CN103197074B - 基于近红外荧光纳米微球标记物的免疫层析定量检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于近红外荧光分子与纳米微球标记的方法以及基于近红外荧光纳米微球的免疫层析定量检测试剂。本发明将近红外荧光与纳米微球连接，制备了基于近红外荧光纳米微球的免疫层析试纸条。在检测过程中，利用红外光扫描仪，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物的浓度。与近红外荧光分子直接与检测分子连接相比，近红外荧光纳米微球免疫层析显著的提高了检测灵敏度，降低了背景荧光强度。该标记方法和试剂可以在微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用。

Description

基于近红外荧光纳米微球标记物的免疫层析定量检测试剂

技术领域

本发明建立了一种基于近红外荧光纳米微球标记物的免疫层析定量检测试剂，包括近红外荧光纳米微球试纸条和相应试剂的制备方法。本发明采用近红外荧光纳米微球作为标记，采用免疫层析技术，制备近红外荧光免疫层析试纸条，然后构成包括样品垫/玻璃纤维膜/硝酸纤维素膜和吸水纸的检测卡，其中硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线。在检测过程中，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，激发荧光分子发光，发射出的荧光经滤光片，经光电倍增管转换成数字信号，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物的浓度。该系统可以在微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用。本发明具有灵敏度高、定量准确操作方便的特点。

背景技术

免疫层析法在疾病快速诊断、小分子检测等领域得到了广泛的应用。其原理是将特异的抗原或抗体（捕获分子）先固定于硝酸纤维膜的某一区带，用标记物标记的抗原或抗体（检测分子）固定在膜的另外一端。当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，当检测样品中含有目标分子时，检测分子与目标分子结合形成复合物。由于毛细管作用，复合物将沿着膜向前移动，当移动至固定有检测分子的区域时，样品中相应的目标分子与检测分子形成的复合物与捕获分子发生特异性结合。若用免疫胶体金标记检测分子，可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。常用的标记物为胶体金颗粒、酶以及着色微球。胶体金颗粒和着色微球是通过静电吸附将抗原或抗体标记在颗粒表面，通过观察胶体金颗粒或微球在检测线上的聚集显色判断检测结果。酶标记通过催化底物显色，显示检测结果。以上标记技术存在灵敏度低，不能精确定量的缺点。限制了免疫层析应用范围。

荧光标记技术具有灵敏度高，操作简单等特点，被广泛用于生物检测领域。如DNA序列测定、蛋白表达分析、临床诊断等。常用的荧光标记物光谱范围大多在可见光区（400-750nm）。由于生物体的蛋白、核酸等在紫外光的激发下会产生荧光，因此，使用可见光区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低了检测的灵敏度。

近红外荧光材料的发射波长范围在650-1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此，使用近红外荧光材料作为检测荧光标记物，具有背景荧光低、检测信噪比高，检测灵敏度高的特点。中国专利CN201210152948.X所公开的内容是将近红外荧光分子直接标记到检测分子上，可以建立基于间接法、双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法等检测方法的检测试剂。本发明与之不同在于，近红外荧光分子首先标记到纳米微球上，再与抗体或抗原（检测分子）连接；或抗体或抗原与近红外荧光分子连接后，再与纳米微球连接。由于抗体或抗原（捕获分子）、纳米微球、荧光分子形成了复合物，改善了标记物在层析卡上的层析特性，显著的提高了检测灵敏度，降低了背景噪音。

CN200910117820.8公开了一种以双结构二氧化硅复合有机染料的发光纳米粒子作为标记物的免疫层析技术。其在检测过程中，采用荧光扫描仪检测检测线和质控线的荧光强度，再将测定的检测线荧光强度乘以校正系数，把校正后的荧光强度代入预先设置在荧光分析仪中的标准曲线，即可通过荧光分析仪自动计算获得样本中待测物的浓度。其特点是将异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明等荧光分子掺入到二氧化硅形成的纳米微球中，再通过修饰微球，将抗体连接到荧光纳米微球上。该专利使用的荧光物质多为紫外激发，生物分子自发荧光较强；与之不同的是，本申请中使用的近红外荧光分子激发光和发射光均为近红外光，生物分子自发荧光较弱；该发明是在合成纳米微球的过程中掺入荧光染料。本申请是通过化学键将荧光染料连接到纳米微球上，特别是使用羟基与氨基的缩合反应形成的肽键，荧光染料与微球的比例可以进行灵活的调整。

中国专利CN03819391.4以及CN200480005319.8公开是以时间分辨荧光标记物作为检测标记物的免疫层析方法及仪器。时间分辨采用脉冲信号激发荧光物质，利用激发脉宽短，而荧光物质发光脉宽长，可以消除寿命较短的背景干扰。与时间分辨荧光免疫层析的区别在于，本发明不使用时间分辨荧光物质，也不需要采用脉冲光源，对检测仪器要求较低。中国专利CN200420049579.2、CN200520045657.6、CN200420049580.5公开的是以上转换磷光纳米材料作为标记物的免疫层析方法。与上转换磷光免疫层析不同的是，本发明采用近红外荧光分子标记无色纳米颗粒，荧光激发和发射不具有上转换的特点。与以上公开的专利最重要的区别是，本发明采用背景干扰低、信噪比更好的近红外荧光物质连接纳米微球。

发明内容

本发明建立了一种基于近红外荧光纳米微球标记物的免疫层析定量检测试剂，以及新的检测方法。所述定量检测试剂包检测试纸条及试纸条的制备方法。其工作原理为：在免疫层析试纸条的样品垫上固定有近红外荧光纳米微球标记的参照物和能与被检测物特异性结合的检测分子，当检测标本滴加到样品垫上，近红外荧光纳米微球标记的检测分子与被检测物形成复合物，与近红外荧光纳米微球标记的参照物在毛细作用下向上涌动，在经过检测线和质控线时分别被固定在两条线上的捕获分子所捕获。用荧光扫描仪分别读取参照线和检测线的荧光强度，即可以判断检测标本中是否含有被检测物；在定量检测中，将两者的荧光强度代入公式，即可得到样品中待检测物的浓度。

本发明所采用的方法是：

近红外荧光分子、纳米微球以及抗原或抗体连接。近红外荧光分子可以首先与检测分子连接，然后再与无色纳米微球连接；也可以先将近红外荧光分子标记到无色纳米微球上，再将检测分子连接到预染色的纳米微球上。

当使用夹心法检测目标分子时（可以是双抗体夹心法检测抗原，也可以是双抗原检测抗体）；在免疫层析试纸的检测线上固定的是与目标分子可以特异性结合的抗原或抗体（双抗体夹心法是抗体，双抗原夹心法是抗原），在质控线上作为参照物的是与目标分子和检测线固定的分子无关的抗体，通常是山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种或多种近红外荧光纳米微球标记的抗体或抗原，一种是与检测目标特异性结合的抗原或抗体，另外一种是可以与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体，一般是鸡IgY。当含有目标分子的样品滴加到样品垫上时，溶液将结合垫上的两种成分解离，目标分子与解离出来的特异性结合分子形成抗原抗体复合物。抗原抗体复合物以及参照物随溶液向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，被固定在检测线上的目标分子特异性结合分子所捕获。质控分子随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的参照物抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。由于结合垫上参照物的量为一个定值，同时参照物单克隆抗体不会与检测目标分子和抗体结合，因此，参照物的荧光强度可以作为检测试剂的内参。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与标准工作曲线进行计算，就能够得出样品中目标分子的浓度；

当使用间接法检测目标分子时：在免疫层析试纸的检测线上固定的是检测抗原，在质控线上固定的是参照物抗体，一般是山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光纳米微球标记的生物分子，分别是小鼠抗人抗体的第二抗体和鸡IgY。当含有目标分子的样品滴加到样品垫上后，同时滴加稀释液，溶液将结合垫上的生物大分子解离，近红外荧光标记的第二抗体与人抗体结合，形成抗体复合物，在溶液的推动下，抗体复合物和鸡IgY随溶液向试纸条上端移动。当抗体复合物移动到检测线时，抗体复合物被固定在检测线上的抗原所捕获。鸡IgY随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的山羊抗鸡IgY抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与预先设定的阈值进行比较，就可以得出样品中是否含有HIV抗体。

当使用竞争法检测小分子时：在免疫层析试纸的检测线上固定的是小分子-BSA偶联物，在质控线上固定的是作为参照的山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种红外荧光纳米微球标记的单克隆抗体，分别是抗小分子单克隆抗体和鸡IgY。检测时，首先向样品垫滴加标本，然后滴加稀释液。溶液将结合垫上的生物大分子解离，若样品存在一定浓度的小分子时，全部小鼠单克隆抗体被结合，小分子与抗体结合的复合物在溶液的推动下向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，抗小分子单克隆抗体不能被固定在检测线上的BSA-小分子复合物所捕获。鸡IgY随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的山羊抗鸡IgY抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与预先设定的阈值进行比较，就可以得出样品中是否含有待检测的小分子。

本申请中所使用的荧光扫描仪器为中国专利CN201220372662.8公开的便携式高灵敏度近红外点荧光扫描仪；

本申请中所使用的近红外荧光标记材料为发射波长在650-1000nm的染料，优选为NHS活化的近红外荧光染料Dylight800；

本申请中使用的纳米微球直径在50-300nm，可以是有机高分子聚合纳米微球，也可以是无机纳米微球；微球表面修饰的化学集团，可以是氨基、羧基等集团，优选为羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球。

该检测方法与近红外荧光分子直接标记抗原或抗体的方法相比具有如下优点：

改善了标记物、免疫复合物的层析性质，缩短了滴加标本到层析完成时间。层析时间由15-20分钟缩短为5-15分钟。

近红外荧光分子直接标记的检测分子分子量较小，在层析过程中，可以进入层析膜的孔径中，层析过程中会有一部分滞留在层析膜中，造成较高的背景噪音信号；近红外荧光分子与纳米微球结合后，除与检测线和质控线结合外，大部分纳米荧光微球通过膜表面层析到顶端吸水纸，降低了背景荧光强度，提高了信噪比。

纳米微球直径在50-300纳米，单个纳米微球上可以结合多个近红外荧光分子及抗原抗体，相当于信号放大系统，因此提高了检测灵敏度。如通过本发明建立的血红蛋白定量检测试剂血红蛋白最低检出限为500pg/ml，而基于近红外荧光分子直接标记抗体的血红蛋白检测试剂最低检出限一般为10ng/ml。

附图说明

图1为近红外荧光微球标记抗体示意图；

1：纳米微球；

2：单克隆抗体；

3：近红外荧光分子；

图2免疫层析卡示意图

4：吸水垫；

5：硝酸纤维膜；

6：含有近红外荧光标记物玻璃纤维膜；

7：反应支持物；

8：检测线；

9：质控线；

10：样品垫。

图3为血红蛋白红外荧光检测图

图4为血红蛋白标准曲线

图5为近红外荧光直接标记血红蛋白抗体检测血红蛋白标本扫描图；

1:检测2000ng/ml标准品荧光扫描图：

2：检测1000ng/ml标准品荧光扫描图：

3：检测500ng/ml标准品荧光扫描图：

4：检测:50ng/ml标准品荧光扫描图：

5：检测5ng/ml标准品荧光扫描图：

C：质控线扫描峰；

T：检测线扫描峰。

图6为近红外荧光纳米微球标记血红蛋白抗体检测500pg/ml血红蛋白标本扫描图；

图7为近红外荧光直接标记HIV-1P24单克隆抗体检测80pg/mlP24标准品扫描图；

图8为近红外荧光纳米微球标记HIV-1P24单克隆抗体检测40pg/mlP24标准品扫描图

图9为100pg/mlNT-proBNP近红外荧光纳米微球扫描图；

图10为50pg/mlNT-proBNP近红外荧光纳米微球扫描图。

具体实施方式

实施例1：近红外荧光纳米微球的制备方法

本申请中主要采用如下两种方法制备近红外荧光纳米微球：

方法1：荧光染料通过中间分子即赖氨酸（Lys）或BSA，通过氨基-羧基缩合反应连接在纳米微球上，然后再通过缩合反应将检测分子连接到纳米微球上。

按照如下步骤进行近红外荧光染料标记纳米微球及连接抗体：

吸取1ml0.01mMNaACpH5.0到玻璃试管中；

加入25μl10%羧基纳米微球（美国ACMEmicrospheres），混匀；

加入10mg碳化二亚胺（EDAC），混匀；

加入100μl100mg/mlLys（或10mg/mlBSA），混匀；

加入3.5μlDylight800近红外荧光染料（美国ThermoScientific），混匀，室温振摇1小时；

3000g离心5分钟，吸掉上清，加入1ml0.01mMNaACpH5.0重悬微球；

3000g离心5分钟，加入1ml0.01mMNaACpH5.0，重悬后，超声分散微球；

加入1mg单克隆抗体，室温振摇1小时，加入9ml重悬液（1%BSA，5%蔗糖，0.2%Tween20,0.1%叠氮化钠，25mMTris.Cl）混匀，4摄氏度保存。

方法2：近红外荧光分子与检测分子通过氨基-羧基缩合反应连接后，再通过缩合反应连接到纳米微球上。

按照如下步骤进行近红外荧光染料标记抗体及连接纳米微球：

吸取1ml0.01mMNaACpH5.0到玻璃试管中；

加入25μl羧基纳米微球（美国ACMEmicrospheres），混匀；

加入10mg碳化二亚胺（EDAC），混匀，室温1小时；

3000g离心5分钟，加入1ml0.01mMNaACpH5.0，重悬后，超声分散微球；

吸取1mg抗体，加入3.5μlDylight800近红外荧光染料（美国ThermoScientific），混匀，室温1小时；

将抗体加入到微球中，室温振摇1小时；

加入9ml重悬液（1%BSA，5%蔗糖，0.2%Tween20,0.1%叠氮化钠，25mMTris.Cl）混匀，4摄氏度保存。

实施例2:制作近红外荧光纳米微球血红蛋白抗原免疫层析检测试剂

1)标记抗体。

血红蛋白单克隆抗体（珠海博美生物技术有限公司）和鸡IgY抗体（英国Abcam公司）用PBS透析后，按照实施例1中的方法1或2标记抗体。4℃保存。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光纳米微球标记的血红蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将血红蛋白捕获单克隆抗体（珠海博美生物技术有限公司）和羊抗鸡IgY多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.4cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫如图2方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

实施例3检测血红蛋白标本

连续稀释血红蛋白抗原标准品（珠海博美生物技术有限公司），用稀释液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）将标准品进行2倍系列稀释，制成2μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml125ng/ml、62.5ng/ml、31.3/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.9ng/ml样品。用微量加样器吸取50μl以上标本滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加50μl样品稀释液。室温静置10分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数。用检测线荧光值值除以质控线荧光值为测量值。每个样品浓度进行测量两次，取平均值后，以测量值对样品浓度做图。结果如图3所示。

用检测峰荧光值除以质控峰荧光值作为检测结果。每个浓度做两次重复试验，取两次结果平均值，以平均值对样品浓度做标准工作曲线，如图4所示。

将血红蛋白标准品连续稀释为2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、50ng/ml、5ng/ml，500pg/ml，同时使用近红外荧光分子直接标记血红蛋白抗体（中国专利CN201210152948.X公开的方法）制备的血红蛋白试纸条以及本申请中制备的试剂检测以上血红蛋白标本。结果见图5及图6。

结果：用近红外荧光纳米直接标记血红蛋白抗体制备的试纸条检测，结果显示检测下限在5ng/ml（图5），而用近红外荧光纳米微球标记血红蛋白抗体后，检测下限达到500pg/ml（图6），比近红外荧光分子直接标记血红蛋白单克隆抗体灵敏度高约10倍；本申请中制备的血红蛋白检测试剂血红蛋白浓度与检测信号值从4ng/ml到2000ng/ml线性关系良好。因此，近红外荧光分子标记纳米微球应用于免疫层析可以提高检测灵敏度。

表1：不同浓度血红蛋白标准品对应检测结果。

实施例4：制作近红外荧光直接标记抗体的HIV-1p24抗原免疫层析检测试剂

1)标记抗体。

HIV-1p24单克隆抗体（北京健乃喜生物技术有限公司）和鸡IgY抗体（英国Abcam公司）用PBS透析后，分别加入7μlDylight800近红外荧光染料（美国ThermoScientific）室温反应1小时后，透析去除未标记染料。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光标记的HIV-1p24单克隆抗体和鸡IgY抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将HIV-1p24捕获单克隆抗体（北京健乃喜生物技术有限公司）和羊抗鸡IgY多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.4cm，室温风干膜条带。

5）组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫如图2方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

实施例5：制作近红外荧光纳米微球HIV-1p24抗原免疫层析检测试剂

1)标记抗体。

HIV-1p24单克隆抗体（北京健乃喜生物技术有限公司）和鸡IgY抗体（英国Abcam公司）用PBS透析后，按照实施例1中方法1或2标记抗体。4℃保存。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光纳米微球标记的HIV-1p24单克隆抗体和鸡IgY抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将HIV-1p24捕获单克隆抗体（北京健乃喜生物技术有限公司）和羊抗鸡IgY多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.4cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫如图2方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

实施例6：检测HIV-1p24标准品

用实施例4和5制备的试纸条检测HIV-1p24标本。将HIV-1P24定量试剂盒VironostikaHIV-1Antigen（Biomerieux）中P24标准品连续稀释为80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、100pg/ml。吸取40μl加入到样品垫中，再滴加40μl稀释液。同时用稀释液作为阴性对照。室温放置10分钟后，用便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数。用检测线荧光值值除以质控线荧光值为测量值。以大于2倍阴性测量值判断为阳性结果。160pg/ml标准品检测扫描结果见图7和图8。实施例5制备的试纸条检测下限为20pg/ml；实施例4制备的试纸条检测下限为80pg/ml。

实施例7：制作近红外荧光纳米微球NT-proBNP免疫层析检测试剂

1)标记抗体。

15F11单克隆抗体（芬兰Hytest公司）和鸡IgY抗体（英国Abcam公司）用PBS透析后，按照实施例1中方法1或方法2标记抗体。4℃保存。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光纳米微球标记的NT-proBNP单克隆抗体15F11和鸡IgY抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将NT-proBNP捕获单克隆抗体24E11（芬兰Hytest公司）和羊抗鸡IgY多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.4cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫如图2方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

6)检测NT-proBNP标准品

用无NT-proBNP的基质血清连续稀释NT-proBNP标准品（芬兰Hytest公司）。吸取40μl加入到样品垫中，再滴加40μl稀释液。同时用基质血清作为阴性对照。室温放置10分钟后，用便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数。用检测线荧光值值除以质控线荧光值为测量值。以大于2倍阴性测量值判断为阳性结果。标准品检测扫描结果见图9及图10。NT-proBNP试纸条检测下限为50pg/ml。

Claims (8)

1.一种近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：由依次在带有粘合剂的反应支持物上相互搭接的样品垫、结合垫、抗体承载膜、吸水垫组成，其中，

所述的结合垫上分别用喷涂法固定了两种或多种连接有近红外荧光纳米微球标记的抗体或抗原，一种是与检测目标特异性结合的抗原或抗体，即检测分子，另外一种是与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体；

所述的抗体承载膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜,抗体承载膜上分别用可以与目标分子特异性结合的抗原或抗体，即捕获分子，和作为质控的抗体划检测线以及质控线；所述的检测线和质控线区域的荧光强度的比值为检测值；通过检测不同浓度的标准品，可以建立待检样品浓度与检测值的工作曲线和方程；待检样品的检测值代入工作方程后，即可以完成待测样品的定量检测，得到样品中待检测物的浓度；

所使用的近红外荧光标记材料为NHS活化的近红外荧光染料Dylight800；所述的纳米微球为直径在50-300nm的聚苯乙烯纳米微球；所述纳米微球的制备方法是使用赖氨酸或BSA作为中间分子，通过氨基-羧基缩合反应将近红外荧光分子与纳米微球连接起来；所述近红外荧光纳米微球的制备方法主要步骤为：

1)用碳化二亚胺活化羧基修饰的聚苯乙烯纳米微球；

2)加入中间分子赖氨酸或BSA，使中间分子连接到活化的纳米微球上；

3)加入近红外荧光染料标记到中间分子上；

4)再加入捕获抗体或抗原与荧光纳米微球连接；

所述近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其主要步骤为：

1)制备近红外荧光纳米微球标记检测分子和鸡IgY；

2)制作结合垫；

3)制作样品垫；

4)制作免疫层析试纸条。

2.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，结合垫上与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体是鸡IgY；质控线上与目标分子和检测线固定的分子无关的抗体为山羊抗鸡IgY多克隆抗体。

3.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述检测线上固定的检测分子是小分子-BSA偶联物，所述质控线上固定的是作为参照的山羊抗鸡IgY多克隆抗体；所述结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光纳米微球标记的单克隆抗体，分别是抗小分子单克隆抗体和鸡IgY。

4.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述检测线上固定的检测分子是抗原，在质控线上固定的是参照物抗体山羊抗鸡IgY多克隆抗体；结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光纳米微球标记的生物分子，分别是作为检测分子的第二抗体和鸡IgY，第二抗体选自小鼠来源、山羊来源或兔来源。

5.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述检测线上固定的检测分子是抗原，在质控线上固定的是参照物抗体山羊抗鸡IgY多克隆抗体；结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光纳米微球标记的生物分子，分别是作为检测分子的抗原和鸡IgY。

6.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述检测线上固定的检测分子是抗体，在质控线上固定的是参照物抗体山羊抗鸡IgY多克隆抗体；结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光纳米微球标记的生物分子，分别是作为检测分子的抗体和鸡IgY。

7.一种利用权利要求1所述的近红外荧光分子免疫层析试纸定量检测抗原或抗体的方法，包括如下步骤：

1)将抗原或抗体标准品配制成2～10倍梯度的浓度系列标准品；

2)将上述浓度系列标准品分别用权利要求1所述的试纸进行免疫层析，利用荧光定量光谱仪分别检测检测线和质控线区域的荧光强度，制作抗原或抗体浓度的标准曲线；

3)待测抗原或抗体用权利要求1所述的试纸进行免疫层析，利用上述的标准曲线求得抗原或抗体浓度。

8.根据权利要求7所述的近红外荧光分子免疫层析试纸定量检测抗原或抗体的方法，其特征在于，所述的抗原选自血红蛋白。