CN111257574B - 用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡包括：卡壳、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，A检测试纸条的结合垫为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B的玻璃纤维膜，它的检测线为包被有芬太尼类物质人工抗原B，它的质控线为包被有羊抗兔抗体，本发明荧光免疫快检卡操作简单、检测时间短、当场能全覆盖快速检测我国列管27种芬太尼类物质，适用于大批样品检测。
Description
技术领域
本发明属于药品检测领域，具体涉及一种基于荧光微球标记的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡及制备方法。
背景技术
芬太尼，适用于各种疼痛及外科、妇科等手术后和手术过程中的镇痛；也用于防止或减轻手术后出现的谵妄；还可与麻醉药合用，作为麻醉辅助用药；与氟哌利多配伍制成“安定镇痛剂”，用于大面积换药及进行小手术的镇痛。
2019年4月1日，公安部、国家卫生健康委、国家药监局联合发布公告，宣布从2019年5月1日起将芬太尼类物质列入《非药用类麻醉药品和精神药品管制品种增补目录》。
本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，适合大批量样品的检测，然而该法不需要专业人员进行操作。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种基于荧光微球标记的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。
本发明的目的之二是提供上述用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，它包括：卡壳、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，反应垫固定在PVC背衬上，结合垫的一端搭接在反应垫的一端上，另一端固定在PVC背衬上，样品垫的一端搭接在结合垫的另一端上，另一端固定在PVC背衬上，吸收垫的一端搭接在反应垫的另一端上，另一端固定在PVC背衬上，检测线和质控线依次设置于反应垫上，其中检测线靠近结合垫的一端，质控线靠近吸收垫的一端，所述的检测线与质控线彼此平行，并且平行于结合垫的搭接端和吸收垫的搭接端，它们之间的距离为5～8mm，其中：所述A检测试纸条的结合垫为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B的玻璃纤维膜，它的检测线为包被有芬太尼类物质人工抗原B，它的质控线为包被有羊抗兔抗体。
本发明的一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其中：所述的芬太尼类物质人工抗原A为含有N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)结构的物质-载体蛋白偶联物；芬太尼类物质人工抗原B为含有N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)结构的物质-载体蛋白偶联物。
本发明的一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其中：所述的芬太尼类物质人工抗原A和芬太尼类物质人工抗原B中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述羊抗兔抗体为能捕获荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体的羊抗兔IgG；荧光微球为水溶性荧光微球，所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm～650nm，粒径为100～300nm。
本发明的一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其中：所述A检测试纸条的结合垫和B检测试纸条的结合垫中的抗芬太尼类物质特异性抗体A和抗芬太尼类物质特异性抗体B的特异性和灵敏度不同；所述样本垫为玻璃纤维膜；吸收垫为吸水纸；反应垫为硝酸纤维素膜。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：它包括以下步骤：
(a)将N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原A；
将N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)经过取代与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原B；
(b)用荧光微球分别标记抗芬太尼类物质抗体A和抗芬太尼类物质抗体B，得到荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B；
(c)用步骤(b)制备得到的荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B分别包被在结合垫上，得到A检测试纸条的结合垫和B检测试纸条的结合垫；
(d)在两个反应垫上分别设置一条检测线和一条质控线，用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原A包被上述其中一个反应垫的检测线，用羊抗兔抗体包被上述反应垫的质控线，制备得到A检测试纸条的反应垫；用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原B包被上述其中另一个反应垫的检测线，用羊抗兔抗体包被上述反应垫的质控线，制备得到B检测试纸条的反应垫；
(e)在PVC背衬上粘附A检测试纸条的反应垫，在上述反应垫的两端分别搭接有A检测试纸条的结合垫的一端和吸收垫的一端，在上述结合垫的另一端搭接有样品垫，即得A检测试纸，将上述A检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，最终得到A检测试纸条；
在PVC背衬上粘附B检测试纸条的反应垫，在上述反应垫的两端分别搭接有B检测试纸条的结合垫的一端和吸收垫的一端，在上述结合垫的另一端搭接有样品垫，即得B检测试纸，将上述B检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬、样品垫、结合垫、检测线、质控线、反应垫和吸收垫，最终得到B检测试纸条；
(f)将步骤(e)得到的A检测试纸条和B检测试纸条固定在卡壳(8)上，得到用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原A的具体制备方法为：取20mg羧甲基羟胺半盐酸盐(简称：CMO)用1mL吡啶充分溶解得到a液；取5mg的N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)用1mL甲醇溶解得到b液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到c液；取30mg的载体蛋白用2mL的0.05MpH7.4磷酸盐缓冲溶液溶解得到d液；
先将上述a液与b液以1:1的比例混合，并在70℃水浴下反应6～8小时，反应完成后用氮气吹干，再加入1mL的去离子水和0.2mL的0.1M的HCl溶液震荡3min后，加入3mL的乙酸乙酯萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的c液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的d液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后，即得芬太尼类物质人工抗原A；
步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原B的具体制备方法为：取3mg的4-氯丁酸(CAS号：627-00-9)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)充分溶解得到e液；取6.5mg的N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解得到f液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到g液；取30mg的载体蛋白用2mL0.05M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解得到h液；
先将上述e液与f液以1:1的比例混合，并在60℃水浴下反应6～8小时，反应完后氮气吹干，再加入2mL的去离子水震荡混匀3min后，加入5mL乙酸乙酯震荡萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的g液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的h液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后即得芬太尼类物质人工抗原B；上述步骤(d)所述的A检测试纸条和B检测试纸条的人工抗原包被检测线(3)的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线(5)的包被浓度为0.5～1μg/cm2；步骤(b)中所述的荧光微球的浓度为1～2μg/ml；上述步骤(e)中，所述的A检测试纸条和B检测试纸条的宽度为2.5～3.5mm
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：所述抗芬太尼类物质特异性抗体A的制备方法包括：
(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体A血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原A的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原A与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原A，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原A对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原A，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NaHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和5.844gNaCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原A
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤上述柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱体；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原A，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NaCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体A。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：所述抗芬太尼类物质特异性抗体B的制备方法包括：
(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体B血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原B的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原B与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原B，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原B对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原B，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NBHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和5.844gNBCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原B
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤上述柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱体；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原B，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NBCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)、上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)、平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体B。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：
用荧光微球标记抗芬太尼类物质抗体A或抗芬太尼类物质抗体B的方法包括：在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾将荧光微球的pH值调至8.2，然后按1～2μg/ml的比例将荧光微球标记物分别加入到芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B中，继续搅拌30min，再加入1％的酪蛋白致使荧光微球浓度为0.1％，在静置30min后，在转速为12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀并用复溶缓冲液洗涤两次后，再将初始荧光微球标记物体积的1/20的上述复溶缓冲液分别加入到荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B沉淀重悬，在4℃下贮存备用；所述复溶缓冲液由2.8g Na2HPO4·12H2O、0.2gNaH2PO4·2H2O、8.5g NaCl、10g牛血清白蛋白、10g海藻糖和1mL Proclin 300组成，再用800mL去离子水充分溶解后，将其pH值调节至7.4，最后用去离子水定容至1L，得到复溶缓冲液；
用荧光微球标记的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B包被结合垫方法包括：将玻璃纤维膜浸泡于含有0.1-1.5％的牛血清白蛋白的0.05M pH值7.4的磷酸盐缓冲液中浸湿30秒，然后在温度37℃下烘2h；再用点膜仪将制备好的荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B分别均匀包被在两个玻璃纤维膜上，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其中：
在反应垫上包被检测线方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将人工抗原A或人工抗原B稀释到1mg/mL，用点膜仪将其分别包被于两个硝酸纤维素膜上作为检测线，包被量为0.8μg/cm2，检测线距结合垫的端部8-10mm；
在反应垫上包被质控线的方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释到500μg/ml，用点膜仪将其包被在上述两个纤维素膜上作为质控线，包被量为0.8μg/cm2，再用含0.1％牛血清的0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液进行封闭，质控线距吸收垫端部8-10mm，包被后于37℃烘干并封装。
检测时，样品被滴入样品垫时，当芬太尼类物质在样品中浓度低时，荧光微球抗体在层析过程中会被固定在反应垫上的人工抗原结合，在紫外灯下观察检测线和质控线会变为红色，呈阴性；如果芬太尼类物质在样品中浓度高时，因为竞争反应，荧光微球抗体与样品中的芬太尼类物质全部结合，检测线上缺乏荧光微球抗体与人工抗原结合，因此检测线不会变为红色，仅质控线变为红色，呈阳性。需要注意到是，当质控线没有变为红色时，无论检测线是否变为红色，该次检测应判为无效。
本发明的有益效果
1、本发明提供的检测试纸，样本垫部分盖住结合垫的设计，延长了检测结果的观察时间，同时样本垫可以将检测液体充分吸收，与抗体完全接触充分反应、减少误差；
2、本发明的提供的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡价格低廉，操作简单，无需专业人员即可操作，检测不受场地限制，同时检测时间短，当场就能快速得到检测结果，适用于大批样品的检测；
3、本发明提供的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡实现国家列管的27种芬太尼类物质的快速检测，全覆盖，检测灵敏度高。可全覆盖快速检测国家列管的27种芬太尼类物质见下表所示：
附图说明
图1为本发明用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡中A检测试纸条和B检测试纸条的剖面示意图；
图2显示了本发明的五种检测结果分析的示意图。
在图1和图2中，标号1为样品垫；标号2为结合垫；标号3为检测线；标号4为反应垫；标号5为；标号6为吸收垫；标号7为PVC背衬；标号8为卡壳。
具体实施方式
如图1所示，本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡包括：卡壳8、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬7、样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线5、反应垫4和吸收垫6，反应垫4固定在PVC背衬7上，结合垫2的一端搭接在反应垫4的一端上，另一端固定在PVC背衬7上，样品垫1的一端搭接在结合垫2的另一端上，另一端固定在PVC背衬7上，吸收垫6的一端搭接在反应垫4的另一端上，另一端固定在PVC背衬7上，检测线3和质控线5依次设置于反应垫4上，其中检测线3靠近结合垫2的一端，质控线5靠近吸收垫6的一端，所述的检测线3与质控线5彼此平行，并且平行于结合垫2的搭接端和吸收垫6的搭接端，它们之间的距离为5～8mm，其特征在于：所述A检测试纸条的结合垫2为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线3为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线5为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫2为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B的玻璃纤维膜，它的检测线3为包被有芬太尼类物质人工抗原B，它的质控线5为包被有羊抗兔抗体。A检测试纸条的结合垫2和B检测试纸条的结合垫2中的抗芬太尼类物质特异性抗体A和抗芬太尼类物质特异性抗体B的特异性和灵敏度不同，样本垫1为玻璃纤维膜；吸收垫6为吸水纸；反应垫4为硝酸纤维素膜。
芬太尼类物质人工抗原A为含有N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)结构的物质-载体蛋白偶联物；芬太尼类物质人工抗原B为含有N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)结构的物质-载体蛋白偶联物，芬太尼类物质人工抗原A和芬太尼类物质人工抗原B中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸中的一种，羊抗兔抗体为能捕获荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体的羊抗兔IgG；荧光微球为水溶性荧光微球，所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm～650nm，粒径为100～300nm。
本发明的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法包括以下步骤：
(a)将N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原A；
将N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)经过取代与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原B；
(b)用荧光微球分别标记抗芬太尼类物质抗体A和抗芬太尼类物质抗体B，得到荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B；
(c)用步骤(b)制备得到的荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B分别包被在结合垫2上，得到A检测试纸条的结合垫2和B检测试纸条的结合垫2；
(d)在两个反应垫2上分别设置一条检测线3和一条质控线5，用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原A包被上述其中一个反应垫2的检测线3，用羊抗兔抗体包被上述反应垫2的质控线5，制备得到A检测试纸条的反应垫4；用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原B包被上述其中另一个反应垫2的检测线3，用羊抗兔抗体包被上述反应垫2的质控线5，制备得到B检测试纸条的反应垫4；
(e)在PVC背衬7上粘附A检测试纸条的反应垫4，在上述反应垫4的两端分别搭接有A检测试纸条的结合垫2的一端和吸收垫6的一端，在上述结合垫2的另一端搭接有样品垫1，即得A检测试纸，将上述A检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬7、样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线5、反应垫4和吸收垫6，最终得到A检测试纸条；
在PVC背衬7上粘附B检测试纸条的反应垫4，在上述反应垫4的两端分别搭接有B检测试纸条的结合垫2的一端和吸收垫6的一端，在上述结合垫2的另一端搭接有样品垫1，即得B检测试纸，将上述B检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬7、样品垫1、结合垫2、检测线3、质控线5、反应垫4和吸收垫6，最终得到B检测试纸条；
(f)将步骤(e)得到的A检测试纸条和B检测试纸条固定在卡壳8上，得到用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。
其中步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原A的具体制备方法为：取20mg羧甲基羟胺半盐酸盐(简称：CMO)用1mL吡啶充分溶解得到a液；取5mg的N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮(CAS号：39742-60-4)用1mL甲醇溶解得到b液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到c液；取30mg的载体蛋白用2mL的0.05MpH7.4磷酸盐缓冲溶液溶解得到d液；
先将上述a液与b液以1:1的比例混合，并在70℃水浴下反应6～8小时，反应完成后用氮气吹干，再加入1mL的去离子水和0.2mL的0.1M的HCl溶液震荡3min后，加入3mL的乙酸乙酯萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的c液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的d液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后，即得芬太尼类物质人工抗原A；
其中步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原B的具体制备方法为：取3mg的4-氯丁酸(CAS号：627-00-9)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)充分溶解得到e液；取6.5mg的N-[4-(methoxymethyl)piperidin-4-yl]-N-phenylpropionamide(CAS号：61086-18-8)用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称：DMF)溶解得到f液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称：EDC)和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺(简称：NHS)用2mL的去离子水溶解得到g液；取30mg的载体蛋白用2mL0.05M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解得到h液；
先将上述e液与f液以1:1的比例混合，并在60℃水浴下反应6～8小时，反应完后氮气吹干，再加入2mL的去离子水震荡混匀3min后，加入5mL乙酸乙酯震荡萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺(简称DMF)溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的g液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的h液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后即得芬太尼类物质人工抗原B；上述步骤(d)所述的A检测试纸条和B检测试纸条的人工抗原包被检测线(3)的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线(5)的包被浓度为0.5～1μg/cm2；步骤(b)中所述的荧光微球的浓度为1～2μg/ml；上述步骤(e)中，所述的A检测试纸条和B检测试纸条的宽度为2.5～3.5mm
抗芬太尼类物质特异性抗体A的制备方法包括：
(一)、带有抗芬太尼类物质特异性抗体A血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原A的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原A与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原A，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原A对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原A，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NaHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和5.844gNaCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原A
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤上述柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱体；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原A，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NaCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体A。
抗芬太尼类物质特异性抗体B的制备方法包括：
(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体B血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原B的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原B与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原B，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原B对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原B，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NBHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和5.844gNBCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原B
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤上述柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱体；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原B，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NBCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体B。
用荧光微球标记抗芬太尼类物质抗体A或抗芬太尼类物质抗体B的方法包括：在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾将荧光微球的pH值调至8.2，然后按1～2μg/ml的比例将荧光微球标记物分别加入到芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B中，继续搅拌30min，再加入1％的酪蛋白致使荧光微球浓度为0.1％，在静置30min后，在转速为12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀并用复溶缓冲液洗涤两次后，再将初始荧光微球标记物体积的1/20的上述复溶缓冲液分别加入到荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B沉淀重悬，在4℃下贮存备用；所述复溶缓冲液由2.8g Na2HPO4·12H2O、0.2gNaH2PO4·2H2O、8.5g NaCl、10g牛血清白蛋白、10g海藻糖和1mL Proclin 300组成，再用800mL去离子水充分溶解后，将其pH值调节至7.4，最后用去离子水定容至1L，得到复溶缓冲液；
用荧光微球标记的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B包被结合垫2方法包括：将玻璃纤维膜浸泡于含有0.1-1.5％的牛血清白蛋白的0.05M pH值7.4的磷酸盐缓冲液中浸湿30秒，然后在温度37℃下烘2h；再用点膜仪将制备好的荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B分别均匀包被在两个玻璃纤维膜上，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
在反应垫4上包被检测线3方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将人工抗原A或人工抗原B稀释到1mg/mL，用点膜仪将其分别包被于两个硝酸纤维素膜上作为检测线3，包被量为0.8μg/cm2，检测线3距结合垫2的端部8-10mm；
在反应垫4上包被质控线5的方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释到500μg/ml，用点膜仪将其包被在上述两个纤维素膜上作为质控线5，包被量为0.8μg/cm2，再用含0.1％牛血清的0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液进行封闭，质控线5距吸收垫6端部8-10mm，包被后于37℃烘干并封装。
本实施例检测了不同种类的芬太尼类物质的检测过程包括：
(1)样本前处理：将不同种类的芬太尼类物质用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液稀释成终浓度为5ppb、50ppb和500ppb；
(2)将步骤(1)处理后的样品用滴管滴入A检测试纸条和B检测试纸条的样品垫1上，每次滴加3滴，加后计时，8min后采用干式荧光分析仪器检测，超过15min的样品检测判读无效；
(3)采用干式荧光分析仪器检测A检测试纸条和B检测试纸条中检测线3(在图2和表1中标记为T)和控制线5(在图2和表1中标记为C)的荧光强度值，按照检测线3荧光强度值与控制线5荧光强度值的T/C比值，判断检测结果，具体判断如下所示：
阴性：如果A检测试纸条和B检测试纸条均显示检测线3荧光强度值与控制线5荧光强度值的T/C比值≥1.0，表示样品中芬太尼类药物未达到检出限，如图2的(a)所示；
阳性：如果A检测试纸条和B检测试纸条任意一个或者全部显示检测线3荧光强度值与控制线5荧光强度值的比值T/C<1.0，表示样品中芬太尼类药物超过检出限，如图2的(b)和(c)所示；
无效：当质控线5不显示数值或者颜色，则无论检测线3是否显示数值或者颜色，如图2的(d)所示，该次检测结果判为无效。
(4)数据显示一种基于荧光微球标记的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡在药物浓度为5～500ng/ml时，可检测出我国列管的27种芬太尼类物质，参见表1，表1为使用检测卡壳检测不同种类的芬太尼类物质的结果。其中：备注：“+”表示为阳性；“-”表示为阴性。
在以上所述的案例仅仅是本发明专利的优选使用案例，本发明专利并不用于限制上述所呈现的优选案例，对于从事相关领域的不同研究技术人员可以理解，在本发明专利的基础上可以在形式上和细节上对其作各种改变。凡在本发明专利的精神和范围之中，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，它包括：卡壳(8)、A检测试纸条和B检测试纸条，A检测试纸条和B检测试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，反应垫(4)固定在PVC背衬(7)上，结合垫(2)的一端搭接在反应垫(4)的一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，样品垫(1)的一端搭接在结合垫(2)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，吸收垫(6)的一端搭接在反应垫(4)的另一端上，另一端固定在PVC背衬(7)上，检测线(3)和质控线(5)依次设置于反应垫(4)上，其中检测线(3)靠近结合垫(2)的一端，质控线(5)靠近吸收垫(6)的一端，所述的检测线(3)与质控线(5)彼此平行，并且平行于结合垫(2)的搭接端和吸收垫(6)的搭接端，它们之间的距离为5～8mm，所述A检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A的玻璃纤维膜，它的检测线(3)为包被有芬太尼类物质人工抗原A，它的质控线(5)为包被有羊抗兔抗体；B检测试纸条的结合垫(2)为涂覆有荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B的玻璃纤维膜，它的检测线(3)为包被有芬太尼类物质人工抗原B，它的质控线(5)为包被有羊抗兔抗体,其特征在于：所述的芬太尼类物质人工抗原A为N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮-载体蛋白偶联物，抗芬太尼类物质特异性抗体A为以芬太尼类物质人工抗原A为抗原，采用免疫兔子的方法获得的抗芬太尼类物质特异性抗体A；芬太尼类物质人工抗原B为N-[4-(甲氧基甲基)哌啶-4-基]-N-苯基丙酰胺-载体蛋白偶联物，抗芬太尼类物质特异性抗体B为以芬太尼类物质人工抗原B为抗原，采用免疫兔子的方法获得的抗芬太尼类物质特异性抗体B。
2.根据权利要求1所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其特征在于：所述的芬太尼类物质人工抗原A和芬太尼类物质人工抗原B中的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白、卵清蛋白、铁蛋白或多聚赖氨酸中的一种；所述羊抗兔抗体为能捕获荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体的羊抗兔IgG；荧光微球为水溶性荧光微球，所述水溶性荧光微球的发射波长为450nm～650nm，粒径为100～300nm。
3.根据权利要求2所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡，其特征在于：所述A检测试纸条的结合垫(2)和B检测试纸条的结合垫(2)中的抗芬太尼类物质特异性抗体A和抗芬太尼类物质特异性抗体B的特异性和灵敏度不同；所述样品垫(1)为玻璃纤维膜；吸收垫(6)为吸水纸；反应垫(4)为硝酸纤维素膜。
4.如权利要求3所述的用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：(a)将N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮经过肟化与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原A；
(a)将N-[4-(甲氧基甲基)哌啶-4-基]-N-苯基丙酰胺经过取代与还原反应后，与载体蛋白偶联，制备得到芬太尼类物质人工抗原B；
(b)用荧光微球分别标记抗芬太尼类物质抗体A和抗芬太尼类物质抗体B，得到荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B；
(c)用步骤(b)制备得到的荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体A和荧光微球标记的抗芬太尼类物质特异性抗体B分别包被在结合垫(2)上，得到A检测试纸条的结合垫(2)和B检测试纸条的结合垫(2)；
(d)在两个反应垫(4)上分别设置一条检测线(3)和一条质控线(5)，用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原A包被上述其中一个反应垫(4)的检测线(3)，用羊抗兔抗体包被上述反应垫(4)的质控线(5)，制备得到A检测试纸条的反应垫(4)；用步骤(a)制备得到的芬太尼类物质人工抗原B包被上述其中另一个反应垫(4)的检测线(3)，用羊抗兔抗体包被上述反应垫(4)的质控线(5)，制备得到B检测试纸条的反应垫(4)；
(e)在PVC背衬(7)上粘附A检测试纸条的反应垫(4)，在上述反应垫(4)的两端分别搭接有A检测试纸条的结合垫(2)的一端和吸收垫(6)的一端，在上述结合垫(2)的另一端搭接有样品垫(1)，即得A检测试纸，将上述A检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，最终得到A检测试纸条；在PVC背衬(7)上粘附B检测试纸条的反应垫(4)，在上述反应垫(4)的两端分别搭接有B检测试纸条的结合垫(2)的一端和吸收垫(6)的一端，在上述结合垫(2)的另一端搭接有样品垫(1)，即得B检测试纸，将上述B检测试纸沿着其纵向进行切割成，使得切割下来的每条试纸条均包括：PVC背衬(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、检测线(3)、质控线(5)、反应垫(4)和吸收垫(6)，最终得到B检测试纸条；
(f)将步骤(e)得到的A检测试纸条和B检测试纸条固定在卡壳(8)上，得到用于芬太尼类物质快速筛查的荧光免疫快检卡。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原A的具体制备方法为：取20mg羧甲基羟胺半盐酸盐用1mL吡啶充分溶解得到a液；取5mg的N-(2-苯乙基)-4-哌啶酮用1mL甲醇溶解得到b液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺用2mL的去离子水溶解得到c液；取30mg的载体蛋白用2mL的0.05MpH7.4磷酸盐缓冲溶液溶解得到d液；先将上述a液与b液以1:1的比例混合，并在70℃水浴下反应6～8小时，反应完成后用氮气吹干，再加入1mL的去离子水和0.2mL的0.1M的HCl溶液震荡3min后，加入3mL的乙酸乙酯萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的c液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的d液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后，即得芬太尼类物质人工抗原A；
步骤(a)所述的芬太尼类物质人工抗原B的具体制备方法为：取3mg的4-氯丁酸用1mL的N,N-二甲基甲酰胺充分溶解得到e液；取6.5mg的N-[4-(甲氧基甲基)哌啶-4-基]-N-苯基丙酰胺用1mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解得到f液；取150mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和43.2mg的N-羟基琥珀酰亚胺用2mL的去离子水溶解得到g液；取30mg的载体蛋白用2mL0.05M、pH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解得到h液；
先将上述e液与f液以1:1的比例混合，并在60℃水浴下反应6～8小时，反应完后氮气吹干，再加入2mL的去离子水震荡混匀3min后，加入5mL乙酸乙酯震荡萃取5min，再静置2min后取上层液体进行氮气吹干，吹干后用1mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，再将上述溶液中缓慢地滴加2mL的g液，边滴加边搅拌，于室温条件下反应16小时，最后在搅拌下逐渐加入2mL的h液，于室温条件下反应4小时后，再缓慢加入0.5mL的8mg/ml的硼氢化钠溶液，于室温条件下反应2小时，反应完成后，用1000ml的0.05M、pH7.4磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，其中每隔6-8小时换液一次，透析完成后即得芬太尼类物质人工抗原B；上述步骤(d)所述的A检测试纸条和B检测试纸条的人工抗原包被检测线(3)的包被浓度为0.5～1μg/cm2，羊抗兔抗体包被质控线(5)的包被浓度为0.5～1μg/cm2；步骤(b)中所述的荧光微球的浓度为1～2μg/ml；上述步骤(e)中，所述的A检测试纸条和B检测试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述抗芬太尼类物质特异性抗体A的制备方法包括：
(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体A血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原A的浓度调整至1mg/mL；取人工抗原A与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原A，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原A对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原A，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的制备
(5)配制以下溶液
(5.1)配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NaHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)、配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和
5.844gNaCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原A
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱料；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原A，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NaCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体A的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原A免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体A。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述抗芬太尼类物质特异性抗体B的制备方法包括：(一)带有抗芬太尼类物质特异性抗体B血液的制备
(1)挑选一只6周大小的健康新西兰大白兔，每只约2Kg，使其适应新的生活环境，即继续饲养一周；
(2)用pH为7.0的0.01mol/L PBS缓冲液将上述芬太尼类物质人工抗原B的浓度调整至
1mg/mL；取人工抗原B与等体积的弗氏完全佐剂进行混匀，乳化成油包水状态，得到注射芬太尼类物质人工抗原B，取1mg注射芬太尼类物质人工抗原B对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行第一次注射免疫；
(3)在第一次注射免疫完成后，每隔3～4周，取0.4mg注射芬太尼类物质人工抗原B，对上述新西兰大白兔的多点颈背部皮下和多点腿部肌肉进行一次注射免疫，一共累计注射免疫4-5次；
(4)在最后一次注射免疫后的3周后，从上述新西兰大白兔的心脏中取5ml血液；
(二)芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的制备
(5)、配制以下溶液
(5.1)、配制碳酸氢钠溶液
量取42.005g的pH＝8.3、浓度为0.1M的NBHCO3溶液，加入超纯水5000mL后，用HCl调节pH至8.3后定容至5000mL，得到碳酸氢钠溶液；
(5.2)配制盐酸溶液
量取83.33μL、浓度为1mM的浓盐酸滴入超纯水中，最终定容至1000mL；
(5.3)配制Tris-HCl缓冲液
量取12.114g的pH＝8.0、浓度为0.1M的Tris溶液，加入超纯水900mL后，用浓HCl调节pH至8.0后定容至1000mL；
(5.4)配制醋酸缓冲液
量取5.095g的pH＝4.0、浓度为0.1M冰醋酸溶液，然后加入醋酸钠2.062g和
5.844gNBCl，最后用超纯水定容至1000mL；
(6)用琼脂糖凝胶偶联芬太尼类物质人工抗原B
(6.1)秤取1g琼脂糖凝胶，将之悬浮于步骤(5.2)配制的盐酸溶液中，在20-30min后，1g琼脂糖凝胶溶胀成3.5mL的柱料，，在溶胀后的15min内，用200mL的上述盐酸溶液洗涤上述柱料，以避免柱料干燥；
(6.2)洗涤完成后，用17.5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液平衡上述柱料；
(6.3)取平衡后的1mL柱料与5mg芬太尼类物质人工抗原B，在温度4℃下振荡并过夜，得到偶联好的柱料；
(6.4)次日将偶联好的柱料装柱，用5mL的步骤(5.1)配制碳酸氢钠溶液对偶联好的柱料进行洗涤；
(6.5)用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后在室温下放置2h或在温度为4℃下过夜，最后对柱料进行封闭；
(6.6)封闭后，分别用5mL的步骤(5.4)配制的醋酸缓冲液和用5mL的步骤(5.3)配制的Tris-HCl缓冲液依次对上述柱料进行洗涤，一共洗涤3次，洗涤后再用5mL的pH＝7.4的PBS缓冲液对上述柱料进行洗涤，然后置于4℃下保存，得到芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料；
(三)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(7)配制以下溶液
(7.1)配制磷酸盐缓冲液
量取0.99g、pH＝7.4的50mM磷酸二氢钠的溶液，然后加入5.16g的磷酸氢二钠和8.0g的氯化钠，最后加入超纯水至1000mL；
(7.2)配制Tris-HCl缓冲液
量取6.057g、pH＝9.0的Tris溶液后，加入超纯水900mL，再用浓HCl调节pH＝9.0后定容至1000mL；
(7.3)配制Gly-HCl缓冲液
准确秤取3.7535g的Gly，并加入4.095g NBCl，然后加入超纯水900mL，用浓HCl调节pH＝3.0后定容至1000mL；
(7.4)配制尿素溶液
秤取240.24g尿素，加入超纯水定容至500mL；
(8)抗芬太尼类物质特异性抗体B的亲和纯化
(8.1)将步骤(6.6)制备好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱的柱料，装填入免疫层析柱管中，用去离子水压实；
(8.2)用3倍于柱料体积的步骤(7.4)配制尿素溶液冲洗上述柱料；
(8.3)冲洗完后，用10倍于柱料体积的去离子水继续冲洗柱料，完成后，用3倍于柱料体积的、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料，得到处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱；
(8.4)将步骤(4)取出的5ml血液，用25ml的步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液进行稀释后，再用0.45μM的滤膜进行过滤，过滤完后的液体加入到上述处理好的芬太尼类物质人工抗原B免疫亲和柱中上样，上样速度为0.5滴/s；
(8.5)上样完成后，用10倍于柱料体积、步骤(7.1)配制磷酸盐缓冲液平衡上述柱料；
(8.6)平衡完成后，用5倍于柱料体积、步骤(7.3)配制Gly-HCl缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，再用步骤(7.2)配制Tris-HCl缓冲液对洗脱液的pH调节至7.0，最后用紫外可见分光光度计来测定收集液体抗体浓度的OD280值；
(8.7)将收集到的洗脱液用透析袋装好后，放入pH为8.0的0.01mol/L PBS的缓冲液中透析3～5天，透析完成后在温度-20℃下保存，得到抗芬太尼类物质特异性抗体B。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：
用荧光微球标记抗芬太尼类物质抗体A或抗芬太尼类物质抗体B的方法包括：在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾将荧光微球的pH值调至8.2，然后按1～2μg/ml的比例将荧光微球标记物分别加入到芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B中，继续搅拌30min，再加入1％的酪蛋白致使荧光微球浓度为0.1％，在静置30min后，在转速为12000rpm、4℃下离心30min，弃上清液，沉淀并用复溶缓冲液洗涤两次后，再将初始荧光微球标记物体积的1/20的上述复溶缓冲液分别加入到荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B沉淀重悬，在4℃下贮存备用；所述复溶缓冲液由2.8g Na2HPO4·12H2O、0.2gNaH2PO4·2H2O、8.5g NaCl、10g牛血清白蛋白、10g海藻糖和1mL Proclin 300组成，再用800mL去离子水充分溶解后，将其pH值调节至7.4，最后用去离子水定容至1L，得到复溶缓冲液；用荧光微球标记的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B包被结合垫(2)方法包括：将玻璃纤维膜浸泡于含有0.1-1.5％的牛血清白蛋白的0.05M pH值7.4的磷酸盐缓冲液中浸湿30秒，然后在温度37℃下烘2h；再用点膜仪将制备好的荧光微球标记物的芬太尼类物质特异性抗体A或抗芬太尼类物质抗体B分别均匀包被在两个玻璃纤维膜上，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：
在反应垫(4)上包被检测线(3)方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将人工抗原A或人工抗原B稀释到1mg/mL，用点膜仪将其分别包被于两个硝酸纤维素膜上作为检测线(3)，包被量为0.8μg/cm2，检测线(3)距结合垫(2)的端部8-10mm；在反应垫(4)上包被质控线(5)的方法包括：用0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液将羊抗兔IgG抗体稀释到500μg/ml，用点膜仪将其包被在上述两个纤维素膜上作为质控线(5)，包被量0.8μg/cm2，再用含0.1％牛血清的0.05M pH值7.4的磷酸缓冲液进行封闭，质控线(5)距吸收垫(6)端部8-10mm，包被后于37℃烘干并封装。
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