧基的 钛酸钡悬浊液放置于EP管中。使用移液枪吸取适量的钛酸钡悬 浊液，与步骤(3)中合成的DNA双链在试管中进行混合。之后， 将试管溶液放置于摇床上，使得钛酸钡微球通过氨基-羧基官能 团成功与该DNA双链相连。经过清洗，去除游离态的微球和DNA 双链，防止其对实验结果产生干扰。将连接好DNA双链的钛酸钡微球溶液和乳腺癌细胞MDA-MB-231共同放置于滴有培养基 的载玻片上进行培养，经过细胞自然的胞吞使得微球被内化。

(5)将内化好微球的乳腺癌细胞载玻片经过密封处理后，放置于三 维调整架上进行观察。使用波长为532nm的脉冲激光器对钛酸 钡微腔进行泵浦，用光谱仪记录激光发射谱，通过CCD调制微 腔的位置。在未与miR-375进行接触时，由于Cy3与钛酸钡微 球共同连接在Recognition-375的3’端，使得Cy3作为供体 激发出激光。由于Cy5和Cy3距离很近，使得Report flare-375 上的Cy5和Recognition-375上的Cy3发生荧光共振能量转移， 可以看到有两组激光发射峰。待荧光共振能量转移稳定以后， 记录Cy5激光峰值波长的位置。

(6)经过一段时间的培养后，MDA-MB-231乳腺癌细胞中的miR-375 会代替Reportflare-375与Recognition-375相结合。由于被 代替，Report flare-375中5’端的Cy3会远离Recognition-375 中3’端的Cy5，荧光共振能量转移消失，Cy3所激发的激光消 失，Cy5所激发的峰值波长发生移动。待光谱信息稳定后，记 录Cy5激发的峰值波长位置，与发生荧光共振能量转移时所对 应的峰值波长位置作差，得到频谱位移量的大小，不同的位移 量表示了癌细胞中含有不同浓度的miR-375。

表1 Report flare-375和Recognition-375的核苷酸序列

结果不仅检测了癌细胞中miR-375是否存在，而且还反映了癌细 胞中miR-375浓度的大小。并且由于微腔具有良好的生物相容性，不 会影响细胞以及其内部物质的正常生命过程。所以通过激光泵浦可以 完成对miR-375的无标记检测与跟踪，为以后进行癌细胞中物质的定 向抑制和治疗提供了新的方案。

Claims (6)

1.一种基于回音壁模式光学微腔的传感检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1：回音壁模式微腔的选取，包括材料和结构；

材料选用硅基氧化物、聚苯乙烯、发光半导体、球形钛酸钡粉体等所有能够产生回音壁模式的材料；微腔的结构是球形、环形或盘型，尺寸在纳米至微米级别；

步骤2，将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为荧光物质对，将其中一种荧光物质A作为供体掺杂到步骤(1)中的回音壁模式微腔内，另一种荧光物质B作为受体；

步骤3：对微腔表面进行功能化处理，使其可以与特异性识别待检测物质的核酸适体进行连接；

微腔表面被羧基、氨基或者其他能与核酸适体结合的官能团修饰，使得微腔可以与待测的物质结合进行特异性识别检测；并且由于在所述的核酸适体具有二级结构，5’端与3’端的碱基可以互补配对，5’端与3’端进行荧光修饰，其中一端修饰或标记步骤2所述的荧光物质B，另一端修饰或标记荧光淬灭物质，能够使5’端与3’端修饰的所述的荧光物质B与所述的荧光淬灭物质之间发生荧光淬灭，掺杂荧光物质A的微腔与荧光物质B之间能够发生荧光共振能量转移(FRET)；

步骤4：对待测生物物质及化学分子的检测

荧光物质B和掺有荧光物质A的微球分别作为对应的受体与供体进行检测时，通过设计使核酸适体一端被荧光淬灭物质标记，另一端通过官能团分别依次与荧光物质B、微腔相连，且同一个核酸适体荧光物质B与荧光淬灭物质的距离十分接近，荧光淬灭剂会淬灭荧光物质B的荧光；用激光器对掺荧光染料的微球进行泵浦，使其产生相应波段的激光，由于荧光物质B与荧光淬灭物质的距离十分接近，荧光淬灭剂会淬灭荧光物质B的荧光，使得荧光物质A不被激发，此时没有能量转移产生，只有微腔的激光发射峰；当待测物质自适应地与核酸适体结合时，核酸适体的二级结构遭到破坏，荧光淬灭物质远离了激发态的微腔和荧光物质B，此时，由于荧光物质B与荧光淬灭物质的距离变远，荧光物质B恢复荧光，同时由于荧光物质B和微腔的距离十分接近，处于激发态的微腔作为供体会把一部分能量转移给荧光物质A，使得荧光物质A被激发，发生一种非辐射能量转移，即荧光共振能量转移,在这个过程中，作为供体的微腔峰值波长会因为能量转移给荧光基团而发生改变，而作为受体的荧光基团峰值波长则会出现并迅速移动，最终产生两种不同波段的激光；通过测量未发生能量转移和发生能量转移时微腔产生激光的频谱漂移差值可以检测出该生物物质以及化学分子。

2.一种基于回音壁模式光学微腔的传感检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)选择无荧光的微腔；同权利要求1的步骤1；

(2)将可以发生荧光共振能量转移效应的两种荧光物质作为荧光物质对，其中一种作为荧光供体记为荧光物质A，另一种作为荧光受体记为荧光物质B；将上述两种荧光物质标记或修饰到与适配体两端，将上述适配体分别被荧光物质A和荧光物质B修饰或标记的两端通过官能团与无荧光的微腔相连，使得荧光物质A和荧光物质B距离接近能够产生荧光共振能量转移；

(3)用激光器对微腔进行泵浦，使供体荧光物质A产生相应波段的激光，由于荧光物质A和荧光物质B之间的距离接近，所以会产生荧光共振能量转移，在这个过程中，作为供体的荧光物质A峰值波长会因为能量转移给荧光物质B受体而发生改变，而作为受体的荧光物质B峰值波长则会出现并迅速移动，最终产生两种不同波段的激光；当待测物质自适应地与适体结合时，适体结构遭到破坏，作为受体的荧光物质B远离供体荧光物质A，使得荧光共振能量转移的条件被破坏，激光输出模式发生改变,激发态的荧光物质A不再作为供体，其峰值波长逐渐移动直至稳定，作为受体的荧光基团由于距离无法接受供体的转移能量，其频谱逐渐移动直至消失，通过测量发生能量转移和未发生能量转移时荧光基团产生激光的频谱漂移差值可以检测出该生物物质以及化学分子。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在整个光学系统中，连接了一台光谱仪和一个CCD装置，分别用于接收光谱变化和实时对微腔和适体进行成像检测。

4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用该发明方法检测不同种类的生物物质以及化学分子，通过观察供体荧光基团或者微球发生荧光共振能量转移前后谐振波长的变化量达到检测的目的；同时，不同谐振波长的变化量对应于不同的检测物质浓度和种类。

5.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，荧光物质为独立的荧光物质分子或荧光基团。

6.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的适体与待测物质具有特异性结合且能破坏原有的适体结构。

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