CN117310164A - 一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条及试剂盒，涉及生物检测技术领域，丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条包括底板，底板上从左到右依次设有吸水层、硝酸纤维素反应膜、金标抗体反应层、生物素化抗体反应层、阻断剂反应层、样品垫层，金标抗体反应层为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体‑胶体金复合物层，本发明引入生物素放大系统，结合位点增多，在试剂上体现在阳性显色度加深，提高灵敏度，且生物阻断剂单独处理阻断剂垫进行使用，与样本充分反应，同时可调节样本流速，增加反应时间，提高试剂灵敏度的基础上，增加阻断剂与样本的反应时间，降低假阳率，使用方便，操作简单，储存方便，有效期长。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体的说，涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条及试剂盒。
背景技术
丙型肝炎病毒（HCV）急性感染后丙型肝炎病毒RNA早于抗丙型肝炎病毒抗体出现于血液中。丙型肝炎病毒RNA最早可于暴露后2周检出，丙型肝炎病毒核心抗原可在丙型肝炎病毒RNA出现后1-2天检出，而抗丙型肝炎病毒直到8-12周才能检出，也就是说，在丙型肝炎病毒感染发生后，有约8-12周的时间，仅能检出丙型肝炎病毒RNA，而抗丙型肝炎病毒抗体为阴性，即抗丙型肝炎病毒抗体检测的“窗口期”。如果仅仅检测抗-HCV抗体就会漏检，不能实现丙型肝炎的早期诊断，同时给临床输血带来潜在威胁。丙型肝炎病毒核心抗原作为HCV感染者体内出现的早期感染的标志，几乎与丙型肝炎病毒RNA同时出现。
对于慢性丙型肝炎，临床多经使用抗HCV抗体进行初筛，但其具有“窗口期”长等不足，此外，各厂家试剂间的特异性、敏感性存在一定差异，直接影响检查结果，且抗体产生后长期存在，即使结果呈阳性，亦无法准确区分患者是既往感染或现症感染。
HCV核心抗原的检测方法有核酸检测法、免疫检测法等。目前国外已经发展到了抗原抗体联合检测，即在检测抗HCV抗体的同时对HCV核心抗原（CORE antigen）进行检测。能够在病毒抗体产生之前检测出CORE抗原阳性的感染者。国内产品还处于起步阶段，因此研发高质量的HCV核心抗原检测试剂具有重要的临床意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条及试剂盒，在标记过程中巯基类还原试剂（β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、二硫苏糖醇、异硫氰酸胍等）的加入，将蛋白质中二硫键还原，阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成蛋白质分子间二硫键，防止反应中非特异性的发生，进而提升试剂特异性，非特异性反应减少，有效反应度增强，灵敏度提高。
引入生物素放大系统，结合位点增多，在试剂上体现在阳性显色度加深，提高灵敏度，且生物阻断剂单独处理阻断剂垫进行使用，与样本充分反应，同时可调节样本流速，增加反应时间，提高试剂灵敏度的基础上，增加阻断剂与样本的反应时间，降低假阳率。
本发明制备的检测试纸条、试剂盒操作方便、简单、可有效进行HCV感染者早期的辅助诊断。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，包括底板，底板上从左到右依次设有吸水层、硝酸纤维素反应膜、金标抗体反应层、生物素化抗体反应层、阻断剂反应层、样品垫层，金标抗体反应层为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物层，制备方法如下：
1）采用柠檬酸三钠还原法制备80nm胶体金溶液；
2）取制备好的胶体金溶液100mL，调节PH5.0-6.0，在胶体金溶液中缓慢加入0.5mg丙型肝炎病毒单克隆核心抗体；
3）加入10% BSA封闭剂；
4）充分反应后，以5000-8000rpm离心30分钟，弃上清，然后加入1mL金复溶液静置30-40min，制得丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物；
5）将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物中加入10-20µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应10-30min，按1:5用金复溶液进行稀释，按45-60μL /cm2均匀涂布于玻璃纤维上，50℃烘干过夜备用。
作为一种优化方案，所述8mmol/mL二硫苏糖醇的制备方法为：称取12.3g二硫苏糖醇加入到10mL PBS中，配置成8mmol/mL二硫苏糖醇溶液。
作为一种优化方案，所述金复溶液配置方法为：100mmoL/L的Tris缓冲液中加入质量百分比为0.7%的酪蛋白、质量百分比为0.3%的Tween-20、质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为3%的海藻糖、质量百分比为1%的PEG20000。
作为一种优化方案，所述生物素化抗体反应层的制备方法如下：取生物素化抗体溶液1mL，加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应20-30min，用50-100mmoL/L Tris缓冲液按1.2-1.5%使用浓度进行稀释，加入质量百分比为2-4%的海藻糖，稀释后的生物素化抗体溶液均匀涂布于玻璃纤维垫上，50℃过夜烘干。
作为一种优化方案，所述生物素化抗体溶液的制备方法如下：
1）将待生物素化的蛋白质用100mmol/L pH 8.0碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，得生物素化标记的蛋白质溶液2.0mL；
2）用1mL DMSO溶解NHSB 1mg，即终浓度为1mg/mL；
3）向生物素化标记的2.0mL蛋白质溶液中加入200μL NHSB溶液进行交联反应；
4）在室温下持续搅拌，保温2-4小时；
5）加入8μL1mol/L NH4Cl，即每25μg NHSB加1μL1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；
6）在4℃，对5）所得液体在PBS中充分透析，以除去游离的生物素；
7）将透析后液体上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1-3 mL之间洗下；
8）在7）所得液体中加入终浓度为0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA，得生物素化抗体溶液。
作为一种优化方案，所述阻断剂反应层的制备方法为：取HBR-X、HBR-5、HBR-7阻断剂，使用50-100mmoL/L Tris缓冲液分别稀释混合，终浓度均为0.7mg/mL，加入质量百分比为1-2%的海藻糖，稀释后的阻断剂溶液均匀涂布于玻璃纤维上，50℃过夜烘干。
作为一种优化方案，所述样品垫层的制备方法如下：样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，干燥得样品垫层，样品垫处理液是由100mM pH9.2的硼酸缓冲液、质量百分比为0.3%的大分子聚合物PEG20000、质量百分比为0.3-0.5%的S17、质量百分比为0.2-0.6%的曲拉通X-100、质量百分比为0.1-0.4%的蔗糖、质量百分比为0.2%的BSA配置而成。
作为一种优化方案，所述硝酸纤维素反应膜上设有检测T线和质控C线，检测T线以链霉亲和素包被，浓度为2.0mg/mL，质控C线以羊抗鸡IgG抗体包被，浓度为2.0mg/mL，均用100mmoL/L的Tris缓冲液进行稀释，并加入质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为0.5%的EDTA，依次包被于硝酸纤维素反应膜上，并于37℃密闭环境中干燥6h。
作为一种优化方案， 所述吸水层的一端搭接在硝酸纤维素反应膜的一端上，金标抗体反应层的一端搭接在硝酸纤维素反应膜的另一端上，生物素化抗体反应层的一端搭接在金标抗体反应层的另一端上，阻断剂反应层的一端搭接在生物素化抗体反应层的另一端上，样品垫层的一端搭接在阻断剂反应层的另一端上。
作为一种优化方案，一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，包括所述的试纸条和样本稀释液，样本稀释液由100mM PH7.0-7.5的PB缓冲液、质量百分比为0.3%BSA、质量百分比为0.1%吐温80以及防腐剂配制而成。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
1、传统的胶体金标记方法中，在胶体金溶液中加入丙型肝炎病毒单克隆核心抗体，反应后离心，弃上清，复融，即可完成。本发明在复融前，加入二硫苏糖醇，在保证胶体金稳定的基础上，其可将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体蛋白质二硫键还原，阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成蛋白质分子间二硫键，防止反应中蛋白聚沉，以及胶体金的聚集，发生非特异性。且与其他蛋白之间无干扰，在试剂上表现为无非特异性假阳出现，提升试剂特异性；与此同时，有效结合位点增多，在试剂上体现在阳性显色度加深，灵敏度提高。
2、传统的胶体金试剂中，硝酸纤维素反应膜检测线位置包被丙型肝炎病毒单克隆核心抗体，与胶体金标记的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体构成双抗体夹芯法检测丙型肝炎病毒核心抗原。本发明在硝酸纤维素反应膜检测线位置包被了链霉亲和素，同时增加了生物素化丙型肝炎病毒单克隆核心抗体垫，在双抗体夹芯法基础上，引入生物素放大系统，结合位点增多，在试剂上体现在阳性显色度加深，提高灵敏度。
3、传统的胶体金试剂中生物阻断剂主要添加到样品垫中。本发明生物阻断剂单独处理阻断剂垫进行使用，在与样本充分反应的基础上，可调节样本流速，增加反应时间，提高试剂灵敏度的基础上，增加阻断剂与样本的反应时间，降低假阳率。
本发明提高了试剂的灵敏度，并解决了非特异性反应引起的试剂假阳性提升了产品的特异性，使用方便，操作简单，储存方便，有效期长。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例中一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条的结构示意图。
图中，
1-底板，2-硝酸纤维素反应膜，3-金标抗体反应层，4-生物素化抗体反应层，5-阻断剂反应层，6-吸水层，7-样品垫层，8-检测T线，9-质控C线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，包括底板1，底板1上从左到右依次设有吸水层6、硝酸纤维素反应膜2、金标抗体反应层3、生物素化抗体反应层4、阻断剂反应层5、样品垫层7，吸水层6的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的一端上，金标抗体反应层3的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的另一端上，生物素化抗体反应层4的一端搭接在金标抗体反应层3的另一端上，阻断剂反应层5的一端搭接在生物素化抗体反应层4的另一端上，样品垫层7的一端搭接在阻断剂反应层5的另一端上，底板1为PS板。
所述硝酸纤维素反应膜2上设有检测T线8和质控C线9，检测T线8以链霉亲和素包被，浓度为2.0mg/mL，质控C线9以羊抗鸡IgG抗体包被，浓度为2.0mg/mL，均用100mmoL/L的Tris缓冲液进行稀释，并加入质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为0.5%的EDTA，依次包被于硝酸纤维素反应膜上，并于37℃密闭环境中干燥6h。
所述金标抗体反应层3为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物层，制备方法如下：
1）采用柠檬酸三钠还原法制备80nm胶体金溶液；
2）取制备好的胶体金溶液100mL，调节PH5.0，在胶体金溶液中缓慢加入0.5mg丙型肝炎病毒单克隆核心抗体；
3）加入10% BSA封闭剂；
4）充分反应后，以5000rpm离心30分钟，弃上清，然后加入1mL金复溶液静置30min，制得丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物；
5）将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物中加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应10min，按1:5用金复溶液进行稀释，按45μL /cm2均匀涂布于玻璃纤维上，50℃烘干过夜备用。
8mmol/mL二硫苏糖醇的制备方法为：称取12.3g二硫苏糖醇加入到10mL PBS中，配置成8mmol/mL二硫苏糖醇溶液。
金复溶液配置方法为：100mmoL/L的Tris缓冲液中加入质量百分比为0.7%的酪蛋白、质量百分比为0.3%的Tween-20、质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为3%的海藻糖、质量百分比为1%的PEG20000。
所述生物素化抗体反应层4的制备方法如下：
取生物素化抗体溶液1mL，加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应20min，用50mmoL/L Tris缓冲液按1.2%使用浓度进行稀释，加入质量百分比为2%的海藻糖，稀释后的生物素化抗体溶液均匀涂布于玻璃纤维垫上，50℃过夜烘干，得生物素化抗体反应层。
所述生物素化抗体溶液的制备方法如下：
1）将待生物素化的蛋白质用100mmol/L pH 8.0碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，得生物素化标记的蛋白质溶液2.0mL；
2）用1mL DMSO溶解NHSB 1mg，即终浓度为1mg/mL；
3）向生物素化标记的2.0mL蛋白质溶液（即含蛋白质2mg）中加入200μL NHSB溶液（即含NHSB 200μg）进行交联反应；
4）在室温下持续搅拌，保温2小时；
5）加入8μL1mol/L NH4Cl，即每25μg NHSB加1μL1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；
6）在4℃，对5）所得液体在PBS中充分透析，以除去游离的生物素；
7）将透析后液体上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1 mL之间洗下；
8）在7）所得液体中加入终浓度为0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA，得生物素化抗体溶液。
将生物素化抗体溶液置4℃，避光保存。
所述阻断剂反应层5的制备方法如下：
取HBR-X、HBR-5、HBR-7阻断剂，使用50mmoL/L Tris缓冲液分别稀释混合，终浓度均为0.7mg/mL，加入质量百分比为1%的海藻糖，稀释后的阻断剂溶液均匀涂布于玻璃纤维上，50℃过夜烘干。
所述样品垫层7的制备方法如下：
样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，干燥得样品垫层，样品垫处理液是由100mMpH9.2的硼酸缓冲液、质量百分比为0.3%的大分子聚合物PEG20000、质量百分比为0.3%的S17、质量百分比为0.2%的曲拉通X-100、质量百分比为0.1%的蔗糖、质量百分比为0.2%的BSA配置而成。
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，包括上述的试纸条、样本稀释液，样本稀释液由100mM PH7.0的PB缓冲液、质量百分比为0.3%BSA、质量百分比为0.1%吐温80以及防腐剂配制而成。
实施例2
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，包括底板1，底板1上从左到右依次设有吸水层6、硝酸纤维素反应膜2、金标抗体反应层3、生物素化抗体反应层4、阻断剂反应层5、样品垫层7，吸水层6的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的一端上，金标抗体反应层3的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的另一端上，生物素化抗体反应层4的一端搭接在金标抗体反应层3的另一端上，阻断剂反应层5的一端搭接在生物素化抗体反应层4的另一端上，样品垫层7的一端搭接在阻断剂反应层5的另一端上，底板1为PS板。
所述硝酸纤维素反应膜2上设有检测T线8和质控C线9，检测T线8以链霉亲和素包被，浓度为2.0mg/mL，质控C线9以羊抗鸡IgG抗体包被，浓度为2.0mg/mL，均用100mmoL/L的Tris缓冲液进行稀释，并加入质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为0.5%的EDTA，依次包被于硝酸纤维素反应膜2上，并于37℃密闭环境中干燥6h。
所述金标抗体反应层3为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物层，制备方法如下：
1）采用柠檬酸三钠还原法制备80nm胶体金溶液；
2）取制备好的胶体金溶液100mL，调节PH5.5，在胶体金溶液中缓慢加入0.5mg丙型肝炎病毒单克隆核心抗体；
3）加入10% BSA封闭剂；
4）充分反应后，以6500rpm离心30分钟，弃上清，然后加入1mL金复溶液静置35min，制得丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物；
5）将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物中加入15µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应20min，按1:5用金复溶液进行稀释，按50μL /cm2均匀涂布于玻璃纤维上，50℃烘干过夜备用。
8mmol/mL二硫苏糖醇的制备方法为：称取12.3g二硫苏糖醇加入到10mL PBS中，配置成8mmol/mL二硫苏糖醇溶液。
金复溶液配置方法为：100mmoL/L的Tris缓冲液中加入质量百分比为0.7%的酪蛋白、质量百分比为0.3%的Tween-20、质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为3%的海藻糖、质量百分比为1%的PEG20000。
所述生物素化抗体反应层4的制备方法如下：
取生物素化抗体溶液1mL，加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应25min，用80mmoL/L Tris缓冲液按1.3%使用浓度进行稀释，加入质量百分比为3%的海藻糖，稀释后的生物素化抗体溶液均匀涂布于玻璃纤维垫上，50℃过夜烘干，得生物素化抗体反应层。
所述生物素化抗体溶液的制备方法如下：
1）将待生物素化的蛋白质用100mmol/L pH 8.0碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，得生物素化标记的蛋白质溶液2.0mL；
2）用1mL DMSO溶解NHSB 1mg，即终浓度为1mg/mL；
3）向生物素化标记的2.0mL蛋白质溶液（即含蛋白质2mg）中加入200μL NHSB溶液（即含NHSB 200μg）进行交联反应；
4）在室温下持续搅拌，保温3小时；
5）加入8μL1mol/L NH4Cl，即每25μg NHSB加1μL1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；
6）在4℃，对5）所得液体在PBS中充分透析，以除去游离的生物素；
7）将透析后液体上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在2mL之间洗下；
8）在7）所得液体中加入终浓度为0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA，得生物素化抗体溶液。
将生物素化抗体溶液置4℃，避光保存。
所述阻断剂反应层5的制备方法如下：
取HBR-X、HBR-5、HBR-7阻断剂，使用80mmoL/L Tris缓冲液分别稀释混合，终浓度均为0.7mg/mL，加入质量百分比为1.5%的海藻糖，稀释后的阻断剂溶液均匀涂布于玻璃纤维上，50℃过夜烘干。
所述样品垫层7的制备方法如下：
样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，干燥得样品垫层，样品垫处理液是由100mMpH9.2的硼酸缓冲液、含质量百分比为0.3%的大分子聚合物PEG20000、质量百分比为0.4%的S17、质量百分比为0.4%的曲拉通X-100、质量百分比为0.3%的蔗糖、质量百分比为0.2%的BSA配置而成。
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，包括上述的试纸条、样本稀释液，样本稀释液由100mM PH7.2的PB缓冲液、质量百分比为0.3%BSA、质量百分比为0.1%吐温80以及防腐剂配制而成。
实施例3
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，包括底板1，底板1上从左到右依次设有吸水层6、硝酸纤维素反应膜2、金标抗体反应层3、生物素化抗体反应层4、阻断剂反应层5、样品垫层7，吸水层6的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的一端上，金标抗体反应层3的一端搭接在硝酸纤维素反应膜2的另一端上，生物素化抗体反应层4的一端搭接在金标抗体反应层3的另一端上，阻断剂反应层5的一端搭接在生物素化抗体反应层4的另一端上，样品垫层7的一端搭接在阻断剂反应层5的另一端上，底板1为PS板。
所述硝酸纤维素反应膜2上设有检测T线8和质控C线9，检测T线8以链霉亲和素包被，浓度为2.0mg/mL，质控C线9以羊抗鸡IgG抗体包被，浓度为2.0mg/mL，均用100mmoL/L的Tris缓冲液进行稀释，并加入质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为0.5%的EDTA，依次包被于硝酸纤维素反应膜2上，并于37℃密闭环境中干燥6h。
所述金标抗体反应层3为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物层，制备方法如下：
1）采用柠檬酸三钠还原法制备80nm胶体金溶液；
2）取制备好的胶体金溶液100mL，调节PH6.0，在胶体金溶液中缓慢加入0.5mg丙型肝炎病毒单克隆核心抗体；
3）加入10% BSA封闭剂；
4）充分反应后，以8000rpm离心30分钟，弃上清，然后加入1mL金复溶液静置40min，制得丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物；
5）将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物中加入20µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应30min，按1:5用金复溶液进行稀释，按60μL /cm2均匀涂布于玻璃纤维上，50℃烘干过夜备用。
8mmol/mL二硫苏糖醇的制备方法为：称取12.3g二硫苏糖醇加入到10mL PBS中，配置成8mmol/mL二硫苏糖醇溶液。
金复溶液配置方法为：100mmoL/L的Tris缓冲液中加入质量百分比为0.7%的酪蛋白、质量百分比为0.3%的Tween-20、质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为3%的海藻糖、质量百分比为1%的PEG20000。
所述生物素化抗体反应层4的制备方法如下：
取生物素化抗体溶液1mL，加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应30min，用100mmoL/L Tris缓冲液按1.5%使用浓度进行稀释，加入质量百分比为4%的海藻糖，稀释后的生物素化抗体溶液均匀涂布于玻璃纤维垫上，50℃过夜烘干，得生物素化抗体反应层。
所述生物素化抗体溶液的制备方法如下：
1）将待生物素化的蛋白质用100mmol/L pH 8.0碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，得生物素化标记的蛋白质溶液2.0mL；
2）用1mL DMSO溶解NHSB 1mg，即终浓度为1mg/mL；
3）向生物素化标记的2.0mL蛋白质溶液（即含蛋白质2mg）中加入200μL NHSB溶液（即含NHSB 200μg）进行交联反应；
4）在室温下持续搅拌，保温4小时；
5）加入8μL1mol/L NH4Cl，即每25μg NHSB加1μL1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；
6）在4℃，对5）所得液体在PBS中充分透析，以除去游离的生物素；
7）将透析后液体上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在3 mL之间洗下；
8）在7）所得液体中加入终浓度为0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA，得生物素化抗体溶液。
将生物素化抗体溶液置4℃，避光保存。
所述阻断剂反应层5的制备方法如下：
取HBR-X、HBR-5、HBR-7阻断剂，使用100mmoL/L Tris缓冲液分别稀释混合，终浓度均为0.7mg/mL，加入质量百分比为2%的海藻糖，稀释后的阻断剂溶液均匀涂布于玻璃纤维上，50℃过夜烘干。
所述样品垫层7的制备方法如下：
样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，干燥得样品垫层，样品垫处理液是由100mMpH9.2的硼酸缓冲液、质量百分比为0.3%的大分子聚合物PEG20000、质量百分比为0.5%的S17、质量百分比为0.6%的曲拉通X-100、质量百分比为0.4%的蔗糖、质量百分比为0.2%的BSA配置而成。
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，包括上述的试纸条、样本稀释液，样本稀释液由100mM PH7.5的PB缓冲液、质量百分比为0.3%BSA、质量百分比为0.1%吐温80以及防腐剂配制而成。
实施例4
一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）检测
a、 打开内包装，取出试剂，放在台面上。
b、加入约 100µL（若用吸管加样，垂直滴加4滴）样本于试剂加样处，若样本浓稠，加入约 50µL （1 滴）样本稀释液。
c、在20分钟判读结果，30分钟后结果无效。
（2）结果判断
阴性：仅质控线C处出现一条红色条带，在检测线T处无红色条带出现，表明丙型肝炎病毒核心抗原为阴性结果，样本中不含待测抗原或待测抗原浓度低于最低检出限；
阳性：一条红色条带出现于检测线T处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有丙型肝炎病毒核心抗原。
无效：质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
实验
（1）敏感性
外购丙型肝炎病毒核心抗原质控品，分别梯度稀释至4000、2000、1000、500、250pg/mL，分别用传统胶体金试剂和本发明试剂盒进行敏感性研究，结果如下表1：
表1
备注：“+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。
由表1可知，本发明检测丙型肝炎病毒核心抗原最低检出限为500pg/mL，灵敏度明显高于传统胶体金试剂。
（2）特异性
对下表2中易引起相同或相似症状的交叉反应物质进行验证：
表2
表2中所列举的干扰物质是与丙型肝炎病毒具有相同或相似症状的病毒，或可造成非特异反应或干扰判读结果，用本发明试剂盒检测含有以上浓度的干扰物质的样本，结果表明对本发明试剂盒的阴阳性结果均无影响。
（3）本发明试剂盒的阳性检出率验证：
本发明丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒与上市试剂盒对比检测样本阴阳性，结果如下表3：
表3
共检测92例样本，其中阳性12例，阴性80例，本发明检测结果与上市试剂盒检测结果一致。
本发明试剂盒稳定性实验考察：
将本发明试剂盒置于45℃温度下进行破坏性试验，考察周期6个月，分别于第1天、第3天、第7天、第10天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天考察试剂盒稳定性，标准如下：
1、样本稀释液物理状态
外观：无色透明澄清液体，无颗粒、絮状物、沉淀，无挥发性。
2、性能指标
（1）阴性质控品符合率：用20份阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性，且试剂盒的准确度均满足要求。
（2）阳性质控品符合率：用10份阳性（包括强、中、弱阳性）质控品检测，检测结果全部呈阳性，且试剂盒的准确度均满足要求。
最低检出限：用最低检出限参考品S进行检测，结果应为阳性。
重复性：阴性参考品、阳性参考品、最低检出限从第1天-6个月的结果变异系数应均不大于15%。
试剂盒稳定性考察结果如下：
样本稀释液物理状态稳定性结果如下表4：
表4
试剂盒45℃加速破坏实验结果如下表5：
表5
备注：“+++、++、+”代表阳性，“±”代表弱阳性，“-”代表阴性。
经试验，在45℃可稳定至少60天，根据稳定性实验原理，阿伦尼乌斯公式：d(Ink)/dT=Ea/RT2 Ea，常温保存24个月，相当于45℃破坏60天，可满足普通医院、诊所及卫生检疫部门的临床需求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：包括底板（1），底板（1）上从左到右依次设有吸水层（6）、硝酸纤维素反应膜（2）、金标抗体反应层（3）、生物素化抗体反应层（4）、阻断剂反应层（5）、样品垫层（7），金标抗体反应层（3）为固相化的丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物层，制备方法如下：
1）采用柠檬酸三钠还原法制备80nm胶体金溶液；
2）取制备好的胶体金溶液100mL，调节PH5.0-6.0，在胶体金溶液中缓慢加入0.5mg丙型肝炎病毒单克隆核心抗体；
3）加入10% BSA封闭剂；
4）充分反应后，以5000-8000rpm离心30分钟，弃上清，然后加入1mL金复溶液静置30-40min，制得丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物；
5）将丙型肝炎病毒单克隆核心抗体-胶体金复合物中加入10-20µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应10-30min，按1:5用金复溶液进行稀释，按45-60μL /cm2均匀涂布于玻璃纤维上，50℃烘干过夜备用。
2. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述8mmol/mL二硫苏糖醇的制备方法为：称取12.3g二硫苏糖醇加入到10mL PBS中，配置成8mmol/mL二硫苏糖醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述金复溶液配置方法为：100mmoL/L的Tris缓冲液中加入质量百分比为0.7%的酪蛋白、质量百分比为0.3%的Tween-20、质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为3%的海藻糖、质量百分比为1%的PEG20000。
4. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述生物素化抗体反应层（4）的制备方法如下：取生物素化抗体溶液1mL，加入10µL 8mmol/mL二硫苏糖醇，反应20-30min，用50-100mmoL/L Tris缓冲液按1.2-1.5%使用浓度进行稀释，加入质量百分比为2-4%的海藻糖，稀释后的生物素化抗体溶液均匀涂布于玻璃纤维垫上，50℃过夜烘干。
5.根据权利要求4所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述生物素化抗体溶液的制备方法如下：
1）将待生物素化的蛋白质用100mmol/L pH 8.0碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/mL，得生物素化标记的蛋白质溶液2.0mL；
2）用1mL DMSO溶解NHSB 1mg，即终浓度为1mg/mL；
3）向生物素化标记的2.0mL蛋白质溶液中加入200μL NHSB溶液进行交联反应；
4）在室温下持续搅拌，保温2-4小时；
5）加入8μL1mol/L NH4Cl，即每25μg NHSB加1μL1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；
6）在4℃，对5）所得液体在PBS中充分透析，以除去游离的生物素；
7）将透析后液体上1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管，蛋白质在1-3 mL之间洗下；
8）在7）所得液体中加入终浓度为0.5g/L叠氮钠及1.0g/L BSA，得生物素化抗体溶液。
6. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述阻断剂反应层（5）的制备方法为：取HBR-X、HBR-5、HBR-7阻断剂，使用50-100mmoL/L Tris缓冲液分别稀释混合，终浓度均为0.7mg/mL，加入质量百分比为1-2%的海藻糖，稀释后的阻断剂溶液均匀涂布于玻璃纤维上，50℃过夜烘干。
7. 根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述样品垫层（7）的制备方法如下：样品垫处理液涂布于玻璃纤维上，干燥得样品垫层，样品垫处理液是由100mM pH9.2的硼酸缓冲液、质量百分比为0.3%的大分子聚合物PEG20000、质量百分比为0.3-0.5%的S17、质量百分比为0.2-0.6%的曲拉通X-100、质量百分比为0.1-0.4%的蔗糖、质量百分比为0.2%的BSA配置而成。
8.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素反应膜（2）上设有检测T线（8）和质控C线（9），检测T线（8）以链霉亲和素包被，浓度为2.0mg/mL，质控C线（9）以羊抗鸡IgG抗体包被，浓度为2.0mg/mL，均用100mmoL/L的Tris缓冲液进行稀释，并加入质量百分比为2%的蔗糖、质量百分比为0.5%的EDTA，依次包被于硝酸纤维素反应膜（2）上，并于37℃密闭环境中干燥6h。
9.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试纸条，其特征在于：所述吸水层（6）的一端搭接在硝酸纤维素反应膜（2）的一端上，金标抗体反应层（3）的一端搭接在硝酸纤维素反应膜（2）的另一端上，生物素化抗体反应层（4）的一端搭接在金标抗体反应层（3）的另一端上，阻断剂反应层（5）的一端搭接在生物素化抗体反应层（4）的另一端上，样品垫层（7）的一端搭接在阻断剂反应层（5）的另一端上。
10.一种丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-9其中之一所述的试纸条和样本稀释液，样本稀释液由100mM PH7.0-7.5的PB缓冲液、质量百分比为0.3%BSA、质量百分比为0.1%吐温80以及防腐剂配制而成。
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