CN107102144A - 快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 - Google Patents

快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法，试纸条包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸且它们依次搭接；结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；包被膜的检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，质控区包被有鸡IgY抗体。制作方法包括步骤:荧光微球的清洗与活化、荧光微球标记抗体的制备、荧光标记抗体结合垫的制备、包被膜的制备、纸条的组装，本发明制作的试纸条可快速、特异、精准检测寨卡病毒NS1蛋白，实现现场快速定量检测。

Description

快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其 制作方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法，尤其涉及一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法。
背景技术
寨卡病毒(Zika Virμs)属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirμsgenμs)，是一种主要由伊蚊传播的虫媒病毒。该病毒于1947年在乌干达首次发现，此后多年持续发现散在病例或发生小规模疫情。但自2015年以来，由寨卡病毒引起的人类感染不断发生，美洲、西太平洋、非洲及亚洲已累计有32个国家和地区报告寨卡病毒在本地传播。
目前，寨卡病毒主要是通过荧光PCR法，通过对血液和尿液进行病毒核酸的检测。该方法检测成本较高，耗时较长且对检测人员有一定的资质要求，很难应用于大规模人群快速筛查和既往感染史的调查研究，因此，能否快速精准的检测该病毒是控制疫情的关键因素。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种快速、特异、精准检测的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，可实现现场快速定量检测。
本发明进一步要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易操作的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，且所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸依次搭接；
所述结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜包含检测区和质控区，所述检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区包被有鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫为玻璃纤维材料，经Tris盐溶液浸泡处理后热烘干处理后裁切制成；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫为奥斯龙8964玻纤材料，并通过含有5％糖和2％吐温的Tris溶液浸泡后烘干处理并裁剪而成。
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
A、.荧光微球的清洗与活化：将荧光微球水洗离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用；
B、荧光微球标记抗体的制备：向步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用含1％BSA的TBST溶液重悬，超声混匀，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体悬液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
C、荧光标记抗体结合垫的制备：将步骤B得到两种荧光微球标记抗体混合并使用含15％糖的TBST溶液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤A的荧光微球的清洗与活化步骤为：将荧光微球水洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，使得溶液浓度为10mg/ml；再依次加入浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀并离心处理，弃上清液，用20～50mMpH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤B的荧光微球标记抗体的制备步骤为：在步骤A得到的荧光微球悬液中，逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使悬液中抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液复容，得到终浓度为0.1～2mg/ml的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体工作液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤D的包被膜的制备步骤为：分别将一种与荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别用1～10mM的PBS溶液调节终浓度至0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
NS1蛋白属于寨卡病毒非结构蛋白，该蛋白的表面电荷分布于其他黄热病毒显著不同，检测该蛋白能较大可能避免登革热和其他黄热病毒带来的干扰。NS1蛋白在发病初期就能被检出，可用于早期诊断，有利于病人的隔离治疗，较大程度的遏制疫情爆发。本发明所述的寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条，是利用不同粒径的荧光微球上的羧基、醛基、羟甲基等基团共价偶联抗体上，样本经过样品垫前处理后流经结合垫时，样本中的寨卡NS1蛋白与结合垫上的抗体结合，在层析作用下移动至硝酸纤维素膜，被检测区的另一寨卡NS1蛋白抗体捕获形成三明治结构的抗体-抗原-抗体复合物并聚集在检测区域，当荧光微球受到光源激发并释放出其特定波长的发射光，通过荧光检测系统将收集到的光信号转化为数字信号，从而可快速精准的测定样本中寨卡NS1蛋白的含量。
本发明首次将寨卡NS1抗体与荧光定量微球结合，可快速、特异、精准的检测出寨卡NS1蛋白的含量，相对于免疫胶体金等检测方法具有更灵敏、更准确、更稳定的优点，可以对待测样品实现快速、超敏、准确的现场检测，并且提供定量的检测结果。本发明检测物质为寨卡病毒NS1蛋白，该蛋白在人感染初期便可被检测出来，而人抗寨卡病毒IgG和IgM抗体的检测则需要感染后7天，本发明具有更早检测寨卡病毒的优势。另外，本发明检测人血清寨卡病毒NS1蛋白的灵敏度为0.1ng/ml，该灵敏度为其他方法如胶体金不能达到，为寨卡病毒的精准研究提供更好的支持。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的结构示意图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1、如图1所示，一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，包括底板5，所述底板5上依次设有样品垫1、结合垫2、包被膜3和吸水纸4，且所述样品垫1、结合垫2、包被膜3和吸水纸4依次搭接；所述结合垫2上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜3包含检测区T和质控区C，所述检测区T包被有与结合垫2上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区C包被有鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫为玻璃纤维材料，经Tris盐溶液浸泡处理后热烘干处理后裁切制成；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫为奥斯龙8964玻纤材料，并通过含有5％糖和2％吐温的Tris溶液浸泡后烘干处理并裁剪而成。
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
A、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球水洗离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用；具体为将荧光微球清洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声混匀，使得溶液浓度为10mg/ml；再依次加入终浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀并离心处理，弃上清液，用20～50mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用。
B、荧光微球标记抗体的制备：在步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。具体为在步骤A得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，使抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到终浓度为0.1～2mg/ml的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体工作液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体工作液。
C、荧光标记抗体结合垫的制备：将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并使用含15％糖的TBST溶液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；具体为：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1～10mM的PBS溶液调节浓度至0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；具体为：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度45～50℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5～1.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10～20μg/cm2。
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
本发明采用以下具体实施例来详细说明本发明：
实施例2、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为500nm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为470nm、525nm。将荧光微球悬液12000×g离心处理10min，去除上清后沉淀物用20mM pH5.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，再超生波100W处理50s，使荧光微球悬液的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后，12000×g离心20min，弃除上清后用20mM pH5.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为0.1mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1后12000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为0.1mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体；
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为0.1mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1后12000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为0.1mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：1的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以0.2μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液调节终浓度至0.5mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5mm，在湿度<20％、温度45℃的环境中热烘干36h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接2mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条。
在本实施例中，结合垫上的是Merck生产的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白抗体和羊抗鸡抗体，荧光微球粒径为500nm，荧光微球的激发光和发射光波长分别为470nm、525nm。包被膜检测区域T处包被为另一株寨卡NS1蛋白抗体。鼠IgG用于消除样本中的人抗鼠IgG，防止其对T、C区域测试的影响。
实施例3、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为0.2μm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为400nm、750nm。荧光微球悬液12000×g离心20min，去除上清后沉淀物用20mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，超生波300W处理20s，使荧光微球终浓度为10mg/ml，依次加入100μl的50mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀30min后15000×g离心10min，弃除上清后用50mM pH6.5的吗啉乙磺酸溶液溶重悬，重复清洗一次后超声复容备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)、逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为2.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后15000×g离心清洗1次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应2h后15000×g离心清洗2次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为2mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体；
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为2.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后15000×g离心清洗1次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应2h后15000×g离心清洗2次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为2mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：200的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以0.5μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用10mM的PBS溶液调节浓度至2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔8mm,在湿度<20％、温度50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度50℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接3mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条.
实施例4、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为0.2μm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为400nm、750nm。荧光微球悬液14000×g离心15min，去除上清后沉淀物用30mM pH6.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，超生波200W处理40s，使荧光微球终浓度为10mg/ml，加入70μl的80mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，置于旋转混匀仪，室温混匀20min后14000×g离心15min，弃除上清后用40mM pH6.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)、逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为1.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应2.5h后14000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1.5h后13000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为1mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为1.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应2.5h后14000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1.5h后13000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为1mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：100的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以1.0μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1～10mM的PBS溶液调节浓度至1.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度47℃的环境中热烘干35h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度47℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.0mg/ml的鼠IgG，喷涂量为15μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条。
试验结果检测：
本发明中利用测试荧光定量免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测系统，该系统主要有荧光光源系统、检测系统和软件分析系统组成。试纸条检测区和质控区捕获的荧光微球标记抗体，荧光微球在荧光光源激发光照射下被激发，发射出荧光信号被荧光信号检测系统捕获后转换为电信号并通过软件分析系统得出测试结果，实现对寨卡NS1蛋白的精确定量。
采用的荧光定量光谱检测系统：AFS-100免疫荧光单通道荧光测试仪，该仪器为广州蓝勃生物科技有限公司生产。
一、测试参数建立：
1.校准品配置，使用人阴性血清将Meridian公司zika virus NS1蛋白按照梯度稀释配置成以下浓度校准品：0、0.34、0.68、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88、43.76ng/ml；
2.将实施例2-4制作的试纸条其中一种准备好，按照从低到高顺序将校准品依次加样到测试卡，每个浓度加样3张卡，15min上机测试；
3.测试完毕后选定各浓度测试数据，选取拟合算法后生成曲线导入HEX文件并录入ID芯片；
二、检测：
1.样本：由于本地没有临床寨卡病毒样本，本测试采用寨卡病毒样本为使用人阴性血清和Meridian zika virusNS1蛋白混合稀释而成为模拟样本。
2.测试：取模拟样本75μl分别加入到实施例2-4的试纸条的和现有的金标检测寨卡病毒NS1蛋白试纸条的测试孔中，15min后上机测试或观察条带。
同时使用实施例2的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值0.00、0.68、1.37、2.73、5.47、10.94ng/ml的样本。定量检测结果如下表：
表1：实施例2寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果0、0.68、1.37使用定性试纸条测试未出现T条带；2.73、5.47、10.94三个浓度值出现T带。
同时使用实施例3的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值0.46、1.82、7.29、17.58、29.16ng/ml的样本。定量检测结果如下表：
表2：实施例3寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果：0.46、1.82使用定性试纸条测试未出现T条带；7.29、17.58、29.16ng/ml浓度值样本出现T条带。
同时使用实施例4的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值：0.17、1.23、2.38、8.68、16.78、27.91ng/ml的样本，定量检测结果如下表：
表3：实施例4寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果：0.17、1.23使用定性试纸条测试未出现T条带；2.38、8.68、16.76、27.91ng/ml浓度值样本出现T条带。
从上述数据可以看出：本发明中所述试纸条，相比于现有PCR检测方法学，具有更灵活便捷、快速的特点，不受操作地点的限制，人员要求低，更适用于区域性疫情的监控研究。本发明中所述的试纸条，只需少量样本，15min内即可显示结果，配套仪器轻便便捷，可手持式，可与疾控、边检、医院直接网络连接，无需人工数据录入，数据处理分析更便捷。同样，本发明与现有市场上金标检测人抗寨卡病毒IgG/IgM试纸条相比，本发明检测物质为寨卡病毒NS1蛋白，该蛋白在人感染初期便可被检测出来，而人抗寨卡病毒IgG和IgM抗体的检测则需要感染后7天，本发明具有更精准、更早检测寨卡病毒的优势，同金标法检测寨卡病毒NS1蛋白试纸条相比具有更灵敏，可定量优势，对疫情的监控和寨卡病毒的研究更有意义。本发明检测人血清寨卡病毒NS1蛋白的灵敏度为0.1ng/ml，该灵敏度为其他方法学如胶体金不能达到，为寨卡病毒的精准研究提供更好的支持。

Claims (10)

1.一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，且所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸依次搭接；
所述结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜包含检测区和质控区，所述检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区包被有鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
4.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
6.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
7.一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球悬液离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
B、荧光微球标记抗体的制备：在步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀后室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用含1％BSA的TBST溶液超声重悬，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
C、荧光标记抗体结合垫的制备：使用含15％糖的TBST溶液稀释步骤B得到的两种荧光微球标记抗体，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
8.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，所述步骤A的荧光微球的清洗与活化步骤为：将荧光微球清洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，使得微球悬液浓度为10mg/ml；再依次加入浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，用20～50mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声复容得到荧光微球悬液备用。
9.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，所述步骤B的荧光微球标记抗体的制备步骤为：在步骤A得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，使悬液中抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到终浓度为0.1～2mg/ml的的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
10.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条制作方法，其特征在于，所述步骤D的包被膜的制备步骤为：分别将一种与荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别用1～10mM的PBS溶液调节至终浓度为0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm，在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
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