CN106353503A - 一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法，属于生物检测试剂领域。该试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及背衬。本发明提供的质控方法是采用两种不同波长的荧光物质分别标记待测分析物对应的检测分子和质控分子I，再将两种荧光物质标记物按一定比例混合后包被在结合垫上，分析膜捕获线上包被待测分析物捕获分子和质控分子II的混合物。在免疫反应过程中，待测分析物与对应的检测分子、捕获分子形成夹心复合物，质控分子I与质控分子II特异性结合。计算待测分析复合物/质控分子复合物的比值。该方法可排除层析过程中环境等因素(温度、湿度等)的干扰，提高测量的精密度和准确性。

Description

一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法

技术领域

本发明涉及免疫层析检测技术，特别涉及一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法，属于生物检测试剂领域。

背景技术

免疫层析技术是利用微孔滤膜为固相载体，以待测液位流动相，将免疫标记技术(如：亲和技术，蛋白偶联技术等)标记的示踪标志物随微孔滤膜的虹吸或毛细作用进行侧向层析。待测物通过层析在检测线处发生特异性的免疫反应，通过肉眼或者相应仪器检测，获得判断结果。近年来，随着基层医疗，家用诊断和床边检测需求的不断提升，免疫层析试纸条的设备简单，检测快速，操作简单便利等优点逐渐显现。免疫层析试纸条主要包含五个部分：加样区(样品垫)，标记区(结合垫)，检测区(硝酸纤维素膜)、吸水区(吸水纸)以及背衬结构。

目前免疫层析试纸条检测方法可分为胶体金免疫层析法和荧光免疫层析法，荧光免疫层析法逐渐在免疫层析中占主导地位。荧光免疫层析检测系统包括免疫反应系统(抗原、抗体作用等)和信号检测放大系统两部分。荧光免疫层析其具有灵敏度高，特异性强，另外多色荧光技术特别是单光源多激发的免疫层析技术实现多指标的联合检测，其分析方法逐渐与生化、发光等指标进行系列检测分析拉近距离。伴随着信息化程度的发展，它已经成为高度细化检测诊断平台的有力竞争者，特别是家庭和小型门诊使用等方面开拓了广大的市场。

然而，免疫层析试纸条的固相载体表面显色与免疫均相反应(生化、化学发光等)相比劣势显著。免疫层析试纸条的测试结果受多方面因素的影响：一、微孔滤膜的孔径大小差异导致待测液体的显色强度有较大的差异。二、结合垫的示踪标志物层析速度与微孔滤膜的干燥程度，外界环境的温湿度有显著影响。三、试纸条的加工过程中的结合垫处理、检测线的包被存在一定的差异等。现有设立控制线的方法只能判断试纸是否失效。其原理是在检测区包被能与标记物相偶联的抗原或抗体发生识别并结合的质控线，当控制线无反应时则认为试纸失效。因此，质控线的测试结果并不能排除上述层析速度等带来对测试准确度的影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明公开了一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法。其包括底板、样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的分析膜及吸水垫，还包括不同荧光波长标记的检测分子和质控分子，提高测量的准确性和精密度。

本发明还公开了一种新型免疫层析试纸条的制作和测定方法，该试纸条的操作方法简单、快速，并且能准确反应出试纸条的层析膜孔径、包被均一性、层析速度等差异。

本发明的免疫层析试纸条，其新质控方法包括结合垫上包被具有不同波长的荧光物质标记的待测分析物的检测分子和质控分子I的混合物，分析膜捕获线上包被待测分析物捕获分子和质控分子II的混合物。在免疫反应过程中，待测分析物与对应的检测分子、捕获分子形成夹心复合物，质控分子I与质控分子II特异性结合，计算待测分析复合物/质控分子复合物的比值。

进一步新型质控方法，其特征在于质控分子可以为抗原、抗体、半抗原、半抗体等物质。

进一步新型质控方法，其特征在于待测分子捕获线和质控线为同一条线。能同时形成捕获分子-待测分子-检测分子-荧光物质I复合物和质控分子I-质控分子II-荧光物质II复合物。

进一步新型质控方法，其特征在于纳米微球为空白微球，羧基微球或荧光微球，大小为20～500nm。

进一步新型质控方法，其特征在于所述的荧光物质选自异硫氰酸荧光素,3H～吲哚菁类染料、荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2～甲氧基荧光增强素、罗丹明、量子点、EGFP绿色荧光增强蛋白、藻红蛋白、稀土铕、上转发光物质等物质中的两种波长不同的荧光物质。

进一步的新型质控方法，其特征在于所述的测量方法为Getein1100多色荧光免疫定量分析仪(基蛋生物科技股份有限公司)测定其荧光值，然后利用待测分析复合物/质控分子复合物的比值在检测标准曲线下准确计算待测物浓度。

与现有技术相比,本发明的新型质控方法具有以下有益效果：

1、本发明的新型质控方法是将待测分析物捕获分子和质控分子II混合包被在同一条线上，通过质控线测定结果试纸条的层析膜孔径、包被均一性、层析速度等差异，提高测量的准确度和精密度。

2、本发明的新型质控方法对应的层析试纸条制作方法，包被一条混合捕获线，简化了生产加工步骤，同时可缩短分析膜的长度，极大的降低生产成本。

附图说明

图1为本发明新型质控层析试纸条结构示意图。

图中标号：1为样品垫，2为结合垫，3为质控分子和检测分子复合捕获线，4为硝酸纤维素膜，5为吸水纸。

图2为新质控试纸条的抗干扰性评估图。

图3为新质控试纸条不同层析膜相关性实验评估图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步对本发明予以说明，但并不以此为限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡事未脱离本发明技术方案内容，根据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

实施例一：不同波长检测分子和质控分子复合物的制备

1.1波长I探测分子复合物的制备：取5mg羧基纳米荧光微球I(粒径大小为20nm～500nm)根据固含量5mg/ml换算，加入EDC，其摩尔含量为羧基摩尔含量的1～10倍，混合均匀后震荡反应30分钟，活化结束后离心使用500μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗微球。将链霉亲和素用100mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到1mg/mL后，加入到微球溶液中，置于220rpm 37℃摇床上反应3h。反应结束后使用400μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗悬浮微球，清洗三次，最后加入生物素化抗体用量为50～500ug/100ul纳米粒子溶液。反应30～60min，后用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗微球三次，后用微球恢复溶液恢复即可得波长I探测分子复合物。

1.2波长II质控分子复合物的制备：取20μL质控分子用10％NaHCO3调节pH至8～9，加入区别于荧光微球I荧光光谱性质相同的小分子荧光染料，搅拌室温反应1～2小时，反应结束后，用纯化树脂出去未反应的荧光染料，再以1：1摩尔比加入羧基微球，EDC活化后室温搅拌反应30～60min，1100g离心3～5分钟，后用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗微球三次，后用微球恢复溶液恢复即可得波长I探测分子复合物。

实施例二：新型免疫层析试纸条的制备

如图2所示，一种新型免疫层析试纸条，包括底板1，在底板上顺次贴上样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5；其中样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5各部件连接处重叠1～2mm，保证检测样本顺利从样本区通过结合垫到达检测区，各部件的制备方法如下所述：

2.1样品垫2的制备：用10mM，pH7.2～7.4的PBS缓冲液100mL溶解0.5g的BSA蛋白，然后加入0.01～0.05g的表面活性剂Tween20，调节pH至6～8；样品垫可选用玻璃纤维或聚酯材料，30cm长样品垫置于上述缓冲液、表面活性剂和蛋白的混合溶液2～5ml中浸泡2～4小时，取出后20～25℃干燥8～12小时可得，其中，PBS缓冲液也可用Tris或甘氨酸缓冲液代替，BSA蛋白也可用酪蛋白代替，表面活性剂Tween20也可用Triton X100代替；

2.2结合垫3的制备：先利用上述样品垫同样的方法处理结合垫，再将实施例一制备的不同波长检测分子和质控分子复合物用PBS缓冲液(10mM，pH7.4，含2％BSA和2％蔗糖)稀释3000倍，均匀的涂布在结合垫，置于20～25℃干燥4～8小时；

2.3硝酸纤维素膜4的处理：

捕获线的制备：将PCT对应的捕获分子与质控分子II按1:1浓度用20mmol/L，pH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/mL的浓度，0.8μL/cm在硝酸纤维素膜上划线涂布得捕获线，干燥箱内20～25℃鼓风干燥8～12h；

2.4吸水垫5的制备：吸水纸裁剪成30*2.7cm每条；

2.5组装：塑料底板1，样品垫2和吸水垫5为本领域通用的部件，将上述硝酸纤维素膜4、吸水垫5、样品垫3粘贴在塑料底板1上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试剂条，20～25℃鼓风干燥8～12h即得所述的新型免疫层析试剂条。

实施例三：荧光免疫层析诊断试剂性能评估

3.1不同体检样本的质控分子的抗干扰实验

随机挑选80例阴性血清和20例阳性血清样本，用同一样本以100ul/根滴加到试纸条上。10min用Getein1100多色荧光免疫定量分析仪(南京基蛋生物科技有限公司)测定质控分子复合物的荧光值。分别以100例样本的测量数值，样本荧光值平均值，平均值+SD和平均值-SD作图，结果见图3：

如图3所示，与传统的羊二抗、兔二抗受不同样本干扰很大不同，新型质控分子在不同血清的质控线荧光值均在一倍的标准差以内，完全符合体外诊断试剂关于质控的标准。证实了新型质控分子得不同血清的抗干扰性强。

3.2质控分子和检测分子的质控相关性

分别取Merck Millipore的75膜、90膜、95膜和135膜各四卷。用同一样本以100ul/根滴加到试纸条上，10min用Getein1100多色荧光免疫定量分析仪(基蛋生物科技股份有限公司)分别测定质控分子复合物和检测分子复合物的荧光值，后以质控分子作X轴，检测分子作Y轴作图比较相关性由图3可见。体系表现出良好地相关性，证实了本发明质控系方法以及依据该体系的试剂盒可消除不同卷膜及不同型号膜的差异性。

3.3本发明试纸条精密度评估

配制2.00ng/mL和0.50ng/mL的PCT标准品溶液，采用本发明体系试剂条进行测定浓度，分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准偏差、CV值如表2-1和表2-2。

表2-1试纸条2.00ng/ml的精密度数据

序号	实验组2.00ng/mL	对照组2.00ng/mL
			1	1.95	1.786
2	1.88	2.436
			3	2.15	2.22
4	1.96	1.96
			5	1.95	1.948
6	2.04	2.04
			7	2.02	2.02
8	1.91	1.85
			9	1.92	1.81
10	2.05	2.23
			平均值	1.98	2.03
标准偏差	0.08	0.21
			CV	4.1％	10.3％

表2-2试纸条0.50ng/ml的精密度数据

序号	实验组0.50ng/mL	对照组0.50ng/mL
			1	0.49	0.49
2	0.46	0.61
			3	0.54	0.56
4	0.49	0.49
			5	0.51	0.49
6	0.51	0.51
			7	0.51	0.51
8	0.48	0.46
			9	0.48	0.45
10	0.51	0.56
			平均值	0.50	0.51
标准偏差	0.02	0.05
			CV	4.5％	9.4％

Claims (6)

1.一种应用于免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及背衬，相邻各组分依次搭接，其特征在于结合垫上包被具有不同波长的荧光物质标记的待测分析物的检测分子和质控分子I的混合物，分析膜捕获线上包被待测分析物捕获分子和质控分子II的混合物。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于质控分子可以为抗原、抗体、半抗原、半抗体等物质。

3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于待测分子捕获线和质控线为同一条线，能同时形成捕获分子-待测分子-检测分子-荧光物质I复合物和质控分子I-质控分子II-荧光物质II复合物。

4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于纳米微球为空白微球，羧基微球或荧光微球，大小为20～500nm。

5.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于所述的荧光物质选自异硫氰酸荧光素,3H～吲哚菁类染料、荧光素cy5、荧光素cy7、羧基荧光素、2～甲氧基荧光增强素、罗丹明、量子点、EGFP绿色荧光增强蛋白、藻红蛋白、稀土铕、上转发光物质等物质中的两种波长不同的荧光物质。

6.根据权利要求1和权利要求3所述的免疫层析试纸条的新型质控方法，其特征在于所述的测量方法为Getein1100多色荧光免疫定量分析仪(基蛋生物科技股份有限公司)测定其荧光值，然后利用待测分析复合物/质控分子复合物的比值在检测标准曲线下准确计算待测物浓度。