CN117571988A - 一种血筛多线试纸条、试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血筛多线试纸条、试剂盒及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域，血筛多线试纸条包括金标结合垫，金标结合垫上包括四种生物原料与胶体金复合物的涂层，四种生物原料分别为乙型肝炎病毒单克隆抗体‑标记抗体、丙型肝炎病毒重组抗原‑标记抗体、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原‑标记抗体和梅毒重组抗原‑标记抗体，本发明可实现一次加样同时检测乙型肝炎病毒表面抗原/丙型肝炎病毒抗体/人类免疫缺陷病毒抗体/梅毒螺旋体抗体四项，使用样本量少、使用便捷、操作简单，可操作性强、耗时短，可在20分钟内得到检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体的说，涉及一种血筛多线试纸条、试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
近年来研究表明，人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、乙型肝炎病毒（HBV）和梅毒（Syphilis）均会造成慢性感染，其传播途径为血液传播、母婴传播、性行为传播和注射传播。目前全球有3300多万人感染人类免疫缺陷病毒。全球丙型肝炎的感染率约为3%，约1.7亿人，每年新增丙型肝炎患者约3.5万例，而在20亿感染乙型肝炎病毒的患者中，超过3.5亿的人会发展成为慢性乙型肝炎，这些慢性感染者具有较高的风险发展为肝硬化和肝癌，每年大约有100万人死于此。全球每年梅毒的感染人数接近1200万，感染比率也呈上升趋势。另外，患者手术前这些指标的检测尤为重要。进行这一检测主要是为了避免可能的医源性感染、不必要的纠纷、加强医护工作。
随着分子生物学技术的飞速发展，实验室检测方法主要有酶联免疫吸附试验、免疫印迹、化学发光微粒免疫分析技术、PCR等，但这些需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员进行操作，不能满足非实验室等基层现场条件下的检测要求，且操作比较繁琐，耗时比较长，不利于大量样本的检测。因此针对上述问题，有必要研发一种检测试剂，实现一次加样可同时检测多项传染病（乙型肝炎病毒表面抗原/丙型肝炎病毒抗体/人类免疫缺陷病毒抗体/梅毒螺旋体抗体（HBsAg/HCV//HIV/TP））。但同时检测多项传染病，不同产品之间可能存在较严重的干扰，容易降低试剂的性能。
在免疫层析平台，胶体金易和蛋白质、抗体等生物大分子结合，但蛋白分子量大小不同、空间结构存在差异，这就造成了在与胶体金结合上的难度。如对于蛋白较小的抗原很难直接用于胶体金标记，需要通过标记抗体进行偶联实现与胶体金的的结合。因此，如何减少反应过程中存在的干扰成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血筛多线试纸条、试剂盒及其制备方法和应用，可实现一次加样同时检测乙型肝炎病毒表面抗原/丙型肝炎病毒抗体/人类免疫缺陷病毒抗体/梅毒螺旋体抗体四项，使用样本量少、使用便捷、操作简单，可操作性强、耗时短，可在20分钟内得到检测结果；
本发明还提供一种标记抗体的制备，该标记抗体可实现同时偶联不同的抗原和抗体，节约生物原料的同时，避免了标记过程中不同抗原、抗体之间或与其他蛋白之间的交叉反应，减少了反应过程中存在的干扰。用其制备金标垫，应用于血筛多线试纸条的制备中，与传统单个产品单独标记相比，产品的灵敏度或特异性更优，进而提升试剂的整体性能，节约试剂成本。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种血筛多线试纸条，包括金标结合垫，金标结合垫的制备采用同一种标记抗体同时偶联四种靶向蛋白，分别制备不同的金标液体，再按照体积比2:2:2:1的比例混合涂布制备成金标结合垫，所述四种靶向蛋白分别为乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体、丙型肝炎病毒重组抗原、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原和梅毒重组抗原。
所述标记抗体的制备步骤如下：
（1）标签蛋白的制备：
1）表达载体构建：利用基因重组技术将3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG插入到表达载体中；
2）转化宿主细胞：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中进行扩大培养；
3）蛋白提取：破碎宿主细胞，提取扩大培养后表达的3*FLAG标签蛋白，利用亲和层析法纯化3*FLAG标签蛋白。
（2）杂交瘤细胞株建立：
1） 使用纯化后获得的3*FLAG标签蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只）；
2） 于免疫后2周进行二免（10-30μg/只）；
3） 二免2周后取小鼠脾细胞并通过PEG使其与SP2/0细胞进行融合，使用HAT培养基筛选融合后的杂交瘤细胞；
4） 将筛选出的杂交瘤细胞扩大培养，并用表达后的3*FLAG蛋白包被ELISA板，对扩大培养后的细胞裂解液进行检测，确认表达FLAG抗体；
（3）目的蛋白的提取：
1） 杂交瘤细胞株继续扩大培养；
2） 裂解细胞提取表达蛋白；
3） 采用亲和层析法纯化目的蛋白得到单一的FLAG抗体即所需的标记抗体。
所述乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术将乙型肝炎病毒表面抗原基因序列插入表达载体；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化获得乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；
4）使用纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只），并取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
5）杂交瘤细胞扩大培养并提取纯化制备乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体；
6）纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体利用碳二亚胺法与纯化后的3*FLAG标签蛋白连接，利用透析、亲和层析法对连接后的蛋白进行纯化，获得单一的连接了3*FLAG标签蛋白的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
所述丙型肝炎病毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备丙型肝炎病毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACG ACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的丙型肝炎病毒重组抗原蛋白。
所述人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCG ATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原蛋白。
所述梅毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备梅毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的梅毒重组抗原蛋白。
所述标记抗体偶联四种靶向蛋白的步骤如下：
（1）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入5-8μg/mL的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，反应15min，制得乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1。
（2）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入1-2μg/mL的丙型肝炎病毒重组抗原，反应15min，制得丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2。
（3）在80nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入3-5μg/mL的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原，反应15min，制得人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3。
（4）在20nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入0.5-1μg/mL的梅毒重组抗原，反应15min，制得人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4。
作为一种改进的技术方案，将乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1、丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3、人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4按照体积比2:2:2:1的比例用金复溶液进行稀释，以3-5μL/cm喷于亲水聚酯膜上，37℃干燥16小时即可。
作为一种改进的技术方案，所述金复溶液为100mmoL/L的Tris缓冲液中加入0.5wt%BSA、0.5wt%酪蛋白、5wt%蔗糖、1wt%PVP10、0.3wt %Tween20。
作为一种改进的技术方案，一种血筛多线试纸条，还包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸，底板上从左到右依次设置吸水纸、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫。
作为一种改进的技术方案，用稀释液分别将HCV重组抗原稀释至1.0-1.2mg/mL、HIV-Ι型重组抗原稀释至1.3-1.5mg/mL、梅毒重组抗原稀释至0.3-0.5mg/mL、乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体稀释至1.5-1.7mg/mL、羊抗鼠IgG抗体稀释至1.0-1.2mg/mL依次包被于硝酸纤维素膜上，60℃2h干燥，分别得包被HCV重组抗原的检测线T1、包被HIV-Ι型重组抗原的检测线T2、包被梅毒重组抗原的检测线T3、包被乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的检测线T4和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C，所述稀释液按照每1L、100-150mmol的PBS缓冲液中含有2wt%的蔗糖和1-3wt%的海藻糖配制而成，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.6。
作为一种改进的技术方案，所述样品垫的制备方法为：将样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，37℃干燥14h即得样品垫，样品垫处理液为每1000mL中含有150mM Tris-HCL、0.8wt%PVP40、0.02wt%Triton X-100、0.3wt%S9、0.1wt%T-20、0.3wt%BSA、0.5wt%碳酸钠、0.2-0.4wt%抗RBC单抗，pH值为10.0。
作为一种改进的技术方案，一种血筛多线试剂盒，包括上述试纸条和样本稀释液，所述样本稀释液按照每1000mL 50mM Tris-HCL缓冲液中含有0.3wt%酪蛋白、0.1wt%吐温20、0.9wt%NaCl以及防腐剂配置而成，样本稀释液pH为9.0-9.5。
一种血筛多线试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
a、检测样本为血清或血浆或全血；
b、取血清或血浆80~100µL或全血100µL，到检测卡的加样孔，全血样本需滴加1滴样本稀释液，15分钟观察结果，20分钟后结果无效
结果判断
阴性：仅质控线C处出现一条红色条带，在试纸条的检测线T1、T2、T3、T4处无红色条带出现，表明为阴性结果，样本中不含待测抗原及待测抗体；
阳性：一条红色条带出现于质控线C处，在检测线T1、T2、T3、T4处任何一种、两种、三种或四种条带出现，均表明阳性结果，样本中会含有乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体的任意一种、两种、三种或四种；
无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
（1）本发明的标记抗体可实现同时偶联不同的抗原和抗体，节约生物原料的同时，避免了单项标记过程中不同抗原、抗体之间或与其他蛋白之间的交叉反应，减少了反应过程中存在的干扰。且与胶体金的结合位点增多，增强胶体金稳定性，进而提升产品性能，用其制备金标垫，应用于血筛多线试纸条（乙型肝炎表面抗原/丙型肝炎病毒抗体/人类免疫缺陷病毒/梅毒螺旋体抗体（HBsAg/HCV//HIV/TP））的制备中，与传统单个产品单独标记相比，提升产品的灵敏度及特异性，节约试剂成本。
（2）实际应用中该试纸条及试剂盒可实现一次加样同时检测乙型肝炎病毒表面抗原/丙型肝炎病毒抗体/人类免疫缺陷病毒抗体/梅毒螺旋体抗体的四项传染病，使用样本量少、操作简单，可操作性强、耗时短，可在20分钟内得到检测结果，大大提高了检测效率，不需要昂贵的仪器设备检测，降低了检测成本，可作为诊断初筛试剂广泛使用。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种血筛多线试纸条，包括金标结合垫，金标结合垫的制备采用同一种标记抗体同时偶联四种靶向蛋白，分别制备不同的金标液体，再按照体积比2:2:2:1的比例混合涂布制备成金标结合垫，所述四种靶向蛋白分别为乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体、丙型肝炎病毒重组抗原、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原和梅毒重组抗原。
所述标记抗体的制备步骤如下：
（1）标签蛋白的制备：
1）表达载体构建：利用基因重组技术将3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG插入到表达载体中；
2）转化宿主细胞：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中进行扩大培养；
3）蛋白提取：破碎宿主细胞，提取扩大培养后表达的3*FLAG标签蛋白，利用亲和层析法纯化3*FLAG标签蛋白。
（2）杂交瘤细胞株建立：
1） 使用纯化后获得的3*FLAG标签蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只）；
2） 于免疫后2周进行二免（10-30μg/只）；
3） 二免2周后取小鼠脾细胞并通过PEG使其与SP2/0细胞进行融合，使用HAT培养基筛选融合后的杂交瘤细胞；
4） 将筛选出的杂交瘤细胞扩大培养，并用表达后的3*FLAG蛋白包被ELISA板，对扩大培养后的细胞裂解液进行检测，确认表达FLAG抗体；
（3）目的蛋白的提取：
1） 杂交瘤细胞株继续扩大培养；
2） 裂解细胞提取表达蛋白；
3） 采用亲和层析法纯化目的蛋白得到单一的FLAG抗体即所需的标记抗体。
所述乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术将乙型肝炎病毒表面抗原基因序列插入表达载体；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化获得乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；
4）使用纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只），并取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
5）杂交瘤细胞扩大培养并提取纯化制备乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体；
6）纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体利用碳二亚胺法与纯化后的3*FLAG标签蛋白连接，利用透析、亲和层析法对连接后的蛋白进行纯化，获得单一的连接了3*FLAG标签蛋白的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体。
所述丙型肝炎病毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备丙型肝炎病毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACG ACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG。
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的丙型肝炎病毒重组抗原蛋白。
所述人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCG ATTACAAGGATGACGACGATAAG。
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原蛋白。
所述梅毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备梅毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG。
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的梅毒重组抗原蛋白。
标记抗体偶联四种靶向蛋白的步骤如下：
（1）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入5-8μg/mL的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，反应15min，制得乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1。
（2）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入1-2μg/mL的丙型肝炎病毒重组抗原，反应15min，制得丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2。
（3）在80nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入3-5μg/mL的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原，反应15min，制得人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3。
（4）在20nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入0.5-1μg/mL的梅毒重组抗原，反应15min，制得人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4。
将乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1、丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3、人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4按照体积比2:2:2:1的比例用金复溶液进行稀释，以3-5μL/cm喷于亲水聚酯膜上，37℃干燥16小时即可。
所述金复溶液为100mmoL/L的Tris缓冲液中加入0.5wt%BSA、0.5wt%酪蛋白、5wt%蔗糖、1wt%PVP10、0.3wt %Tween20。
一种血筛多线试纸条，还包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸，底板上从左到右依次设置吸水纸、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫。
用稀释液分别将HCV重组抗原稀释至1.0-1.2mg/mL、HIV-Ι型重组抗原稀释至1.3-1.5mg/mL、梅毒重组抗原稀释至0.3-0.5mg/mL、乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体稀释至1.5-1.7mg/mL、羊抗鼠IgG抗体稀释至1.0-1.2mg/mL依次包被于硝酸纤维素膜上，60℃2h干燥，分别得包被HCV重组抗原的检测线T1、包被HIV-Ι型重组抗原的检测线T2、包被梅毒重组抗原的检测线T3、包被乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的检测线T4和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C。
所述稀释液按照每1L、100-150mmol的PBS缓冲液中含有2wt%的蔗糖和1-3wt%的海藻糖配制而成，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.6。
所述样品垫的制备方法为：将样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，37℃干燥14h即得样品垫，样品垫处理液为每1000mL中含有150mM Tris-HCL、0.8wt%PVP40、0.02wt%TritonX-100、0.3wt%S9、0.1wt%T-20、0.3wt%BSA、0.5wt%碳酸钠、0.2-0.4wt%抗RBC单抗，pH值为10.0。
一种血筛多线试剂盒，包括上述试纸条和样本稀释液，所述样本稀释液按照每1000mL 50mM Tris-HCL缓冲液中含有0.3wt%酪蛋白、0.1wt%吐温20、0.9wt%NaCl以及防腐剂配置而成，样本稀释液pH为9.0-9.5。
实施例2
一种血筛多线试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
a、检测样本为血清或血浆或全血；
b、取血清或血浆80~100µL或全血100µL，到检测卡的加样孔，全血样本需滴加1滴样本稀释液，15分钟观察结果，20分钟后结果无效
结果判断
阴性：仅质控线C处出现一条红色条带，在试纸条的检测线T1、T2、T3、T4处无红色条带出现，表明为阴性结果，样本中不含待测抗原及待测抗体；
阳性：一条红色条带出现于质控线C处，在检测线T1、T2、T3、T4处任何一种、两种、三种或四种条带出现，均表明阳性结果，样本中会含有乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体的任意一种、两种、三种或四种；
无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
检测结果：
（1）敏感性
相应产品标准品梯度稀释进行检测，研究血筛多线试剂盒敏感性，结果如表1：
表1
备注：“+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。
本发明血筛多线试剂盒检测乙型肝炎病毒表面抗原最低检出限为4IU/ml，检测丙型肝炎病毒抗体最低检出限为0.5NCU/ml，检测人类免疫缺陷病毒抗体最低检出限为8NCU/ml，检测梅毒螺旋体抗体最低检出限为3mIU/ml，灵敏度可达单项试剂灵敏度水平。
（2）分析特异性
对下表2中易引起相同或相似症状的交叉反应物质进行验证，结果表明在下列浓度条件下对本发明血筛多线试剂盒无影响：
表2
解释：本发明血筛多线试剂盒为同时检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体抗体的试剂盒，以上表中所列举的干扰物质是与检测的病毒具有相同或相似症状的病毒，或可造成非特异反应或干扰判读结果，用本发明血筛多线试剂盒检测含有以上浓度的干扰物质的样本，对本发明血筛多线试剂盒的阴阳性结果均无影响。
（3）本发明血筛多线试剂盒的阳性检出率验证结果如下：
1）本发明试剂盒与上市乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒对比检测乙型肝炎病毒表面抗原阴阳性样本结果如下表3：
表3
数据解释：共检测600例样本，其中乙型肝炎病毒表面抗原阳性100例，阴性500例，检测结果与上市乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒结果一致。
2）本发明血筛多线试剂盒与上市丙型肝炎病毒抗体试剂盒对比检测丙型肝炎病毒抗体阴阳性样本结果如下表4：
表4
数据解释：共检测600例样本，其中丙型肝炎病毒抗体阳性100例，阴性500例，检测结果与上市丙型肝炎病毒抗体试剂盒结果一致。
3）本发明血筛多线试剂盒与上市人类免疫缺陷病毒抗体试剂盒对比检测人类免疫缺陷病毒抗体阴阳性样本结果如下表5：
表5
数据解释：共检测550例样本，其中人类免疫缺陷病毒抗体阳性50例，阴性500例，检测结果与上市人类免疫缺陷病毒抗体试剂盒结果一致。
4）本发明血筛多线试剂盒与上市梅毒螺旋体抗体试剂盒对比检测梅毒螺旋体抗体阴阳性样本结果如下表6：
表6
数据解释：共检测600例样本，其中梅毒螺旋体抗体阳性100例，阴性500例，检测结果与上市梅毒螺旋体抗体试剂盒结果一致。
本发明血筛多线试剂盒稳定性实验考察：
将本发明试剂盒置于45℃温度下进行破坏性试验，考察周期6个月，分别于第1天、第3天、第7天、第10天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天考察试剂盒稳定性，标准如下：
1）样本稀释液物理状态
外观：无色透明澄清液体，无颗粒、絮状物、沉淀，无挥发性。
2）性能指标
乙型肝炎病毒表面抗原：
（1）阴性质控品符合率：用20份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（2）阳性质控品符合率：用3份阳性质控品检测，检测结果全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（3）最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。
（4）重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天-6个月的结果变异系数应均不大于15%。
丙型肝炎病毒抗体：
（1）阴性质控品符合率：用20份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（2）阳性质控品符合率：用20份阳性质控品检测，检测结果全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（3）最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。
（4）重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天-6个月的结果变异系数应均不大于15%。
人类免疫缺陷病毒抗体：
（1）阴性质控品符合率：用20份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（2）阳性质控品符合率：用20份阳性质控品检测，检测结果全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（3）最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。
（4）重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天-6个月的结果变异系数应均不大于15%。
梅毒螺旋体抗体：
（1）阴性质控品符合率：用20份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（2）阳性质控品符合率：用10份阳性质控品检测，检测结果全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（3）最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。
（4）重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天-6个月的结果变异系数应均不大于15%。
稳定性考察结果如下：
样本稀释液物理状态稳定性结果如下表7：
表7
试剂盒45℃加速破坏实验结果：
（1）乙型肝炎病毒表面抗原：
/>
（2）丙型肝炎病毒抗体：
/>
（3）人类免疫缺陷病毒抗体：
/>
（4）梅毒螺旋体抗体：
/>
备注：“+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。
解释：因为试剂盒除了检测试剂就是样本稀释液，这两个同时验证稳定性，样本稀释液是肉眼可观测到的状态，试剂与样本稀释液一起同时验证试剂性能指标，反映出试剂的检测结果，同时证明了样本稀释液与试剂的稳定性结果。这个地方的加减号与以上加减号意义相同，意思就是试剂加速破坏之后检测不同的阴性、阳性质控品，结果阴性均为阴性，阳性均为阳性，+++代表的是样本的显色强度，一般阳性为+++、++、+，弱阳为±，阴性为-。
经试验，在45℃可稳定至少60天，根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式：d(Ink)/dT=Ea/RT2 Ea，常温保存24个月，相当于45℃破坏60天，可满足普通医院、诊所及卫生检疫部门的临床需求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种血筛多线试纸条，其特征在于：包括金标结合垫，金标结合垫的制备采用同一种标记抗体同时偶联四种靶向蛋白，分别制备不同的金标液体，再按照体积比2:2:2:1的比例混合涂布制备成金标结合垫，所述四种靶向蛋白分别为乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体、丙型肝炎病毒重组抗原、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原和梅毒重组抗原。
2.根据权利要求1所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：所述标记抗体的制备步骤如下：
（1）标签蛋白的制备：
1） 表达载体构建：利用基因重组技术将3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG插入到表达载体中；
2） 转化宿主细胞：将构建好的表达载体转化到大肠杆菌中进行扩大培养；
3） 蛋白提取：破碎宿主细胞，提取扩大培养后表达的3*FLAG标签蛋白，利用亲和层析法纯化3*FLAG标签蛋白；
（2）杂交瘤细胞株建立：
1） 使用纯化后获得的3*FLAG标签蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只）；
2） 于免疫后2周进行二免（10-30μg/只）；
3） 二免2周后取小鼠脾细胞并通过PEG使其与SP2/0细胞进行融合，使用HAT培养基筛选融合后的杂交瘤细胞；
4） 将筛选出的杂交瘤细胞扩大培养，并用表达后的3*FLAG蛋白包被ELISA板，对扩大培养后的细胞裂解液进行检测，确认表达FLAG抗体；
（3）目的蛋白的提取：
1） 杂交瘤细胞株继续扩大培养；
2） 裂解细胞提取表达蛋白；
3） 采用亲和层析法纯化目的蛋白得到单一的FLAG抗体即所需的标记抗体。
3.根据权利要求2所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
1） 利用基因重组技术将乙型肝炎病毒表面抗原基因序列插入表达载体；
2） 将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3） 裂解细胞、提取并纯化获得乙型肝炎病毒表面抗原蛋白；
4） 使用纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫BALB/c小鼠（10-30μg/只），并取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
5） 杂交瘤细胞扩大培养并提取纯化制备乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体；
6） 纯化后的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体利用碳二亚胺法与纯化后的3*FLAG标签蛋白连接，利用透析、亲和层析法对连接后的蛋白进行纯化，获得单一的连接了3*FLAG标签蛋白的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体；
所述丙型肝炎病毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1） 利用基因重组技术制备丙型肝炎病毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACG ACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的丙型肝炎病毒重组抗原蛋白；
所述人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCG ATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原蛋白；
所述梅毒重组抗原的制备方法包括如下步骤：
1）利用基因重组技术制备梅毒重组抗原表达载体，且在目的基因N端插入3*FLAG标签基因编码序列：GATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGATCGATTACAAGGATGACGACGATAAG；
2）将制备好的表达载体转化至大肠杆菌进行扩大培养；
3）裂解细胞、提取并纯化分别获得带有3*FLAG标签的梅毒重组抗原蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：所述标记抗体偶联四种靶向蛋白的步骤如下：
（1）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入5-8μg/mL的乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体，反应15min，制得乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1；
（2）在40nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入1-2μg/mL的丙型肝炎病毒重组抗原，反应15min，制得丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2；
（3）在80nm粒径的胶体金溶液中按照10-20μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入3-5μg/mL的人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原，反应15min，制得人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3；
（4）在20nm粒径的胶体金溶液中按照10-15μg/mL的比例缓慢加入标记抗体，充分反应5min后，以7000~9000rpm离心30分钟，弃上清，加入金复溶液，100倍浓缩，然后加入0.5-1μg/mL的梅毒重组抗原，反应15min，制得人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4。
5.根据权利要求4所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：将乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体-标记抗体-胶体金复合物1、丙型肝炎病毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物2、人类免疫缺陷病毒Ι型重组抗原-标记抗体-胶体金复合物3、人梅毒重组抗原-标记抗体-胶体金复合物4按照体积比2:2:2:1的比例用金复溶液进行稀释，以3-5μL/cm喷于亲水聚酯膜上，37℃干燥16小时即可。
6. 根据权利要求5所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：所述金复溶液为100mmoL/L的Tris缓冲液中加入0.5wt%BSA、0.5wt%酪蛋白、5wt%蔗糖、1wt%PVP10、0.3wt %Tween20。
7.根据权利要求1所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：还包括底板、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水纸，底板上从左到右依次设置吸水纸、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫。
8.根据权利要求7所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：用稀释液分别将HCV重组抗原稀释至1.0-1.2mg/mL、HIV-Ι型重组抗原稀释至1.3-1.5mg/mL、梅毒重组抗原稀释至0.3-0.5mg/mL、乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体稀释至1.5-1.7mg/mL、羊抗鼠IgG抗体稀释至1.0-1.2mg/mL依次包被于硝酸纤维素膜上，60℃2h干燥，分别得包被HCV重组抗原的检测线T1、包被HIV-Ι型重组抗原的检测线T2、包被梅毒重组抗原的检测线T3、包被乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的检测线T4和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C，所述稀释液按照每1L、100-150mmol的PBS缓冲液中含有2wt%的蔗糖和1-3wt%的海藻糖配制而成，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.6。
9.根据权利要求7所述的一种血筛多线试纸条，其特征在于：所述样品垫的制备方法为：将样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，37℃干燥14h即得样品垫，样品垫处理液为每1000mL中含有150mM Tris-HCL、0.8wt%PVP40、0.02wt%Triton X-100、0.3wt%S9、0.1wt%T-20、0.3wt%BSA、0.5wt%碳酸钠、0.2-0.4wt%抗RBC单抗，pH值为10.0。
10. 一种血筛多线试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-9其中之一所述的试纸条和样本稀释液，样本稀释液按照每1000mL 50mM Tris-HCL缓冲液中含有0.3wt%酪蛋白、0.1wt%吐温20、0.9wt%NaCl以及防腐剂配置而成，样本稀释液pH为9.0-9.5。
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