RU2799016C1 - Способ детекции локальной температуры в живых клетках и построения температурных карт живых клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и касается методик измерения локальной температуры в живых клетках, в частности внутриклеточной температуры. Описанный способ заключается в регистрации кинетики затухания антистоксовой флуоресценции белка TagRFP в клетках. Для измерения температуры предлагается использовать явление конформационной подвижности хромофора белка TagRFP, представленное гетерогенностью спектрально-временных характеристик антистоксовой флуоресцентной. Данное явление проявляется в изменении характерного времени затухания антистоксовой флуоресценции белка TagRFP при нагревании при возбуждении квантами света с длиной волны от 600 до 650 нм. При этом зависимость отношения среднего характерного времени затухания флуоресценции к времени наиболее длительной компоненты от температуры имеет характер наклонной прямой. Техническим результатом является обеспечение возможности функциональной визуализации локальной температуры внутри и/или на поверхности живых клеток и построения температурных карт всей клетки или отдельной области с точностью от 0,05°С до 0,3°С и пространственным разрешением до 300 нм. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к технологиям, более конкретно к биотехнологии. В частности, изобретение является способом определения температуры растворов и картирования температуры внутри или на поверхности живых клеток с помощью оптических методов, а именно с помощью время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии. Основа метода заключается в измерении времен затухания флуоресценции флуоресцентного белка TagRFP и дальнейшем определении температуры на основе полученных параметров. Изобретение может найти свое применение для расширения функциональных возможностей флуоресцентной микроскопии и спектроскопии с высоким временным разрешением.

Уровень техники

Температура напрямую отражает активность метаболических процессов в биологическом объекте и поэтому является важным параметром наблюдения за живым организмом. Так, известно, что развитие злокачественных новообразований, локализованные и системные инфекции, а также другие патологические состояния организма сопровождается повышенным тепловыделением [doi: 10.1111/j.1600-0609.1986-tb01749.x; doi: 10.1016/0002-9610(69)90090-7]. Частично температура регулируется на молекулярном уровне и может отражать активность химических реакций внутри клетки и в разных ее компартментах, например путем изменения уровня экспрессии генов, активности ферментов, активацию ионных каналов и т.д. Так, было обнаружено, что температура в разных частях живой клетки может отличаться [doi: 10.1038/ncomms1714], причем эти различия могут составлять от десятых до единиц градусов. В последние годы активно ведется поиск способов регистрации температуры внутри клеток. Такие способы могут найти применение в развитии методов функционального и метаболического имиджинга клеток как для диагностики ряда заболеваний, в том числе ранней диагностики опухолей, так и для тестирования на клеточных культурах новых фармпрепаратов.

Из уровня техники известен ряд подходов к измерению внутриклеточной температуры с использованием оптических методов, в частности методы с применением флуоресцентных нано термометров, которые можно разделить на несколько групп: измерение температуры на основе изменения интенсивности сигнала люминесценции красителя, изменения времени жизни флуоресценции красителя, на основе вычисления отношения времени жизни флуоресценции к интенсивности флуоресценции красителя, на основе ратиометрических методов путем сравнения интенсивности флуоресценции двух или более молекул, на основе измерения анизотропии флуоресценции. В качестве материалов термосенсоров используются комплексы металлов и флуоресцентных красителей, наноалмазы, нанокластеры золота, квантовые точки, наночастицы, а том числе полимерные наногранулы, флуоресцентные белки и низкомолекулярные красители, доставляемые внутрь клетки посредством липосом, физического контакта микропипетки с клеткой, микроинъекций, вирусов, инъекции мРНК, эндоцитоза, трансфекции, а также путем временного нарушения целостности мембраны [doi: 10.1007/s00424-018-2113-4].

Наиболее известные методы измерения температуры на основе время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии могут быть осуществлены с помощью алмазного нанотермометра [doi: 10.1038/naturel2373], нанотермометра из квантовой точки [doi: 10.1021/nn201142f], а также флуоресцентного полимерного термометра [doi: 10.1038/ncomms1714.]. Подобные нанотермометры позволяют измерять локальную температуру в разных частях клетки с высокой точностью (от 0,05°С до 0,2°С), однако они имеют высокую цитотоксичность, в том числе из-за необходимости нарушать целостность клеточной мембраны для доставки термосенсора в клетку. Применение инвазивных методов доставки термосенсора не влияет на точность измерения температуры внутри клетки, но осложняет применение таких термосенсоров для индикации специфических внутриклеточных процессов и диагностики патологических состояний.

Использование флуоресцентных белков решает проблему цитотоксичности, так как клетка может самостоятельно экспрессировать термосенсоры без необходимости нарушения целостности клеточной мембраны. Таковыми являются, например, флуоресцентные белки типа β-бочонка, а также различные химерные конструкции на их основе. Из уровня техники известно применение зеленого флуоресцентного белка (GFP) для измерения температуры с помощью метода регистрации анизотропии флуоресценции [doi: 10.1021/nl300389y], а также химерной конструкции оранжевого каротиноидного белка с флуоресцентным белком (патентный документ RU 2728678; doi: 10.1038/s41598-019-45421-7). Оба из представленных вариантов позволяют измерять помимо температуры вязкость среды, однако это затрудняет интерпретацию результатов, полученных при измерении внутри клетки. Кроме того, данные методы требуют сложного аппаратного оснащения, а также значительного времени накопления сигнала.

Наиболее близкое решение по отношению к заявляемому способу, известное из уровня техники, раскрыто в патентном документе US 7413341 B1 «Imaging methods» («Методы визуализации»), который защищает способ определения температуры, а также локальной температуры в одной или нескольких точках образца, содержащего флуорофор, например, флуоресцентный белок. При этом флуорофор, применимый в данном изобретении должен обеспечивать излучение стоксовой и антистоксовой флуоресценции, а определение температуры осуществляется с помощью параметра соотношения этих интенсивностей. Для определения температуры используется распределение Больцмана, если концентрация флуорофора в точке измерения неизвестна, или калибровочная кривая зависимости температуры от исследуемого параметра, если концентрация флуорофора в точке измерения образца известна. В качестве образцов для измерения температуры по данному способу могут быть использованы отдельные клетки и культуры клеток. При этом в документе не раскрыта чувствительность и точность измерения температуры по данному способу. Недостатками данного способа является низкая чувствительность и точность определения температуры по интенсивности флуоресценции, а также зависимость от концентрации, от которой зависят получаемые значения интенсивности стоксовой и антистоксовой флуоресценции, на основе которых определяется температура.

Раскрытие изобретения

В заявляемом изобретении предложено использование красного флуоресцентного белка TagRFP в качестве оптического температурного сенсора. Заявляемый способ заключается в использовании время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии для получения информации о температуре локального окружения белка внутри живой клетки, а также построения на основе этих данных температурных карт. Для этого используется селективное возбуждение минорных групп хромофоров TagRFP, которые изначально есть в клетке или для построения калибровочной кривой - в растворе, при любых температурах среды и отличаются от основной группы своей конформацией. Для селективного возбуждения таких групп в заявляемой технологии используются кванты света с энергией, не превышающей энергию электронного уровня S0-S1. При этом происходит излучение квантов антистоксовой флуоресценции, которые регистрируются для последующего определения спектрально-временных характеристик флуоресценции TagRFP.

Хромофоры белка TagRFP могут находиться как минимум в двух разных конформационных состояниях, и соотношение этих форм в растворе чувствительно к изменению температуры. Времена жизни флуоресценции двух форм хромофора отличаются и составляют 2300 пс для основного и 200 пс для минорного состояния. Такая значительная разница позволяет с высокой точностью определять соотношение вкладов двух хромофорных форм в общую кинетику флуоресценции раствора белков.

Флуоресцентные белки широко используются в биологических исследованиях для имиджинга и изучения белок-белковых взаимодействий. Красный флуоресцентный белок TagRFP был разработан в 2007 году на основе белка eqFP578, полученного из анемоны Entacmaea quadricolor. Значительными преимуществами белка по сравнению с аналогами стали высокий квантовый выход флуоресценции (0,48) и низкая кислотная чувствительность. В заявляемой технологии эти свойства белка-сенсора необходимы для получения высокого уровня сигнала и достоверного измерения температуры вне зависимости от состава среды.

На основе представлений о конформационной подвижности хромофора флуоресцентного белка TagRFP предлагается его использование для визуализации локальной температуры с возможностью высокого пространственного разрешения. Данный способ регистрации флуоресценции может быть использован для получения функциональных изображений клеток, в том числе температурных карт, оценки их метаболического состояния и исследования влияния факторов среды и воздействия различных веществ, в том числе и для тестирования новых препаратов.

Задачей изобретения является разработка способа оптического измерения температуры внутри и/или на поверхности живых клеток, экспрессирующих TagRFP, с высокой точностью (от 0,05°С до 0,3°С) и высоким пространственным разрешением (до 300 нм), а также построения температурных карт живых клеток. Анализ гетерогенности распределения конформационных состояний и связанных с ними спектрально-кинетических параметров осуществляется за счет регистрации кинетики затухания антистоксовой флуоресценции красного флуоресцентного белка TagRFP, экспрессируемого внутри клеток при доставке генетического материала в клетки за счет стандартных трансфекционных агентов. Техническим результатом, достигаемым заявленным изобретением, является обеспечение возможности функциональной визуализации локальной температуры внутри и/или на поверхности живых клеток и построения температурных карт всей клетки или отдельной области с точностью от 0,05°С до 0,3°С и пространственным разрешением до 300 нм за счет использования явления гетерогенности раствора флуоресцентного белка TagRFP из-за конформационной подвижности хромофора, определяемой с помощью регистрации времени жизни флуоресценции от 550 до 600 нм при возбуждении квантами света от 600 до 650 нм (фиг. 1), которое зависит от локальной температуры.

Заявляемый способ неинвазивен для клеток и характеризуется высокой точностью, значительным пространственным разрешением, а также достоверностью получаемых данных. Также в заявляемой технологии обеспечена возможность работать с образцом на глубине, определяемой фокусом объектива микроскопа, благодаря регистрации параметра времени затухания флуоресценции, а также благодаря использованию квантов красной области излучения для возбуждения флуоресценции. Благодаря простоте интерпретации данных и отсутствию необходимости дополнительных расходных материалов и специальных навыков персонала, метод может быть быстро и широко внедрен в практику.

Способ детекции локальной температуры в живых клетках и построения температурных карт живых клеток включает следующие шаги:

1. Проведение контрольных калибровочных исследований на белке в буферном растворе, соответствующем по составу и параметрам среде целевого образца, в диапазоне температур от 10 до 50°С методом импульсной время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии (фиг. 2).

2. Окрашивание клеток за счет доставки генетического материала, позволяющего клеткам самостоятельно экспрессировать флуоресцентный белок TagRFP.

3. Проведение измерений кинетики затухания антистоксовой флуоресценции флуоресцентного белка TagRFP в клетках с помощью время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (фиг. 2).

Даже при комнатной температуре (25°С) часть популяции хромофоров TagRFP может находиться в отличном от основной формы состоянии за счет флуктуаций тепловой энергии окружающей среды, вероятно, вызывающих изменения внутрибелковых контактов. Визуализация таких особых состояний хромофоров возможна за счет селективного однофотонного возбуждения флуоресценции квантами с низкой энергией (так называемое возбуждение антистоксовой флуоресценции). При этом возбуждаются электронные переходы в колебательно-возбужденных состояниях хромофоров, которые, по всей видимости, обладают большей конформационной подвижностью и, соответственно, более короткими временами жизни возбужденного состояния. Заселенность таких состояний и, соответственно, интенсивность антистоксовой флуоресценции зависит от температуры среды. Анализ спектрально-временных характеристик антистоксовой флуоресценции TagRFP показывает, что именно время жизни является наиболее чувствительным параметром для детектирования нетипичных конформационных состояний хромофоров, поэтому использование импульсной флуориметрии открывает новые возможности для использования флуоресцентного белка TagRFP для решения задач метаболического имиджинга, регистрации локальной температуры внутри или на поверхности живой клетки и построения температурных карт. Высокий квантовый выход флуоресценции (и времена жизни возбужденного состояния порядка 2.3 нс) достигаются за счет поддержания структуры хромофора с помощью нековалентных белок-хромофорных взаимодействий, которые могут значительно изменяться в зависимости от внешних условий и, соответственно, чувствительны к локальному окружению белка, что определяет возможность наблюдения за состоянием среды, в частности, температуры.

Для получения калибровочных зависимостей времени затухания флуоресценции TagRFP от температуры белки могут нарабатываться в бактериальной системе экспрессии по стандартной методике, например, описанной в статье [http://dx.doi.org/10.1016/j.chembiol.2010.03.005]. Полученный таким образом белок характеризуется диапазоном поглощения (переход S₀-S₁) от 450 до 600 нм с максимумом поглощения 555 нм и флуоресценции от 550 до 700 нм с максимумом интенсивности флуоресценции на 584 нм. По-видимому, различные конформационные состояния хромофора TagRFP характеризуются разными длинами волн поглощения, так как при возбуждении на 555 нм стоксовой флуоресценции на длине волны 584 нм в кинетике затухания флуоресценции есть только одна компонента с характерным временем 2.3 нс, характерным для основного состояния хромофора, тогда как при 630 нм возбуждении в кинетике затухания антистоксовой флуоресценции появляется вторая, быстрая, компонента с характерным временем 200 пс, вклад которой в общую кинетику затухания флуоресценции составляет более 20% при комнатной температуре, увеличиваясь более чем до 50% при нагревании до 50°С.

Флуоресценция различных состояний хромофора TagRFP характеризуется различиями в временах затухания флуоресценции, которые можно детектировать методами время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии, например методом счета одиночных фотонов с помощью гибридных детекторов со следующими характеристиками: квантовой эффективностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм не менее 10%, разбросом времени детектирования фотонов не более 180 пс. При использовании метода счета одиночных фотонов должно быть использовано импульсное возбуждающее лазерное излучение с частотой импульсов до 80 МГц, длительностью импульса не более 30 пс, длиной волны излучения от 600 до 650 нм и энергией одиночного импульса не менее 10 пДж. Полученные с помощью метода счета одиночных фотонов кинетики затухания флуоресценции аппроксимируют суммой одной или двух затухающих экспоненциальных функций, подбирая свободные параметры модели так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным.

Для калибровки зависимости характерных времен затухания флуоресценции TagRFP от температуры может быть использован раствор белка в стандартном буферном растворе на основе натрий-фосфата (10 мМ, рН 7,4) в концентрации не более 1 мкМ (25 мкг на мл), чтобы значение оптической плотности не превышало 0,1 оптических единиц для предотвращения эффектов перепоглощения флуоресценции. Калибровка должна быть получена для диапазона от 10 до 50°С с шагом 0,05°С при стабилизации необходимой температуры с помощью термостатируемого кюветного отделения, стенки которого представляют из себя элементы Пельтье с системой водяного охлаждения. Запись каждой кинетики должна начинаться после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор.

Также для калибровки можно использовать клеточную культуру, экспрессирующую флуоресцентный белок TagRFP, в виде суспензии или в прикрепленном виде. В последнем случае будет необходима платформа для инвертированного микроскопа с возможностью изменения и поддержки температуры, а запись каждой кинетики должна начинаться после достижения необходимой температуры, определяемой с помощью термопары, погруженной в клеточную среду. Для измерения методом время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) и получения данных пространственного распределения локальной температуры в процессе калибровки и при измерении опытного образца применяются следующие технологические требования: 1) Наличие время-разрешенного флуоресцентного микроскопа (FLIM) (допускается также использование обычного флуоресцентного микроскопа с приставкой FLIM) с длиной волны возбуждения импульсного лазера от 750 до 790 нм; 2) Длительность импульса лазера не должна превышать 30 пс; 3) Частота импульсов лазера не должна быть больше 80 МГц; 4) Мощность лазера должна быть не менее 1 мВт; 5) Наличие детектора время-коррелированного счета фотонов с возможностью детекции эмиссии образца в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм, разбросом времени прохождения не более 180 пс и квантовой эффективностью не менее 10%; 6) Синхронизация лазера и детектора через модуль для времякоррелированного счета одиночных фотонов; 7) Программное обеспечение для управления детектором время-коррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю;

После получения калибровочных зависимостей возможно использование методов время-разрешенной флуоресцентной спектроскопии и микроскопии для измерения средней температуры или ее градиента в опытном образце. Требования к лазерному оборудованию и системе детекции будут аналогичными требованиям для оборудования для получения калибровки времен затухания флуоресценции от температуры, изложенной выше. При этом, значение характерного времени затухания флуоресценции, полученного с помощью экспоненциального анализа кинетики затухания флуоресценции опытного образца, или попиксельное распределение характерных времен затухания флуоресценции, будет однозначно указывать на температуру образца, с которого детектировался флюоресцентный сигнал, или на распределение температур, соответственно, согласно калибровочной зависимости, полученной ранее для раствора флуоресцентных белков или для культуры, экспрессирующей флуоресцентные белки.

Полученные с помощью время-разрешенной флуоресцентной микроскопии изображения обрабатываются таким образом, что экспоненциальные функции аппроксимируют кинетики затухания флуоресценции в каждом пикселе изображения, благодаря чему определяются значения характерных времен затухания флуоресценции в каждом отдельном пикселе. Каждое значение времени сопоставляется с калибровочной зависимостью характерного времени затухания флуоресценции от температуры, которая была получена заранее в контрольных экспериментах, благодаря чему может быть решена обратная задача, и значение времени жизни возбужденного состояния может быть однозначно представлено в виде соответствующей температуры. Преобразованное таким образом изображение является картой распределения значений локальной температуры внутри культуры клеток или внутри отдельной клетки.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 представлен спектр возбуждения и флуоресценции флуоресцентного белка TagRFP с выделенными рабочими областями для возбуждения и регистрации антистоксовой флуоресценции.

На фиг. 2 представлена схема принципиальная схема эксперимента и рабочего оборудования для измерения локальной внутриклеточной температуры.

На фиг. 3 представлена калибровочная зависимость параметра отношения времен затухания флуоресценции от температуры.

Осуществление изобретения

Для начала проводится калибровка значения времен затухания флуоресценции TagRFP по температуре. Для этого можно использовать как раствор флуоресцентного белка, так и клетки, экспрессирующие TagRFP. В первом случае готовят раствор красного флуоресцентного белка TagRFP посредством разбавления в 1 мл натрий-фосфатного буфера (10 мМ, рН 7,4) раствора наработанного в рекомбинантной системе белка до концентраций не более 1 мкМ при комнатной температуре 25°С. Во втором случае стандартными методиками трансфецируют подготовленную культуру клеток встроенными в плазмидные векторы генами, кодирующими TagRFP. Полученный образец помещают под микроскоп или в спектральную установку с возможностью контроля температуры с точностью не менее 0,1°С и облучают импульсным лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны излучения от 600 до 650 нм в течение нескольких секунд для возбуждения и регистрации флуоресценции образца. Регистрируют сигнал флуоресценции в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Кривую кинетики затухания флуоресценции представляют в виде гистограммы распределения фотонов по времени их прибытия. Точки этой гистограммы аппроксимируют биэкспоненциальной функцией, представляющей модель из двух состояний. Методом деконволюции определяют времена жизни флуоресценции двух компонент и соотношения их вкладов в общую кинетику затухания флуоресценции. Далее строят калибровочную зависимость от температуры параметра отношения среднего характерного времени жизни флуоресценции к времени жизни флуоресценции второй, долго затухающей или медленной, компоненты. Таким образом получают линейную калибровочную зависимость от температуры среды.

Затем готовят опытные образцы путем стандартных методик трансфекции культуры клеток встроенными в плазмидные векторы генами, кодирующими TagRFP. С использованием микроскопа для возможности пространственного разрешения или спектральной установки, если пространственное разрешение не предполагается, проводят измерение время-разрешенного сигнала антистоксовой флуоресценции. Для этого образец облучают лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны от 600 до 650 нм в течение от нескольких секунд до не более пяти минут. Регистрируют время разрешенный флуоресцентный сигнал в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10. Строят кинетические кривые затухания флуоресценции и методом аппроксимации экспериментальных данных биэкспоненциальной функцией определяют времена затухания флуоресценции двух компонент и соотношение вкладов этих компонент в кинетику затухания флуоресценции. С использованием калибровочной кривой по рассчитанному из экспериментальных данных значению отношения среднего времени жизни флуоресценции к наиболее медленному определяют локальную температуру. Для приложений требующих исследование морфологии объектов, картирования внутриклеточной температуры и распределения неоднородностей локальной температуры необходимо получение пространственной карты распределения кинетик затухания антистоксовой флуоресценции в режиме конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с высоким пространственным разрешением.

Ниже представлены детальные примеры, описание которых не ограничивает возможные применения заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.

Пример 1

Построение калибровочной кривой на примере раствора белка TagRFP

Для получения очищенного раствора белка была использована одна из стандартных методик, описанная в статье [https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2010.03.005]. Для бактериальной экспрессии TagRFP был использован вектор pBAD/HisB (Invitrogen), модифицированный путем вставки последовательности ДНК сайта разрезания высокоспецифичной цистеиновой протеазой вируса гравировки табака между сайтом BglII и последовательность, кодирующей His6-таг. Затем с помощью полимеразной цепной реакции амплифицированный фрагмент BglII/EcoRI, кодирующий TagRFP, клонировали в модифицированный pBAD/HisB. Рекомбинантный белок TagRFP с N-концевой меткой His6 был экспрессирован в бактериальном штамме LMG194 (Invitrogen) путем культивирования в течение ночи в минимальной среде RM при 37°С в присутствии 0,005% арабинозы. Затем культуру центрифугировали при 5000 об/мин при 4°С в течение 15 мин; Осадок клеток ресуспендировали в 50 мМ NaH₂PO₄ и 300 мМ буфере NaCl (рН 8,0) и лизировали обработкой ультразвуком на льду. Рекомбинантный белок очищали с помощью металлоаффинной смолы Ni-NTA (QIAGEN) с последующим диализом в течение 3 часов против буфера, состоящего из 50 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT и 150 мМ NaCl (рН 7,5). Для получения белка TagRFP без His6-тага использовали протеазу вируса гравировки табака при соотношении TagRFP : протеаза 10:1 и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 часов. TagRFP диализовали против 10 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,0) с последующей очисткой катионообменной хроматографией. В результате был получен раствор TagRFP с концентрацией 10 мг на мл, который был разбавлен в растворе натрий фосфатного буфера (10 мМ, рН 7,4) до 25 мкг на мл до оптической плотности 0,1.

Кинетики затухания флуоресценции регистрировали с помощью детектора коррелированного по времени счета одиночных фотонов НРМ-100-07С со сверхвысоким соотношением «сигнал-шум» и разбросом времени детектирования единичного фотона менее 20 пс (Becker & Hickl, Германия), модифицированного монохроматором ML-44 (Solar LS, Беларусь), установленным на длине волны 584 нм (фиг. 1). Антистоксову флуоресценцию возбуждали лазерным импульсным излучением при 630 нм (частота 80 МГц, время полуширины импульса 150 фс, мощность излучения 3 мВт), полученным с использованием генератора второй гармоники (ASG-O-1250, ООО «Авеста-Проект», Россия) от режима «idler» фемтосекундного параметрического генератора TOPOL (ООО «Авеста-Проект», Россия), способного генерировать лазерный луч с длиной волны от 680 до 2400 нм, с накачкой фемтосекундным Yb-лазером ТЕМА-150 (ООО «Авеста-Проект», Россия). Флуоресценцию образца детектировали перпендикулярно возбуждающему пучку. Чтобы избежать регистрации рассеянного излучения лазера, используют краевой коротковолновый светофильтр (Thorlabs, США) с пропусканием не менее 80% до 600 нм (и менее 1% после 600 нм). Температуру образца во время экспериментов поддерживали с помощью системы Qpod 2е с магнитной мешалкой (Quantum Northwest, Liberty Lake, WA, США) с точностью поддержвания температуры в кювете до 0,05°С. Запись каждой кинетики затухания флуоресценции начинали после достижения необходимой температуры раствора, определяемой с помощью термопары, погруженной в белковый раствор. Измерения проводили в кварцевой кювете 10×10 мм. Время накопления сигнала при каждой температуре составляло 30 секунд. Получение и первичная обработка данных проводится с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия). Полученные кинетики затухания флуоресценции при разных температурах аппроксимировали двумя затухающими экспоненциальными функциями, так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимальным. С помощью этой процедуры определяли соответствующие характерные кинетические компоненты (характерные времена жизни возбужденных состояний) и величины соответствующих амплитуд компонент кинетики. Для каждой температуры рассчитывали параметр отношения среднего времени затухания флуоресценции (τ_m) к времени затухания медленной компоненты (τ₂) (фиг. 2). Экспериментальные калибровочные данные аппроксимируются прямой вида у=а*х+b, где у - температура, а х - параметр τ_m/τ₂ (фиг. 3). Полученные значения а и b в дальнейшем использовали для определения локальной температуры в опытных образцах с точностью не менее 0,05°С с помощью регистрации кинетик затухания флуоресценции TagRFP.

Пример 2

Картирование температуры клеток HEK293, экспрессирующих TagRFP

Клетки HEK293T, выращенные в инкубаторе при температуре +37°С в атмосфере 5% углекислого газа в среде F12/DMEM с 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 15 мМ HEPES. При степени конфлюентности 80% на чашках Петри 35 мм со стеклянным дном клетки трансфицировали по одной из стандартных методик с использованием смеси для трансфекции, состоящей из 100 нг ДНК и 1,5 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в 100 мкл среды Optimem (Invitrogen), добавлением в культуральную среду. Через сутки в СО₂-инкубаторе чашки были использованы для картирования неоднородностей распределения внутриклеточной температуры.

Измерения проводили с помощью инвертированного конфокального флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ti2-U (США), модифицированного мультифотонным гальваносканером FLIM DCS-120 (Becker & Hickl, Германия) с детектором времякоррелированного счета фотонов НМР-100-40 (Becker & Hickl, Германия) со следующими характеристиками: эффективность детекции в диапазоне от 550 до 600 нм не менее 10%, разброс времени прохождения 180 пс. Получение и обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения SPCM и SPCImage (Becker & Hickl, Германия) для управления детектором времякоррелированного счета фотонов, сбора и анализа данных с возможностью экспорта данных времен затухания флуоресценции по каждому пикселю. Измерения клеток проводили при комнатной температуре. Полученные кинетики затухания флуоресценции аппроксимировали двумя затухающими экспоненциальными функциями, для каждого пикселя так, чтобы значение суммы квадратов расхождений экспериментальных данных и экспоненциальной функции было минимально. Для более быстрой обработки данных расчет производили на компьютере с видеокартой с поддержкой графических ядер CUDA. Значения параметра τ_m/τ₂ экспортировали для каждого пикселя в виде общей матрицы, после чего значения пересчитывали с учетом заранее полученной калибровки (фиг. 3), аналогичной методике из Примера 1, и визуализировали в виде температурного изображения клетки (фиг. 2) с помощью программного обеспечения Origin (США).

Claims (5)

1. Способ детекции локальной температуры в живых клетках и построения температурных карт живых клеток путем регистрации спектрально-временных характеристик флуоресцентного белка TagRFP, обеспечивающий измерение локальной температуры в живых клетках, в диапазоне температур от 10°С до 50°С с точностью не менее 0,05°С, включающий следующие шаги:

а) построение калибровочной зависимости параметра отношения среднего характерного времени затухания флуоресценции к времени затухания наиболее длительной компоненты кинетики затухания флуоресценции от температуры в диапазоне +10°С - +50°С с шагом не более 0,05°С в растворе флуоресцентного белка TagRFP, включающее получение раствора белка TagRFP с концентрацией не более 25 мкг/мл в натрий-фосфатном буфере 10 мМ с рН 7,4 или в другом буферном растворе, соответствующем по составу и параметрам среде целевого образца, при температуре 25°С, обеспечение поддержания стабильной температуры раствора в диапазоне +10°С - +50°С с точностью не менее 0,05°С, оптическое возбуждение флуоресценции образца лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны излучения от 600 до 650 нм в течение нескольких секунд, регистрация сигнала флуоресценции в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10, построение кинетики затухания флуоресценции, аппроксимация экспериментальных данных моделью из двух состояний, определение соотношения времен затухания флуоресценции и вкладов двух компонент;

б) измерение времяразрешенного сигнала антистоксовой флуоресценции в образце биологического материала, культуре клеток, экспрессирующих флуоресцентные белки TagRFP, в том числе облучение образца лазером с параметрами частоты излучения от 10 до 80 МГц и длиной волны от 600 до 650 нм в течение не менее одной минуты и не более десяти минут, регистрация времяразрешенного флуоресцентного сигнала в диапазоне длин волн от 550 до 600 нм с отношением "сигнал-шум" не менее 10; построение кинетических кривых затухания флуоресценции; определение времен затухания флуоресценции и соотношения вкладов двух компонент в кинетику затухания флуоресценции; получение температурной карты и определение локальной температуры по калибровочной кривой.

2. Способ по п. 1, где в качестве образца используют культуру клеток HEK293T, экспрессирующую флуоресцентные белки TagRFP.

3. Способ по п. 1, где в качестве инструмента для измерения используют микроскоп, обеспечивающий возможность визуализации времени жизни флуоресценции в диапазоне от 550-600 нм и импульсным лазерным излучением от 600 до 650 нм, возбуждающим антистоксову флуоресценцию в однофотонном режиме.

Images