CN108314710A

CN108314710A - 肺炎支原体重组抗原及其应用

Info

Publication number: CN108314710A
Application number: CN201810098248.4A
Authority: CN
Inventors: 朱碧银; 刘春艳; 罗沛; 黄荣生; 杨耿周; 魏钟杰; 覃素妮; 吴仁贞; 宗雪; 陈洁
Original assignee: Fei Peng Biological Co Ltd
Current assignee: Guangdong Weishi Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-01-31
Also published as: CN108314710B

Abstract

本发明涉及一种肺炎支原体重组抗原及其应用，上述肺炎支原体重组抗原包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段。实验结果表明，该重组抗原经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。能够大大减少检测时抗原的配对筛选工作，检测肺炎支原体时检出率高、特异性较高。

Description

肺炎支原体重组抗原及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种肺炎支原体重组抗原及其应用。

背景技术

肺炎支原体(MycoplasmaPneumoniac，Mp)是一种病原性支原体，由它引起的原发性非典型肺炎约占非细菌性肺炎的1/2，且近年来Mp感染的发病率呈上升趋势。除原发性非典型肺炎之外，Mp尚能引起其它呼吸道感染性疾病如支气管炎、咽炎等，以及神经系统、血液系统、心血管系统以及皮肤、肌肉、关节等并发症。普通人群中约30％的肺炎是由肺炎支原体引起的，Mp感染引起的呼吸道损害及各种肺外并发症已引起广泛关注。

肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验。标本可采可疑病人的痰或咽试子，接种于含血清或酵母浸膏的琼脂培养基中，5～10天后观察有无直径30～100μm的圆形房顶样菌落。多次传代后可变为典型的“荷包蛋”样菌落，并能吸附多种动物红细胞和气管上皮细胞、HeLa细胞等，且此类吸附可被特异性抗体所抑制。分离的支原体经形态、溶血与生化反应作初步鉴定后需进一步用特异性抗血清作生长抑制试验和代谢抑制试验。用患者血清与支原体脂质抗原作补体结合试验，恢复期较急性期效价高4倍以上具有诊断价值。亦可用间接免疫荧光试验、间接血凝ELISA检测标本。

肺炎支原体抗体分为IgG抗体和IgM抗体两种，人类感染Mp后，因为肺炎支原体感染的潜伏期为2周～3周，大约7～10天出现IgM抗体，20天左右出现IgG抗体。当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此，IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。但如IgM抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测IgG抗体。IgG较IgM出现晚，需动态观察，如显著升高提示近期感染，显著降低说明处于感染后期。但是，检测到Mp特异性IgM并不能表明患者处于急性感染期，因为在感染后一年内，特异性IgM仍能持续升高。此外，大约20％的成年人再次感染Mp后，其特异性IgM抗体滴度很低，有时几乎检测不到。因此，在Mp的血清学诊断方法中，若能在检测中检测总抗体，则可较好地辅助Mp的临床诊断。

目前我国Mp发病率在持续上升，然而目前临床血清学检测很大部分是使用了Mp天然抗原，但是天然抗原价格昂贵，且提取天然抗原时步骤繁琐、无确定产量、且对人体危险性高，所以需要研究重组抗原为基础性的Mp生物学研究和研发快捷、准确的Mp检测试剂盒奠定基础。

然而传统的具有多个抗原表位的肺炎支原体重组抗原，很难根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。抗原的配对筛选工作繁琐，用于检测肺炎支原体时检出率低、特异性较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种具有多个抗原表位，且能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位的肺炎支原体重组抗原及其应用。

一种肺炎支原体重组抗原，包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段，所述P1A片段位于所述重组抗原的C端，所述P30片段位于所述重组抗原的N端，所述P1A片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸，所述P1B片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸，所述P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸。

在一个实施方式中，所述重组抗原为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，

(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述重组抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一个实施方式中，所述重组抗原为：

(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，

(b)在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述重组抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。

一种表达基因，所述表达基因能够表达肺炎支原体重组抗原，所述重组抗原包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段，所述P1A片段位于所述重组抗原的C端，所述P30片段位于所述重组抗原的N端，所述P1A片段包括肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸，所述P1B片段包括肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸，所述P30片段包括肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸。

在一个实施方式中，所述表达基因为：

(a)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或，

(b)在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述重组抗原活性的核苷酸序列。

一种表达载体，所述表达载体中含有上述的表达基因。

一种宿主表达菌，所述宿主表达菌中转染了上述的表达载体。

一种肺炎支原体的检测试纸，包括支撑薄片、样品垫、标记垫、包被膜以及吸收垫，所述样品垫、所述标记垫、所述包被膜以及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述标记垫部分重叠，所述标记垫与所述包被膜部分重叠，所述包被膜与所述吸收垫部分重叠；

所述标记垫上负载有胶体金标记的MP-1，所述胶体金标记的MP-1由MP-1包附胶体金颗粒形成；

所述包被膜上设有检测区域和质控区域，所述检测区域上负载有MP-2，所述质控区域上负载有IgG抗体；

其中，所述MP-1通过如权利要求1～3任一项所述的重组抗原纯化得到，所述MP-1具有第一抗原优势表位；所述MP-2通过如权利要求1～3任一项所述的重组抗原纯化得到，所述MP-2具有第二抗原优势表位，且所述第一抗原优势表位与所述第二抗原优势表位不完全相同。

在一个实施方式中，所述MP-1通过上述任一项所述的重组抗原采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式得到，所述MP-2通过上述任一项所述的重组抗原采用电洗脱纯化的方式得到。

一种检测试剂盒，包括上述任一项所述的检测试纸。

上述肺炎支原体重组抗原包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段。实验结果表明，P1A片段、P1B片段以及P30片段形成的重组抗原经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。能够大大减少检测时抗原的配对筛选工作，检测肺炎支原体时检出率高、特异性较高。

附图说明

图1为一实施方式的检测试纸的正面示意图；

图2为图1中检测试纸的纵截面示意图；

图3为一实施方式的检测试剂盒的示意图；

图4为纯化得到的MP-1与MP-2以同样的蛋白量上样后得到的电泳图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的肺炎支原体重组抗原包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段。P1A片段位于重组抗原的C端，P30片段位于重组抗原的N端。P1A片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸，P1B片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸，P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸。

具体地，P1A片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸(对应序列表中SEQ ID No.1的第1号～第204号)，P1B片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸(对应序列表中SEQ ID No.1的第210号～第254号)，P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸(对应序列表中SEQ IDNo.1的第260号～第366号)。

该肺炎支原体重组抗原包含了P1蛋白最具检测活性的区段(简称P1A片段和P1B片段)以及P30蛋白最具检测活性的区段(简称P30片段)，具有多个抗原表位。P1A片段与P1B片段通过第一连接肽连接，P1B片段与P30片段通过第二连接肽连接，这种连接顺序使得多个抗原表位不相互影响，能够在宿主细胞中顺利表达肺炎支原体重组抗原。

具体地，第一连接肽和第二连接肽包括至少三个连接氨基酸，每个连接氨基酸均选自甘氨酸(缩写为G)、丝氨酸(缩写为S)和丙氨酸(缩写为A)中的一种。本实施方式中，第一连接肽和第二连接肽分别包括五个连接氨基酸，依次为GGGGS。其他实施方式中，第一连接肽的氨基酸序列还可以为GSGGS、GGGGA等等。甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸的氨基酸残基片段较小，能将P1A片段与P1B，以及P1B片段与P30片段有效的连接，进而表达形成具有多个抗原表位的肺炎支原体重组抗原，又不影响相互的免疫性能。

具体地，肺炎支原体重组抗原为：(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述重组抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。

进一步地，该肺炎支原体重组抗原为：(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，(b)在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有所述重组抗原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本实施方式中，肺炎支原体重组抗原为由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，该肺炎支原体重组抗原由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到。可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有重组抗原活性的蛋白质，或在SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有重组抗原活性的衍生的蛋白，得到的蛋白与肺炎支原体重组抗原没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

具有上述氨基酸序列以及特定的连接方式的肺炎支原体重组抗原，经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。

一实施方式的表达基因，该表达基因能够表达上述任一实施方式的肺炎支原体重组抗原。

具体地，肺炎支原体重组抗原的具体特征请参见上文的描述，在此不作赘述。

具体地，该表达基因为：(a)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或，(b)在SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有重组抗原活性的核苷酸序列。

上述表达基因能够用于表达肺炎支原体重组抗原，该肺炎支原体重组抗原具有多个抗原表位，经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。

此外，本申请还提供一实施方式的表达载体，该表达载体中含有上述表达基因。

在一个实施方式中，该表达载体为含有上述表达基因的pET-32a表达载体，简称重组质粒pET-32a-MP。

该表达载体能够用于表达上述肺炎支原体重组抗原，表达效率高，表达量稳定。

此外，本申请还提供一种实施方式宿主表达菌，宿主表达菌中转染了上述表达载体。

在一个实施方式中，该宿主表达菌为转染了上述表达载体的大肠杆菌BL21。

该宿主表达菌能够用于表达上述肺炎支原体重组抗原，表达效率高，表达量稳定。

此外，本申请还提供一种实施方式的肺炎支原体重组抗原的制备方法，包括如下步骤：

构建肺炎支原体重组抗原的基因表达序列，并对其密码子进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，最终的基因序列通过化学合成的方法获得，并在其上游引物引入BamHI位点，下游引物引入EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA，具体的肺炎支原体重组抗原氨基酸序列见SEQ ID NO1。合成目的片段后，用上下游引物进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-32a中，得到重组质粒pET-32a-MP。将上述构建好的重组质粒pET-32a-MP转化至宿主表达菌BL21，得到重组质粒的表达菌株，备用。然后对重组质粒的表达菌株进行诱导表达，纯化后得到肺炎支原体重组抗原。

在一个实施方式中，采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化，获得具有一种类型的抗原优势表位的肺炎支原体重组抗原。

在一个实施方式中，采用电洗脱纯化的方式对表达后的蛋白进行纯化，获得具有另一种类型的抗原优势表位的肺炎支原体重组抗原。

此外，本申请还提供一实施方式的肺炎支原体的检测试纸100，请参阅图1和图2，肺炎支原体的检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、标记垫130、包被膜140以及吸收垫150。样品垫120、标记垫130、包被膜140以及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上，样品垫120与标记垫130部分重叠，标记垫130与包被膜140部分重叠，包被膜140与吸收垫130部分重叠。标记垫130上负载有胶体金标记的MP-1，胶体金标记的MP-1由MP-1包附胶体金颗粒形成。包被膜140上设有检测区域141和质控区域143，检测区域141上负载有MP-2，质控区域143上负载有IgG抗体。其中，MP-1通过上述的重组抗原纯化得到，MP-1具有第一抗原优势表位。MP-2通过上述的重组抗原纯化得到，MP-2具有第二抗原优势表位，且第一抗原优势表位与第二抗原优势表位不完全相同。

在一个实施方式中，包被膜140为硝酸纤维素膜。

在一个实施方式中，检测区域141和质控区域143均为线状，也可称为检测线、质控线。

在一个实施方式中，MP-1通过上述的重组抗原采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式得到。

在一个实施方式中，MP-2通过上述的重组抗原采用电洗脱纯化的方式得到。

上述检测试纸100利用同一个重组核酸序列表达的蛋白，通过不同的纯化方式得到具有不同免疫反应的重组抗原MP-1和MP-2，并利用该对重组抗原进行双抗原夹心，制备成胶体金快速检测试剂盒，大大减少了抗原配对的筛选工作，且能同时满足高检出率和高特异性的需求。

此外，本申请还提供一实施的检测试剂盒20，请参阅图3，检测试剂盒20包括上述的检测试纸100。

具体地，检测试剂盒20包括壳体200以及置于壳体200内的检测试纸100。

在一个实施方式中，检测试纸100置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测区域141和质控区域143对应在观察窗220的位置，方便观察。

上述检测试剂盒20利用双抗原夹心法来检测被检材料中的是否含有肺炎支原体的特异性抗体。检测时，特异性抗体先和标记垫130上的胶体金标记的Mp重组抗原MP-1结合形成胶体金标记的Mp重组抗原-抗体复合物，由于毛细管作用，胶体金标记的Mp重组抗原-抗体复合物沿包被膜140向前泳动，到达检测线160时，胶体金标记的Mp重组抗原-抗体复合物会与包被在包被膜140上的检测区域141的Mp重组抗原MP-2结合，形成胶体金标记的Mp重组抗原-抗体-Mp重组抗原的复合物，从而富集在检测区域141上，形成红色沉淀线。未结合特异性Mp抗体的胶体金标记的鼠IgG则通过检测区域141，在质控区域143被兔抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控区域140上，形成红色沉淀线。当检测区域141与质控区域143上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有Mp特异性抗体，未结合特异性Mp抗体的胶体金标记的鼠IgG到达检测区域141时，不会形成胶体金标记的Mp重组抗原-抗体-Mp重组抗原的复合物，未结合特异性Mp抗体的胶体金标记的鼠IgG通过质控区域143，仅富集在质控区域143上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。

此外，在其他实施方式中，该检测试剂盒20的结构不限于上文描述。上述肺炎支原体重组抗原除应用在上述胶体金标记的抗体检测试剂盒外，还可以用于其他结构的肺炎支原体检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解，将本实施方式的肺炎支原体重组抗原直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等)，或将本实施方式的肺炎支原体重组抗原作为包被抗原(例如ELISA)，则可用于其他形式的肺炎支原体检测试剂或设备。故本实施方式所制备得到的肺炎支原体重组抗原可广泛适用于制备肺炎支原体检测试剂或设备。

通过使用上述肺炎支原体重组抗原，采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式能够形成具有一种类型的抗原优势表位的重组抗原(MP-1)，采用电洗脱纯化的方式能够形成具有另一种类型的抗原优势表位的重组抗原(MP-2)，经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。利用同一个重组核酸序列表达的蛋白，通过不同的纯化方式得到具有不同免疫反应的重组抗原MP-1和MP-2，大大简化了肺炎支原体抗体检测试剂盒的制备工艺，且将该重组抗原应用于肺炎支原体抗体检测试剂盒中，其表现了比市场同类产品更高的灵敏度和更强的特异性。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。单位mM表示mmol/L，M表示mol/L。

实施例1

1、肺炎支原体重组抗原表达质粒的构建

首先在Genbank中搜集肺炎支原体基因的序列，建立肺炎支原体的基因数据，并且利用计算机软件对其进行分析，获得肺炎支原体粘附蛋白P1(GenBank:AAB95661.1)和粘附蛋白P30(NCBI Reference Sequence:NP_110141.1)最具有检测活性的区段，将P1蛋白最具检测活性的区段(第1219个氨基酸至第1422个氨基酸区段，简称P1A片段，第1583个氨基酸至第1627个氨基酸区段，简称P1B)、以及P30蛋白最具检测活性的区段(第168个氨基酸至第274个氨基酸，简称P30片段)通过连接肽GGGGS串联起来后，串联顺序从C端到N端依次为P1A片段-第一连接肽-P1B片段-第二连接肽-P30片段，并对其密码子进行优化，选择大肠杆菌偏爱的密码子，最终的基因序列通过化学合成的方法获得。并在其上游引物引入BamHI位点，下游引物引入EcoRI位点且EcoRI位点之前带有6个His氨基酸的编码序列以及终止密码TAA，具体的Mp重组抗原氨基酸序列见SEQ ID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2。合成目的片段后，用上下游引物进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收(本发明所使用的分子生物学提取和回收试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司)之后，用BamHI和EcoRI酶切(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表达载体pET-32a(购自Novagen公司)中，得到重组质粒pET-32a-MP，即用于表达Mp重组抗原MP-1和MP-2的重组质粒。将上述构建好的重组质粒pET-32a-MP转化至宿主表达菌BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，得到重组质粒的表达菌株，备用。

2、肺炎支原体重组抗原的原核表达

Buffer A的配制：20mM Tris-HCl，1mM EDTA，50mM NaCl，0.01％Triton X-100，pH8.0。

将上述宿主表达菌接种于含100μg/mL氨苄青霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司，以下简称生工)的500mL LB培养基，置于37度200rpm摇床过夜培养至菌体浓度为OD600＝2.1～2.6，加入IPTG(终浓度为0.5mM)进行诱导，190rpm，37度诱导约4h，4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，分离上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白为包涵体表达，保留沉淀进行后续处理。沉淀用Buffer A洗杂3次，12000rpm×15min，去上清，沉淀用6M尿素+20mMTris(pH8.0)溶解，超声2min，4度环境放置30min后，再超声2min，13500rpm×30min，取上清，待进行后续纯化。

3、肺炎支原体重组标记抗原的纯化、复性(制备MP-1)

平衡液的配制：20mM Tris-HCl，200mMNaCl，6M尿素，pH8.0；

洗脱液的配制：20mM Tris-HCl，200mMNaCl，6M尿素，再加入250mM咪唑，pH8.0；

配制好平衡液和洗脱液以后，利用ATKA purifier层析仪(购自GE医疗集团)，先用平衡液清洗平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)，Ni-NTA柱平衡好之后，将待上柱样品上柱结合，结合完之后，再用10倍柱体积的平衡液清洗柱子，然后再用洗脱液进行逐步洗脱，收集洗脱峰，测定蛋白浓度，待复性。

将上述Ni-NTA亲和纯化得到的目的蛋白用平衡液稀释至浓度为0.5mg/mL，再分别用含有4M、2M、1M尿素的复性缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，5％甘油，1mM EDTA，pH 8.0)于4度进行透析复性，最终将目的蛋白透析至缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，收集透析样品，离心，用超滤浓缩管(购自Millipore公司，截留蛋白分子量为10kD)浓缩，收集浓缩样，即为Mp重组标记抗原MP-1，测定蛋白浓度，置于-20度备用。

4、肺炎支原体重组包被抗原的纯化、复性(制备MP-2)

电洗脱缓冲液的配制：1/万SDS，pH7.4的PB溶液；

采用浓度为9％的蛋白分离胶进行凝胶电泳，3.5mL粗抗/板胶的上样量进行上样，电泳电压为100V，4度过夜电泳，电泳后目标蛋白带距离胶的底部约2～4cm，目标蛋白带宽约1.2cm，将目标蛋白带切下来后，6板目标蛋白带胶条/袋进行装袋，并加入6mL电泳洗脱液，扎紧袋口两端，将该透析袋置于电泳槽中，并在电泳槽中加入电泳缓冲液至缓冲液没过装胶条的透析袋即可，在4度环境下100V电压电泳3h，停止电泳，将透析袋中的液体挤出，并用0.22μm的滤膜进行过滤，收集滤液，即为肺炎支原体重组包被抗原MP-2，测定蛋白浓度，置于-20度备用。

测试一

MP-1与MP-2鉴定

将制得的MP-1与MP-2以同样的蛋白浓度(1.0mg/mL)进行SDS凝胶电泳上样，每孔上8μL，电泳结果如图4所示。可以看出MP-1与MP-2均在35KD左右有蛋白条带，与预期相符。MP-1在116KD左右还有一些蛋白条带。说明MP-1表现为多聚体形式与单体形式共存，MP-2主要是单体形式。单体结构的抗原主要的抗原表位为一级结构的表位，即氨基酸序列的表位，而聚体结构的蛋白既有一级表位，也有结构表位，MP-1的聚体结构多样化，由不同数量的单体构成不同的聚体结构，因此，MP-1的表位较丰富，更有利于捕获标本中的抗体进行免疫反应。

重组抗原MP-1和MP-2的性能比较

发明人将上述得到的重组抗原MP-1、MP-2分别与肺炎支原体天然抗原(购自Microbix公司)用胶体金检测的方法进行交叉配对，检测了10份阳性质控标本和50份临床阴性标本，具体结果见表1。

表1重组抗原MP-1、MP-2和天然抗原交叉配对检测

注：表中A/B表示B份标本中检出A份标本。

从表1中的结果分析可知：标记抗原MP-1配对包被抗原MP-2和天然抗原这两个配对可以检出我司的10份阳性质控标本，同时只检出1份临床阴性标本，从抗原来源和制造成本来看的话，优选MP-1做标记抗原，MP-2做包被抗原进行胶体金快速检测试纸条的制备。MP-1做标记抗原与MP-2做包被抗原配对具有良好的特异性。

按上述方法进行多次重复实验，多次重复实验的结果也表明，得到的MP-1表现为多聚体形式与单体形式共存，MP-2主要是单体形式，且每次表达都很稳定。因此，P1A片段、P1B片段以及P30片段形成的重组抗原经过不同的方式纯化后能够获得不同类型的抗原优势表位，且各类型的抗原优势表位表现稳定，即能够根据需要稳定的表现出不同类型的抗原优势表位。能够大大减少检测时抗原的配对筛选工作，检测肺炎支原体时检出率高、特异性较高。

实施例2肺炎支原体抗体胶体金检测试纸的制备

1、包被膜(硝酸纤维素膜)的制备

包被缓冲液的配制：含6％甲醇、0.01M pH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。

1000mL 6％甲醇的0.01M pH 7.2PBS缓冲液配方：NaCL 8g、KCL 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、甲醇60mL，双蒸去离子水定容至1000mL。

包被膜(硝酸纤维素膜)的制备：用包被缓冲液将肺炎支原体重组包被抗原MP-2稀释到1～2mg/mL，调整机器，在包被膜的检测区域划线，即为肺炎支原体抗体检测线(T线)。用包被缓冲液将兔抗鼠IgG抗体(菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0002)稀释到1～5mg/mL，调整机器，在包被膜的质控区域划线，即为控制线(C线)。C线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm，与T线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。

2、胶体金、金标记肺炎支原体重组抗原、金标记鼠IgG的制备。

(1)溶液的配制。

①氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000mL 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000mL。

②柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期容至1000mL。

③0.1M碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000mL。

④标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％叠氮钠(NaN3)，0.01MpH7.2PBS溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方：20gBSA，0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)胶体金的制备。

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100mL 0.01％氯金酸加入2mL 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。

(3)胶体金标记肺炎支原体重组抗原的制备。

用0.2M碳酸钾调胶体金的pH值至8.0，按20～30μg抗原/mL胶体金加入实施例1中制备得到的肺炎支原体重组标记抗原MP-1，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。11000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

(4)胶体金标记鼠IgG的制备。

用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按8～10μg抗体/mL胶体金加入鼠IgG(菲鹏生物股份有限公司，货号BA-PAB-MU0006)，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。

3、金标垫的制备

(1)封闭液的配制。

2％BSA，0.1％TritonX-100、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、1mL TritonX-100、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)金标垫的制备。

将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。将金标记肺炎支原体重组标记抗原和金标记鼠IgG按照适当比例混合均匀，然后将混合好的金标记肺炎支原体重组标记抗原和金标记鼠IgG均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。

4、试纸条样品垫的制备

(1)封闭液的配制。

2％BSA，0.05％Tween-20、0.05％NaN3，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方：20g BSA，0.5g NaN3、0.5mL Tween-20、0.01MpH7.2PBS溶液定容至1000mL。

(2)样品垫的制备。

将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。

5.检测试纸的组装

将吸收垫(购自Millipore公司)、包被膜(硝酸纤维素膜)、标记垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到肺炎支原体的检测试纸。

实施例3检测肺炎支原体抗体的试剂盒

1、快速检测肺炎支原体抗体的试剂盒包括：实施例2制作的检测试纸、样品稀释液及卡壳和滴管。

样品稀释液为0.5％酪蛋白，8％NaCl，50mM Tri-base的溶液。配制方法：80gNaCl，5g酪蛋白，6.5g Tris-base，加蒸馏水定容至1000mL。

2、胶体金法检测肺炎支原体。

(1)直接吸取20μL采集好的人血清或血浆加入到试纸卡加样孔，再滴加两滴样品稀释液至加样孔，等待15min后即可观察结果。

(2)结果判定：当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，没有出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阴性；当试纸条出现肉眼可见的红色质控线，同时也出现肉眼可见的红色检测线，结果判为阳性。检测线颜色越深说明被检测样品的肺炎支原体抗体水平越高。当试纸条没有出现肉眼可见的紫红色质控线，不管有没有出现肉眼可见的紫红色检测线，结果都判为检测试纸条失效，应废弃。

实施例4快速检测肺炎支原体抗体试剂盒的应用

以市场上商业化的主流产品WF肺炎支原体检测试剂盒和实施例3制备的肺炎支原体检测试剂盒(简称FP MP检测试剂盒)做对比，同时检测我司收集的113份Mp阳性标本和326份临床阴性标本。结果显示，FP Mp检测试剂盒能检出上述113份阳性标本中的108份，而WF试剂盒检出阳性标本105份，对于326份临床阴性标本，FP试剂盒检出假阳14份，WF试剂盒检出假阳18份，具体见表2。

表2：肺炎支原体抗体试剂盒发热检出情况对比

上述结果说明实施例3制作的检测试剂盒在灵敏度和特异性方面均优于市场同类产品WF的试剂盒，完全可以用于肺炎支原体的快速诊断。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 菲鹏生物股份有限公司

<120> 肺炎支原体重组抗原及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ser Ala Tyr Lys Pro Asn Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr

1 5 10 15

Asn Ser Ser Pro Tyr Leu His Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Thr Gln

20 25 30

Ser Asp Lys Leu Asp Asp Asp Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln

35 40 45

Val Arg Thr Lys Leu Arg Gln Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln

50 55 60

Pro Gln Pro Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser

65 70 75 80

Ser Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly

85 90 95

Ser Ser Gly Ser Gly Gln Ser Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys

100 105 110

Val Ser Gly Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn

115 120 125

Thr Ser Ser Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp

130 135 140

Val Val Gly Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn

145 150 155 160

Asp Asp Val Asp Gly Ile Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp

165 170 175

Gly Glu Gly Gln Thr Ala Asp Thr Gly Pro Gln Ser Val Lys Phe Lys

180 185 190

Ser Pro Asp Gln Ile Asp Phe Asn Arg Leu Phe Thr Gly Gly Gly Gly

195 200 205

Ser Asn Arg Thr Gly Ile Ser Gln Ala Pro Lys Arg Leu Lys Gln Thr

210 215 220

Ser Ala Ala Lys Pro Gly Ala Pro Arg Pro Pro Val Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Gly Ala Pro Lys Pro Pro Val Gln Pro Pro Lys Lys Pro Ala Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Pro Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly

275 280 285

Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His

290 295 300

Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala

305 310 315 320

Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly

325 330 335

Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Gln Pro Pro

340 345 350

Arg Pro Gly Met Pro Pro Gln Pro Gly Phe Pro Pro Lys Arg

355 360 365

<210> 2

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctctgcct ataagcctaa cacatcttct ggccagacgc aatctacaaa cacaacacca 60

tacctacacc tagtaaagcc aaagaaggta acacagacag acaagctaga cgacgaccta 120

aagaacctac tagacccaaa ccaggtaaga acaaagctaa gacagacatt cggaacagac 180

cacacaacac agccacagcc acagacacta aagacaacaa caccagtatt cggaacaaca 240

acaggaaacc taacaacagt actaacagga ggaggagcag gaggaggaac aacaggaaca 300

ggacagacag gagtagacct aacaccagta gagaaggtaa caggatggct agtaggacag 360

ctaccaacaa caacagacgg aaacacaaca acaacaaaca acctagcacc aaacacaaac 420

acaggaaacg acgtagtagg agtaggaaga ctaacagaga caaacgcagc aaagatgaac 480

gacgacgtag acggaattgt aagaacacca ctagcagagc tactagacgg agagggacag 540

acagcagaca caggaccaca gacagtaaag ttcaagacac cagaccagat tgacttcaac 600

agactattca caggaggagg aggaacaaac agaacaggaa ttacacaggc accaaagaga 660

ctaaagcaga caacagcagc aaagccagga gcaccaagac caccagtacc accaaagcca 720

ggagcaccaa agccaccagt acagccacca aagaagccag caggaggagg aggaacagga 780

ccaagaacag gattcccacc acagccagga atggcaccaa gaccaggaat gccaccacac 840

ccaggaatgg caccaagacc aggattccca ccacagccag gaatggcacc aagaccagga 900

atgccaccac acccaggaat ggcaccaaga ccaggattcc caccacagcc aggaatggca 960

ccaagaccag gaatgccacc acacccagga atggcaccaa gaccaggatt cccaccacag 1020

ccaggaatgg caccaagacc aggaatgcag ccaccaagac caggaatgcc accacagcca 1080

ggattcccac caaagaga 1098

Claims

1.一种肺炎支原体重组抗原，其特征在于，包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段，所述P1A片段位于所述重组抗原的C端，所述P30片段位于所述重组抗原的N端，所述P1A片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸，所述P1B片段为肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸，所述P30片段为肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的重组抗原，其特征在于，所述重组抗原为：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，

3.根据权利要求1所述的重组抗原，其特征在于，所述重组抗原为：

(a)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码得到的蛋白质；或，

4.一种表达基因，其特征在于，所述表达基因能够表达肺炎支原体重组抗原，所述重组抗原包括依次连接的P1A片段、第一连接肽、P1B片段、第二连接肽以及P30片段，所述P1A片段位于所述重组抗原的C端，所述P30片段位于所述重组抗原的N端，所述P1A片段包括肺炎支原体粘附蛋白P1的第1219位氨基酸～第1422位氨基酸，所述P1B片段包括肺炎支原体粘附蛋白P1的第1583位氨基酸～第1627位氨基酸，所述P30片段包括肺炎支原体粘附蛋白P30的第168位氨基酸～第274位氨基酸。

5.根据权利要求4所述的表达基因，其特征在于，所述表达基因为：

(a)如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或，

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求4或5所述的表达基因。

7.一种宿主表达菌，其特征在于，所述宿主表达菌中转染了如权利要求6所述的表达载体。

8.一种肺炎支原体的检测试纸，其特征在于，包括支撑薄片、样品垫、标记垫、包被膜以及吸收垫，所述样品垫、所述标记垫、所述包被膜以及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上，所述样品垫与所述标记垫部分重叠，所述标记垫与所述包被膜部分重叠，所述包被膜与所述吸收垫部分重叠；

9.根据权利要求8所述的检测试纸，其特征在于，所述MP-1通过如权利要求1～3任一项所述的重组抗原采用Ni-NTA亲和柱纯化的方式得到，所述MP-2通过如权利要求1～3任一项所述的重组抗原采用电洗脱纯化的方式得到。

10.一种检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求8～9任一项所述的检测试纸。