CN109991418A - 一种循环肿瘤细胞捕获装置及方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及肿瘤细胞捕获技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞捕获装置及方法。本公开提供了一种循环肿瘤细胞的捕获装置，将上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮因子生长受体(EGFR)的抗体修饰在包被有PDMS胶状物的留置针上进行肿瘤细胞的捕获。本公开通过血液循环泵中模拟体内环境，EGFR抗体捕获循环肿瘤细胞数在60左右，EpCAM捕获的循环肿瘤细胞数在55左右，而EGFR+EpCAM混合抗体捕获的细胞数约为130，大于两种抗体单独使用的捕获数量之和。多抗体联用技术可远远提高循环肿瘤细胞的捕获效率，减少循环肿瘤细胞的损失，为循环肿瘤细胞的捕获与检测奠定了基础。

Description

一种循环肿瘤细胞捕获装置及方法

技术领域

本公开涉及肿瘤细胞捕获技术领域，具体涉及一种采用EpCAM、EGFR混合抗体包被的肿瘤细胞捕获装置及循环肿瘤细胞捕获方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

循环肿瘤细胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。因此早期发现血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。

常用的循环肿瘤细胞检测方法包括：免疫细胞化学法(immunocytochemistry,ICC)利用染料或酶标记的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)特异性抗体，通过检测标记抗体的染料或者酶，实现对肿瘤细胞的定性、定量和定位检测及分析；流式细胞术(flowcytometry,FCM)使不同细胞带上不同电荷，在偏转电场中对细胞进行偏转分离，完成细胞的分离和统计；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，基于血液中存在游离的CTCs的DNA，通过PCR技术对游离DNA进行特异性复制，通过检测DNA达到检测CTCs的目的；逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、荧光RT-PCR(fluorescent RT-PCR)、实时定量RT-PCR(real-time quantitativeRT-PCR)、巢式RT-PCR(nested RT-PCR)等技术。CellSearch检测系统是经美国食品及药品管理局(FDA)批准的唯一一个商用体外检测CTCs的方法。该系统检测全程封闭并自动化，检测结果最终以图像形式输出，系统挑选符合标准的细胞照片供检测者识别和计数。CellSearch系统提供的数据库可以根据患者被检查出的CTCs的数量，对癌症患者的总生存期和无进展生存期进行预测，为癌症患者后续治疗过程提供建议。通过肿瘤细胞表面分子标志物的抗原抗体识别作用对肿瘤细胞进行捕获可以有效提高对肿瘤细胞的识别及捕获灵敏度。CellSearch系统采用EpCAM修饰的磁球实现对患者血液中的循环肿瘤细胞的捕获。传统的CTC细胞捕获多限于对离体样本中肿瘤细胞的捕获，但是离体样本通常由于受到污染等原因导致检测结果的差异较大。发明人课题组在先专利CN103908306A中提供了一种基于留置针的循环肿瘤细胞在体捕获装置及方法，以EpCAM作为特异性捕获抗体，在输液过程中即可完成对血液中循环肿瘤细胞的捕获。

循环肿瘤细胞进入血液，会经历上皮间质转化，上皮间质转化是肿瘤发生侵袭转移的关键过程。具有极性的上皮表型细胞，在一定条件下发生细胞骨架重塑，转化成为更具强迁移能力的间质表型细胞。在此过程中，不仅细胞形态会发生改变，其表面分子标志物的表达也会发生变化，如细胞黏附分子(EpCAM)、细胞角蛋白的减少，而间质型标记物的增加，促进循环肿瘤细胞获得更强的侵袭能力，发生远处转移。由此可见循环肿瘤细胞发生上皮间质转化现象，往往会涉及上皮细胞及间质细胞的表达变化。发明人发现，采用EpCAM抗体作为识别材料对EpCAM高表达的循环肿瘤细胞可较好的识别，对于处于上皮间质转化的循环肿瘤细胞及间质型循环肿瘤细胞，其EpCAM表达较少，EpCAM抗体的识别能力及捕获效率大大降低。

发明内容

针对上述研究背景，发明人认为，EpCAM作为上皮细胞粘附分子抗体，针对EpCAM高表达的循环肿瘤细胞具有良好的捕获作用。但是，某些肿瘤细胞在经历过上皮间质转化后，细胞上皮特性消失，导致EpCAM表达量降低。以EpCAM作为特异性捕获抗体，针对上述EpCAM表达较少或不表达的细胞采集效率显著降低甚至无法捕捉，导致CTC的计数存在偏差。为了克服由于上皮间质转化导致的CTC计数偏差，发明人设计采用间质型标志物抗体EGFR与上皮型标志物抗体EpCAM联用的方式提高循环肿瘤细胞的捕获效率。研究表明当采用EpCAM和EGFR共同作为肿瘤细胞捕获抗体时，其捕获效率大于两者单独捕获肿瘤细胞之和，具有较好的检测灵敏度；上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体能够识别上皮型CTC，表皮因子生长受体(EGFR)的抗体能够识别间质型CTC，本公开研究发现：将两种抗体联合使用，突破了循环肿瘤细胞捕获不完全的技术难点；更为重要的，本公开研究表明，当采用上皮细胞粘附分子(EpCAM)及表皮因子生长受体(EGFR)共同作为捕捉抗体时，其捕获效果优于EpCAM与其他间质性抗体联用的采集效果，并且当采用该两种特异性抗体作为捕捉抗体时，捕获数量超过了两种抗体单独捕获的数量加和，体现出协同效果。

本公开第一方面，提供一种用于循环肿瘤细胞检测的捕获探针，所述捕获探针置于样本中能够吸附样本中的肿瘤细胞，所述捕获探针表面具有特异性识别肿瘤细胞表面抗原EpCAM及EGFR的抗体。

优选的，所述捕获探针为表面覆盖特异性识别抗体的留置针。

优选的，所述捕获探针表面包覆可吸附蛋白材料，所述可吸附蛋白材料表面包覆所述特异性识别肿瘤细胞表面抗原EpCAM及EGFR的抗体。

进一步优选的，所述可吸附蛋白材料为聚二甲基硅氧烷。

本公开第二方面，提供第一方面所述肿瘤细胞捕捉探针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：在留置针表面制备可吸附蛋白层获得功能化留置针，将功能化留置针分别置于一定浓度的EpCAM及EGFR抗体溶液中得到所述肿瘤细胞捕获探针。

优选的，所述可吸附蛋白层为聚二甲基硅氧烷，所述聚二甲基硅氧烷的制备方法如下：按比例称取预聚物和固化剂后混合连续搅拌一段时间获取胶状物，将胶状物减压干燥排尽其中的气泡后保持真空一段时间；将留置针蘸取真空后的胶状物并在一定温度下干燥。

更进一步优选的，所述预聚物为SYLGUARD-184A，所述固化剂为SYLGUARD-184B。

更进一步优选的，所述预聚物和固化剂的比例为9～11:0.5～1.5。

更进一步优选的，所述胶状物在真空状态下干燥0.5-1h。

优选的，所述特异性识别抗体溶液配制方法为将EpCAM及EGFR_的抗体冻干粉分别用PBS稀释为1mg/mL的母液，然后用PBS将母液分别稀释为EpCAM 100μg/mL，EGFR 100μg/mL。

优选的，所述特异性识别抗体EpCAM及EGFR浓度分别为50～100μg/mL、50～100μg/ml。

进一步优选的，所述EpCAM及EGFR的比例为4～6：3～5。

进一步优选的，所述功能化的留置针置于EpCAM及EGFR抗体溶液中，4℃孵育过夜制备所述捕获探针。

本公开第三方面，提供一种肿瘤细胞的捕获方法，所述方法包括采用第一方面所述的捕获探针放置于样品中一段时间捕捉样品中的肿瘤细胞，取出捕获探针后用洗脱液将肿瘤细胞洗脱并收集。

本公开第四方面，提供一种非诊断治疗目的的肿瘤细胞检测方法，所述检测方法采用第三方面所述肿瘤细胞捕获方法将样本中的肿瘤细胞收集后，通过免疫细胞化学法、流式细胞术法、PCR方法及荧光检测方法对收集的肿瘤细胞数量进行检测。

优选的，将收集到的肿瘤细胞经DAPI染色后检测。

本公开第五方面，提供一种肿瘤细胞检测试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的肿瘤细胞捕获探针。

优选的，所述肿瘤细胞检测试剂盒中还包括洗脱液、酶标板及检测试剂。

进一步优选的，所述检测试剂包括固定液、透膜液及清洗液。

与现有技术相比，本公开的有益效果是：

1.本公开提供了一种采用EpCAM、EGFR两种特异性抗体对循环样品中的肿瘤细胞进行识别的探针，可以有效实现对样品中的肿瘤细胞的识别及捕获。依据本公开研究结果，采用上述组合的抗体共同进行肿瘤细胞捕获时，捕获效果优于单独捕获的数量之和，呈现出协同效果。

2.本公开还提供了上述肿瘤细胞捕获探针的制备方法，通过可吸附蛋白层将特异性捕获探针固定于留置针表面，可以方便的进行肿瘤细胞的采集。另外，本公开进一步提供了应用于该特异性探针的可吸附层制备方法，工艺简单，成本经济。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为实施例1中不同浓度抗体的捕获率柱状图；

其中，图1A为不同浓度EpCAM对SMMC-7721、MCF-7肿瘤细胞的捕获率；图1B为不同浓度EGFR对SMMC-7721、MCF-7肿瘤细胞的捕获率。

图2为实施例1中优化好浓度的EpCAM和EGFR联合使用对SMMC-7721、MCF-7的捕获效率。

图3为实施例1中体外模拟血液循环系统捕获肿瘤细胞效果图；

图4为实施例1中体外模拟捕获肿瘤细胞效果图；

图5为实施例2中不同组合的捕获效率柱形图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，采用特异性抗体对肿瘤细胞进行捕获的效率及准确性与抗体的选择具有一定的关系，本公开针对肿瘤细胞捕获装置表面的特异性探针进行了研究，研究表明采用EpCAM和EGFR共同作为肿瘤细胞捕获抗体时，其捕获效率大于两者单独捕获肿瘤细胞之和，具有较好的检测灵敏度。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1：

1.相关溶液配制

磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法：称取0.2gNaH₂PO₄,1.15gNa₂HPO₄和8gNaCl，用超纯水充分溶解后定容至1000mL。

固定液配制方法：称取20g多聚甲醛，用500mL PBS在60℃水浴中搅拌溶解，即配制成4％多聚甲醛固定液。

透膜液配制方法：称取0.061g MgCl₂·6H₂O,0.292g NaCl,0.477g Hepes,0.02gNaN₃,500μL TritonX-100和10.269g蔗糖，使用PBS溶解并定容至100mL。

清洗液配制方法：取10μL Triton-100和10μL Tween-20，使用PBS溶解并定容至100mL。

2.小鼠MCF-7细胞的培养及准备

(1)MCF-7细胞的培养

采用MCF-7细胞系，为贴壁细胞，细胞培养使用添加有10％胎牛血清及1％青链霉素双抗溶液的1640培养基，37℃，含5％CO2的饱和湿度培养。细胞传代使用0.25％猪胰蛋白酶(不含EDTA)。

(2)MCF-7细胞悬液的制备

①无菌环境下，倒掉细胞培养瓶中的培养液，使用不完全培养基缓慢冲洗细胞，重复三次。

②加入经37℃预热的0.25％猪胰蛋白酶(不含EDTA)2mL，放入37℃温箱中保温消化5min。

③将细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察。如发现细胞间隙透射出亮光且细胞变圆即证明消化已经完成，可以终止消化。

④无菌环境下，将培养瓶内的胰酶溶液倒掉，加入完全培养基终止消化，并使用吹打管将细胞全部吹打下来，并吹打成单细胞悬液。

⑤吸出细胞悬液。培养瓶内加入5mL完全培养基继续细胞培养。

⑥取少量细胞悬液使用血球计数板计数，计算出细胞悬液的细胞浓度。

⑦取细胞悬液，1000rpm，离心4min，弃上清，加PBS吹打重悬，配制成特定浓度的细胞悬液。

3.SMMC-7721细胞的培养及准备

(1)SMMC-7721细胞的培养

本文采用SMMC-7721细胞系，为贴壁细胞，细胞培养使用添加有10％胎牛血清及1％青链霉素双抗溶液的1640培养基，37℃，含5％CO₂的饱和湿度培养。细胞传代使用0.25％猪胰蛋白酶(不含EDTA)。

(2)SMMC-7721细胞悬液的制备

①无菌环境下，倒掉细胞培养瓶中的培养液，使用不完全培养基缓慢冲洗细胞，重复三次。

②加入经37℃预热的0.25％猪胰蛋白酶(不含EDTA)2mL，放入37℃温箱中保温消化5min。

③将细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察。如发现细胞间隙透射出亮光且细胞变圆即证明消化已经完成，可以终止消化。

④无菌环境下，将培养瓶内的胰酶溶液倒掉，加入完全培养基终止消化，并使用吹打管将细胞全部吹打下来，并吹打成单细胞悬液。

⑤吸出细胞悬液。培养瓶内加入5mL完全培养基继续细胞培养。

⑥取少量细胞悬液使用血球计数板计数，计算出细胞悬液的细胞浓度。

⑦取细胞悬液，1000rpm，离心4min，弃上清，加PBS吹打重悬，配制成特定浓度的细胞悬液。

4.功能化留置针的制备

①按照10：1的比例称取10g预聚物和1g固化剂，将预聚物和固化剂倒入一次性纸杯中，用玻璃棒连续搅拌10min，制成PDMS胶状物。

②将混匀的混合物放入玻璃干燥器中，用真空泵抽真空，可观察到混合物中混杂的气泡彻底放出，保持真空状态40min。

③将留置针套管蘸取PDMS胶状物，包上薄层后，放入烘箱中干燥，85℃，干燥40min。

5.抗体浓度的优化

(1)EGFR抗体

①将功能化的留置针软管浸泡于不同浓度的EGFR抗体溶液中，抗体的浓度分别为50μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，150μg/ml。4℃孵育过夜。

②乳腺癌细胞，肝癌细胞用血细胞计数板在显微镜下进行计数，PBS进行稀释。吹打均匀后，分别取相同量的两种细胞置于五个EP管中。

③将包被有抗体的留置针软管分别置于EP管中，取两根没有包被抗体的功能化留置针分别置于两个不同肿瘤细胞的EP管中作为对照。置于震荡仪，震荡2h。

(2)EpCAM抗体

①将功能化的留置针软管浸泡于不同浓度的EpCAM抗体溶液中，抗体的浓度分别为50μg/mL，100μg/mL，150μg/ml。4℃孵育过夜。

②乳腺癌细胞，肝癌细胞用血细胞计数板在显微镜下进行计数，PBS进行稀释。吹打均匀后，分别取相同量的两种细胞置于五个EP管中。②将包被有抗体的留置针软管分别置于EP管中，取两根没有包被抗体的功能化留置针分别置于两个不同肿瘤细胞的EP管中作为对照。置于震荡仪，震荡2h。

6.染色和计数

①震荡捕获2h后取出。使用200μL PBS冲洗留置针软管，将吸附在软管上的细胞冲洗到酶标板中，静置30min后进行荧光染色。

②轻轻吸净酶标板孔中液体。

③加入固定液，室温固定15min。

④吸除固定液，加入透膜液，室温下透膜25min。

⑤吸除透膜液，使用清洗液冲洗三遍。

⑥吸除清洗液，加入DAPI溶液，室温避光孵育10min。

⑦将酶标板置于荧光倒置显微镜下观察计数。

7.结果

(1)采用DAPI染色检测肿瘤细胞数量

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以透过细胞膜，一般用于固定细胞和活细胞的染色。倒置显微镜下观察到的蓝色荧光即为肿瘤细胞。

如图1所示，图1A中EpCAM的浓度达到100μg/mL时，MCF-7的捕获效率达到最高，图1B中可观察到EGFR浓度达到100μg/mL时，SMMC-7721的捕获数趋于平衡，所以选择EGFR 100μg/mL，EpCAM 100μg/mL两个浓度。

鸡尾酒式抗体修饰的留置针进行体外捕获(图2)

如图2所示，将混合抗体包被留置针分别对两种循环肿瘤细胞的捕获效率进行了检测，结果发现，对于MCF-7细胞来说，捕获效率从27.00％增加到29.84％。原因可能是在模拟实验中使用的MCF-7细胞是通过与EMT相关的表型改变的附着细胞进行胰蛋白酶化的。因此，MCF-7的捕获性能将得到进一步改善。对于肝细胞癌细胞株SMMC 7721，捕获效率显著提高，从3.17％提高到26.67％，这表明混合抗体修饰留置针的方法可以弥补基于EpCAM的方法的缺陷。

(2)DMEM培养基体外模拟血液循环

采用如图3所示的体外模拟血液循环系统对循环状态下液体中的肿瘤细胞进行捕获并检测，

①将功能化的留置针软管置于100μg/mL EGFR，100μg/mL EpCAM，100μg/mL EGFR和100μg/mL EpCAM混合的三种抗体溶液中4℃孵育过夜。

③取一次性输液器和恒流泵组成封闭的管道系统，注入DMEM培养基，200个乳腺癌MCF-7细胞和200个肝癌SMMC-7721细胞，模拟人体静脉的血液循环。

④在封闭系统中刺入修饰有上述三种抗体只之修饰PDMS的留置针，打开恒流泵，使加有乳腺癌细胞和肝癌细胞的DMEM培养基以2cm/s的速度流动，模拟血管内的血液流动。当细胞流经留置针时，留置针上的抗体可以通过三种抗体抗体与乳腺癌细胞，肝癌细胞表面抗原的特异性结合作用将细胞捕获在留置针上，循环吸附2h后，将留置针拔出，用洗脱剂洗脱到酶标板上。

⑤用DAPI染色并于倒置荧光显微镜下观察和计数。

(3)DMEM培养基体外模拟血液循环结果

如图4所示，体外模拟血液循环实验，EGFR抗体捕获循环肿瘤细胞数在60左右，EpCAM捕获的循环肿瘤细胞数在55左右，而EGFR+EpCAM混合抗体捕获的细胞数在130左右，比两种抗体单独使用的和还要大。因此，鸡尾酒式抗体包被留置针能够提高对循环肿瘤细胞的捕获效率。

实施例2

本实施例中，将上皮型抗体anti-EpCAM antibody和间质型抗体anti-vimentinantibody以1：1修饰在捕获装置中作为对照组，进行循环肿瘤细胞的富集。本实施例取一次性输液器和恒流泵组成封闭的管道系统，注入DMEM培养基，200个乳腺癌MCF-7细胞和200个肝癌SMMC-7721细胞，模拟人体静脉的血液循环。在密闭系统中分别刺入修饰有EpCAM+vimentin(对照组)和EpCAM+EGFR(实验组)的留置针循环吸附2h后，将留置针拔出，用洗脱剂洗脱到酶标板上。用DAPI染色并于倒置荧光显微镜下观察和计数。

结果如图5所示，实验组的捕获循环肿瘤细胞数为140个左右，对照组捕获循环肿瘤细胞数数为60～70个，因此，本公开中捕获探针效率高于对照组的循环肿瘤细胞捕获效率。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于循环肿瘤细胞检测的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针置于样本中能够特异性吸附样本中的肿瘤细胞，所述捕获探针表面具有特异性识别肿瘤细胞表面抗原EpCAM及EGFR的抗体。

2.如权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，所述捕获探针为表面覆盖特异性识别抗体的留置针。

3.如权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，捕获探针表面包覆可吸附蛋白材料，所述可吸附蛋白材料表面包覆所述特异性识别肿瘤细胞表面抗原EpCAM及EGFR的抗体；优选的，所述可吸附蛋白材料为聚二甲基硅氧烷。

4.权利要求1-3任一项所述肿瘤细胞捕获探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：在留置针表面制备可吸附蛋白层获得功能化留置针，将功能化留置针分别置于一定浓度的EpCAM及EGFR抗体溶液中得到所述肿瘤细胞捕获探针。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述可吸附蛋白层为聚二甲基硅氧烷，所述聚二甲基硅氧烷的制备方法如下：按比例称取预聚物和固化剂后混合连续搅拌一段时间获取胶状物，将胶状物减压干燥排尽其中的气泡后保持真空一段时间；将留置针蘸取真空后的胶状物并在一定温度下干燥。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述预聚物为SYLGUARD-184A；和所述固化剂为SYLGUARD-184B；所述预聚物和固化剂的比例为9～11:0.5～1.5；和/或所述胶状物在真空状态下干燥0.5-1h。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述特异性识别抗体EpCAM及EGFR浓度分别为50～100μg/mL、50～100μg/mL；优选的，所述EpCAM及EGFR的比例为4～6：3～5；优选的，所述功能化的留置针置于EpCAM及EGFR抗体溶液中，4℃孵育过夜制备所述捕获探针。

8.一种肿瘤细胞的捕获方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-3任一项所述的捕获探针放置于样品中一段时间捕捉样品中的肿瘤细胞，取出捕获探针后用洗脱液将肿瘤细胞洗脱并收集。

9.一种非诊断治疗目的的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求8所述肿瘤细胞捕获方法将样本中的肿瘤细胞收集后，通过免疫细胞化学法、流式细胞术法、PCR方法及荧光检测方法对收集的肿瘤细胞数量进行检测；优选的，收集到的肿瘤细胞经DAPI染色后检测。

10.一种肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-3任一项所述的肿瘤细胞捕获探针；优选的，所述肿瘤细胞检测试剂盒中还包括洗脱液、酶标板及检测试剂；进一步优选的，所述检测试剂包括固定液、透膜液及清洗液。