CN106290832A - 一种免疫侧向层析定量检测试剂及其制备方法、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于链霉亲和素偶联物结合生物素偶联物的侧向层析检测试剂及其制备方法、检测方法。本发明基于近红外荧光分子标记链霉亲和素形成复合物，应用此复合物与生物素偶联物再结合的性能，以硝酸纤维素膜为固相载体制备免疫层析定量检测试纸条。本试剂在检测过程中生成标记免疫复合物，采用常规近红外荧光检测仪器进行采集和分析，获得样本中待测物的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及链霉亲和素标记物与生物素偶联物在侧向层析定量检测中的应用技术领域，特别涉及一种免疫侧向层析定量检测试剂及其制备方法、检测方法。
背景技术
免疫侧向层析技术的主要特点是检测速度快，操作简单，因此在很多领域得到了广泛的应用。它是以条状纤维材料为固相，如硝酸纤维素膜，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上预包被的该待测物特异性受体发生高亲和性免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过对该特定区域的分析得到实验结果，从而达到检测目的。常用的标记物如酶、胶体金颗粒、彩色微球、荧光微球、有机荧光分子。
酶法标记是利用酶催化底物的原理，其缺点是检测范围窄、受温度影响大；胶体金标记是通过静电吸附原理标记，再对捕获线上胶体金颗粒的富集显色判定结果，其缺点是重复性差，灵敏度不高；彩色微球可以采用共价的化学交联法也可以采用物理吸附法标记，但定量检测的缺点是捕获线上色度不均一；荧光微球的本质和彩色微球一样，是将有机荧光分子掺入或包被乳胶微球而制成，其缺点是微球分子阻碍大、特异性低、微球容易凝聚；上述方法均难以做到精确定量，从而限制了这类产品的实际应用。在已经商品化的定量免疫层析诊断试剂中，也有用荧光分子标记，而一般的荧光染料因为它们的激发光和检测光的波长位于可见光区，容易形成高背景的荧光干扰，降低了检测灵敏度。
链霉亲和素生物素系统是一种新型生物反应系统，此系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合，且一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，目前已应用于酶法检测微量抗原、分离DNA片段和蛋白、在细胞水平的定位观察研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于针对现有免疫侧向层析定量检测试剂条所存在的检测灵敏度差的问题而提供一种操作简单便捷、检测速度快，定量准确的免疫侧向层析定量检测试剂。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供上述免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三在于提供上述免疫侧向层析定量检测试剂的检测方法。
作为本发明的第一方面的免疫侧向层析定量检测试剂，包括测试条，所述测试条包括底板和按样品流动方向依次设置在所述底板上的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，按样品流动方向所述检测线在前，质控线在后，所述检测线上包被有检测线蛋白，所述质控线上包被有质控线蛋白，其特征在于，
所述检测线蛋白为能与抗体免疫标记复合物结合，形成免疫复合物；所述质控线蛋白能与参照标记复合物特异性结合；
还包括抗体免疫标记复合物冻干品和参照标记复合物两者混合物的冻干品；
所述抗体免疫标记复合物是以近红外荧光分子染料标记链霉亲和素与活化的生物素偶联能与体内的疾病标志物特异性结合的生物素标记特异性抗体结合而形成的抗体免疫标记复合物；
所述参照标记复合物是以近红外荧光分子染料标记链霉亲和素与活化的生物素标记参照物结合而形成。
作为本发明第二发明的免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法，具有如下步骤：
1)制备近红外荧光分子染料标记链霉亲和素；
2)活化的生物素偶联能与体内的疾病标志物特异性结合得到生物素标记特异性抗体，活化的生物素标记参照物得到活化的生物素标记参照物；
3)将步骤1)制备的近红外荧光标记的链霉亲和素分别与步骤2)制备的生物素标记特异性抗体、活化的生物素标记参照物混合，发生链霉亲和素生物素放大反应，形成抗体免疫标记复合物和参照标记复合物，将所述抗体免疫标记复合物和参照标记复合物混合后冻干形成两者混合物的冻干品；
4)将检测线蛋白和质控线蛋白分别包被到所述硝酸纤维素膜上的检测线位置和质控线位置，在所述硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；
5)将样品垫和吸水垫分别粘贴到硝酸纤维素膜的两端，切割成测试条并装入塑料卡槽组装成试剂卡；
6)将步骤3)的抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者混合物的冻干品与步骤5)的试剂卡装入包装袋内组装成免疫侧向层析定量检测试剂盒，免疫侧向层析定量检测试剂处于干燥低温保存状态。
在本发明的一个优选实施例中，所述近红外荧光分子染料为发射波长为650-1000nm的近红外荧光分子染料。
在本发明的而一个优选实施例中，所述近红外荧光分子染料为琥珀酰亚胺酯IRDye800。
在本发明的一个优选实施例中，所述参照物为抗兔IgG抗体。
作为本发明第三方面的免疫侧向层析定量检测试剂的检测方法，具有如下步骤：
1)将抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者混合物的冻干品复溶恢复至使用状态得到抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者的混合复溶液；
2)将待测抗原分别与抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者的混合复溶液以1:2比例混匀，取100ul加到测试条样品垫上；
3)将试剂卡用近红外荧光检测仪读取检测线和质控线，以储存的标准曲线计算待测物浓度。
本发明使用硝酸纤维素膜作为固相载体，将特定蛋白质固定在上面形成检测线和质控线，组装成由样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成的试剂卡；用近红外荧光标记的链霉亲和素与生物素标记的抗体，发生每个链霉亲和素能结合四个分子生物素的信号放大反应，形成标记复合物。在检测过程中，标记复合物与待测物样本反应后，再与固相上的检测线和质控线分别反应，形成相应的免疫复合物，最后用红外荧光检测仪对试剂卡视窗进行扫描，并根据荧光强度和标准曲线计算标本中待测物的浓度。本发明操作简单便捷、检测速度快，定量准确，可以应用于疾病诊断、毒品以及食品安全等的检测。
本发明利用红外荧光染料的优势，应用了链霉亲和素生物素系统，克服了以一般荧光染料为标记物的侧向层析技术所呈现的背景荧光干扰大，灵敏度低，定量不精确的缺点，建立了一种基于近红外荧光染料标记链霉亲和素、再与生物素偶联物反应的检测方法。本发明的工作原理为：使用划膜仪，将能与被检测物特异性结合的蛋白质固定在硝酸纤维素膜的检测线上，将能与参照物形成特异性结合的蛋白质固定在硝酸纤维素膜的质控线上，检测时，先将冻干品恢复至使用状态，形成的近红外荧光染料偶联链霉亲和素—生物素标记第二抗体复合物、参照物标记复合物，这些标记复合物与待测物样本反应后，再与固相上的检测线和质控线分别反应，形成相应的免疫复合物，使用红外荧光检测仪扫描检测卡视窗，以参照物的荧光强度作为参照，代入标准曲线计算待测物的浓度。
本发明所采用的方法是双抗体夹心法检测抗原。当使用双抗夹心法检测待测物时，在免疫层析试纸上将特定的抗体固定于检测线，将能与参照物形成特异性结合的蛋白质固定于质控线，此质控体系与检测体系不发生交叉反应，无干扰性，质控线通常包被的是兔IgG。近红外荧光染料标记链霉亲和素与生物素偶联抗体先发生生物反应，形成特异识别待测抗原的检测抗体标记复合物与参照物标记复合物。将检测样本加至标记复合物中，待测物与检测抗体发生特异性反应形成检测抗体标记免疫复合物，此时存在着检测抗体标记免疫复合物和参照标记复合物，再加样至样品垫上，检测抗体标记免疫复合物与检测线上的捕获抗体反应，即形成近红外荧光染料偶联链霉亲和素生物素标记的检测抗体-待测抗原-捕获抗体形式的双抗体夹心复合物，参照标记复合物即羊抗兔IgG复合物与质控线上蛋白兔IgG发生特异性抗原抗体反应。反应结束后，用红外荧光扫描仪读取检测卡视窗的荧光强度，取检测线与质控线的荧光强度的比值，代入标准曲线进行计算。参照标记复合物与质控线上的固定蛋白均不与检测体系发生反应，因此质控线是作为内控标准，也可作为实验有效性的判断依据。
本发明中使用的荧光扫描仪为常用的实验扫描仪器，例如美国LI-COR公司的Odyssey近红外成像系统。
本发明与其他侧向层析检测方法比较，具有以下的优点：
材料背景信号和生物背景信号低，信噪比高，检测灵敏度高。目前的侧向层析检测法很多是用一般的荧光染料进行标记。但是，在一般的荧光染料的波长范围内，生物物质会产生干扰背景荧光，同时硝酸纤维素膜也会产生很强的干扰背景荧光，因此，使用基于硝酸纤维素为固相和一般荧光染料标记的蛋白芯片检测灵敏度低，检测结果不够稳定。而用近红外标记，则具有低背景的优势，而且具有很高的信噪比，从而获得很高的检测灵敏度；同时引入生物素链霉亲和素系统，每个链霉亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子，这种结合具有极高的亲和力，亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，其反应呈高度专一性，不可逆反应性，产物的稳定性高，此系统的上述优点可极大地提高检测方法的灵敏度和准确性，而且实验成本低。
附图说明
图1为本发明测试条的结构示意图。
图2为近红外荧光检测仪扫描测试条的视窗图。
图3为CRP标准曲线示意图。
具体实施方式
本发明的免疫侧向层析定量检测试剂，包括图1所示的测试条，该测试条包括采用PVC材料制成的底板100和按样品流动方向依次设置在底板100上的样品垫200、硝酸纤维素膜300、吸水垫400，在硝酸纤维素膜300上设置有检测线T和质控线C，按样品流动方向检测线T在前，质控线C在后，检测线T上包被有检测线蛋白，质控线C上包被有质控线蛋白。
下面以双抗体夹心法检测C反应蛋白(CRP)为例来详细说明本发明。
1.生物素标记CRP单克隆抗体和羊抗兔IgG多克隆抗体
CRP单克隆抗体(深圳菲鹏)和羊抗兔IgG多克隆抗体(杭州隆基公司)分别用PBS透析，按照每1ml 2mg/ml抗体，加入约27ul 10m生物素酰化物(美国Thermo FisherScientifc公司)的比例混合，室温反应1小时。反应结束后，将标记物置入生物素标记试剂盒提供的脱盐柱纯化，以去除多余的生物素。收集蛋白样品，加入0.005％ProClin300防腐，2-8℃保存。
2.制备冻干品
取出近红外荧光链霉亲和素偶联物1mg/ml，用稀释液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀释至0.8ug/ml；将生物素标记CRP抗体用稀释液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀释至2.5ug/ml，再在其中加入生物素标记羊抗兔IgG多克隆抗体使其浓度为0.2ug/ml；将近红外荧光链霉亲和素和生物素标记物等体积混匀，将液体加至棕色冻干玻璃瓶中，冻干后取出。
3.测试条制作
1)配制划膜稀释液：Na2HPO4 0.142％，KH2PO4 0.027％，蔗糖2％，ProClin3000.02％，调节PH至7.4；
2)将CRP包被抗体(深圳菲鹏公司)用划膜稀释液配制至0.8mg/ml，兔IgG配制至0.5mg/ml；
3)将硝酸纤维素膜300粘贴到底板100上，用划膜仪将配制的CRP包被抗体和兔IgG包被至硝酸纤维素膜上形成检测线T和质控线C，37℃干燥24h；
4)将样品垫200和吸水垫400分别粘贴在底板100上并位于硝酸纤维素膜的两侧，配示意图如图1；
5)切割后形成测试条，将测试条与步骤2)的冻干品一起放入包装袋内装配成免疫侧向层析定量检测试剂，包装封口备用。
4.制作标准曲线
1)试验前准备：标准品、封口的检测卡、冻干品恢复至室温；
2)配制加样液：将CRP标准品(罗氏生物公司)37.1ug/ml取3ul用稀释液(1％BSA，PBS)稀释至0.5565ug/ml，再对半稀释，各浓度为0.27825ug/ml、0.139125ug/ml、0.0695625ug/ml、0.03478125ug/ml、0.01739062ug/ml、8.69531ng/ml、4.347655ng/ml、2.173828ng/ml；取冻干复溶剂，每瓶加200ul；取各标准品50ul加到100ul冻干复溶液中，混匀，此时各标准品浓度为0.1855ug/ml、0.092ug/ml、0.046ug/ml、0.023ug/ml、0.0115ug/ml、5.75ng/ml、2.875ng/ml、1.4375ng/ml、0.71875ng/ml；
3)加样：吸取加样液100ul加至检测卡的加样孔，计时15min；
4)阅读，分析：将检测卡放入红外扫描仪用荧光强度I＝L0.5扫描检测卡视窗，附图2所示扫描图。每个浓度做两次重复性实验，取检测线与质控线信号比值(T/C)的均值与浓度制作标准曲线，具体数据如下表1所示，附标准曲线示意图如图3。
表1
5.检测临床样本
1)试验前准备：临床样本、封口的检测卡、冻干品恢复至室温；
2)制备加样液：样本用稀释液300倍稀释；冻干品加复溶剂200ul复溶；取出样本50ul加到100ul冻干液中，混匀；
3)加样：计时吸取加样液100ul加至检测卡的加样孔，计时15min；
4)阅读，分析：将检测卡放入红外扫描仪用荧光强度I＝L0.5读取实验结果。代入上述标准曲线计算浓度值。具体数据如下表2所示
表2
Claims (9)
1.免疫侧向层析定量检测试剂，包括测试条，所述测试条包括底板和按样品流动方向依次设置在所述底板上的样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，按样品流动方向所述检测线在前，质控线在后，所述检测线上包被有检测线蛋白，所述质控线上包被有质控线蛋白，其特征在于，
所述检测线蛋白为能与抗体免疫标记复合物结合，形成免疫复合物；所述质控线蛋白能与参照标记复合物特异性结合；
还包括抗体免疫标记复合物冻干品和参照标记复合物两者混合物的冻干品；
所述抗体免疫标记复合物是以近红外荧光分子染料标记链霉亲和素与活化的生物素偶联能与体内的疾病标志物特异性结合的生物素标记特异性抗体结合而形成的抗体免疫标记复合物；
所述参照标记复合物是以近红外荧光分子染料标记链霉亲和素与活化的生物素标记参照物结合而形成。
2.如权利要求1所述的免疫侧向层析定量检测试剂，其特征在于，所述近红外荧光分子染料为发射波长为650-1000nm的近红外荧光分子染料。
3.如权利要求1所述的免疫侧向层析定量检测试剂，其特征在于，所述近红外荧光分子染料为琥珀酰亚胺酯IRDye800。
4.如权利要求1所述的免疫侧向层析定量检测试剂，其特征在于，所述参照物为抗兔IgG抗体。
5.权利要求1所述的免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，具有如下步骤：
1)制备近红外荧光分子染料标记链霉亲和素；
2)活化的生物素偶联能与体内的疾病标志物特异性结合得到生物素标记特异性抗体，活化的生物素标记参照物得到活化的生物素标记参照物；
3)将步骤1)制备的近红外荧光标记的链霉亲和素分别与步骤2)制备的生物素标记特异性抗体、活化的生物素标记参照物混合，发生链霉亲和素生物素放大反应，形成抗体免疫标记复合物和参照标记复合物，将所述抗体免疫标记复合物和参照标记复合物混合后冻干形成两者混合物的冻干品；
4)将检测线蛋白和质控线蛋白分别包被到所述硝酸纤维素膜上的检测线位置和质控线位置，在所述硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；
5)将样品垫和吸水垫分别粘贴到硝酸纤维素膜的两端，切割成测试条并装入塑料卡槽组装成试剂卡；
6)将步骤3)的抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者混合物的冻干品与步骤5)的试剂卡装入包装袋内组装成免疫侧向层析定量检测试剂盒，免疫侧向层析定量检测试剂处于干燥低温保存状态。
6.如权利要求5所述的免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光分子染料为发射波长为650-1000nm的近红外荧光分子染料。
7.如权利要求6所述的免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述近红外荧光分子染料为琥珀酰亚胺酯IRDye800。
8.如权利要求5所述的免疫侧向层析定量检测试剂的制备方法，其特征在于，所述参照物为抗兔IgG抗体。
9.权利要求1所述的免疫侧向层析定量检测试剂的检测方法，其特征在于，具有如下步骤：
1)将抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者混合物的冻干品复溶恢复至使用状态得到抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者的混合复溶液；
2)将待测抗原分别与抗体免疫标记复合物和参照标记复合物两者的混合复溶液以1:2比例混匀，取100ul加到测试条样品垫上；
3)将试剂卡用近红外荧光检测仪读取检测线和质控线，以储存的标准曲线计算待测物浓度。
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