CN103207271A - 一种丙型肝炎抗体确证试剂 - Google Patents

Abstract

一种丙型肝炎抗体确证试剂，试剂包括HCV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品及阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素显色系统；用免疫层析结果判读仪或肉眼判定条带显色情况判定检测结果，进行HCV抗体的确证，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。

Description

一种丙型肝炎抗体确证试剂

技术领域

本发明涉及生物应用技术领域，特别是一种丙型肝炎抗体确证试剂。 

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是1989年由美国Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中最初发现，主要由血液、体液传播，占输血后肝炎的70％。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人感染HCV。丙型肝炎慢性化率为50％～85％，其中又有20％可发展为肝纤维化，危害十分严重。我国HCV的感染率和世界水平接近，HCV抗体携带者达4千万左右。到目前为止丙型肝炎既无有效疫苗，亦无有效的治疗方法，预防感染是唯一有效的方法。预防感染的主要措施是对HCV抗体进行有效的检测。1993年我国将HCV抗体检查列为我国法定的血源性筛查项目。ELISA法HCV抗体诊断是当前最为常用的HCV检查方法，采用HCV的C22-3、C33C、C100-3和NS5作为包被抗原，用间接法进行检测。免疫层析胶体金技术是新展起来的HCV抗体检测技术，与ELISA相比，具有检测方便、快速、适于现场检测，稳定性好等特点。但ELISA法和胶体金法都有一定的假阳性率，只能作为HCV抗体检测的初筛使用。HCV抗体检测公认的确证方法是重组免疫印迹(RIBA)试剂，只有Chiron Ortho和MP等公司生产，但这些试剂存在操作复杂，反应时间长等问题。 

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种丙型肝炎抗体确证试剂。 

实现上述目的本发明的技术方案为，一种丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于，试剂包括HCV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG， C100、C33C、C22、NS5为基因工程表达纯化制成，或用氨基酸人工合成，不含hSOD等标签蛋白，抗人IgG采用免疫纯化制备；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素组成显色系统，胶体金直径为20-100nm，SPA、亲和素为提取纯化或基因工程表达制成；HCV抗体试纸结构为NC膜，NC膜下方紧密连接的吸样垫，NC膜和吸样垫装载在塑料外壳中。 

所述HCV抗体试纸上包被有6条蛋白条带。 

所述HIV抗体试纸的结构为NC膜与吸样垫搭接在一起装入塑料壳构成的。 

所述蛋白条带都被包被在NC膜上。 

所述6条蛋白条带分别由高浓度人IgG、C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG包被而成的。 

所述显色试剂是由胶体金标记的抗人IgG或SPA构成的。 

所述显色试剂还可由胶体金标记的亲和素与生物素标记的抗人IgG或SPA混合构成的。 

所述洗涤液是含有Tween20的磷酸盐缓冲液。 

所述阳性对照品和阴性对照品都是通过人HIV抗体阳性血清处理后制得的。 

利用本发明的技术方案制作的丙型肝炎抗体确证试剂，HCV抗体试纸选用包被的C33C的NS5抗原为非HSOD融合抗原，所以与CHIRON产品相比，不需要设立HSOD条带，降低制造和判定复杂程度，但可确保判定结果；采用了胶体金显色试剂，与其它酶显色试剂相比，更为简单、直接、稳定；利用本试剂盒检测可明显缩短了检测时间，并且操作简单，本试剂盒在60min内可完成单个检测，30个检测所需时间不超过90min，而其它检测设备需时约6小时。 

附图说明

图1是本发明所述丙型肝炎抗体确证试剂的结构示意图；图2是发明所述HCV抗体试纸的剖面结构示意图； 

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1是本发明所述丙型肝炎抗体确证试剂的结构示意图，如图所示，一种丙型肝炎抗体确证试剂，试剂盒1内包含有HCV抗体试纸2、洗涤液3、显色试剂4、阳性对照品5、阴性对照品6共五个部分，且所述HIV抗体试纸、洗涤液、显色试剂、阳性对照品、阴性对照品分别装入试剂盒内的嵌置槽中。图2是发明所述HCV抗体试纸的剖面结构示意图，如图所示，所述HIV抗体试纸的结构为NC膜7与吸样垫8搭接在一起装入塑料壳9构成的，所述HCV抗体试纸上包被有6条蛋白条带10，所述蛋白条带都被包被在NC膜上，所述6条蛋白条带分别由高浓度人IgG、C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG包被而成的。 

其中，所述HCV抗体试纸制备过程为：1、包被NC膜：将蛋白用0.01M的磷酸盐缓冲液稀释成0.001-2mg/ml，优选为，高浓度人IgG为0.05mg/ml，低浓度人IgG为0.005mg/ml，C100为0.2mg/ml，C33C为1mg/ml，C22为0.5mg/ml，NS5为0.8mg/ml。NC膜选用0.45um孔径的膜，宽度30mm，长度300mm，将稀释好的抗体装载在喷膜机上，按1ul/cm划线，各线的间隔为2-5mm，优选为3mm，划线完成后，将NC膜置于30％以下的湿度干燥4小时以上；2、制备试纸：将NC膜横向切成3-8mm的宽度，优选为5mm，在NC膜下部垫上吸样垫，吸样垫为吸水材料，吸水能力不低于1.5ml，然后装入大小合适的塑料卡内，形成试纸。 

所述显色试剂可分为直接显色试剂和生物素-亲和素显色试剂两种，这两种试剂的制备过程分别为： 

1、直接显色试剂：(1)用还原法制备尝试为0.02％的20-100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；(2)用K2CO 3将胶体金pH调节成8.0，按10ug抗人IgG或SPA每ml胶体金将蛋白加入，混匀30min，离心弃上清，将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，即成为显色试剂。 

2、生物素-亲和素显色试剂：(1)用还原法制备尝试为0.02 ％的20-100nm的胶体金，优选为40nm的胶体金；(2)用无水DMSO配制10mg/ml生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，用硼酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.8)配制浓度为2mg/ml的抗人IgG或SPA溶液，按25ug/mg的比率将生物素酯加入抗体中，混合均匀并在室温下孵育4hr，将抗体溶液用PBS透析，以除去未结合的生物素，再稀释成合适的比例后，制成显色底物1；(3)用K2CO3将胶体金pH调节成8.0，按10ug亲和素每ml胶体金将蛋白加入，混匀30min，离心弃上清，将溶液用1/10体积的磷酸盐缓冲液溶解，加入微量防腐剂，为显色底物2；(4)显色底物1和2构成显色试剂。 

所述阳性对照品为人HCV抗体阳性血清，经处理后制成，基抗HCVC100、C33C、C22、NS5均为阳性；所述阴性对照品为人HCV抗体阳性血清，经处理后制成，基抗HCVC100、C33C、C22、NS5均为阴性；所述洗涤液为含0.5％Tween20的0.01M的磷酸盐缓冲液。 

所述丙型肝炎抗体确证试剂，检测方法如下： 

1、将试剂和待检血清(浆)平衡到室温；2-8℃保存的试剂需20-30min平衡至室温； 

2、将HCV抗体试纸取出，平放，向试纸的NC膜上滴加80-120ul的待检血清(浆)样本，样本将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min； 

3、向NC膜上滴加80-120ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后，再滴加80-120ul洗涤液，重复洗涤2次，此过程约5-8min； 

4、若采用直接显色系统，向NC膜上滴加80-120ul胶体金标记的抗人IgG或SPA，胶体金将将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min；若采用生物素-亲和素显色系统，向NC膜上滴加80-120ul生物素标记抗人IgG或SPA，待生物素缓慢渗入NC膜后，再滴加80-120ul洗涤液，参照步骤3，洗涤3次，此过程约5-8min，再加入80-120ul胶体金标记的亲和素，胶体金将缓慢渗入NC膜，最后进入吸样垫，此过程约2-3min； 

5、向NC膜上滴加80-120ul洗涤液，等洗涤液渗入进膜后， 再滴加80-120ul洗涤液，重复洗涤1次，此过程约4-6min； 

6、此时NC膜上将出现胶体金显色的红色条带，用专用的检测仪器或肉眼判定检测结果。 

进行上述检测时需同时平行做阳性和阴性对照，即用阳性对照品和阴性对照品同时做一次检测。 

所述HCV抗体抗确证试剂，结果判定方法如下： 

1、条带阴、阳性的判定方法： 

仪器检测方法，用免疫层析结果判读仪检测：将反应后HCV抗体试纸放入仪器内，启动设定程序，仪器将自动显示出各条带的检测结果，给出定量的值。 

肉眼判读法：直接观察指定区域内是否有显色条带出现，有条带为阳性，反之为阴性。 

2、条带强度的判定方法：条带强度分为5级： 

-：条带强度不可见或低于低浓度IgG条带的强度； 

1+：条带强度类似于低浓度IgG条带的强度； 

2+：条带强度介于低浓度IgG和高浓度IgG条带强度之间； 

3+：条带强度类似于高浓度IgG条带的强度； 

4+：条带强度高于高浓度IgG条带的强度。 

检测系统有效的判定，需满足以下所有条件： 

1、阳性对照的所有条带需显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值； 

2、阴性对照两条I gG线需显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值，余下4条带检测均需为阴性； 

3、待检样本两条IgG线应显示出肉眼可见的条带或仪器检测出有效值； 

4、所有检测试纸中高浓度I gG条带的强度需高于低浓度IgG条带。 

否则检测无效，需重新检测。 

检测结果阴阳性的判定，需在检测系统有效的情况下判定： 

阴性：C100、C33C、C22、NS5条带显色强度均为阴性； 

不确定：C100、C33C、C22、NS5条带中有一条为阳性； 

阳性：C100、C33C、C22、NS5条带中有二条或以上为阳性； 

本专利和现有的产品或专利比较，有以下的不同：(1)选用的抗原部分不同，C33C和NS5抗原为非HSOD融合抗原，所以与CHIRON产品相比，不需要设立HSOD条带，降低制造和判定复杂程度，但不影响判定结果；(2)采用了胶体金显色方法，与其它酶显色法相比，更为简单、直接、稳定；(3)明显缩短了检测时间，并且操作简单，本试剂在60min内可完成单个检测，30个检测所需时间不超过90min，而其它检测需时约6小时；(4)结果可用专用的检测仪器判定，与肉眼判定相比，可以检测出更微弱的条带，并可避免肉眼主观判定时潜在的错误。综合以上特点，本试剂是一种新的HCV抗体确证试剂，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等优点。 

实施例1：HCV抗体确证试剂盒的制造 

1、主要材料 

1.1HCV特异性抗原C100、C33C、C22、NS5：由北京京麦克莱金生物技术有限公司提供，为基因工程表达的HCV抗原，抗原不含HSOD蛋白标签；人IgG和鼠抗人IgG：由深圳菲鹏生物技术有限公司提供；NC膜：美国Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)20000、水解酪蛋白：美国Sigma公司产品；其它试剂为常规分析纯化学试剂。 

1.2检测仪器：免疫层析结果判读记录仪，型号：NS3001，天津中新科炬生物制药有限公司产品。 

1.3临床血清：由公司在相关医院获得，HCV抗体阳性样本20份，已由新加坡MP试剂检测确证；阴性样本20份，采自健康人，临床综合检测判定为阴性。 

2、主要方法 

2.1HCV抗体试纸的制备：将蛋白用0.01M的磷酸盐缓冲液稀释成不同浓度，每个蛋白均设3个浓度：高浓度人IgG为0.02、0.05和 0.1mg/ml，低浓度人IgG为0.002、0.005和0.01mg/ml，C100为0.2、0.4和0.6mg/ml，C33C为0.5、1和1.5mg/ml，C22为0.2、0.5和1.0mg/ml，NS5为0.4、0.8和1.5mg/ml；NC膜选用0.45um孔径的膜，宽度30mm，长度300mm，将稀释好的抗体装载在喷膜机上，按1ul/cm划线，各线的间隔为3mm，划线完成后，将NC膜置于30％以下的湿度干燥4小时。 

干燥完成后用切条机将NC膜横向切成5mm的宽度，在NC膜下部垫上吸水滤纸，吸水滤纸大小为15×30mm，6层吸水滤纸重叠摆放，吸水能力2-2.5ml，然后装入大小合适的塑料卡内，压紧，形成试纸。 

2.2显色系统的制备：用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M K2CO3将溶液调到pH7.0、pH8.0和pH9.0，然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入0.5mg、1mg、1.5mg鼠抗人IgG，将抗体滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0.1％的PEG2000和1％的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/m离心，弃上清，沉淀，按原体积复溶至原体积1/10的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血清，蔗糖、表面活性剂和防腐剂)中。 

2.3洗涤液的制备：为0.01MpH 7.4的磷酸缓冲液，含0.9％NaCl，0.05％Tween 20，以20倍浓缩形式保存，使用前用纯化水稀释至工作浓度。 

2.4对照品：用临床血清制成。阳性对照品：选用HCV抗体阳性血清，数份血清混合，经适当稀释，并灭活制成，用MP试剂盒检测，C100、C33C、C22、NS5均为阳性；阳性对照品：用数份健康人血清混合制成，用MP试剂盒验证为HCV抗体阴性。 

2.5检测方法：对不同浓度包被的HCV抗体试纸和不同pH标记的显色系统进行逐一配对，分别用阳性对照品和阴性对照品进行检测，检测方法如说明书所述，检测结果放入免疫层析结果判读记录仪中，设定参数，读取各反应线的GOD值，确定产品的最佳参数。 

2.6结果判定方法：如说明书所述方法进行判定。 

3、结果检测 

3.1包被抗原浓度的确定 

采用不同浓度的蛋白抗原包被后，用pH8.0标记的显色系统测试，阴性对照品测试均符合标标准，阳性对照品检测结果如下： 

表1：不同包被蛋白浓度的检测值(GOD) 

注：尝试1、2、3是包被浓度由低到高，具体值见2.1HCV抗体试纸的制备。 

参考阳性对照品里抗体的滴度和MP试剂的检测结果，对三个包被浓度优选如下：高浓度人IgG为0.05mg/ml，低浓度人IgG为0.005mg/ml，C100为0.2mg/ml，C33C为1mg/ml，C22为0.5mg/ml，NS5为0.8mg/ml。考虑到不同批蛋白抗原性的变化和批间差异，以上浓度只为参考尝试，不同批次、不同蛋白的浓度可在0.001-2mg/ml之间有所变化。 

3.2显色系统参考的确定 

采用不同浓度鼠抗人IgG，不同pH标记后，用阳性对照品进行检测，观察高、低浓度IgG的值，检测结果如下： 

表2：不同标记量、标记pH的检测值(GOD) 

分类

高浓度人IgG

低浓度人IgG

 

	0.5mg	1mg	1.5mg	0.5mg	1mg	1.5mg
							pH7.0	5.4	6.3	7.8	0.3	0.7	1.2
pH8.0	4.5	5.3	6.4	0.2	0.5	1.0
							pH9.0	4.2	4.6	5.1	0.1	0.4	0.8

兼顾到高浓度和低浓度IgG的显色的期望值，显色系统优选的参考数为pH8.0，标记量1mg抗人IgG每100ml的胶体金(10ug/ml)。 

考虑到不同批蛋白抗原性的变化和批间差异，不同批的产品标记量和pH有一定的变化。 

实施例2：临床试验 

1、主要材料 

1.1考核HCV抗体确证试剂：按实施例1优化制备的试剂。 

1.2对照HCV抗体确证试剂：新加坡MP公司产品。 

1.3临床样本：由公司在相关传染医院获得。HCV阳性样本100份，ELISA初筛HCV抗体阳性；阴性样本400份，采自健康人，临床综合检测判定为阴性。 

2、检测方法 

按各自产品说明书的方法进行，判定检测结果，并进行分析。 

3、结果：检测结果如下： 

表3：本试剂盒与MP试剂盒结果对比 

从上表检测结果可以看出，本试剂的阳性符合率为98/99＝99 ％，阴性符合率为396/396＝100％，总符合率为498/500＝99.8％，检测结果高度一致，符合临床上作为HCV抗体确证的需要。 

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于：试剂包括HCV抗体试纸、洗涤液、显色系统、阳性对照品、阴性对照品；所述HCV抗体试纸上包被了6条蛋白条带，分别是HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和2条不同浓度的人IgG；胶体金标记的抗人IgG或SPA，或是生物素标记的抗人IgG或SPA、胶体金标记的亲和素组成显色系统。

2.根据权利要求1所述的丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于：HCV抗体试纸结构为NC膜、NC膜下方紧密连接的吸样垫和装载NC膜及吸样垫的塑料外壳；NC膜从一端开始，依次包被的6条蛋白条带为高浓度人IgG、HCV重组抗原C100、C33C、C22、NS5和低浓度人IgG。

3.根据权利要求1所述的丙型肝炎抗体确证试剂，其特征在于：胶体金直径为20-100nm。

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