CN106970224B - 一种应用cd45免疫荧光联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种应用cd45免疫荧光联合cep探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学临床检测领域,具体涉及一种应用CD45免疫荧光联合CEP荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括:固定液、2×SSC、0.3%NP‑40/0.4×SSC、0.075M KCl溶液、CD45单抗和CEP探针混合液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂。本发明采用CD45免疫荧光抗体联合CEP荧光原位杂交探针鉴定捕获的循环肿瘤细胞,通过一步法完成了免疫荧光和荧光原位杂交检测,克服了免疫荧光检测和荧光原位杂交检测联合使用时存在相互干扰、检测耗时较长的问题,一步法杂交孵育在2h内快速完成,大大减少了检测时间,并且检测结果观察直观。

Description

一种应用CD45免疫荧光联合CEP探针鉴定循环肿瘤细胞的试 剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学临床检测领域,具体涉及一种应用CD45免疫荧光联合CEP荧 光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。
背景技术
[0002] 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是指是存在于外周血中的各类 肿瘤细胞的统称,因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落释放进入外周 血循环的肿瘤细胞,大部分CTCs在进入外周血后发生凋亡或被吞噬,少数能够逃逸并锚着 发展成为转移灶。近几年CTCs在肿瘤诊断、治疗和监控等方面的临床表现逐渐崭露头角,是 目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段,临床应用价值极其显著。与传统 的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比,优势显著,可更加敏感地发现疾病的变 化,更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果。而且分离富集CTCs只需抽取患者少量外周 血,对患者没有副作用,因此可以高频度的监测,达到实时监测疾病进展的目的。更为重要 的是,CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本,可以发现患者的实时生物学变化, 并根据结果及时调整治疗方案,实现实时的个体化治疗。
[0003] CTCs富集捕获的方法基本上基于以下三种原理:免疫捕获、细胞大小、其他特征的 识别(如细胞密度、电荷、形变能力等),前两种是目前应用较多的方法。捕获后对CTCs鉴定 是实现CTCs运用于临床肿瘤患者的疗效实时评估、病情实时监测、指导用药和预后判断的 关键。鉴定CTCs最常用的方法主要有6种方法:(1)免疫荧光法;(2)流式细胞法;(3)荧光原 位杂交法;⑷RT-PCR; (5)基因芯片法;⑹二代测序法。免疫荧光法和流式细胞法基于CTCs 膜蛋白特征鉴定技术;荧光原位杂交法、RT-PCR、基因芯片法和二代测序法基于CTCs核酸特 征鉴定技术。
[0004] 免疫荧光是利用抗原与抗体特异性结合的原理,使荧光素标记的抗体与特异的肿 瘤标志物(主要包括上皮细胞角蛋白、上皮细胞膜特异性抗原等)结合,通过酶和底物反应 显色来判断肿瘤细胞的存在。免疫荧光是检测CTCs的成熟方法之一,简便、直观并可以进行 形态学分析,但其敏感性只有IO5左右,而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原,而非上 皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性,加之镜下对结果观察和判读的主观性较 强,这些都限制了免疫荧光在CTCs检测中的应用。
[0005] 焚光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是一门新兴的分子 细胞遗传学技术,是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的 一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色 体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多 领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针,按照碱基互补的原则,与待检材 料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色 体上是沿着染色体纵轴呈线性排列,因而可以用探针直接与染色体进行杂交从而将特定的 基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比,荧光原位杂交具有快速、检测信 号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。荧 光原位杂交技术在应用于检测CTCs染色体多倍体,基因断裂,基因融合时,由于捕获的CTCs 中存在大量的血细胞背景,在荧光显微镜下,寻找目标CTCs极为困难,从而限制了 FISH技术 在CTCs中的应用。
发明内容
[0006] 本发明针对现有技术的不足,目的在于提供一种应用CD45免疫荧光联合CEP荧光 原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用。
[0007] 为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案为:
[0008] —种应用CD45免疫荧光联合CEP荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒, 包括:固定液、2 X SSC、0 · 3 %NP-40/0 · 4 X SSC、0 · 075M KCl溶液、CD45单抗和CEP探针混合 液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂。
[0009] 上述方案中,所述⑶45单抗和CEP探针混合液的组分为荧光标记⑶45单抗、CEP荧 光原位杂交探针、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、BSA、SSC、Triton-100。
[0010] 上述方案中,所述⑶45单抗和CEP探针混合液各组分的浓度为:荧光标记⑶45单抗 的浓度为〇.〇〇2mg/ml,CEP荧光原位杂交探针的浓度为2ngAiL,硫酸葡聚糖10% (质量浓 度)、去离子甲酰胺50% (体积浓度)、BSA1% (质量浓度)、6XSSC、Triton-100 1%。(体积浓 度)。
[0011] 上述方案中,所述固定液为甲醇和冰乙酸按体积比3:1混合所得混合液。
[0012] 上述方案中,所述穿孔剂的组分为5%〇Triton x-100、0. IM磷酸盐缓冲液。
[0013] 上述方案中,所述封闭液为5%的BSA。
[0014] 上述方案中,所述封片剂为树脂。
[0015] 上述试剂盒在制备用于鉴定循环肿瘤细胞产品中的应用,具体地包括如下步骤:
[0016] ⑴收获细胞:将捕获的循环肿瘤细胞样本(CTCs)吸至尖底离心管,离心、去上清;
[0017] (2)低渗:加入预温至37°C的0.075mol/L KCl溶液6〜8mL,用吸管吹打混匀后置37 °C 温箱 20 〜30min;
[0018] (3)预固定:加入固定液2mL,吹打混匀,离心;
[0019] ⑷吸去上清液,加新鲜配制的固定液5mL,吹打混勾,固定IOmin,离心;
[0020] (5)重复步骤⑷直至细胞沉淀洗白洗干净;
[0021] ⑹细胞悬液的制备:吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的胞悬液(10X 物镜在相差显微镜下观察细胞密度,要求细胞无重叠,且单视野细胞数量在100〜200个为 宜);
[0022] ⑺制片:吸取3〜5yL细胞悬液滴至防脱载玻片上,56°C老化0.5〜2小时;
[0023] ⑻封闭:向玻片加入IOOul封闭液,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0024] ⑼穿孔:滴加IOOul穿孔剂,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0025] (10)脱水:将玻片依次置于70Vt% (体积浓度)乙醇、85Vt%乙醇和lOOVt%乙醇中 各2min脱水后自然干燥玻片;
[0026] (11)杂交孵育:取出⑶45单抗和CEP探针混合液,室温静置5分钟,彻底混匀后短暂 离心,取IOyL滴于细胞滴片杂交区域,立即盖上22mmX 22mm的盖玻片,探针在盖玻片下应均 匀展开无气泡,用树脂封边,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;
[0027] (12)洗涤:取出孵育后的玻片,去除盖玻片上的橡皮胶,立即将玻片置于65°C〜68 °C 0.3%NP-40/0.4 X SSC溶液中,振荡10〜20s脱去盖玻片,浸泡5〜10分钟,将玻片置于37 °C去离子水中,振荡1〜3s,浸泡2分钟,暗处自然干燥玻片;
[0028] (13)封片:滴加IOul DAPI复染剂;
[0029] (14)阅片:在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察玻片;
[0030] (15)结果判定:a. CD45染色阳性为白细胞;b. CD45未被染色,但呈巨大裸核,为非 肿瘤细胞;C.CD45未被染色,信号点多2个,非巨大裸核可以判断为循环肿瘤细胞,进行计 数。
[0031] 上述方案中,步骤(11)所述杂交孵育的条件为:75°C变性2分钟,37°C孵育2小时。
[0032] 本发明的有益效果如下:
[0033] (1)本发明采用免疫荧光联合荧光原位杂交技术鉴定循环肿瘤细胞,克服了免疫 荧光检测或荧光原位杂交检测单一技术检测时,检测结果不能充分证实为循环肿瘤细胞的 缺点,减少循环肿瘤细胞鉴定的错误;
[0034] (2)本发明采用CD45免疫荧光抗体联合CEP荧光原位杂交探针鉴定捕获的循环肿 瘤细胞,通过一步法完成了免疫荧光和荧光原位杂交检测,一步法杂交孵育在2h内快速完 成,大大减少了检测时间;
[0035] (3)本发明中所述CEP探针采用非重复序列技术制备而成,减少了常规CEP探针因 为重复序列导致的非特异性杂交信号,能有效减少循环肿瘤细胞的计数错误;同时该技术 制备的CEP探针能够在2个小时内快速完成杂交,比传统探针的16〜24小时杂交时间,大大 缩短。
附图说明
[0036] 图1为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被CD45染红色,同时核中含有 多个(>2个)荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细胞被CD45染红色,核中含有2 个荧光信号点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
[0037] 图2为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被⑶45染红色,同时核中含有2 个荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细胞被CD45染红色,核中含有2个荧光信号 点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
[0038] 图3为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被CD45染红色,同时核中含有 多个(>2个)荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细胞被CD45染红色,核中含有2 个荧光信号点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
具体实施方式
[0039] 为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0040] 实施例1
[0041] —种应用CD45免疫荧光联合CEP荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒, 试剂盒的组成如下表1所示:
[0042] 表1试剂盒组成
[0043]
Figure CN106970224BD00061
[0044] 实施例2
[0045] 使用实施例1所述试剂盒鉴定结直肠癌患者循环肿瘤细胞,采用的CD45单抗+3号 染色体荧光原位杂交探针检测,3号染色体荧光原位杂交探针特异性序列(SEQ ID NO. 1) 为:GAATTCTCAGTAGCTTCTTTGTGTGTGTGTACTCAACTCACAGAGTTGAACCTTCCTTTAGACAGAGC AGATTGGAAACACTCTTTTTGTGGAATTTGCAAGTGGAAAATTCTAGCAGTATGAGGTCAATGGTACA AAAGG
[0046] 具体包括如下步骤:
[0047] (1)收获细胞:将捕获的循环肿瘤细胞样本(CTCs)吸至尖底离心管,离心,1000转/ min, lOmin,去上清;
[0048] (2)低渗:加入预温至37°C的0.075mol/L KCL溶液6〜8mL,用吸管吹打混匀后置37 °C 温箱 20 〜30min;
[0049] ⑶预固定:加入固定液2mL,吹打混勾,1000转/min离心IOmin;
[0050] ⑷吸去上清液,加新鲜配制的固定液5mL,吹打混勾,固定IOmin,1000转/min离心 IOmin;
[0051] (5)重复步骤⑷直至细胞沉淀洗白洗干净;
[0052] ⑹细胞悬液的制备:吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液;
[0053] ⑺制片:吸取3〜5yL细胞悬液滴至防脱载玻片上,56°C老化0.5〜2小时;
[0054] ⑻封闭:向玻片加入IOOul封闭液,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0055] ⑼穿孔:滴加IOOul穿孔剂,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0056] (10)脱水:将玻片依次置于70Vt%乙醇、85Vt%乙醇和lOOVt%乙醇中各2min脱水 后自然干燥玻片;
[0057] (11)杂交孵育:取出⑶45单抗和CEP探针混合液,室温静置5分钟,彻底混匀后短暂 离心,取IOyL滴于细胞滴片杂交区域,立即盖上22mmX 22mm的盖玻片,探针在盖玻片下应均 匀展开无气泡,用树脂封边,将玻片置于杂交仪上,75 °C变性2分钟,37 °C孵育2小时;
[0058] (12)洗涤:取出孵育后的玻片,去除盖玻片上的橡皮胶,立即将玻片置于65°C〜68 °C 0.3%NP-40/0.4XSSC溶液中,振荡10〜20秒脱去盖玻片,浸泡5〜10分钟,将玻片置于 37°C去离子水中,振荡1〜3秒,浸泡2分钟,暗处自然干燥玻片;
[0059] (13)封片:滴加IOul DAPI复染剂;
[0060] (14)阅片:在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察玻片。
[0061] 检测结果如图1和图2所示。图1为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被 CD45染为红色,同时核中含有多个(>2个)荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细 胞被CD45染红色,核中含有2个荧光信号点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
[0062] 图2为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被CD45染为红色,同时核中含 有2个荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细胞被CD45染红色,核中含有2个荧光 信号点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
[0063] 实施例3
[0064] 使用本发明实施例所述试剂盒,应用CD45免疫荧光和CEP7荧光原位杂交联合检测 膀胱癌患者外周血循环肿瘤细胞。7号染色体荧光原位杂交探针特异性序列(SEQ ID NO. 2) 为:GAATCATTCTCAGAAAGTGCTTTGTGATGTGTGCGTTCAACTCACAAAGTTTAACCTTTCTTTTCATAG AGGAGTTTGAAAACACACTGTTTGTAAAGTCTGCAAGTGGATATATGGACCTGTTTGAGGCCTTCGTT GGAAACGGGATTTCTTCATTGAATGCTAGACGGAAG
[0065] (1)收获细胞:抽取患者外周血10ml,采用市售的循环肿瘤细胞捕获仪或试剂盒捕 获的循环肿瘤细胞(CTCs),捕获后的循环肿瘤细胞吸至尖底离心管,离心,1000转/min, IOmin,去上清;
[0066] (2)低渗:加入预温至37°C的0.075mol/L KCL溶液6〜8mL,用吸管吹打混匀后置37 °C 温箱 20 〜30min;
[0067] ⑶预固定:加入固定液2mL,吹打混勾,1000转/min离心IOmin;
[0068] ⑷吸去上清液,加新鲜配制的固定液5mL,吹打混勾,固定IOmin,1000转/min离心 IOmin;
[0069] (5)重复步骤⑷直至细胞沉淀洗白洗干净;
[0070] ⑹细胞悬液的制备:吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液;
[0071] ⑺制片:吸取3〜5yL细胞悬液滴至防脱载玻片上,56°C老化0.5〜2小时;
[0072] ⑻封闭:向玻片加入IOOul封闭液,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0073] ⑼穿孔:滴加IOOul穿孔剂,室温封闭IOmin后,2 X SSC (pH 7.0)漂洗5min;
[0074] (10)脱水:将玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水后自然 干燥玻片;
[0075] (11)杂交孵育:取出⑶45单抗和CEP探针混合液,室温静置5分钟,彻底混匀后短暂 离心,取IOyL滴于细胞滴片杂交区域,立即盖上22mmX 22mm的盖玻片,探针在盖玻片下应均 匀展开无气泡,用树脂封边,将玻片置于杂交仪上,75 °C变性2分钟,37 °C孵育2小时;
[0076] (12)洗涤:取出孵育后的玻片,去除盖玻片上的橡皮胶,立即将玻片置于65°C〜68 °C 0.3%NP-40/0.4XSSC溶液中,振荡10〜20秒脱去盖玻片,浸泡5〜10分钟,将玻片置于 37°C去离子水中,振荡1〜3秒,浸泡2分钟,暗处自然干燥玻片;
[0077] (13)封片:滴加IOul DAPI复染剂;
[0078] (14)阅片:在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察玻片。
[0079] 检测结果如图3所示。图3为本试剂盒鉴定捕获的循环肿瘤,其中A细胞未被CD45 染红色,同时核中含有多个(>2个)荧光原位杂交信号,该细胞为循环肿瘤细胞;B细胞被 CD45染红色,核中含有2个荧光信号点,该细胞为血液细胞(白细胞)。
[0080] 显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对 于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

  1. I. 一种应用CD45免疫荧光联合CEP荧光原位杂交探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒检测 鉴定循环肿瘤细胞的方法,所述方法用于非疾病诊断和治疗目的,其特征在于,具体地包括 如下步骤: (1) 收获细胞:将捕获的循环肿瘤细胞样本(CTCs)吸至尖底离心管,离心、去上清; (2) 低渗:加入预温至37°C的0.075mol/L KCl溶液6〜8mL,用吸管吹打混匀后置37°C恒 温箱20〜30min; (3) 预固定:加入固定液2mL,吹打混勾,离心; (4) 吸去上清液,加新鲜配制的固定液5mL,吹打混勾,固定IOmin,离心; (5) 重复步骤(4)直至细胞沉淀洗白洗干净; (6) 细胞悬液的制备:吸去上清液,加入适量固定液,制成浓度合适的细胞悬液; (7) 制片:吸取3〜5yL细胞悬液滴至防脱载玻片上,56 °C老化0.5〜2小时; ⑻封闭:向玻片加入IOOuL封闭液,室温封闭IOmin后,2 X SSC漂洗5min; (9) 穿孔:滴加IOOul穿孔剂,室温封闭IOmin后,2 X SSC漂洗5min; (10) 脱水:将玻片依次置于70%、85%和100%乙醇溶液中各2min脱水后自然干燥玻片; (11) 杂交孵育:取出CD45单抗和CEP探针混合液,室温静置5分钟,彻底混匀后短暂离 心,取IOyL滴于细胞滴片杂交区域,立即盖上22mmX 22mm的盖玻片,探针在盖玻片下应均匀 展开无气泡,用树脂封边,将玻片置于杂交仪上进行杂交孵育;所述杂交孵育的条件为:75 °C变性2分钟,37 °C孵育2小时; (12) 洗涤:取出孵育后的玻片,去除盖玻片上的橡皮胶,立即将玻片置于65 °C〜68°C
  2. 0.3%NP-40/0.4 X SSC溶液中,振荡10〜20s脱去盖玻片,浸泡5〜10分钟,将玻片置于37°C去离 子水中,振荡1〜3s,浸泡2分钟,暗处自然干燥玻片; (13) 封片:滴加IOuL DAPI复染剂; (14) 阅片:在荧光显微镜下选用合适的滤光片观察玻片; (15) 结果判定:a.⑶45染色阳性为白细胞;b.⑶45未被染色,但呈巨大裸核,为非肿 瘤细胞;c. CD45未被染色,信号点多2个,非巨大裸核可以判断为循环肿瘤细胞; 所述试剂盒包括:固定液、2 X SSC、0.3%NP-40/0.4 X SSC、0.075M KCl溶液、CD45单抗和 CEP探针混合液、DAPI复染剂、穿孔剂、封闭液和封片剂;所述CD45单抗和CEP探针混合液的 组分为荧光标记CD45单抗、CEP荧光原位杂交探针、硫酸葡聚糖、去离子甲酰胺、BSA、SSC和 Triton X-100;所述⑶45单抗和CEP探针混合液各组分的浓度为:荧光标记⑶45单抗的浓度 为0.002mg/ml,CEP荧光原位杂交探针的浓度为2ngAiL,硫酸葡聚糖10%、去离子甲酰胺50%、 BSAl%、6XSSC、Triton X-100 1%。;所述固定液为甲醇和冰乙酸按体积比3:1混合所得混合 液;所述穿孔剂的组分为5%。Triton X-100、0. IM磷酸盐缓冲液;所述封闭液为5%的BSA;所 述封片剂为树脂。
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