CN103487418A - 一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以水溶性的上转换荧光纳米材料为荧光供体,以碳纳米材料为荧光受体荧光共振能量转移检测方法,具体步骤为:(1)制备水溶性上转换荧光纳米材料并对其进行表面标记,得到荧光供体溶液;(2)制备碳纳米材料,得到荧光受体溶液;(3)将荧光供体溶液和荧光受体溶液混合,孵育后,测定荧光强度,得到荧光猝灭曲线;(4)将一定浓度的荧光供体溶液和荧光受体溶液混合,孵育后,加入不同浓度的目标物,继续孵育后,测定荧光强度,绘制标准曲线;(5)根据标准曲线计算实际样品中目标物的浓度。本方法可以避免生物样本本底荧光的干扰,可以直接实现对血清或全血样品中目标物的检测,无需洗涤分离过程,检测速度快,成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于上转换荧光共振能量转移检测技术领域,具体涉及一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法。
背景技术
目前生物样品中的生物分子的检测方法主要有异相分析和均相分析两种,现有的异相分析方法主要有酶联免疫分析、化学发光免疫分析和放射性免疫分析等。其中酶联免疫分析是在抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记的基础上进行的分析,加入酶反应的底物后,底物被酶催化成有色产物,通过产物的量与受检物的关系进行定性或定量分析。现有的均相分析方法主要有时间分辨荧光免疫测定、下转换荧光免疫和上转换荧光共振能量转移检测。下转换荧光共振能量转移是一种基于供受体在距离足够近时的偶极-偶极相互作用的非辐射跃迁过程,是一种均相检测方法,可以克服异相分析所需的洗涤分离过程,操作简单,目前已经被用于疾病相关的生物分子的检测。时间分辨荧光免疫测定是一种非同位素免疫分析技术,它用镧系元素标记抗原或抗体,根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量荧光,同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异荧光的干扰,极大地提高了分析灵敏度。上转换荧光共振能量转移利用上转换荧光纳米材料作为荧光共振能量转移体系的供体材料的均相分析方法,可以克服生物样品背景荧光的干扰,可用于复杂生物样品的检测,现有的基于上转换荧光共振能量转移的检测方法所采用的受体材料主要有有机染料、金纳米粒子。
但是这些方法都存在一定的缺陷:
(1)酶联免疫分析是一种异相分析方法,需要洗涤分离过程,操作繁琐、耗时,同时,酶联免疫分析还需要使用抗原抗体等蛋白,价格昂贵,检测成本高;
(2)下转换荧光免疫可以克服异相分析需要洗涤分离的缺点,但是却无法避免生物样品的背景干扰和光散射,限制其在复杂血液样本分析中的应用;
(3)时间分辨荧光免疫分析不仅可以克服异相分析分析需要洗涤分离的缺点,同时也可以避免生物样品的背景干扰和光散射,可用于复杂血液样本的分析检测,但是时光分辨荧光免疫分析的仪器价格昂贵,检测成本高;
(4)目前基于上转换荧光共振能量转移的检测方法所使用的受体材料主要是有机染料、金纳米粒子,其中有机染料作为猝灭剂时的猝灭能力较低,影响分析检测的灵敏度;金纳米粒子作为猝灭剂时需要进行表面标记。
发明内容
本发明克服现有技术的不足,提供一种以碳纳米颗粒为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法。
一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于以水溶性的上转换荧光纳米材料为荧光供体,以碳纳米材料为荧光受体,按下列步骤操作:
(1)制备水溶性的上转换荧光纳米材料并在其表面标记单链核酸、多肽或蛋白,将带有表面标记的上转换荧光纳米材料分散于缓冲液中,得到荧光供体溶液;
(2)制备碳纳米材料,将碳纳米材料分散于溶剂中,得到荧光受体溶液;
(3)将荧光供体溶液、荧光受体溶液和缓冲液按不同体积比混合后,得到荧光供体浓度相同、荧光受体浓度不同的各混合液,置于20~30℃孵育60~120min,在980nm激光器下测定各混合液的上转换荧光强度,得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的荧光供体浓度和荧光受体浓度;
(4)标准曲线绘制:取荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液7组,置于20~30℃孵育60~120min后,以其中一组混合液为空白样,向其余各组混合液中分别加入已知浓度的目标物,再置于37℃孵育90~120min;在980nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度,空白样的荧光强度为F0,加入目标物的各组混合液的荧光强度为F,以(F-F0)/F0为纵坐标,目标物在混合液中的浓度为横坐标,绘制标准曲线;
(5)取步骤(4)所述荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液,20~30℃孵育60~120min,加入未知浓度的目标物样品,再置于37℃孵育90~120min后,测定混合液的荧光强度Fx,计算(Fx-F0)/F0的值,代入步骤(4)得到的标准曲线,再计算得到样品中目标物的浓度。
上述方案中,所述水溶性上转换荧光纳米材料为粒径30~100nm的球形纳米材料,其表面修饰有氨基或羧基。
上述方案中,所述碳纳米材料为碳纳米颗粒、还原型氧化石墨烯、氧化石墨烯、或壳聚糖修饰的氧化石墨烯。
上述方案中,所述目标物为单链核酸、糖类、或蛋白等所有可以与上转换荧光纳米材料表面标记物发生作用使供受体距离产生变化的物质。
上述方案中,所述目标物为血清或全血中的单链核酸、糖类、或蛋白等所有可以与上转换荧光纳米材料表面标记物发生作用使供受体距离产生变化的物质。
上述方案中,所述水溶性的上转换荧光纳米材料由如下方法制备得到:
(1)配制稀土硝酸盐溶液,所述稀土硝酸盐溶液中,稀土离子摩尔比为钇离子:镱离子:铒离子为(60~90):(5~35):(0.5~10);
(2)向步骤(1)所得稀土硝酸盐溶液中加入低级醇、及水溶性稀土离子配体水溶液,混匀,所述低级醇为乙醇、正丙醇或正丁醇,所述水溶性稀土离子配体为聚丙烯酸、氨基乙基膦酸、或聚乙烯亚胺,所述稀土硝酸盐与水溶性稀土离子配体的质量比为0.162~1.01:1;
(3)向步骤(2)所得溶液中加入氟化钠水溶液,得到均匀的混合液体;所得混合液体中,所述氟离子与总的稀土离子摩尔比为(5~16):1,所述低级醇的体积占所述混合液体的体积的1/3~1/2;
(4)将步骤(3)所得混合液体于200~240℃水热反应10~24小时;
(5)冷却至室温后,分离纯化固体产物,得到上转换荧光纳米材料。
本发明的有益效果:
(1)与传统的上转换荧光共振能量转移检测方法相比,该体系采用碳纳米材料(包括碳纳米颗粒、还原型氧化石墨烯和氧化石墨烯)作为荧光受体,碳纳米材料的碳源易得,制备方法简单,成本低廉,具有优良的猝灭能力,分析检测的灵敏度高,且在大多数检测模型中无需进行生物标记,同时也可通过对其进行生物标记来实现对目标物的检测。
(2)与使用碳材料为荧光受体的其他检测体系相比,上转换荧光共振能量转移检测可以避免生物样品本底荧光的干扰,可以用于检测单链核酸、糖类、或蛋白,也可以实现对血清或全血样本中的单链核酸、糖类、或蛋白的检测,操作简单,具有重要的临床意义。
附图说明
图1是以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法的原理图,其中1为水溶性上转换荧光纳米材料(UCPs),2为单链核酸、多肽或蛋白,3为碳纳米材料(碳纳米颗粒、还原型氧化石墨烯或氧化石墨烯),4为目标物。
图2是水热法制备的水溶性上转换荧光纳米材料的表征谱图,其中A为XRD谱图,B为透射电镜图。
图3是碳纳米颗粒的表征谱图,其中A为透射电镜图,B为紫外-可见吸收光谱图。
图4是实施例1中的荧光检测情况,其中A为上转换荧光光谱图,B为标准曲线(荧光恢复程度与目标物浓度线性关系图)。
图5是实施例2中的荧光检测情况,其中A为上转换荧光光谱图,B为标准曲线(荧光恢复程度与目标物浓度线性关系图)。
图6是实施例3中的荧光检测情况,其中A为上转换荧光光谱图,B为标准曲线(荧光恢复程度与目标物浓度线性关系图)。
图7是实施例4中的荧光检测情况,其中A为上转换荧光光谱图,B为标准曲线(荧光恢复程度与目标物浓度线性关系图)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合附图、附表及实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
以下实施例中,所述水溶性上转换荧光纳米材料按如下方法制备得到:
(1)制备稀土硝酸盐溶液:按照稀土硝酸盐中稀土离子摩尔比为钇离子:镱离子:铒离子为(60~90):(5~35):(0.5~10)称取0.4238~0.6356g氧化钇、0.0616~0.4317g氧化镱和0.0060~0.1200g氧化铒,向其中加入4~8ml质量分数为65~68%的浓硝酸,将混合溶液加热到65℃,搅拌4~12h,形成无色透明的稀土硝酸盐溶液,将反应温度升高到140℃,继续搅拌6~18h,蒸干水分和硝酸,得到稀土硝酸盐粉末,用25ml超纯水溶解稀土硝酸盐粉末,配成0.25mol/L的稀土硝酸盐溶液,过滤后备用。
(2)取2ml0.25mol/L稀土硝酸盐溶液(稀土硝酸盐的质量为0.1458g,各稀土离子摩尔比为钇离子:镱离子:铒离子=80:18:2),向其中加入18ml无水乙醇,再加入含0.9g聚丙烯酸(稀土硝酸盐与聚丙烯酸的质量比为0.162:1)或0.34g聚乙烯亚胺(稀土硝酸盐与聚乙烯亚胺的质量比为0.429:1)的水溶液8ml,搅拌10min;然后加入含0.21g氟化钠(F-/Ln3+摩尔比为10∶1)或0.126g氟化钠(F-/Ln3+摩尔比6:1)的水溶液8ml,搅拌20min后,置于高压反应釜中,在搅拌条件下于200℃反应10h;停止加热并保持搅拌冷却至室温,离心分离出固体产物,用无水乙醇和超纯水各洗3次,室温下真空干燥12h得到固体上转换荧光材料,称重后加入适量的高纯水分散得到20mg/ml的上转换荧光纳米材料水分散液。制备得到的水溶性上转换荧光纳米材料的表征谱图见图2,其中A为XRD谱图,B为透射电镜图,由图A可以看出制得的上转换荧光纳米材料由立方晶相和六方晶相的混合晶相构成,由图B可以看出其粒径为50nm。
以下实施例中,所述水溶性上转换荧光纳米材料的表面标记按如下方法进行:取5mg聚丙烯酸或者是聚乙烯亚胺修饰的上转换荧光纳米材料溶于2~5ml2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液(10mM,pH5.5)或者是羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶液(10mM,pH7.4)中,加入0.8~3.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、2.2~6.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)或者是1~5mg4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC),在30℃、轻微振荡条件下孵育0.5~2h以活化上转换荧光纳米材料表面的羧基或氨基。活化完成后离心分离得到活化的聚丙烯酸或聚乙烯亚胺修饰的上转换荧光纳米材料,将其用高纯水洗三次。洗完的沉淀分散于2~5mlHEPES缓冲液(10mM,pH7.2)中,向其中加入1.5~4uM的单链DNA或1~3mg的多肽或1~5mg蛋白,在30℃、轻微振荡条件下孵育2~24h后加入50mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)以封闭过量的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。离心分离,将得到的沉淀用高纯水洗三次以除去过量的单链DNA、多肽或蛋白,洗完后分散于2.5ml三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲溶液(10mM,150mM NaCl,pH7.4)中,得到2mg/ml的上转换荧光纳米材料-表面标记物溶液,所述上转换荧光纳米材料-表面标记物为上转换荧光纳米材料-单链核酸(UCPs-ssDNA)、上转换荧光纳米材料-多肽(UCPs-peptide)、上转换荧光纳米材料-伴刀豆球蛋白(UCPs-conA)或上转换荧光纳米材料-链霉亲和素(UCPs-SA)。
以下实施例中所述碳纳米材料按如下方法制备:
(1)碳纳米颗粒的制备:称取8mg蜡烛灰分散于20ml混合溶剂(乙醇和水的体积比为1:1)中,超声5h,3000rpm离心2min以除去大尺寸颗粒,收集上清,6000rpm离心6min得到2mg黑色沉淀,即为碳纳米颗粒,其表征谱图见图3,其中A为透射电镜图,B为紫外-可见吸收光谱图;将2mg碳纳米颗粒分散于20ml溶剂中,超声分散2h得到质量分数为0.1mg/ml的黑色碳纳米颗粒溶液。
(2)氧化石墨烯(GO)的制备:取50mL浓硫酸(浓度大于或等于70%)加热至90℃,向其中加入10g K2S2O8和10g P2O5,降温至80℃,待K2S2O8和P2O5完全溶解后缓慢加入12g石墨粉(30min内加完),80℃条件下反应4~5h,然后加入2L水,静置一夜后过滤,离心洗涤以除去酸,干燥后得到预氧化石墨烯;取460mL浓硫酸(浓度大于或等于70%)置于冰水浴中,加入预氧化石墨烯并搅拌,然后缓慢加入60g高锰酸钾(使反应液温度不超过10℃),于35℃反应2h后缓慢加入1L蒸馏水(使其温度不超过50℃),继续搅拌2h后加入3L去离子水和50mL30%H2O2,静置一天后弃去上清液,残留液先用10%HCl洗再用蒸馏水洗,得到氧化石墨烯,将得到的氧化石墨烯进行干燥;将干燥后产物称重并用适量高纯水分散,继续超声2h,使氧化石墨烯逐渐剥落成层状氧化石墨烯,得到浓度为1.5mg/ml的氧化石墨烯水溶液。
(3)壳聚糖修饰的氧化石墨烯(CS-GO)按如下方法制备:取3mg氧化石墨烯(GO)分散在12mL Tris-HCl(10mM,pH=7.4)缓冲溶液中,向其中加入3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)并在室温条件下搅拌1h,然后向其中加入1mg壳聚糖(CS)反应12h,最后用半透膜透析以除去过量的EDC和CS,得到壳聚糖修饰的氧化石墨烯(CS-GO),将其分散在2ml高纯水中,得到1.5mg/ml壳聚糖修饰的氧化石墨烯水溶液。
实施例1
取2mg/ml的上转换荧光纳米材料-单链核酸(UCPs-ssDNA)溶液6uL,向其中加入不同体积的0.1mg/mL的0.02%(wt)十二烷基苯磺酸钠分散的碳纳米颗粒水溶液(SDBS-CNPs),补加Tris-HCl(10mM,150mM NaCl,pH7.4)缓冲液至总体积为400uL,得到8组混合液,各混合液中UCPs-ssDNA浓度为0.03mg/mL,SDBS-CNPs浓度分别为0,0.006,0.012,0.02,0.03,0.036,0.04,0.05mg/mL,25℃孵育1.5h后在980nm激光器下测其上转换荧光强度,当SDBS-CNPs浓度为0.036mg/ml时所对应的混合液的荧光猝灭效率达到最大。取6组含0.03mg/ml UCPs-ssDNA、0.036mg/ml SDBS-CNPs的混合液在25℃孵育1.5h,然后以其中一组为空白样,向其余6组加入不同体积的凝血酶和血清的混合物,使得凝血酶在混合液中的浓度分别为0,0.5,2,5,10,15,20nM,血清为40倍稀释,在37℃孵育2h后在980nm激光器下测7组混合液的上转换荧光强度,得到的上转换荧光光谱图见图4A,计算加入了凝血酶和血清混合物的混合液的荧光强度F与空白样的荧光强度F0的比值,以凝血酶在混合液中的浓度对(F-F0)/F0的比值作图得到标准曲线,标准曲线见图4B。对于未知目标物浓度的血清样品,加入UCPs-ssDNA、SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液,该溶液中UCPs-ssDNA、SDBS-CNPs浓度分别为0.03mg/mL、0.036mg/mL,37℃孵育2h后,测定混合液的荧光强度,计算其与空白样的荧光强度F0的比值,然后代入标准曲线,计算得到样品中目标物的浓度。
图4A表明本发明方法建立的检测方法能够对一定浓度范围内的凝血酶有所响应,凝血酶的浓度越大,荧光强度也越高。图4B表明在一定浓度范围内荧光恢复的程度与凝血酶的浓度呈现良好的线性关系。图4A和图4B的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对血清中凝血酶的浓度的检测。
实施例2
取2mg/ml的上转换荧光纳米材料-多肽(UCPs-peptide)溶液5.6uL,向其中加入不同体积的0.1mg/mL0.05%(wt)曲拉通分散的碳纳米颗粒水溶液(TritonX-100-CNPs),补加TCNB(pH7.5,50mM Tris,10mM CaCl2,150mM NaCl,0.05%Brij)缓冲液至总体积为400uL,得到8组混合液,各混合液中UCPs-peptide浓度为0.028mg/mL,Triton X-100-CNPs浓度分别为0,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07和0.08mg/mL,20℃孵育2h后在980nm激光器下测其上转换荧光强度,当Triton X-100-CNPs浓度为0.05mg/ml时所对应的混合液荧光猝灭效率达到最大。取7组含0.028mg/ml UCPs-peptide、0.05mg/ml Triton X-100-CNPs的混合液在25℃孵育1.5h,然后以其中一组为空白样,向其余6组加入不同体积的人基质金属蛋白酶-2(MMP-2),使得MMP-2在混合液中的浓度分别为0,10,50,80,100,200,和500pg/mL,在37℃孵育1.5h后在980nm激光器下测7组混合液上转换荧光强度,计算加入了MMP-2的混合液的荧光强度F与空白样的荧光强度F0的比值,得到的上转换荧光光谱图见图5A,以MMP-2在混合液中的浓度对(F-F0)/F0的比值作图得到标准曲线,标准曲线见图5B。对于未知目标物浓度的样品,加入UCPs-peptide、Triton X-100-CNP的TCNB溶液,该溶液中UCPs-peptide、TritonX-100-CNPs浓度分别为0.028mg/mL、0.05mg/mL,37℃孵育1.5h后,测定混合液的荧光强度,计算其与空白样的荧光强度F0的差值,然后代入标准曲线,计算得到样品中目标物的浓度。
图5A表明本发明方法建立的检测方法能够对一定浓度范围内的人基质金属蛋白酶-2有所响应,人基质金属蛋白酶-2的浓度越大,荧光强度也越高。图5B表明在一定浓度范围内荧光恢复的程度与人基质金属蛋白酶-2的浓度呈现良好的线性关系。图5A和图5B的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对人基质金属蛋白酶-2的浓度的检测。
对于血清或全血样品中人基质金属蛋白酶-2的检测,利用加标回收实验来验证其可行性。取五份人基质金属蛋白酶浓度已知的实际样品(其中包含三份血清样品和两份全血样品),向其中各加入一定浓度的人基质金属蛋白酶-2溶液,加入UCPs-peptide、SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液,补加TCNB缓冲至总体积为400ul,使得该溶液中UCPs-peptide、SDBS-CNPs浓度分别为0.028mg/mL、0.05mg/ml,加入的人基质金属蛋白酶-2的浓度为100pg/ml,实际样品中人基质金属蛋白酶-2的原始浓度见表1,37℃孵育1.5h后,测定混合液的荧光强度,计算其与空白样的荧光强度F0的比值,然后代入标准曲线,计算得到样品中目标物的浓度,从而计算回收率,具体实验结果见表1,从表1的结果看,回收率可以达到92.8%~106.7%,相对标准偏差约为5%,表明本实施例的检测方法可以实现对血清或全血样品中人基质金属蛋白酶-2的检测。
表1血清或全血样品中人基质金属蛋白酶-2检测的加标回收实验
注:样品1~3为人血清样品,样品4~5为人全血样品
实施例3
取2mg/ml的上转换荧光纳米材料-伴刀豆球蛋白(UCPs-conA)溶液51uL,向其中加入不同体积的1.5mg/mL壳聚糖修饰的氧化石墨烯水溶液(GO-CS),补加Tris-HCl(10mM,pH7.4)缓冲液至总体积为400uL,得到6组混合液,各混合液中UCPs-conA浓度为0.45mg/mL,GO-CS浓度分别为0,0.05,0.1,0.15,0.20,0.22mg/mL,30℃孵育1h后在980nm激光器下测各混合液的上转换荧光强度,当GO-CS浓度为0.22mg/ml时所对应的混合液的荧光猝灭效率达到最大。取七组含0.45mg/ml UCPs-conA、0.22mg/ml GO-CS的混合液在30℃孵育1h,然后以其中一组为空白样,向其余六组加入不同体积的葡萄糖和血清混合物,使得葡萄糖在混合液中的浓度分别为0,0.56,0.8,1.04,1.28,1.6,2mM,血清为20倍稀释,在37℃孵育2h后在980nm激光器下测七组混合液的上转换荧光强度,得到的上转换荧光光谱图见图6A,计算加入了葡萄糖和血清混合物的混合液的荧光强度F与空白样的荧光强度F0的比值,以葡萄糖在混合液中的浓度对(F-F0)/F0的比值作图得到标准曲线,标准曲线见图6B。对于未知浓度的血清样品,加入UCPs-conA、GO-CS的Tris-HCl溶液,该溶液中UCPs-conA、GO-CS的浓度分别为0.45mg/mL、0.22mg/mL,37℃孵育2h后,测定溶液的荧光强度,计算其与空白样的品荧光强度F0的比值,然后代入标准曲线,计算得到血清样品中目标物的浓度。
图6A表明本发明方法建立的检测方法能够对一定浓度范围内的葡萄糖有所响应,葡萄糖的浓度越大,荧光强度也越高。图6B表明在一定浓度范围内荧光恢复的程度与葡萄糖的浓度呈现良好的线性关系。图6A和图6B的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对血清中葡萄糖浓度的检测。
实施例4
取2mg/ml上转换荧光纳米材料-链霉亲和素(UCPs-SA)溶液2ml,向其中加入4nM生物素修饰的单链核酸(SA-ssDNA)(市售试剂),室温反应4h,然后离心洗涤出去过量的SA-ssDNA,得到2mg/ml的UCPs-SA-B-ssDNA溶液。取2mg/ml的UCPs-SA-B-ssDNA溶液51uL,向其中加入不同体积的1.5mg/mL氧化石墨烯水溶液(GO),补加Tris-HCl(10mM,pH7.4)缓冲至总体积为400uL,得到8组混合液,各混合液中UCPs-SA-B-ssDNA浓度为0.45mg/mL,GO浓度分别为0,0.02,0.05,0.08,0.10,0.15,0.20mg/mL,25℃孵育2h后在980nm激光器下测各混合液上转换荧光强度,当GO浓度为0.20mg/ml时所对应的混合液的荧光猝灭效率达到最大。取7组含0.45mg/ml UCPs-SA-B-ssDNA、0.20mg/mlGO的混合液在25℃孵育2h,然后以其中一组为空白样,向其余6组加入不同体积的单链核酸(ss-DNA)溶液,使得单链核酸(ss-DNA)的浓度在混合液中的浓度分别为0,3.33,6.65,13.3,26.6,53.2,106.4nM,在37℃孵育2h后在980nm激光器下测各混合液的上转换荧光强度,得到的上转换荧光光谱见图7A,计算加入了单链核酸(ss-DNA)的混合液的荧光强度F与空白样的荧光强度F0的差值,以单链核酸(ss-DNA)在混合液中的浓度对(F-F0)/F0的比值作图得到标准曲线,标准曲线见图7B。对于未知浓度的单链核酸样品,加入UCPs-SA-B-ssDNA、GO的Tris-HCl溶液,该溶液中UCPs-SA-B-ssDNA、GO的浓度分别为0.45mg/mL、0.20mg/mL,37℃孵育2h后,测定溶液的荧光强度,计算其与空白样的品荧光强度F0的差值,然后代入标准曲线,计算得到样品中目标物的浓度。
图7A表明本发明方法建立的检测方法能够对一定浓度范围内的单链核酸有所响应,单链核酸的浓度越大,荧光强度也越高。图7B表明在一定浓度范围内荧光恢复的程度与单链核酸的浓度呈现良好的线性关系。图7A和图7B的结果表明,本实施例的检测方法可以实现对单链核酸浓度的检测。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于以水溶性的上转换荧光纳米材料为荧光供体,以碳纳米材料为荧光受体,按下列步骤操作:
(1)制备水溶性的上转换荧光纳米材料并在其表面标记单链核酸、多肽或蛋白,将带有表面标记的上转换荧光纳米材料分散于缓冲液中,得到荧光供体溶液;
(2)制备碳纳米材料,将碳纳米材料分散于溶剂中,得到荧光受体溶液;
(3)将荧光供体溶液、荧光受体溶液和缓冲液按不同体积比混合后,得到荧光供体浓度相同、荧光受体浓度不同的各混合液,置于20~30℃孵育60~120min,在980nm激光器下测定各混合液的上转换荧光强度,得到荧光猝灭效率最大的混合液中所对应的荧光供体浓度和荧光受体浓度;
(4)标准曲线绘制:取荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液7组,置于20~30℃孵育60~120min后,以其中一组混合液为空白样,向其余各组混合液中分别加入已知浓度的目标物,再置于37℃孵育90~120min;在980nm激光器下测定各组混合液的上转换荧光强度,空白样的荧光强度为F0,加入目标物的各组混合液的荧光强度为F,以(F-F0)/F0为纵坐标,目标物在混合液中的浓度为横坐标,绘制标准曲线;
(5)取步骤(4)所述荧光供体浓度和荧光受体浓度分别为荧光猝灭效率最大时所对应的浓度的混合液,20~30℃孵育60~120min,加入未知浓度的目标物样品,再置于37℃孵育90~120min后,测定混合液的荧光强度Fx,计算(Fx-F0)/F0的值,代入步骤(4)得到的标准曲线,再计算得到样品中目标物的浓度。
2.根据权利要求1所述的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于所述水溶性上转换荧光纳米材料为粒径30~100nm的球形纳米材料,其表面修饰有氨基或羧基。
3.根据权利要求1所述的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于所述碳纳米材料为碳纳米颗粒、还原型氧化石墨烯、氧化石墨烯、或壳聚糖修饰的氧化石墨烯。
4.根据权利要求1所述的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于所述目标物为单链核酸、糖类、或蛋白。
5.根据权利要求1所述的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于所述目标物为血清或全血中的单链核酸、糖类、或蛋白。
6.根据权利要求1所述的上转换荧光共振能量转移检测方法,其特征在于所述水溶性的上转换荧光纳米材料由如下方法制备得到:
(1)配制稀土硝酸盐溶液,所述稀土硝酸盐溶液中,稀土离子摩尔比为钇离子:镱离子:铒离子为(60~90):(5~35):(0.5~10);
(2)向步骤(1)所得稀土硝酸盐溶液中加入低级醇、及水溶性稀土离子配体水溶液,混匀,所述低级醇为乙醇、正丙醇或正丁醇,所述水溶性稀土离子配体为聚丙烯酸、氨基乙基膦酸、或聚乙烯亚胺,所述稀土硝酸盐与水溶性稀土离子配体的质量比为0.162~1.01:1;
(3)向步骤(2)所得溶液中加入氟化钠水溶液,得到均匀的混合液体;所得混合液体中,所述氟离子与总的稀土离子摩尔比为(5~16):1,所述低级醇的体积占所述混合液体的体积的1/3~1/2;
(4)将步骤(3)所得混合液体于200~240℃水热反应10~24小时;
(5)冷却至室温后,分离纯化固体产物,得到上转换荧光纳米材料。
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