CN110964089A - 一种肺炎支原体抗原及其在同时定量检测末梢血中肺炎支原体IgG、IgM含量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种肺炎支原体抗原及其在同时定量检测末梢血中肺炎支原体IgG、IgM含量中的应用，本发明所述突变的肺炎支原体抗原P80，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的肺炎支原体抗原P80与抗体的免疫反应性较天然抗原提高了约34.6％。本发明的肺炎支原体抗原P80结合量子点免疫层析技术，克服了现有肺炎支原体抗体检测方法如免疫层析试验(ICA)和酶联免疫分析法(ELISA)技术等仅能定性或半定量检测，且进行MP‑IgM和MP‑IgG检测必须进行2次实验等存在的不足，可以同时实现MP‑IgM和MP‑IgG的检测，从而区分患者是近期感染还是既往感染，减少误诊率。

Description

一种肺炎支原体抗原及其在同时定量检测末梢血中肺炎支原 体IgG、IgM含量中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物学检测技术领域，具体地，本发明涉及一种肺炎支原体突变体及指尖血加样法检测肺炎支原体量子点免疫层析试剂盒的开发。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma Pneumoniae,Mp)是引起社区获得性肺炎(CommunityAcquired Pneumonia，CAP)最重要病原体之一，是介于细菌与病毒的一种超滤过性病原微生物。据报道，Mp感染引起的肺炎在CAP中占10-40％，近年来发病趋势仍有逐渐上升的趋势，Mp感染临床上主要表现为气管炎和上呼吸道感染症状。其主要特点是起病较慢，有头疼、发热、咽喉疼痛不适，以及最典型的干咳等症状。

通常情况，人体感染Mp后能产生IgM、IgG类抗体。IgM抗体一般在初次感染1周内开始升高，2-3周达到高峰，2-3月降至最低，Mp-IgM抗体是诊断肺炎支原体的特异性抗体；IgG在IgM之后产生，一般在感染后14d左右出现，浓度峰值一般在感染后的第5周，持续6个月甚至数年，当患者恢复期较急性期IgG抗体滴度达4倍以上升高或降低时有诊断价值。因此Mp-IgM在肺炎支原体的早期诊断有重要意义，Mp-IgG常用于感染中、后期的辅助诊断，Mp-IgM和Mp-IgG联合检测可区分患者近期感染和既往感染。从而为早期诊断MP感染提供了重要依据。

由于发病特点不显著，MP曾被误认为是病毒感染而发生误诊。因此，为了避免误诊、漏诊等情况的发生，能够快速、准确地进行病原学鉴别诊断是非常重要的。目前，国内外已有的肺炎支原体检测方法包括培养法、抗原检测法、核酸检测法(NAT)、抗体检测法等。血清学方法只能够回顾性诊断肺炎支原体感染，原因在于出现症状后并不会立即出现抗体。随着技术的不断发展，PCR法逐渐地进入了应用领域。但考虑到其特异性的问题，容易出现假阳性。实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)虽然有较高的灵敏度和特异性，但其对于营养要求较高，且花费时间较长，某些结果的判定需要耗费近1个月的时间，对于Mp的早期诊断结果而言产生了一定的阻碍。而胶体金法诊断肺炎支原体时使用试剂样本量多、采血量较大。肺炎支原体抗原或NAT检测虽能在感染初期进行诊断，但由于样本污染或非致病菌定植情况，诊断假阳性率较高且费用昂贵。肺炎支原体培养虽然被认为是诊断MP的金标准，但有明显的方法学局限性，如培养时间长，敏感性低等。肺炎支原体抗体检测可区分定植菌和致病菌，但目前国内外检测抗体所用的标记物多为异硫氰酸荧光素(FluoresceinIsothiocyanate，FITC)等常规标记物，荧光寿命短、易猝灭、发光不稳定、斯托克斯位移小、单一光源单色激发等问题是FITC的局限性所在，故用FITC等普通荧光剂标记的抗体检测时阳性率较低，易漏诊。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种肺炎支原体抗原，其反应性较天然的提高了34.6％，使检测所需样本类型兼容末梢血成为可能。

本发明目的之二在于提供所述肺炎支原体抗原的应用，特别是在肺炎支原体量子点免疫层析中的应用，本发明所述的应用可以在一个免疫层析板上同时进行MP-IgM和MP-IgG定量检测，为临床提供一种新的方便、快速、灵敏度高、定量、可用末梢血的检测技术。

本发明的目的之三在于提供一种检测肺炎支原体IgG、IgM量子点免疫层析试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案具体实现：

本发明提供一种突变的肺炎支原体抗原P80，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的这种突变体与抗体的免疫反应性较天然抗原提高了约34.6％。

本发明还提供编码肺炎支原体抗原P80的核苷酸序列，在一种实施例中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供表达编码肺炎支原体抗原P80的核苷酸序列的载体。

本发明还提供含有本发明所述载体的宿主细胞，在一种具体的实施例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供包含所述的肺炎支原体抗原P80的生物制品。

本发明还提供包含所述的肺炎支原体抗原P80的检测试剂。

本发明还提供所述的肺炎支原体抗原P80、本发明所述的核苷酸序列、本发明所述的载体或本发明所述的宿主细胞在肺炎支原体抗体检测中的应用，特别是在肺炎支原体IgG、IgM检测中的应用。

本发明还提供所述的肺炎支原体抗原P80、本发明所述的核苷酸序列、本发明所述的载体或本发明所述的宿主细胞在制备肺炎支原体抗体检测试剂盒中的应用，特别是在制备肺炎支原体IgG、IgM检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测肺炎支原体IgG、IgM试剂盒，特别是一种量子点免疫层析试剂盒，所述试剂盒中包含肺炎支原体抗原P80。

本发明所述的试剂盒可以用本领域常用的样品，由于本发明所述的肺炎支原体抗原P80具有更佳的免疫反应性，因此本发明所述的试剂盒所需样本类型可以为末梢血。

本发明的有益效果：

本发明通过对肺炎支原体外膜粘附蛋白的抗原表位丰富区域深入的分子改良，筛选性能优良的突变体，制备高反应性的重组蛋白肺炎支原体抗原，本发明所述的肺炎支原体抗原P80与抗体的免疫反应性较天然抗原提高了约34.6％。此外，本发明的肺炎支原体抗原P80结合量子点免疫层析技术，样本类型兼容末梢血，解决了小儿采血的痛点，且克服了现有肺炎支原体抗体检测方法如免疫层析试验(ICA)和酶联免疫分析法(ELISA)技术等仅能定性或半定量检测，且进行MP-IgM和MP-IgG检测必须进行2次实验等存在的不足，可以同时实现MP-IgM和MP-IgG的检测，从而区分患者是近期感染还是既往感染，减少误诊率。

附图说明

图1为本发明实施例1中PCR扩增。1：编码天然肺炎支原体外膜粘附蛋白的抗原表位丰富区域的基因片段；2：编码P80的基因片段；M：DNA marker；

图2为本发明实施例1中原核表达P80 SDS-PAGE电泳鉴定结果图：M：Proteinmarker；1：诱导前全菌；2：诱导后全菌；

图3为本发明实施例4中检测肺炎支原体IgG、IgM量子点免疫层析试剂盒线性范围验证；

图4为本发明实施例5中试剂盒检测不同样本类型相关性比较。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1新型肺炎支原体P80抗原制备

已知肺炎支原体外膜粘附蛋白的抗原表位丰富区域序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.3)及对应抗体序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.4)，通过Pymol生物软件，预测其结合位点相关的氨基酸残基，按照本领域常规方法进行定点突变，获得一种突变的肺炎支原体抗原P80，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过基因工程常规操作将突变序列整合到pET28a质粒中，转化DH5α，经测序验证无误后转入大肠杆菌中构建原核表达体系外源表达突变抗原P80，经Ni柱纯化，纯度大于90％。从图1可知，突变型与天然抗原大小相等；图2为原核表达P80的SDS-PAGE图，从图中可知，相较于泳道1未加诱导剂的裂解全菌，泳道2在添加了诱导剂IPTG下表达了约80KDa的蛋白，如箭头所示，与理论值相符。

实施例2新型肺炎支原体抗原P80反应性测试

为了研究新型肺炎支原体抗原P80的免疫反应性，将其稀释至100mg/L，并在蛋白储存液中添加了20％的牛血清来模拟血清样本。在西门子BNII系统上用FUJIREBIO公司试剂测定P80相对免疫反应性。经计算P80和天然肺炎支原体抗原(核酸序列如SEQ ID NO.3)的实际有效浓度分别为91mg/L和40.7mg/L。测定结果如表1所示，表明P80具有较好的免疫反应性，排除基质效应后测定浓度能够达到实际浓度的94.9％，较天然抗原提高了34.6％。

表1重组抗原与天然抗原反应性比较

实际浓度＝天然/重组抗原相对分子质量×纯度×浓度；相对免疫反应性＝测量浓度/实际浓度

实施例3检测肺炎支原体IgG、IgM量子点免疫层析试剂盒的制备

试纸条采用双抗夹心法的原理。将50μL量子点原液加入到装有活化buffer的EP管中，置于涡旋混匀仪混匀活化0.5h。加入450μL偶联buffer和75μg鼠抗人IgM和鼠抗人IgG抗体，置于涡旋混匀仪震荡混匀0.5h。离心去上清后用10％乙醇胺溶液、5％Casein溶液封闭，垂直混匀仪混匀45min。重悬去除上清，制得鼠抗人IgM和鼠抗人IgG抗体包被的水溶性量子点结合物，并加入缓冲液于2-8℃避光保存。

取宽度为8mm的标记物垫，使用喷金仪以5μ/cm的喷量将用包被缓冲液稀释至0.1％固含量(以量子点固含量计算)的量子点标记的鼠抗人IgM和鼠抗人IgG抗体固定在结合垫上，并置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16-24h。

用蛋白固定液稀释重组肺炎支原体抗原P80和肺炎支原体IgM和IgG内参蛋白，用BioDot喷膜机在硝酸纤维素膜上分别包被作T线和C线，喷量设置为2μL/cm，C、T线间隔1cm；喷膜完成后将硝酸纤维素膜置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干16-24h。

将滤血膜浸于包被缓冲液中5min，室温晾干15min后置于恒温鼓风干燥箱中，37℃烘干18-24h。在PVC背衬板上依次粘贴硝酸纤维素膜，标记物垫和滤血膜。组装好的试纸大卡用自动斩切机切割为每条宽度为3.54mm的试纸条，并用PVC外壳按压封装，与干燥机一起放入铝箔袋内密封保存。

实施例4肺炎支原体IgG、IgM量子点免疫层析试剂盒的性能评价

1、精密度

采用实施例4制备的试剂盒，测定4个不同浓度水平的质控品，重复测定10次，统计各自均值、标准差和变异系数(CV)，由结果表2和表3可知，Mp-IgG和Mp-IgG的CV值均低于10％，表明本发明所述的肺炎支原体抗原P80制备的试剂盒精密度良好。

表2 Mp-IgG精密度测试

表3 Mp-IgM精密度测试

2、检测限

取低值样本5份，将每份样本进行25次重复检测，将各自的检测值进行统计，计算各自精密度，结果见表4和表5，检测限验证结果表明该试剂盒IgG-LoD和IgM-LoD值分别为2.96RU/mL和4.03RU/mL，说明该试剂盒针对两种抗体的灵敏度较高，可以同时实现MP-IgM和MP-IgG的检测，从而区分患者是近期感染还是既往感染，减少误诊率。

表4 IgG检测限测试

表5 IgM检测限测试

3、线性范围

选择一份接近线性范围上限浓度水平样本(H)，及一份位于检出限附近低值浓度水平样本(L)，按L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H及H方式进行稀释，每个稀释度重复检测并计算均值，与计算的预期浓度水平进行统计学分析，结果见图3。

经统计学分析，IgG检测平均值与理论值之间的线性方程分别为y＝0.005x+0.198，相关系数为0.9973；IgM检测平均值与理论值之间的线性方程分别为y＝0.0248x+0.5306，相关系数为0.9939，结果表明该试剂盒实际检测值与理论值一致性较好。

实施例5末梢血的检测

分别取同一样本静脉全血、末梢血，静置，获得分凝胶血清，按1:100分别稀释分凝胶血清、末梢血，用肺炎支原体IgG、IgM检测试剂盒在干式荧光免疫分析仪AFS-1000/2000反应。结果如图4，无论是检测IgG还是IgM，血清与末梢血整体相关性良好，两种样本类型之间没有差异，从而解决了小儿采血困难的痛点。

序列表

<110> 南京诺唯赞医疗科技有限公司

<120> 一种肺炎支原体抗原及其在同时定量检测末梢血中肺炎支原体IgG、IgM含量中的应用

<150> 2019110740700

<151> 2019-11-06

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His Gln Thr Lys Lys Thr Ala Leu Ser Lys Ser Thr Trp Ile Leu

1 5 10 15

Ile Leu Thr Ala Thr Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Thr Val Val Gly

20 25 30

His Phe Thr Ser Thr Thr Thr Thr Leu Lys Arg Gln Gln Phe Ser Tyr

35 40 45

Thr Arg Pro Asn Glu Val Ala Leu Arg His Thr Asn Ala Ile Asn Pro

50 55 60

Arg Leu Thr Pro Trp Thr Tyr Arg Asn Thr Ser Phe Ser Ser Leu Pro

65 70 75 80

Leu Thr Gly Glu Asn Pro Gly Ala Trp Ala Leu Val Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Ala Lys Gly Ile Thr Ala Gly Ser Gly Ser Gln Gln Thr Thr Tyr Asp

100 105 110

Pro Thr Arg Thr Glu Ala Ala Leu Thr Ala Ser Thr Thr Phe Ala Leu

115 120 125

Arg Pro Tyr Asp Leu Ala Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Leu Asp Phe Ser

130 135 140

Lys Leu Asn Pro Gln Thr Pro Thr Arg Asp Gln Thr Gly Gln Ile Thr

145 150 155 160

Phe Asn Pro Phe Gly Gly Phe Gly Leu Ser Gly Ala Ala Pro Gln Gln

165 170 175

Trp Asn Glu Val Lys Asn Lys Val Pro Val Glu Val Ala Gln Asp Pro

180 185 190

Ser Asn Pro Tyr Pro Phe Ala Val Leu Leu Val Pro Arg Ser Val Val

195 200 205

Tyr Tyr Glu Gln Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Pro Asn Gln Gly Ser

210 215 220

Ser Ser Gly Ser Asp Ser Thr Asn Gln Thr Gly Ala Met Phe Gly Leu

225 230 235 240

Lys Val Lys Asp Ala Thr Val Asp Ser Ser Lys Gln Ser Thr Glu Ser

245 250 255

Leu Lys Gly Glu Glu Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Ser Ser Thr Ser

260 265 270

Thr Thr Gln Arg Gly Gly Ser Ser Asn Glu Asn Lys Ile Lys Ala Leu

275 280 285

Gln Val Ala Val Lys Lys Lys Ser Gly Ser Gln Gly Asn Ser Gly Asp

290 295 300

Gln Gly Thr Glu Gln Val Glu Leu Glu Ser Asn Asp Leu Ala Asn Ala

305 310 315 320

Pro Ile Lys Arg Gly Ser Asn Asn Asn Gln Gln Val Gln Leu Lys Ala

325 330 335

Asp Asp Phe Gly Thr Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Gln Asp

340 345 350

Gly Thr Pro Thr Pro Trp Thr Pro Trp Leu Thr Thr Glu Gln Ile His

355 360 365

Asn Asp Pro Ala Lys Phe Ala Ala Ser Ile Leu Ile Leu Tyr Asp Ala

370 375 380

Pro Tyr Ala Arg Asn Arg Thr Ala Ile Asp Arg Val Asp His Leu Asp

385 390 395 400

Pro Lys Ala Met Thr Ala Asn Tyr Pro Pro Ser Trp Arg Thr Pro Lys

405 410 415

Trp Asn His His Gly Leu Trp Asp Trp Lys Ala Arg Asp Val Leu Leu

420 425 430

Gln Thr Thr Gly Phe Phe Asn Pro Arg Arg His Pro Glu Trp Phe Asp

435 440 445

Gly Gly Gln Thr Val Ala Asp Asn Thr Gln Thr Gly Phe Asp Thr Asp

450 455 460

Asp Thr Asp Asn Lys Lys Gln Gly Phe Arg Lys Gln Gly Glu Gln Ser

465 470 475 480

Pro Ala Pro Ile Ala Leu Pro Phe Glu Ala Tyr Phe Ala Asn Ile Gly

485 490 495

Asn Leu Thr Trp Phe Gly Gln Ala Leu Leu Val Phe Gly Gly Asn Gly

500 505 510

His Val Thr Lys Ser Ala His Thr Ala Pro Leu Ser Ile Gly Val Phe

515 520 525

Arg Val Arg Tyr Asn Ala Thr Gly Thr Ser Ala Thr Val Thr Gly Trp

530 535 540

Pro Tyr Ala Leu Leu Phe Ser Gly Met Val Asn Lys Gln Thr Asp Gly

545 550 555 560

Leu Lys Asn Leu Pro Phe Asn Asn Asn Arg Trp Phe Glu Tyr Val Pro

565 570 575

Arg Met Ala Val Ala Gly Ala Lys Phe Val Gly Arg Glu Leu Val Leu

580 585 590

Ala Gly Thr Ile Thr Met Gly Asp Thr Ala Thr Val Pro Arg Leu Leu

595 600 605

Tyr Asp Glu Leu Glu Ser Asn Leu Asn Leu Val Ala Gln Gly Gln Gly

610 615 620

Leu Leu Arg Glu Asp Leu Gln Leu Phe Thr Pro Tyr Gly Trp Ala Asn

625 630 635 640

Arg Pro Asp Leu Pro Ile Gly Ala Trp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

645 650 655

His Asn Ala Pro

660

<210> 2

<211> 1992

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaccaaa ccaaaaaaac tgccttgtcc aagtccactt ggattctcat cctcaccgcc 60

accgcctccc tcgcgacggg actcaccgta gtgggacact tcacaagtac caccacgacg 120

ctcaagcgcc agcaatttag ctacacccgc cctaacgagg tcgcgctgcg ccacaccaat 180

gccatcaacc cgcgcttaac cccgtgaacg tatcgtaaca cgagcttttc ctccctcccc 240

ctcacgggtg aaaatcccgg ggcgtgggcc ttagtgcgcg acaacagcgc taagggcatc 300

actgccggca gtggcagtca acaaaccacg tatgatccca cccgaaccga agcggctttg 360

accgcatcaa ccacctttgc gttacgcccg tatgacctcg ccgggcgcgc cttatacgac 420

ctcgattttt cgaagttaaa cccgcaaacg cccacgcgcg accaaaccgg gcagatcacc 480

tttaacccct ttggcggctt tggtttgagt ggggctgcac cccaacagtg aaacgaggtc 540

aaaaacaagg tccccgtcga ggtggcgcaa gacccctcca atccttatcc gtttgccgtt 600

ttactcgtgc cgcgtagcgt ggtgtactat gagcagttgc agcgggggtt agcgctccct 660

aaccaaggga gttcgtcagg ctcagacagc actaaccaaa caggcgcaat gtttggcttg 720

aaggtgaagg atgcaaccgt ggatagttcg aagcaatcaa cggaaagctt aaagggcgaa 780

gaatcgagtt ccagttccac cacatcttcc acctccacca cccaacgtgg gggttcgtca 840

aatgaaaaca aaatcaaggc gttgcaggtg gcggtgaaaa agaaatccgg gagtcagggc 900

aactccggtg accaaggcac cgaacaggtg gaacttgaat ctaatgattt agccaacgcc 960

ccgattaaac ggggctccaa taacaaccag caagtccaac tcaaggcgga cgattttggt 1020

actgcccctt ccagttcggg atcaggcacc caagatggca cccccacccc ctgaacgccg 1080

tggttaacga ctgagcaaat tcacaacgac cccgccaaat tcgccgcctc gatcctgatt 1140

ctgtacgatg cgccttatgc gcgcaaccgt accgccattg accgcgttga tcacttggat 1200

cccaaggcca tgaccgcgaa ctatccgccc agttgaagaa cgcccaagtg aaaccaccac 1260

ggtcgccacc ccgagtggtt tgatggcggg cagacggtcg cggataatac ccaaaccggg 1320

tttgatacag atgacaccga taataaaaag cagggctttc gcaaacaagg cgaacaatcc 1380

cctgccccca tcgccctccc gtttgaagcg tacttcgcca acattggcaa cctcacctgg 1440

ttcgggcaag cgcttttggt gtttggtggc aatggccatg ttaccaagtc ggcccacacc 1500

gcgcctttga gtataggtgt ctttagggtg cgctataatg caactggtac cagtgctact 1560

gtaactggtt gaccatatgc cttactgttc tcaggcatgg tcaacaaaca aactgacggg 1620

ttaaagaatc taccctttaa caataaccgc tggtttgaat atgtaccacg gatggcagtt 1680

gctggcgcta agttcgttgg tagggaactc gttttagcgg gtaccattac catgggtgat 1740

accgctaccg tacctcgctt actgtacgat gaacttgaaa gcaacctgaa cttagtagcg 1800

caaggccaag gtcttttacg cgaagacttg caactcttca caccctacgg atgagccaat 1860

cgtccggatt taccaatcgg ggcttgaagt agtagtagta gtagtagtca caacgcaccc 1920

tactacttcc acaataaccc cgattgacaa gaccgtccaa tccaaagtgt ggttgatgcc 1980

tttattaagc cc 1992

<210> 3

<211> 1992

<212> DNA

<213> 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)

<400> 3

atgcaccaaa ccaaaaaaac tgccttgtcc aagtccactt ggattctcat cctcaccgcc 60

accgcctccc tcgcgacggg actcaccgta gtgggacact tcacaagtac caccacgacg 120

ctcaagcgcc agcaatttag ctacacccgc cctaacgagg tcgcgctgcg ccacaccaat 180

gccatcaacc cgcgcttaac cccgtgaacg tatcgtaaca cgagcttttc ctccctcccc 240

ctcacgggtg aaaatcccgg ggcgtgggcc ttagtgcgcg acaacagcgc taagggcatc 300

actgccggca gtggcagtca acaaaccacg tatgatccca cccgaaccga agcggctttg 360

accgcatcaa ccacctttgc gttacgccgg tatgacctcg ccgggcgcgc cttatacgac 420

ctcgattttt cgaagttaaa cccgcaaacg cccacgcgcg accaaaccgg gcagatcacc 480

tttaacccct ttggcggctt tggtttgagt ggggctgcac cccaacagtg aaacgaggtc 540

aaaaacaagg tccccgtcga ggtggcgcaa gacccctcca atccttatcg gtttgccgtt 600

ttactcgtgc cgcgtagcgt ggtgtactat gagcagttgc agcgggggtt agcgctccct 660

aaccaaggga gttcgtcagg ctcagacagc actaaccaaa caggcgcaat gtttggcttg 720

aaggtgaagg atgcaaccgt ggatagttcg aagcaatcaa cggaaagctt aaagggcgaa 780

gaatcgagtt ccagttccac cacatcttcc acctccacca cccaacgtgg gggttcgtca 840

aatgaaaaca aaatcaaggc gttgcaggtg gcggtgaaaa agaaatccgg gagtcagggc 900

aactccggtg accaaggcac cgaacaggtg gaacttgaat ctaatgattt agccaacgcc 960

ccgattaaac ggggctccaa taacaaccag caagtccaac tcaaggcgga cgattttggt 1020

actgcccctt ccagttcggg atcaggcacc caagatggca cccccacccc ctgaacgccg 1080

tggttaacga ctgagcaaat tcacaacgac cccgccaaat tcgccgcctc gatcctgatt 1140

ctgtacgatg cgccttatgc gcgcaaccgt accgccattg accgcgttga tcacttggat 1200

cccaaggcca tgaccgcgaa ctatccgccc agttgaagaa cgcccaagtg aaaccaccac 1260

ggtcgccacc ccgagtggtt tgatggcggg cagacggtcg cggataatac ccaaaccggg 1320

tttgatacag atgacaccga taataaaaag cagggctttc gcaaacaagg cgaacaatcc 1380

cctgccccca tcgccctccc gtttgaagcg tacttcgcca acattggcaa cctcacctgg 1440

ttcgggcaag cgcttttggt gtttggtggc aatggccatg ttaccaagtc ggcccacacc 1500

gcgcctttga gtataggtgt ctttagggtg cgctataatg caactggtac cagtgctact 1560

gtaactggtt gaccatatgc cttactgttc tcaggcatgg tcaacaaaca aactgacggg 1620

ttaaagaatc taccctttaa caataaccgc tggtttgaat atgtaccacg gatggcagtt 1680

gctggcgcta agttcgttgg tagggaactc gttttagcgg gtaccattac catgggtgat 1740

accgctaccg tacctcgctt actgtacgat gaacttgaaa gcaacctgaa cttagtagcg 1800

caaggccaag gtcttttacg cgaagacttg caactcttca caccctacgg atgagccaat 1860

cgtccggatt taccaatcgg ggcttgaagt agtagtagta gtagtagtca caacgcaccc 1920

tactacttcc acaataaccc cgattgacaa gaccgtccaa tccaaagtgt ggttgatgcc 1980

tttattaagc cc 1992

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse)

<400> 4

Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met

1 5 10 15

Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe

20 25 30

Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr

35 40 45

Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp

50 55 60

Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val

65 70 75 80

Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val

85 90 95

Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe

100 105 110

Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys

115 120

Claims (10)

1.一种突变的肺炎支原体抗原P80，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述肺炎支原体抗原P80的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.表达权利要求2所述的核苷酸序列的载体。

5.包含权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的肺炎支原体抗原P80、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在肺炎支原体抗体检测中的应用。

7.权利要求1所述的肺炎支原体抗原P80、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在分别/同时检测肺炎支原体IgG、IgM中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测所用的样品为末梢血。

9.权利要求1所述的肺炎支原体抗原P80、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备肺炎支原体抗体检测试剂盒中的应用。

10.权利要求1所述的肺炎支原体抗原P80、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备肺炎支原体IgG、IgM检测试剂盒中的应用。

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