CN105466902A - 一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法。该测量方法包括以下具体的步骤：在活细胞中表达一种含有1个供体和n个受体的FRET串联质粒结构；首先对上述细胞进行三通道荧光成像，分别得到I_DD、I_AA、I_DA三种荧光强度图，然后选择性光漂白部分受体，再进行荧光成像获得和的荧光强度图；(3)计算G因子：本发明的测量方法具有测量过程简单、测量时间短和测量结果稳定的优点。因此，本发明对于活细胞FRET定量检测具有重要的应用价值，必将极大地提高活细胞FRET检测的成功率，从而推动FRET定量检测技术在细胞生物学中的应用。

Description

一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法

技术领域

本发明涉及一种荧光共振能量转移(FRET)敏化淬灭转化因子(G因子)的测量方法，具体涉及一种基于部分受体光漂白的G因子测量方法。

背景技术

基于荧光蛋白(FPs)的FRET显微术已经成为在活细胞中研究生化动态分子过程的重要工具。获得不依赖于检测系统和FPs表达水平的定量FRET信号是进行学术交流和比较的前提。

由于高灵敏性、低损伤和快速的特性，基于三个滤光片组合的FRET显微成像术(简称3-cubeFRETmicroscopy)成为活细胞中主流的定量FRET成像分析技术。这种受体敏化FRET检测方法(SE-FRET方法)要求分别利用三个不同的荧光滤光片组对FRET样本得到三种图像：供体通道图像(I_DD，通过供体激发光激发时在供体荧光探测通道探测到的供体荧光)，受体通道图像(I_AA，通过受体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的受体荧光)，FRET通道图像(I_DA，通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光)。

G因子表示的是敏化受体发射的荧光(F_c)占由于发生FRET使供体发生淬灭的荧光的比值。对于一种给定的FRET荧光团对和成像系统，G因子是一个恒量。测量可靠的G因子是3-cubeFRET测量的关键。

目前已有多种测量G因子的方法，Hoppe[A.D.Hoppe,K.Christensen,andJ.A.Swanson,“Fluorescenceresonanceenergytransfer-basedstoichiometryinlivingcells,”Biophys.J.83(6),3652–3664(2002)]利用荧光寿命FRET测量方法(FLIM)先测量出一种供受体浓度比为1:1的FRET串联结构的FRET效率(E)，然后再用该质粒测量出G因子。这种方法需要额外昂贵复杂FLIM测量仪器，并且测定速度慢，且容易受到光漂白的影响。Zal和Gascoigne[T.ZalandN.R.J.Gascoigne,“Photobleaching-correctedFRETefficiencyimagingoflivecells,”Biophys.J.86(6),3923–3939(2004)]提出一种基于逐渐漂白固定FRET样本的受体来确定G因子的方法，该方法需要固定细胞(死细胞)，并需要同时测量漂白前后FRET样本三个通道的图像，至少需要转换滤光片组(cube)4次。另外，利用死细胞测量的G值是否适合活细胞中FRET的精确测量一致存在争议。Nagy[Nagy,Peter,etal.“Novelcalibrationmethodforflowcytometricfluorescenceresonanceenergytransfermeasurementsbetweenvisiblefluorescentproteins,”CytometryPartA67(2)86-96(2005)]通过三种E值不同的供受体浓度比为1:1的FRET串联结构来确定G值。这种方法需要的活细胞样本多，实验过程繁琐，数据处理较为困难。Chen[H.Chenetal.,“MeasurementsofFRETEfficiencyandRatioofDonortoAcceptorConcentrationinlivingCells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)]在活细胞中用两个E值未知的供受体浓度比1:1的FRET串联结构来确定G因子。这种方法需要准备两种效率不同的FRET活细胞样本，并且两种FRET样本必须在完全相同的条件下测量。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法。对于一个给定的供受体对和检测系统，其G因子是一个恒量。G因子的准确测量是基于受体敏化荧光强度测量的FRET效率定量检测的关键。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明是基于部分受体光漂白来测量G因子，即将我们最近发明的部分受体光漂白FRET效率测量技术[H.N.Yuetal.,“Anempiricalquantitativefluorescenceresonanceenergytransfermethodformultipleacceptorsbasedonpartialacceptorphotobleaching,”Appl.Phys.Lett.100,253701(2012).]与E-FRET方法相结合，提出了一种G因子的测量新方法。

一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法，包括以下具体的步骤：

(1)在活细胞中表达一种含有1个供体和n个受体(1：n)的FRET串联质粒结构；

(2)首先利用宽场荧光显微镜对上述细胞进行三通道荧光成像，分别得到I_DD、I_AA、I_DA三种荧光强度图，然后选择性光漂白部分受体，再进行荧光成像获得和的荧光强度图；

(3)计算G因子：

$G=\frac{F_c}{I_{DD}^{post}-I_{DD}}\·\frac{x}{n}.$

其中，F_c是敏化到受体的荧光强度，F_c＝I_DA-a(I_AA-cI_DD)-d(I_DD-bI_AA)，a、b、c、d是光谱串扰系数；

I_DD表示通过供体激发光激发时在供体荧光探测通道探测到的供体荧光强度；

I_AA表示通过受体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的受体荧光强度；

I_DA表示通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光强度；

表示选择性光漂白部分受体后探测到的I_DD；

表示选择性光漂白部分受体后探测到的I_AA；

为漂白程度，控制为10～80％，优选为15～30％；

n为正整数，n优选为1～50的整数。

为了更好的阐述本发明，下面以一个G因子测量的实例进行说明：

给定的供体受体对：供体为Cerulean(简称C)，受体为Venus(简称V)。

测量系统：本实例采用双通道宽场荧光显微镜，结构如图1所示。

FRET串联质粒结构C32V：由32个氨基酸的连接序列(TSGLETRDIRSENLYFQGPREFPGGTAGPVAT)将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。

具体测量过程如下：

(1)在人的肝癌细胞(HepG2细胞)中转染并表达C32V；

(2)在宽场荧光显微镜对上述细胞进行三通道荧光成像。采用445±12.5nm、510±8.5nm的光分别作为Cerulean和Venus的激发光，采用480±11nm、长通530nm的通道分别作为Cerulean和Venus荧光的探测通道，可以测得I_DD、I_AA、I_DA三种荧光强度图；图像采集后利用较强的受体激发光(510±8.5nm)选择性地漂白部分受体Venus，实际过程中为了减少细胞的光损伤将x控制在15～30％之间，漂白时间在2～4s之间；受体部分漂白之后，同样进行荧光成像获得和的荧光强度图。

(3)用C32V(n＝1)计算G因子：

$G=\frac{F_c\·x}{I_{DD}^{post}-I_{DD}}.$

由于F_c＝I_DA-a(I_AA-cI_DD)-d(I_DD-bI_AA)，其中a、b、c、d在FRET定量测量中通过单转的供体C样本和受体V样本求出；为漂白程度。

因此，我们通过测量漂白前的I_DD、I_AA、I_DA以及漂白后的值，就能很快的得到F_c和x值，进而求出对应的G因子。

本发明的基本原理如下：

对Zal和Gascoigne提出的E-FRET公式进行整理：

${\mathrm{Ef}}_D=\frac{F_c}{F_c+G\·I_{DD}}\⇒G=\frac{1-{\mathrm{Ef}}_D}{{\mathrm{Ef}}_D}\·\frac{F_c}{I_{DD}},---\left(1\right)$

其中f_D表示FRET结构体中供体分子占所有供体分子的比例。

从该式可以看出，如果能测量出已知受供体浓度比的FRET串联结构的E值，并结合该FRET串联结构在三通道测得的荧光强度就可以求出G值。

这里可以运用我们最近发明的部分受体光漂白FRET效率测量技术[H.N.Yuetal.,“Anempiricalquantitativefluorescenceresonanceenergytransfermethodformultipleacceptorsbasedonpartialacceptorphotobleaching,”Appl.Phys.Lett.100,253701(2012).]测量出受供体分子数之比为1：n的FRET串联结构的效率E：

$E=\frac{1-I_{DD}/I_{DD}^{post}}{1-(1-x/n)I_{DD}/I_{DD}^{post}},---\left(2\right)$

为了方别求解，直接将公式(2)代入到公式(1)中消去E，其中对于固定的FRET串联结构f_D＝1，于是整理得到G值的表达式如下：

$G=\frac{F_c}{I_{DD}^{post}-I_{DD}}\·\frac{x}{n}.---\left(3\right)$

通过测量漂白前后的5个通道的值，即I_DD、I_AA、I_DA、和后即可求出G因子。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明是一种测量给定供受体对和测量系统的G因子的方法，具有测量过程简单、测量时间短和测量结果稳定的优点。因此，本发明对于活细胞FRET定量检测具有重要的应用价值，必将极大地提高活细胞FRET检测的成功率，从而推动FRET定量检测技术在细胞生物学中的应用。

附图说明

图1是实例中所述的双通道宽场荧光显微镜系统的结构示意图；其中，(a)光源；(b)三孔的激发片拉板，装载的激发片分别为：1、BP445/25，2、BP510/17，3、空挡；(c)衰减片转轮，成像时调为6档，漂白时调为1档；(d)参照样本；(e)物镜；(f)双二色片：DFT460+520；(g)二级滤光片组，装载的滤光片分别为：1、BP480/22；2、FT510；3、LP530；(h)和(i)探测器CCD。

图2是双通道宽场荧光显微镜系统探测的荧光图以及对应数据处理的x和G因子的灰度图；其中，(a)是双通道宽场荧光显微镜系统探测到的漂白前后的5个通道的图像，DD(漂白前，I_DD：BP445/25，DFT460+520，BP480/22)、AA(漂白前，I_AA：BP510/17，DFT460+520，LP530)、DA(漂白前，I_DA：BP445/25，DFT460+520，LP530)、DDP(漂白后，)、AAP(漂白后，)，白色比例尺表示20μm；(b)是运用本发明中提出的G值的测量公式，通过对(a)中的5个图像进行逐像素处理，得出对应的漂白程度x的灰度图和G值的灰度图以及G的灰度图所对应各像素灰度值的统计直方图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、质粒来源

质粒C32V(Cerulean-32-Venus)和CTV(Cerulean-TRAF-Venus，其中TRAF是一个肿瘤坏死因子受体相关因子域，一个包括229个氨基酸的长链)购于美国addgene质粒库。

2、双通道宽场荧光显微镜系统

该双通道宽场荧光显微镜系统产自德国卡尔蔡司公司，型号为AxioObserver，结构如图1所示。光源是美国LumenDynamics公司的X-Cite120Q系列的金属卤化灯，物镜是放大倍数为40、数值孔径为1.3(40×1.3NA)的油镜，一个三孔的激发片拉板，一个衰减片转轮，一个cube(每个cube中可安装激发片、分光片、发射片各一个)转轮，外接两个CCD相机。激发光波段通过推拉激发片拉板来进行选择，激发光强通过选择光源输出的5个不同档位(总光强的0％，12.5％，25％，50％，100％)和衰减片转轮的不同衰减程度(从1～6分别为原光强的100％，70％，50％，40％，20％，2％)来调节。

3、细胞培养以及质粒转染

HepG2细胞来自中国广州暨南大学，用DMEM培养基加入10％的新生牛血清放在含有5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养。细胞用胰蛋白酶消化，转到细胞培养皿中，培养24小时后，当细胞生长至70～90％时，用体外转染试剂Turbofect^TM将质粒短暂转入细胞。

转染的具体步骤：(1)取两只灭菌的EP管，每个EP管中先加入40μL无血清的DMEM，然后向一只EP管中加入1～2μL的转染试剂，另一只EP管中加入1～2μL(500～600ng/μL)的质粒，静置5分钟；(2)5分钟后，将两只EP管混匀，轻轻吹打6～8次后静置20分钟，(3)20分钟后，将420μL的无血清的DMEM加入到刚刚混匀的EP管中，轻轻混匀；(4)用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，主要洗去死细胞等脏污，然后把上述的(3)中的混合物移到培养皿中，把培养皿重新放回培养箱中4～6小时；(5)4～6小时后，吸去转染液，然后用用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，再往培养皿中加入含有新生牛血清的DMEM培养基，培养24～48小时即可用于实验。

4、测量G因子

将载有表达C32V的HepG2细胞的培养皿置于宽场荧光显微镜40×1.3NA的油镜上进行荧光成像和受体光漂白。在FRET检测时，使用445/25激发光(表示的是以425nm为中心、带宽为25nm的激发光)激发Cerulean，使用510/17激发光(表示的是以510nm为中心、带宽为17nm的激发光)激发Venus，双通道的荧光探测通道分别是采用480/22(表示的是以480nm为中心、带宽为22nm的发射光)通道检测Cerulean发射的荧光，LP530(表示的是大于530的发射光)通道检测Venus发射的荧光。受体光漂白时，将激发光源调为最大功率100％，衰减片调为100％透过率，并持续2～4秒的时间。测量得到漂白部分受体前后的转染C32V细胞的荧光强度图，如图2(a)所示。本次实验中，事先已分别用单转供体和单转受体的活细胞样本测量了供受体的光谱串扰系数，即a＝0.3163；b＝0.0077；c＝0.0008；d＝0.8536。实验测量得到的漂白程度x和G值如图2(b)所示，在同样条件下测量9组图像得到统计的G值为3.634±0.067。

本实验的结果可以通过Chen[H.Chenetal.,“MeasurementsofFRETEfficiencyandRatioofDonortoAcceptorConcentrationinlivingCells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)]提出的在活细胞中用两个E值未知的1:1FRET串联结构来确定G因子的方法来进行验证。对表达C32V和CTV的活细胞分别进行三通道的荧光成像实验，测量得到该系统的FRET敏化淬灭转化因子G为3.679±0.389，与用本发明测量得到的结果(3.634±0.067)一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法，其特征在于包括以下具体的步骤：

(1)在活细胞中表达一种含有1个供体和n个受体的FRET串联质粒结构；

(2)首先对步骤(1)中所述的细胞进行三通道荧光成像，分别得到I_DD、I_AA、I_DA三种荧光强度图，然后选择性光漂白部分受体，再进行荧光成像获得和的荧光强度图；

(3)计算G因子：

$G=\frac{F_c}{I_{DD}^{post}-I_{DD}}\·\frac{x}{n};$

其中，F_c＝I_DA-a(I_AA-cI_DD)-d(I_DD-bI_AA)，a、b、c、d是光谱串扰系数；

$x=(I_{\mathrm{AA}}-I_{\mathrm{AA}}^{\mathrm{post}})/I_{\mathrm{AA}}$ 为漂白程度；

n为正整数。

2.根据权利要求1所述的荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法，其特征在于：所述的x控制为10～80％。

3.根据权利要求1所述的荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法，其特征在于：所述的x控制为15～30％。

4.根据权利要求1所述的荧光共振能量转移敏化淬灭转化因子的测量方法，其特征在于：所述的n为1～50的整数。