CN104698181A - 近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法和应用。本发明采用近红外荧光分子作为标记，采用免疫层析技术，制备近红外荧光免疫层析试纸，再制得包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸的检测卡，其中硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线。在检测过程中，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，激发荧光分子发光，发射出的荧光在荧光定量光谱仪中被检测到，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物浓度。本发明的试纸可以在生物标志物检测、微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用，具有灵敏度高、检测速度快、操作方便的特点。

Description

近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物检测技术领域，具体的是指一种近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
免疫层析法在疾病快速诊断、小分子检测等领域得到了广泛的应用。其原理是将特异的抗原或抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，并使得事先结合的标记物被检测到，从而实现特异性的免疫诊断。常用的标记物为胶体金颗粒、酶以及着色微球。胶体金颗粒和着色微球是通过静电吸附将抗原或抗体标记在颗粒表面，通过观察胶体金颗粒或微球在检测线上的聚集显色判断检测结果。酶标记通过催化底物显色，显示检测结果。以上标记技术存在灵敏度低，不能精确定量的缺点，限制了免疫层析应用范围。
荧光标记技术具有灵敏度高，操作简单等特点，被广泛用于生物检测领域。常用的荧光标记物光谱范围大多在可见光区(400～750nm)。由于生物体的蛋白、核酸等在紫外光的激发下会产生荧光，因此，使用可见光区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低了检测的灵敏度。而近红外荧光材料的发射波长范围在650～1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此，使用近红外荧光材料作为检测荧光标记物，具有低背景荧光、检测信噪比高，检测灵敏度高的特点。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种特异性好、灵敏度高的近红外荧光分子免疫层析试纸及其制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：包括带有粘合剂的底板，样品垫、结合垫、承载膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、承载膜和吸水纸依次与底板连接，样品垫与吸水纸分别位于底板的两端，结合垫和承载膜位于底板的中间；所述承载膜的两端分别与吸水纸的一端和结合垫的一端搭接，所述结合垫的另一端与样品垫的一端搭接；
所述结合垫为玻璃纤维，结合垫上喷涂了近红外荧光标记的可与目标检测物特异性结合的检测抗体；
所述承载膜为硝酸纤维素膜，承载膜上设有检测线和质控线；所述检测线上设有与目标检测物可以特异性结合的抗体，质控线上设有二抗。
作为一种优选方案，所述近红外荧光标记材料为发射波长为650～1000nm的染料。
进一步地，所述近红外荧光标记材料为近红外荧光染料CFTM770。
更进一步地，所述结合垫上的检测抗体为单克隆抗体；所述质控线上的固定有针对结合垫上的单克隆抗体的抗体，即二抗。
更进一步地，所述单克隆抗体被近红外荧光分子标记。
本发明还提供了一种上述近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：它包含如下步骤:
1)以含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的稀释缓冲液将所述检测抗体稀释到10-5～10mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应0.5～3h；随后在40kDa旋转脱盐柱中纯化近红外荧光染料标记的抗体；
2)将步骤1)中纯化后的检测抗体喷涂到结合垫上，喷涂完成后冻干，置于4℃避光密封保存。将捕获抗体和质控二抗以1～1.5μL/cm喷涂到承载膜上，喷涂完成后在37℃晾干，分别得到带有检测线的捕获抗体条带和质控线；质控线与捕获条带间隔为15～20mm；
3)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装到底板上，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接且彼此保持1～2.5mm重叠；最后，将装配好的底板剪裁为成品试纸条并放置免疫层析检测卡盒中。
进一步地，所述步骤1)中使用的稀释缓冲液含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；将所述检测抗体稀释到10-5～10mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应，反应时间为0.5～3h。
进一步地，所述步骤2)中将检测抗体喷涂到结合垫上，喷涂完成后冻干；将捕获抗体和质控二抗以1～1.5μL/cm喷涂到承载膜上，喷涂完成后在37℃晾干。
进一步地，所述步骤3)中所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次搭接且彼此保持1～2.5mm重叠重叠；最后，将装配好的底板剪裁成3～6mm宽的成品试纸条并放置免疫层析检测卡盒中。
本发明还提供一种上述近红外荧光分子免疫层析试纸在生物标志物检测、微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中的应用。
在免疫层析试纸条的样品垫上固定有近红外荧光标记与目标分子特异性结合的抗体，当检测标本滴加到样品垫上，近红外荧光标记的抗体与被检测物形成复合物，在毛细作用下向上涌动，在经过检测线和质控线时分别被固定在两条线上的分子所捕获。用荧光扫描仪分别读取质控线线和检测线的荧光强度，将两者的荧光强度代入公式，即可得到样品中待检测物的浓度。在检测中，控制所述检测线和质控线区域的荧光强度分别与标准抗原浓度的标准曲线相对应，完成定量检测，即可得到样品中待检测物的浓度。
本发明的优点在于：本发明的检测方法为早期诊断提供一种无创伤的，准确方便的临床检测手段。本发明克服了以胶体金颗粒或者可见光区荧光物质作为标记物免疫层析试剂灵敏度低、定量不准确的问题，建立了一种基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂，以及新的检测方法，所述定量检测试剂包检测试纸条及试纸条的制备方法，该检测方法与其他检测方法相比，具体优点如下:
(1)生物背景信号低，检测灵敏度高：由于生物体的蛋白、核酸等在紫外光的激发下会产生荧光，因此，使用可见光区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低了检测的灵敏度。近红外荧光材料的发射波长范围在650～1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此，使用近红外荧光材料作为检测荧光标记物，具有低背景荧光、检测信噪比高，检测灵敏度高的特点。
(2)操作简单：本方法操作程序与传统免疫层析方法相类似，从加样到读取报告操作步骤少，操作人员很容易掌握。
(3)可以定量检测：传统的胶体金免疫层析方法是靠金颗粒的聚集效应判读结果。金颗粒的聚集与样品中的浓度存在一定的数量关系，但是只能通过观测金颗粒着色深浅进行半定量。本发明将荧光分子标记在生物大分子上，检测线上的荧光强度反应了与捕获分子相结合的标本的量。通过扫描仪对检测线和控制线荧光值的检测，可以通过计算二者荧光强度比并与标准曲线比对得出被检测物的浓度。
【附图说明】
图1是本发明检测试纸的侧面结构示意图。
图2是本发明免疫层析检测卡的结构示意图。
图3是本发明肝纤四项免疫层析四合一检测卡的结构示意图。
图4是本发明Ⅲ型前胶原(PCⅢ)近红外荧光检测图。
图5是本发明Ⅳ型胶原(Ⅳ～C)近红外荧光检测图。
图6是本发明层粘连蛋白(LN)近红外荧光检测图。
图7是本发明透明质酸酶(HA)近红外荧光检测图。
图8是本发明人心肌肌钙蛋白I(cTnI)近红外荧光检测图。
图中：1、样品垫，2、底板，3、结合垫(含有近红外荧光标记物的玻璃纤维)，4、检测线，5、质控线，6、承载膜(硝酸纤维素膜)，7、吸水纸，8、免疫层析检测卡盒，9、加样孔，10、观察窗。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。
如图所示的近红外荧光分子免疫层析试纸，包括带有粘合剂的底板2，样品垫1、结合垫3、承载膜6和吸水纸7，样品垫1、结合垫3、承载膜6和吸水纸7依次与底板连接，样品垫1与吸水纸7分别位于底板2的两端，结合垫3和承载膜6位于底板2的中间；承载膜6的两端分别与吸水纸7的一端和结合垫3的一端搭接，结合垫3的另一端与样品垫1的一端搭接；
结合垫3为玻璃纤维，结合垫3上喷涂了近红外荧光标记的可与目标检测物特异性结合的检测抗体；承载膜6为硝酸纤维素膜，承载膜6上设有检测线4和质控线5；检测线4上设有与目标检测物可以特异性结合的抗体，质控线5上设有抗检测抗体—抗体。
近红外荧光标记材料为发射波长为650～1000nm的染料，近红外荧光标记材料为近红外荧光染料CFTM770。结合垫3上的检测抗体为单克隆抗体；质控线5上的抗检测抗体为针对检测抗体的二抗。本发明近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，具体步骤如下:
1)以含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的稀释缓冲液将所述检测抗体稀释到10-5～10mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应0.5～3h；随后在40kDa旋转脱盐柱中纯化近红外荧光染料标记的抗体；
2)将步骤1)中纯化后的检测抗体喷涂到结合垫3上，喷涂完成后冻干，置于4℃避光密封保存。将捕获抗体和质控二抗以1～1.5μL/cm喷涂到承载膜6上，喷涂完成后在37℃晾干，分别得到带有检测线4的捕获抗体条带和质控线5；质控线5与捕获条带间隔为15～20mm；
3)将样品垫1、结合垫3、硝酸纤维素膜、吸水纸7组装到底板2上，所述样品垫1、结合垫3、硝酸纤维素膜、吸水纸7依次搭接且彼此保持1～2.5mm重叠；最后，将装配好的底板2剪裁为成品试纸条并放置免疫层析检测卡盒8中。
本发明的工作原理如下：使用双抗体夹心法检测目标分子，在免疫层析试纸的检测线上分别固定与目标分子可以特异性结合的捕获抗体，在质控线上作为参照物的是前述捕获抗体的抗体。结合垫上固定了近红外荧光标记的与检测目标特异性结合的检测抗体，当含有目标分子的样品滴加到样品垫上时，溶液将结合垫上的近红外荧光标记的检测抗体解离，目标分子与解离出来的检测抗体形成抗原抗体复合物。抗原抗体复合物随溶液向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，与固定在检测线上的捕获抗体特异性结合。未被捕获抗体结合所捕获的抗原抗体复合物以及未形成抗原抗体复合物的目标分子和检测抗体随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的抗体所捕获。反应结束后，用荧光定量光谱仪测定检测线和质控线的荧光强度。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与事先准备好的标准工作曲线进行比对，就能够得出样品中目标分子的浓度。
实施例一：近红外荧光分子免疫层析同步检测肝纤维化四项标志物
本实施例中的近红外荧光分子免疫层析试纸同步检测肝纤维化四项标志物的方法，步骤如下：
(1)近红外荧光标记肝纤维化四项标志物单克隆抗体
将检测抗体鼠抗人PCⅢ，鼠抗人ⅣC，鼠抗人HA，鼠抗人LN(芬兰Hytest公司)分别与CFTM770近红外荧光染料结合。以含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的稀释缓冲液将所述检测抗体稀释到0.2mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应2h；随后在40kDa旋转脱盐柱中纯化近红外荧光染料标记的抗体；
(2)制作层析试纸条
将步骤1)中纯化后的检测抗体喷涂到结合垫3上，喷涂完成后冻干，置于4℃避光密封保存。将捕获抗体和羊抗鼠IgG以1μL/cm喷涂到承载膜6上，喷涂完成后在37℃晾干，分别得到带有检测线4的捕获抗体条带和质控线5；质控线5与捕获条带间隔为20mm。将NC膜条、结合垫、吸水纸、样品垫按图1所示组装到底板上，彼此之间保留2.5mm重叠。将装配好的卡片剪裁成4mm宽。将前述组装好的卡条放入免疫层析检测卡盒中，制成检测卡，如图2所示。将检测肝纤四项的4张免疫层析试纸卡条放置在一个免疫层析检测卡盒中，可以制成如图3所示肝纤四项同步检测卡盒，对肝纤四项的检测更方便。
(3)层析实验：
制备肝纤维化四项血清标志物样品，将每项样品梯度稀释，按比例加入至健康人血清中，并将稀释后的血清100μL滴加到加样孔上，5min后将样品卡放到近红外荧光扫描仪读数。
(4)分析实验结果。实验结果如下(请参见图4～图7)：
实验结果显示，PCⅢ、ⅣC、HA、LN各指标标准曲线的线性在检测的浓度范围内R2≧0.99，实测浓度与预期浓度的相对误差不超过5％。通过四项指标的联合检测，预计可使肝纤维化诊断的灵敏度达到85％以上，特异性达到92％以上，准确率达到90，阳性检出率达92％。
实施例二：近红外荧光分子免疫层析检测人心肌肌钙蛋白I
本实施例中的近红外荧光分子免疫层析试纸同步检测人心肌肌钙蛋白I的方法，步骤如下：
(1)近红外荧光标记人心肌肌钙蛋白I
将检测抗体鼠抗人cTnI(芬兰Hytest公司)与CFTM770近红外荧光染料结合。以含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的稀释缓冲液将所述检测抗体稀释到5×10-4mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应3h；随后在40kDa旋转脱盐柱中纯化近红外荧光染料标记的抗体；
(2)制作层析试纸条
将步骤1)中纯化后的检测抗体喷涂到结合垫3上，喷涂完成后冻干，置于4℃避光密封保存。将捕获抗体和质控二抗以1.5μL/cm喷涂到承载膜6上，喷涂完成后在37℃晾干，分别得到带有检测线4的捕获抗体条带和质控线5；质控线5与捕获条带间隔为20mm。将NC膜条、结合垫、吸水纸、样品垫按图1所示组装到底板上，彼此之间保留1mm重叠。将装配好的卡片剪裁成4mm宽。将前述组装好的卡条放入免疫层析检测卡盒中，制成检测卡。
(3)层析实验：
制备肝纤维化四项血清标志物样品，将样品梯度稀释，按比例加入至健康人血清中，并将稀释后的血清100μL滴加到加样孔上，5min后将样品卡放到近红外荧光扫描仪读数。
(4)分析实验结果。实验结果如下(请参见图8)：
实验结果显示，cTnI标准曲线的线性在检测的浓度范围内R2≧0.9，实测浓度与预期浓度的相对误差不超过5％。预计可使心肌细胞受损诊断的灵敏度达到90％以上，特异性达到95％以上，准确率达到90，阳性检出率达95％。

Claims (10)

1.一种近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：包括带有粘合剂的底板(2)，样品垫(1)、结合垫(3)、承载膜(6)和吸水纸(7)，所述样品垫(1)、结合垫(3)、承载膜(6)和吸水纸(7)依次与底板连接，样品垫(1)与吸水纸(7)分别位于底板(2)的两端，结合垫(3)和承载膜(6)位于底板(2)的中间；所述承载膜(6)的两端分别与吸水纸(7)的一端和结合垫(3)的一端搭接，所述结合垫(3)的另一端与样品垫(1)的一端搭接；
所述结合垫(3)为玻璃纤维，结合垫(3)上喷涂了近红外荧光标记的可与目标检测物特异性结合的检测抗体；
所述承载膜(6)为硝酸纤维素膜，承载膜(6)上设有检测线(4)和质控线(5)；所述检测线(4)上设有与目标检测物可以特异性结合的抗体，质控线(5)上设有二抗。
2.根据权利要求1所述的近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：所述近红外荧光标记材料为发射波长为650～1000nm的染料。
3.根据权利要求2所述的近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：所述近红外荧光标记材料为近红外荧光染料CFTM770。
4.根据权利要求1至3中任一所述的近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：所述结合垫(3)上的检测抗体为单克隆抗体；所述质控线(5)上的固定有针对结合垫(3)上的单克隆抗体的抗体，即二抗。
5.根据权利要求4所述的近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：所述单克隆抗体被近红外荧光分子标记。
6.一种如权利要求1～3所述的近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：它包含如下步骤:
1)以含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的稀释缓冲液将所述检测抗体稀释到10-5～10mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应0.5～3h；随后在40kDa旋转脱盐柱中纯化近红外荧光染料标记的抗体；
2)将步骤1)中纯化后的检测抗体喷涂到结合垫(3)上，喷涂完成后冻干，置于4℃避光密封保存。将捕获抗体和质控二抗以1～1.5μL/cm喷涂到承载膜(6)上，喷涂完成后在37℃晾干，分别得到带有检测线(4)的捕获抗体条带和质控线(5)；质控线(5)与捕获条带间隔为15～20mm；
3)将样品垫(1)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜、吸水纸(7)组装到底板(2)上，所述样品垫(1)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜、吸水纸(7)依次搭接且彼此保持1～2.5mm重叠；最后，将装配好的底板(2)剪裁为成品试纸条并放置免疫层析检测卡盒(8)中。
7.根据权利要求6所述的近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中使用的稀释缓冲液含有10mmol/L乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、5％牛血清白蛋白(BSA)、5％海藻糖、1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；将所述检测抗体稀释到10-5～10mg/mL；以染料分子：抗体分子摩尔比例为3:1加入近红外荧光染料，置于室温反应，反应时间为0.5～3h。
8.根据权利要求6所述的近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中将检测抗体喷涂到结合垫(3)上，喷涂完成后冻干；将捕获抗体和质控二抗以1～1.5μL/cm喷涂到承载膜(6)上，喷涂完成后在37℃晾干。
9.根据权利要求6所述的近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中所述样品垫(1)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜、吸水纸(7)依次搭接且彼此保持1～2.5mm重叠重叠；最后，将装配好的底板(2)剪裁成3～6mm宽的成品试纸条并放置免疫层析检测卡盒(8)中。
10.一种如权利要求1所述的近红外荧光分子免疫层析试纸在生物标志物检测、微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中的应用。
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