CN110031621B

CN110031621B - 一种hiv新发感染检测试剂盒和制备方法

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Publication number: CN110031621B
Application number: CN201910336950.4A
Authority: CN
Inventors: 刘兴旺; 景滢滢
Original assignee: Beijing Xinchuang Bioengineering Co ltd
Current assignee: Beijing Xinchuang Bioengineering Co ltd
Priority date: 2019-04-24
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2039-04-24
Also published as: CN110031621A

Abstract

本发明公开了一种HIV新发感染检测试剂盒和制备方法，涉及生物技术领域，该试剂盒采用一步酶反应法，极大缩短了检测时间，灵敏度高，特异性强，稳定性好，能够同时检测我国HIV流行亚型B、E和D共3种抗原，提高了HIV新发感染检测的准确率。采用二次包被的方法包被酶联板，极大降低了检测原料的添加量，采用间接标记，提高了抗原的活性、反应一致性和准确率。有利于进行微量样本的检测，减少了空间位阻，提高了反应效率、灵敏度和特异性。

Description

一种HIV新发感染检测试剂盒和制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种HIV新发感染检测试剂盒和制备方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)新发感染检测是艾滋病监测工作的重要内容，对于及时了解病毒的传播动态，发现高危人群，有效地评价疾病的干预措施，从而实现卫生资源的合理分配。目前估算新发感染率的方法主要有队列研究、数学模型和实验室检测三种方法。队列研究虽然是获得新发感染率的金标准，但因其观察随访时间长，需要投入巨大的人力、物力、财力，同时还存在失访、选择性偏倚等缺陷，使其无法广泛使用；数学模型方法的应用虽然比较简单，但该方法是建立在往年数据和前提假说的基础上，存在较多不可控和不可预知的因素，应用上也有一定局限性。因此，近年来利用检测技术以横断面样本为基础区分新近感染或长期感染样本，进而估算新发感染率的实验室检测方法得到越来越多的重视。

新发感染的实验室检测方法，根据检测的标志物不同可以分为多种方法。血清学阳转前的方法主要有病毒核酸(Ribonucleic acid，RNA)检测和p24抗原检测；血清学阳转后，根据检测原理不同，大致分为六类：抗体滴度检测、抗体亲和力检测、特异性抗体占总抗体的比例检测、p24抗原免疫球蛋白3抗体(Immunoglobulin G3，IgG3)抗体检测、线性免疫印迹检测、抗特异性免疫原性反应检测。其中按HIV gp41特异性抗体占总抗体比例的原理开发的HIV-1 BED捕获EIA法(BED-CEIA)，简称BED法，是到目前为止在全世界范围内应用最为广泛的方法。该方法是根据特异性占总抗体的比例随着感染时间的延长而增高的特性来区别近期感染与既往感染。由于结果可靠、可操作性强，己在美国、法国、泰国等国家的艾滋病监测体系中被列为常规检测项目。

我国自2006年以来就引进了该方法，并且建立了相应的技术平台和质量控制体系。但所使用的试剂盒均为国外进口，成本高，订货周期长，且由于该方法受病毒亚型，CD4+T淋巴细胞数量和抗病毒治疗等因素的影响，迫切需要针对我国艾滋病的流行背景，病毒株亚型，开发出适合我国艾滋病病毒新发感染检测用的BED法检测试剂盒及其制备方法。

现有用于BED法的试剂盒均为国外进口，成本高，订货周期长，操作复杂。我国所研发的检测试剂盒大多采用两步酶反应，检测时间长，且存在反应效率低、灵敏度低和特异性差的缺陷。

现有技术中的重组BED抗原，基本由3个多肽B、E、D融合表达而成，3个多肽片段中间由连接肽连接成一个完整的BED抗原。这种很大的抗原结构，容易发生片段的叠加、覆盖，使3个多肽片段的反应效率不一致，即3个多肽片段的活性不一致，针对不同的血清样本反应差异很大。如果遇到针对反应效率低的多肽片段的血清样本，则容易产生假阳性结果造成误判。另外B、E、D 3个多肽每个结构都含有多个赖氨酸，在进行辣根过氧化物酶(HRP)标记时，每个赖氨酸都能单独与HRP发生反应。当赖氨酸在抗原活性中心附近时，赖氨酸与HRP结合反应后产生空间位阻就会降低抗原的活性甚至导致抗原失活，当与样本反应时容易产生不反应或反应弱，出现假阳性导致错判。

现有技术中，当检测HIV-1中的某一种抗原检测灵敏度下降后，经常采用重新重组融合多种抗原，等比例增加原重组抗原中的多个抗原含量的方法，这样会导致其他未被干预多肽检测灵敏度发生改变，对检测带来困扰。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HIV新发感染检测试剂盒，该试剂盒采用间接标记的方法，不对抗原进行直接的酶标记，通过在抗原上引入标签，再在标签上通过亲和反应连接上酶标的标签抗体，避免了假阳性的发生，提高了检测的灵敏度，采用一步酶反应法，极大缩短了检测时间，灵敏度高，特异性强，稳定性好，能够同时检测我国HIV流行亚型B、E和D共3种抗原。

本发明提供了一种HIV新发感染检测试剂盒的制备方法，该制备方法采用二次包被的方法包被酶联板，且通过自适应调节HIV-1 B、E和D蛋白片段的添加量有效避免了HRP直接结合在BED抗原上而造成的活性损失，而且增加了B、E、D这3个多肽反应的均一性，使针对不同片段的血清样本的反应非常一致，提高了检测的准确率。此外，极大降低了检测原料的添加量，有利于进行微量样本的检测，减少了空间位阻，提高了反应效率、灵敏度和特异性。

本发明是这样实现的：

一种HIV新发感染检测试剂盒，包括检测抗原，检测抗原为重组抗原，重组抗原包括HIVgp41中的HIV-1 B、E和D蛋白片段，HIV B、E和D蛋白片段均带有标签。

在本发明应用较佳的实施例中，上述标签可以是Trx标签，Flag标签，MBP(麦芽糖结合蛋白)，GST(谷胱甘肽巯基转移酶)，Avi标签，SUMO标签，c-Myc标签和HA标签中的任意一种；

优选的，标签为Trx标签。

在本发明应用较佳的实施例中，上述标签上通过亲和识别连接有与标签相匹配的标签抗体，优选的，标签抗体为鼠抗标签，标签抗体上标记有酶，酶可以是辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶中的任意一种；

优选的，酶为辣根过氧化物酶(HRP)。

在本发明应用较佳的实施例中，上述HIV B、E和D蛋白片段分别通过设置连接肽与标签连接，连接肽的核苷酸序列如序列1所示。在本发明应用较佳的实施例中，上述HIVgp41中的HIV-1 B的核苷酸序列如序列2所示，HIVgp41中的HIV-1 E的核苷酸序列如序列3所示，HIVgp41中的HIV-1 D的核苷酸序列如序列4所示。

在本发明应用较佳的实施例中，上述HIV新发感染检测试剂盒还包括酶联板，酶联板上包被有X抗羊IgG和羊抗人IgG两种原料，X可以是鼠，兔和猪中的任意一种，X抗羊IgG的稀释比例为1:1000～5000，羊抗人IgG的稀释比例为1:1000～10000；

优选的，X为鼠，X抗羊IgG的稀释比例为1:2500；羊抗人IgG的稀释比例为1:6000。经过多次重复实验表明当设置X抗羊IgG的稀释比例为1:2500，羊抗人IgG的稀释比例为1:6000时，试剂盒的新发感染误检率低，特异性高。

在本发明应用较佳的实施例中，还包括强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)、阴性对照(NC)、显色液、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液。其中强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)、阴性对照(NC)均保存在低于-20℃或制成冻干品的保存于2-8℃环境中，显色液、洗涤缓冲液、样本稀释液和终止液均保存于2-8℃环境下。

一种HIV新发感染试剂盒的制备方法，包括重组抗原的制备，将HIVgp41中的HIV-1B、E和D分别进行全基因合成得到HIV-1 B、E和D三种目的基因，将三种目的基因转入带有标签的载体中，分别表达获得带有标签的HIV-1 B、E和D蛋白片段，分别按照一定的比例混合制得带有标签的重组抗原；

优选的，将HIV-1 B、E和D蛋白片段分别按照1：1：1的比例混合制得带有标签的重组抗原。

经过多次重复设计实验得出，当HIV-1 B、E和D蛋白片段分别按照1：1：1的比例混合制得带有标签的重组抗原时，制备得到的试剂盒灵敏度和特异性最佳。

在本发明应用较佳的实施例中，还包括将用于合成连接肽的核苷酸序列1分别与HIV-1 B、E和D三种目的基因连接。

在本发明应用较佳的实施例中，还包括在带有标签的重组抗原上通过亲和识别连接标签抗体，包括如下步骤：先将标签抗体上标记酶形成酶标物，再将酶标物与带有标签的重组抗原按照1:20-30的比例混合，亲和连接，组成酶结合物；

优选的，酶标物与带有标签的重组抗原按照1:23的比例混合。当酶标物与带有标签的重组抗原按照1:23的比例混合时，制备得到的试剂盒的灵敏度高，特异性好。

在本发明应用较佳的实施例中，上述抗体标签上标记酶的方法是交联法，交联法中交联剂为过碘酸钠、过碘酸钾和戊二醛中的任意一种，优选的，交联剂为过碘酸钠。

过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的糖基部分的羟基氧化成醛基，然后与蛋白质序列中赖氨酸残基上的游离氨基反应，形成酶标物。HRP先标记抗体Trx，再与分别单独重组表达的带有Trx标签的B多肽片段(Trx-B)、E多肽片段(Trx-E)、D多肽片段(Trx-D)按适当的比例混合，组成酶结合物。这种间接标记方法增加了空间臂，提高了反应效率；增加了血清样本与Trx-B、Trx-E、Trx-D的反应的均一性；使标记得率、活性得到了很大的提升。

在本发明应用较佳的实施例中，还包括酶联板的制备，酶联板的制备采用的是二次包被方法，具体包括如下步骤：先在酶联板上包被X抗羊IgG，再包被羊抗人IgG。通过二次包被的方法，有利于增长羊抗人IgG的空间臂，使得羊抗人IgG在酶联板上能够垂直竖起，这样设置有利于降低待测样本的添加量，减少了空间位阻，提高了反应效率，灵敏度和特异性。

在本发明应用较佳的实施例中，上述包被X抗羊IgG的包被时间为15-18h，X抗羊IgG的稀释比例为1:1000～5000，包被羊抗人IgG的包被时间为15-18h，羊抗人IgG的稀释比例为1:1000～10000；

优选的，包被X抗羊IgG的包被时间为16h，X抗羊IgG的稀释比例为1:2500，包被羊抗人IgG的包被时间为16h，羊抗人IgG的稀释比例为1:6000。

HRP标记抗体标签包括如下步骤：透析、氧化、终止氧化、交联、还原、透析和收酶的步骤。

一种HIV新发感染试剂盒的检测方法，在酶联板上加入待测样本，强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)和阴性对照(NC)，经过温育，洗板后，在酶联板上加入抗原HIV，温育，洗板，最后加入显色液和终止液分别进行显色反应和终止显色反应，在单波长450nm或双波长450/630nm下测定吸光度值。该检测方法反应时间短，准确率高，漏检率低。

一种用于区分HIV-1新近和慢性感染的检测方法，通过测得的吸光度值来判断待测样本中HIV抗体的含量，判断被测对象处于HIV新近或者慢性感染。该检测方法对于新发感染的HIV检测准确率高。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种HIV新发感染检测试剂盒，该试剂盒采用间接标记的方法，不对抗原进行直接的酶标记，通过在抗原上引入标签，再在标签上通过亲和反应连接上酶标的标签抗体，避免了假阳性的发生，提高了检测的灵敏度，采用一步酶反应法，极大缩短了检测时间，灵敏度高，特异性强，稳定性好，能够同时检测我国HIV流行亚型B、E和D共3种抗原。本发明提供了一种HIV新发感染检测试剂盒的制备方法，该制备方法采用二次包被的方法包被酶联板，且通过自适应调节HIV-1 B、E和D蛋白片段的添加量有效避免了HRP直接结合在BED抗原上而造成的活性损失，而且增加了B、E、D这3个多肽反应的均一性，使针对不同片段的血清样本的反应非常一致，提高了检测的准确率。此外，极大降低了检测原料的添加量，有利于进行微量样本的检测，减少了空间位阻，提高了反应效率、灵敏度和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明的技术路线图；

图2为BED-Ag间接标记HRP的示意图；

图3为二次包被抗体的示意图；

图4为校准品的标准曲线图；

图5为试验结果的判断图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

参照图1所示，本发明根据捕获法原理，将鼠抗人IgG、羊抗人IgG作为包被的主要原料进行筛选、鼠抗羊IgG作为包被的辅助原料，通过不同的包被缓冲液、包被温度、封闭缓冲液、封闭方式的调试检测，根据检测结果最终选择二次包被方法，先包被鼠抗羊IgG，再包被羊抗人IgG，且选定最适的包被条件。辣根过氧化物酶(hrp)标记鼠抗Trx，对标记的条件进行摸索，并与单独表达的Trx-B、Trx-E、Trx-D 3株重组抗原按适当的反应比例混合，组成酶结合物。十字交叉组合检测包被板和酶结合物，选出最佳的组合条件，分别检测血清样本和稳定性两个性能指标，根据新发感染率和稳定性的试验结果最终确定鼠抗羊IgG、羊抗人IgG的包被浓度和酶结合物的使用浓度。

实施例1

辣根过氧化物酶(HRP)间接标记鼠抗Trx抗体

制备抗原：

将HIV-1 B、E和D三个肽段的核苷酸进行全基因合成得到HIV-1 B、E和D三种目的基因，将用于合成连接肽的核苷酸序列1分别与HIV-1 B、E和D三种目的基因连接，经NcoI和XhoI双酶切和DNA连接酶连接，将目的基因连入pET30a-Trx表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，最终获得三种目的蛋白。三种抗原在大肠杆菌中均为包涵体表达，将菌体超声破碎后，离心收集沉淀，经包涵体裂解，纯化后获得蛋白纯度>85％的三种目的蛋白Trx-B、Trx-E和Trx-D，三种目的蛋白可用于直接包被酶标板或标记HRP。

辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠抗Trx抗体

具体包括如下步骤：

(1)透析

用50mM PH 9.5碳酸盐缓冲液把鼠抗Trx进行透析，原料与透析液的比例为1：200进行透析，2h需换一次透析液共透析两次。

(2)氧化

用超纯水配置10mg/ml HRP液体，加入新配0.1M NaIO₄溶液，体积比为4：1，避光搅拌25分钟。

(3)终止氧化

氧化完成后在HRP溶液中加入稀释20倍后的乙二醇溶液，乙二醇溶液与NaIO₄溶液所加入体积相同，继续避光搅拌30分钟。

(4)交联

将步骤(3)中终止氧化后的反应液加至步骤(1)中透析后的抗体溶液透析袋中，混匀后用50mM PH9.5碳酸盐缓冲液进行透析4h，每隔2h换液一次。

(5)还原

将步骤(4)交联反应后的溶液中加入新配的10mg/ml NaBH₄溶液进行还原反应，步骤(4)交联反应后的溶液与NaBH₄溶液体积比例为1：0.4，充分混匀后，再置于4℃平衡2h。

(6)透析

将步骤(5)中还原后的溶液装入透析袋中，用20mM TBS PH8.0缓冲液透析，还原后的酶标抗原与透析液的比例为1：200进行透析，2h需换一次透析液，共透析两次。

(7)收酶

将得到的成品酶中加入等体积的甘油，混匀，－20℃保存；制得带有Trx标签的重组抗原Trx-B，Trx-E和Trx-D。

参照图2所示，将回收得到的标记酶分别与重组表达的带有Trx标签的重组抗原按照1：23的比例混合，组成酶结合物。其中，重组抗原中Trx－B，Trx－E和Trx－D的占比分别为1：1：1。这种间接标记方法增加了空间臂，提高了反应效率；增加了血清样本与Trx-B、Trx-E、Trx-D的反应的均一性；使标记得率、活性得到了很大的提升。

实施例2

试剂盒的制备

试剂盒主要包括如下表1中的成分：

表1试剂盒中的组分

制备酶联板

96孔板、封闭液、样本稀释液、酶稀释液、强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)、阴性对照(NC)、封板膜、TMB显色液A液、TMB显色液B液、终止液均购自英科新创(厦门)科技有限公司。

用包被缓冲液(50mM pH9.6的碳酸缓冲液)把鼠抗羊IgG抗体1：2500的比例进行稀释混匀，按100ul/孔加入到96孔板中，用保鲜膜包裹，4℃恒温箱放置16小时，直接甩干包被液，再把羊抗人IgG抗体按1：6000的比例进行稀释混匀，按100ul/孔加入到96孔板中，保鲜膜包裹，37℃恒温箱放置16小时。洗板1次，扣干，按200ul/孔加入封闭液，保鲜膜包裹，在37℃恒温箱放置2小时。甩掉板孔中的封闭液，将甩干的酶标板置于干燥间(温度24±4℃、湿度﹤25％)过夜干燥(18h)。干燥完的酶标板装入铝箔袋封中，加入干燥剂，抽真空包装后放入4℃冰箱中储存。

参照图3所示，二次包被后的酶联板上羊抗人IgG能垂直竖起，减少了待测原料的使用量，减少了空间位阻，提高了反应效率、灵敏度和特异性。

实施例3

试剂盒的检测方法

1)编号：取所需数量的包被好的微孔条，置于板架上，并做好标识。

2)加样：样本、校准品(CAL)及阴、阳性对照先用样本稀释液进行100倍的稀释混匀，然后按顺序分别在相应孔中加入100ul稀释后的样本、校准品(CAL)及阴、阳性对照。

3)温育：将步骤(2)的酶联板在37℃恒温箱中温育60min。

4)洗板：用洗涤缓冲液充分洗涤步骤(3)中温育后的酶联板5次，然后扣干(洗涤液浸泡时间为60秒)。

5)加酶：向步骤(4)中洗板后的孔中加入酶结合物，每孔加入酶结合物100ul。

6)温育：将加酶后的酶联板置于37℃恒温箱中温育30min(可以根据需要在酶联板上覆盖封板膜)。

7)洗板：重复步骤4)。

8)显色：向经过步骤(7)洗板后的酶联板中加入底物A、B液，每孔加入TMB显色液A液、TMB显色液B液各50ul，轻拍混匀后，置于37℃恒温箱中温育30min。

9)终止：在加入显色液后的酶联板上每孔加入终止液50ul，混匀。

10)测定：用酶标仪在双波长450/630nm下测定各孔的A值，并记录结果。

初筛试验加样顺序如下表2所示：

表2初筛试验加样顺序

NC	HPC	6	14	22	30	38	46	54	62	70	78
												NC	HPC	7	15	23	31	39	47	55	63	71	79
CAL	HPC	8	16	24	32	40	48	56	64	72	80
												CAL	1	9	17	25	33	41	49	57	65	73	81
CAL	2	10	18	26	34	42	50	58	66	74	82
												LPC	3	11	19	27	35	43	51	59	67	75	83
LPC	4	12	20	28	36	44	52	60	68	76	84
												LPC	5	13	21	29	37	45	53	61	69	77	85

确认试验加样顺序如下表3所示：

表3确认试验加样顺序

试验数值的选择标准：

(1)选择中位数作为校准品、弱阳性对照、强阳性对照和待检样本(确认试验)的OD值。以平均值作为阴性对照的OD值。

(2)将校准品按照倍比的方法进行稀释，稀释5个梯度，根据实施例3中的试剂盒的检测方法进行吸光度值的检测，用检测的吸光度值绘制标准曲线，参照图4所示。

强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)和阴性对照(NC)的原始OD值参照表4所示。

表4原始OD值

OD值	Mean OD+2SD
		NC	0.125±2(0.063)
CAL	0.865±2(0.243)
		LPC	0.500±2(0.150)
HPC	1.350±2(0.375)

强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)和阴性对照(NC)的OD值范围参照表5所示。

表5 OD值范围

OD值	NC	CAL	LPC	HPC
					最小值	0.000	0.380	0.200	0.600
最大值	0.250	1.350	0.800	2.100

可以得出强阳性对照(HPC)、弱阳性对照(LPC)、校准品(CAL)和阴性对照(NC)的ODn值范围参照表6所示。

表6 ODn值范围

OD值	NC	CAL	LPC	HPC
					最小值	0.000	1.000	0.400	1.200
最大值	0.300	1.000	0.750	1.900

保证每次试验的校准品、对照品OD值和ODn值均须在以上可接受范围内，否则试验不成立，必须进行复检。

实施例4

试验结果的分析

根据中国疾控中心专家的前期研究表明，CUTOFF值即ODn＝0.8表示平均阳转时间为168天。参照图5所示，ODn为0.8时可以减少AIDS病人错分为近期感染的几率，进而得到较好的近期感染的预测值。当ODn超过1.2时，判断检测样本为既往感染样，当ODn低于或等于1.2时，进行二次复检确认试验，若二次复检ODn值大于0.8，则判断检测样本为既往感染样，若二次复检ODn值小于或等于0.8，则判断检测样本为新发感染样。

新发感染率的计算

美国疾病预防控制中心和全球艾滋病协调办公室，联合国艾滋病规划署和世界卫生组织全球艾滋病和性病工作组联合推荐的，用于横断面样本的新发感染率的计算公式如下：

I_F代表新发感染率；

N代表调查中阴性样本数量；

P代表调查中阳性样本数量；

R代表阳性样本中被判定为新近感染的样品的数量；

ω代表平均窗口期；

FRR代表假近期感染率。

从计算公式中可以看出，窗口期ω和假近期感染率FRR是影响新发感染率估算准确与否的关键影响因素。因此，在应用该公式计算新发感染率时推荐以下三条前提条件：

a)有合适的样品群用于估算新发感染率和当地的FRR系数，获得本地区或自己国家的FRR值，并且该校正系数准确可靠；中国CDC对国内样本评估显示。FRR为2.3％；

b)有抗病毒治疗史的感染者的样本应排除在外，不纳入新发感染率的计算；

c)不符合纳入检测条件的样本，尽可能删除。

实施例5

针对一次包被酶联法和二次包被酶联法的灵敏度和特异性检测

取确诊的HIV阳性血清96例，阴性血清823例，按照实施例2和实施例3中的包被方法和试剂盒的检测方法进行灵敏度和特异性的检测。检测结果参照表7和表8所示。由表7的灵敏度检测结果可以得出，二次包被方法阴性OD值比一次包被方法的阴性OD值要低，这说明二次包被方法所带来的背景色影响较少，此外，二次包被方法的校准品(CAL)、弱阳性对照(LPC)以及强阳性对照(HPC)的OD值要比一次包被方法所测得的OD值要大，灵敏度更高。由表8中的特异性检测结果可以得出，二次包被的方法比一次包被的方法特异性高，漏检率大幅下降。

表7两种包被方法的灵敏度检测结果

表8两种包被方法的特异性检测结果

实施例6

针对直接标记法和间接标记法的灵敏度和准确性检测

选择经CDC确证的艾滋新发感染血清8例，既往感染血清10例按试剂盒检测方法进行检测，选择HRP直接标记和间接标记两种方法平行检测。检测结果参照表9和表10所示，由表9和表10可以得出本申请间接标记HRP的方法新发感染准确率要比直接标记的准确率要高，本申请间接标记HRP的方法检测既往感染符合率要比直接标记要高。经分析，这是由于间接法中HRP通过标记鼠抗Trx，鼠抗Trx与带有Trx的抗原亲和连接从而降低了误检率。直接法HRP直接标记抗原，抗原上多个赖氨酸游离氨基与HRP进行反应，增加了误检率。这种间接标记方法增加了空间臂，提高了反应效率；增加了鼠抗Trx-HRP与Trx-B、Trx-E、Trx-D的反应的均一性；使标记得率、活性得到了很大的提升。

表9两种标记方法的灵敏度检测结果

表10两种标记方法的准确性检测结果

实施例7

新发感染试剂盒针对新发HIV新发感染率检测和稳定性检测

选取经CDC确证的艾滋新发感染血清88例，既往感染血清126例。按实施例3中的试剂盒检测方法进行检测。进口BED试剂盒(厂家：SEDIA Biosciences批号：HD1301)和本发明开发的试剂盒同时进行检测，检测结果参照表11。由表11中的检测结果可以得出，本发明提供检测试剂盒在新发感染检测准确率具有较强的竞争力，既往感染检测符合率也明显具有较强的竞争力。

表11新发感染率的检测结果

新发感染试剂盒稳定性实验：

随机抽取同批生产的待检试剂盒分成2份，1份置于4℃冰箱中，另1份置于37℃恒温箱中6天后取出放入4℃冰箱中平衡过夜，用阳性关键质控品HPC进行稳定性检测。

结果判定：4℃活性残存率＝(初检4℃放置的试剂盒对阳性关键质控品的检测B值)/(37℃放置6天试剂盒+4℃放置12个月试剂盒对阳性关键质控品的检测A值)，4℃活性残存率比值越高稳定性越好。试验结果参照表12所示，由表12可以得出，本发明提供的试剂盒稳定性较好。

表12试剂盒稳定性检测结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京新创生物工程有限公司

<120> 一种HIV新发感染检测试剂盒和制备方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggc 6

<210> 2

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccaagcgc gtattctggc ggtagagcgt tatctgaaag accaacaact cctcggcatc 60

tggggttgtt ctggtaaact gatttgcacc actacggctc ct 102

<210> 3

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcaggcac gtgtactggc agtagaacgt tacctcaagg accaaaagtt tctgggtctg 60

tggggctgtt ccggtaagat catctgtact actgctgcgc c 101

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgcaagcac gtatcctggc aatcgaacgc tatctccaag atcagcagct cctgggcatt 60

tggggttgta gcggtaagca tatctgtacg accacc 96

<210> 5

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Gly

1

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln

1 5 10 15

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Thr

20 25 30

Ala Pro

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Lys

1 5 10 15

Phe Leu Gly Leu Trp Gly Cys Ser Gly Lys Ile Ile Cys Thr Thr Ala

20 25 30

Ala Pro

<210> 8

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Leu Gln Asp Gln Gln

1 5 10 15

Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys His Ile Cys Thr Thr Thr

20 25 30

Claims

1.一种HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，包括检测抗原，所述检测抗原为重组抗原，所述重组抗原包括HIVgp41中的HIV-1 B、E和D蛋白片段，所述HIV B、E和D蛋白片段均带有标签；所述标签上通过亲和识别连接有与所述标签相匹配的抗体标签，所述抗体标签上标记有酶；

所述HIV新发感染检测试剂盒还包括酶联板，所述酶联板上包被有X抗羊IgG和羊抗人IgG两种原料，X为鼠，兔和猪中的任意一种，所述X抗羊IgG的稀释比例为1:1000～5000，所述羊抗人IgG的稀释比例为1:1000～10000；

所述HIVgp41中的HIV-1 B的核苷酸序列如序列2所示，所述HIVgp41中的HIV-1 E的核苷酸序列如序列3所示，所述HIVgp41中的HIV-1 D的核苷酸序列如序列4所示，HIV-1 B的氨基酸序列如序列6所示，所述HIVgp41中的HIV-1 E的氨基酸序列如序列7所示，所述HIVgp41中的HIV-1 D的氨基酸序列如序列8所示。

2.根据权利要求1所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，所述标签为Trx标签，Flag标签，MBP（麦芽糖结合蛋白），GST（谷胱甘肽巯基转移酶），Avi 标签，SUMO标签，c-Myc标签和HA标签中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，所述标签为Trx标签。

4.根据权利要求1所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，所述抗体标签为鼠抗标签，所述酶选自辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（AP），葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶（HRP）。

6.根据权利要求1所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，所述HIV B、E和D蛋白片段分别通过设置连接肽与所述标签连接，所述连接肽的核苷酸序列如序列1所示，所述连接肽的氨基酸序列如序列5所示。

7.根据权利要求1所述的HIV新发感染检测试剂盒，其特征在于，X为鼠，所述X抗羊IgG的稀释比例为1:2500；所述羊抗人IgG的稀释比例为1:6000。

8.一种如权利要求1所述的HIV新发感染试剂盒的制备方法，其特征在于，包括重组抗原的制备，将HIVgp41中的HIV-1 B、E和D分别进行全基因合成得到HIV-1 B、E和D三种目的基因，将三种目的基因转入带有所述标签的载体中，分别表达获得带有所述标签的HIV-1B、E和D蛋白片段，再将HIV-1 B、E和D蛋白片段分别按比例混合制得带有标签的重组抗原；

还包括酶联板的制备，所述酶联板的制备采用的是二次包被方法，具体包括如下步骤：先在酶联板上包被X抗羊IgG，再包被羊抗人IgG。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，将HIV-1 B、E和D蛋白片段分别按照1：1：1的比例混合制得带有标签的重组抗原。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，还包括在带有标签的重组抗原上通过亲和识别连接抗体标签，包括如下步骤：先将所述抗体标签上标记酶形成酶标物，再将所述酶标物与带有所述标签的重组抗原按照1:20-30的比例混合，亲和连接，组成酶结合物。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述酶标物与带有所述标签的重组抗原按照1:23的比例混合。

12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述包被X抗羊IgG的包被时间为15-18h，所述X抗羊IgG的稀释比例为1:1000～5000，所述包被羊抗人IgG的包被时间为15-18h，所述羊抗人IgG的稀释比例为1:1000～10000。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述包被X抗羊IgG的包被时间为16h，所述X抗羊IgG的稀释比例为1:2500，所述包被羊抗人IgG的包被时间为16h，所述羊抗人IgG的稀释比例为1:6000。