CN106226272A - 一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法 - Google Patents

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李婷婷
杨秋霞
丁嘉敏
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Abstract

本发明公开了一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，包括如下步骤：(1)基底制备：将具有能够发生荧光共振能量转移的纳米材料修饰在吸水纸上，吸水纸切成3±0.3mm*1±0.1mm的矩形，在20‑40℃的环境下晾干后，滴加0.5‑1ul 20mM PBS缓冲液于基底上晾干；(2)探针制备：将特定序列的多肽用荧光分子进行修饰；(3)探针与基底杂化：滴加0.5‑1ul探针多肽溶液至基底上进行杂化，孵育10‑20min并晾干；(4)胶原肽的识别：将待测物质与探针多肽预混，滴加0.5‑1ul混合液至基底中，孵育20‑40min，并晾干；在暗处，以步骤(2)中荧光分子的激发波长激发，检测荧光恢复的程度。本发明具有试纸制备成本低廉，操作简单，检测方便，特异性好，用样量少等优点。

Description

一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法
技术领域
本发明涉及一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
胶原蛋白降解产生的非折叠状态的片段是疾病诊断和治疗的重要靶标。胶原蛋白作为结缔组织的主要成分，具有支撑和保护柔软组织的功能。胶原酶解在伤口愈合、组织发育和再生等众多生物过程中发挥重要作用；但是，胶原蛋白的过度降解将导致关节炎、肿瘤等大量疾病。因此，开发针对非折叠状态的胶原降解产物的抗体和多肽药物，一直是一个研究热点。胶原蛋白高度重复性的(Gly-X-Y)n氨基酸序列，导致开发其高特异性的抗体非常困难。人源化单克隆IgG抗体能识别变性的胶原蛋白，而不能识别天然的胶原蛋白。通过噬菌体展示库技术，发现了能特异性结合被金属基质蛋白酶酶切的IV型胶原蛋白碎片的肿瘤靶向肽，但该方法繁琐耗时、特异性差，且亲和力弱。因此，开发简单有效的检测非折叠状态的胶原肽的方法，仍然非常紧迫和必要。
基于荧光共振能量转移的分析技术具有灵敏度高、重现性好等特点。其中，单原子二维碳纳米材料氧化石墨烯因具有比表面积大、表面易改性、分散性好等优点，在生物领域中广为应用。不同类型的荧光基团均可以通过共振能量转移到氧化石墨烯而发生荧光淬灭，使得氧化石墨烯成为荧光共振能量转移生物传感器的优良受体。荧光标记单链DNA与氧化石墨烯通过非共价结合，被广泛应用于检测靶标DNA链、蛋白质和金属离子。基于氧化石墨烯-染料标记多肽的荧光生物传感器已被用于实时跟踪研究不同多肽与蛋白的相互作用、蛋白酶活性和癌细胞表面标记物。这些方法为理解蛋白扮演的生物角色提供了重要的平台，但是它们仅限于折叠状态良好的蛋白质。针对与疾病相关的非折叠状态的蛋白或多肽的检测方法的开发，仍然面临巨大挑战。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提出一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法。该试纸用于特异性识别胶原肽，具有检测简单、特异性好、方便快捷、价格低廉的优点。
为实现上述目的，本发明公开了如下技术方案：
一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，包括如下步骤：
(1)基底制备
将具有能够发生荧光共振能量转移的纳米材料修饰在吸水纸上，吸水纸切成3±0.3mm*1±0.1mm的矩形，在20-40℃的环境下晾干后，滴加0.5-1ul 20mM PBS缓冲液于基底上晾干；
(2)探针制备
将特定序列的多肽用荧光分子进行修饰；
(3)探针与基底杂化
滴加0.5-1ul探针多肽溶液至基底上进行杂化，孵育10-20min并晾干，探针与基底发生荧光共振能量转移，导致探针分子的荧光淬灭；
(4)胶原肽的识别
将待测物质与探针多肽预混，滴加0.5-1ul混合液至基底中，孵育20-40min，并晾干；在暗处，以步骤(2)中荧光分子的激发波长激发，利用手机拍照和图像识别软件，检测荧光恢复的程度。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)中所述能够发生荧光共振能量转移的纳米材料为不同纳米尺寸的氧化石墨烯。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)中所述吸水纸为硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、醋酸纤维素膜其中的一种。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(1)中所述将能够发生荧光共振能量转移的纳米材料修饰到吸水纸上的过程包括化学键合和物理吸附。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(3)中所述探针多肽的序列中包含多个带正电荷的氨基酸，以增加和氧化石墨烯的结合能力。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(4)中所述待测物质的定量分析，是通过利用手机拍照和图像识别软件，检测待测物质对探针分子的荧光恢复程度实现的。
本发明公开的一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，具有以下效果：
1.操作简单，检测方便，特异性好；
2.用样量少，价格便宜，成本低廉。
附图说明
图1为氧化石墨烯修饰前后的硝酸纤维素膜的扫描电镜图。
图2为氧化石墨烯试纸淬灭探针多肽的荧光图；
图3为靶标胶原肽在PBS缓冲液条件下对探针多肽-氧化石墨烯试纸的荧光恢复；
图4为靶标胶原肽在唾液条件下对探针多肽-氧化石墨烯试纸的荧光恢复；
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1-图4所示，实施例1：
(1)基底制备
将硝酸纤维素膜切成3±0.3mm*1±0.1mm的矩形，将0.7ul一定浓度氧化石墨烯溶液滴在硝酸纤维素膜上，室温晾干10min，滴加0.7ul 20mM PBS缓冲液于基底上晾干；
(2)探针制备
将氨基酸序列为G(PRGPOG)5的多肽用FITC荧光染料进行修饰，用液相色谱进行纯化，得到探针多肽FITC-G(PRGPOG)5；
(3)荧光淬灭曲线
将不同浓度的氧化石墨烯溶液滴在硝酸纤维素膜上，室温晾干10min，滴加0.7ul20mM PBS缓冲液于基底上晾干；将0.7ul 15uM的探针多肽溶液滴至基底中，室温孵育10min并晾干；在暗处，以312nm的紫外光照射试纸进行荧光显色，使用手机照相功能进行拍照，使用ImageJ软件对对照片中的显色程度进行读数，绘制氧化石墨烯对探针多肽的荧光淬灭曲线；
(4)荧光恢复曲线
将10ul浓度为300uM的探针多肽A与7.5ul不同浓度的靶标多肽B(氨基酸序列为G(POG)10)混合，90℃水浴加热15min，然后4℃孵育4hrs；将混合物用PBS缓冲液稀释20倍，取0.7ul稀释后的混合物滴至(1)所制备的基底中，室温孵育10min并晾干；在暗处，以312nm的紫外光照射试纸进行荧光显色，使用手机照相功能进行拍照，使用ImageJ软件对对照片中的显色程度进行读数，绘制靶标多肽对探针多肽-氧化石墨烯试纸的荧光恢复曲线。
(5)复杂体系中的胶原肽识别
将10ul浓度为300uM的探针多肽A与7.5ul不同浓度的靶标多肽B(氨基酸序列为G(POG)10)混合，90℃水浴加热15min，然后4℃孵育4hrs；将混合物用唾液稀释20倍，取0.7ul稀释后的混合物滴至(1)所制备的基底中，室温孵育10min并晾干；在暗处，以312nm的紫外光照射试纸进行荧光显色，使用手机照相功能进行拍照，使用ImageJ软件对对照片中的显色程度进行读数，绘制唾液条件下，靶标多肽对探针多肽-氧化石墨烯试纸的荧光恢复曲线。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (6)

1.一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)基底制备
将具有能够发生荧光共振能量转移的纳米材料修饰在吸水纸上，吸水纸切成3±0.3mm*1±0.1mm的矩形，在20-40℃的环境下晾干后，滴加0.5-1ul 20mM PBS缓冲液于基底上晾干；
(2)探针制备
将特定序列的多肽用荧光分子进行修饰；
(3)探针与基底杂化
滴加0.5-1ul探针多肽溶液至基底上进行杂化，孵育10-20min并晾干，探针与基底发生荧光共振能量转移，导致探针分子的荧光淬灭；
(4)胶原肽的识别
将待测物质与探针多肽预混，滴加0.5-1ul混合液至基底中，孵育20-40min，并晾干；在暗处，以步骤(2)中荧光分子的激发波长激发，利用手机拍照和图像识别软件，检测荧光恢复的程度。
2.如权利要求1所述一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述能够发生荧光共振能量转移的纳米材料为不同纳米尺寸的氧化石墨烯。
3.如权利要求1所述一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述吸水纸为硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、醋酸纤维素膜其中的一种。
4.如权利要求1所述一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述将能够发生荧光共振能量转移的纳米材料修饰到吸水纸上的过程包括化学键合和物理吸附。
5.如权利要求1所述一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述探针多肽的序列中包含多个带正电荷的氨基酸，以增加和氧化石墨烯的结合能力。
6.如权利要求1所述一种识别胶原肽的氧化石墨烯试纸检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述待测物质的定量分析，是通过利用手机拍照和图像识别软件，检测待测物质对探针分子的荧光恢复程度实现的。
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