CN105004862B - 一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高通量联合检测丙肝病毒抗原‑抗体的试剂，本发明利用流式细胞术的原理，在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下，根据不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。利用荧光显色效果，增强了反应的灵敏度，同时利用FITC标记微球同时检测抗原和抗体的方式，可以同时对丙型肝炎病毒抗体和核心抗原进行检测。对于丙肝检测更加准确，不会漏检，达到了早发现的效果，对丙肝的预防具有很高的应用价值。

Description

一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂
技术领域
本发明属于丙型肝炎检测技术领域，具体涉及一种高通量联合检测丙肝病毒抗原-抗体的试剂。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染而引起的一种全球性传染病。据估计目前全世界有1.7亿丙肝病毒感染者，我国的丙肝感染率大约为30%，目前至少有4000~6000万丙肝患者。其中有80~85%的感染者将发展为慢性丙型肝炎，其中又有20%可发展为肝纤维化，最终有4~5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，危害十分严重。
目前，尚无针对丙型肝炎病毒的特效治疗药物，丙型肝炎疫苗的研制也因HCV快速变异而困难重重，短期内难有突破进展。因此，HCV的早期诊断对于筛查HCV传染源、指导临床治疗和预后判断有重大意义。
现有HCV在临床上的检测方式主要有PCR检测、丙型肝炎病毒抗体检测和丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，三种检测方法中，PCR检测方法灵敏度高且结果准确，但是方法操作繁琐，需要的人员技术能力强，不容易在各个医院进行推广；丙型肝炎病毒抗体检测试剂是临床上最常见的一种丙肝检测方法，但是该检测存在一个“窗口期”，即在丙肝的感染初期，病人体内还没有出现免疫性抗体，无法在早期就获得检测结果，造成漏诊的状况；丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂在最近几年开始逐渐被医院所接受，市场占有量也不断增大，但是针对于丙肝病人的后期跟踪检测，没有很好的跟踪效果。
发明内容
为了解决上述各种检测方法存在的问题，本发明提供一种高通量联合检测丙型肝炎病毒抗体及抗原的试剂。该试剂利用流式细胞术的原理，在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，在加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下，不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。采用荧光检测的原理，提高了检测的灵敏度，可以同时定性检测抗原和抗体，能够确定检测样本中是否具有丙型肝炎病毒的感染，具有很高的临床应用价值。
本发明是通过以下措施实现的：
一种化学发光法联合检测丙型肝炎病毒抗体-抗原试剂，其组分如下：
组分1（R1）FITC荧光微球试剂：
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0.1%-1%；
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.1%-1%；
Tris 12.1g/L；
BSA 0.5g/L；
PC-300 0.1%；
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC）溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：1的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的HEPES缓冲液（0.1M ，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。
FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素（FITC）溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：3的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤， 5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的HEPES缓冲液（0.1M ，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球1mL，加入1mL 含0.005g N-羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0.1M ，pH=8.0），室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝核心抗原包被抗体，加入1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4），室温震荡孵育4h，加入含01%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4）洗涤离心三次，加入00mL的HEPES缓冲液（0.1M ，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球1mL，加入1mL含0.005g N-羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的碳酸盐缓冲液（0.1M ，pH=8.0），室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝病毒混合蛋白（NS3、NS4和NS5），各种类浓度比例为1：1：1，加入1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4），室温震荡孵育4h，加入含01%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH=7.4）洗涤离心三次，加入100mL的HEPES缓冲液（0.1M ，pH=7.4）中，2-8℃放置，保存。
组分2（R2）PE标记试剂：
PE标记的HCV-cAg抗体 0.1%-1%；
PE标记的NS3蛋白 0.1%-1；
PE标记的NS4蛋白 0.1%-1%；
PE标记的NS5蛋白 0.1%-1%；
Tris 12.1g/L；
BSA 0.5g/L；
PC-300 0.1%；
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
其中PE标记抗体或蛋白制备流程为：（1）巯基化藻红蛋白（phycoerthrin PE）的制备：取600μL的15.5mg/mL盐酸巯醇亚胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2mL的3.6mg/mL的PE（藻红蛋白）中，和1.2mL磷酸盐缓冲液（0.2M，pH6.8） 混合，装入透析袋置入50mmol/L pH6.8 磷酸盐缓冲液中透析，4℃过夜，再换用50mmol/L pH7.5 磷酸盐缓冲液透析6h。（2）PE标记抗体或蛋白：取30μL含3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺（SPDP）1.1mg/mL的乙醇溶液，加入700μL含4.2mg/mL 抗体或蛋白的磷酸盐缓冲液（50mmol/L，pH7.5），在室温中反应2.5h。再加入上述巯基化藻红蛋白400μL，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用50mmol/L pH7.5 磷酸盐缓冲液4℃透析透析过夜，加入0.01%Na3N3分装，2-8℃放置，保存。
清洗液
磷酸氢二钠 1.974g/L
磷酸二氢钾 0.224g/L
氯化钠 0.9g/L
吐温-20 0.5%;
所有组分都用去离子水进行溶解，配制成溶液状态。
阳性对照
丙型肝炎病毒核心抗原 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS3） 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS4） 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS5） 1%
用小牛血清溶解。
阴性对照
BSA 4%
用小牛血清溶解。
本发明的试剂盒的使用方法如下：
（1）根据实验需要准备平底试管，做好编号；
（2）在试管中加入15μl阳性对照、阴性对照或样本；
（3）用连续移液器在试管中加入30μl R2（PE标记试剂）；
（4）置于振荡器上轻轻震荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；
（5）用连续移液器在试管中加入30μl R1（FITC荧光微球试剂），加样时要保证荧光微球试剂充分混匀；
（6）置于振荡器上轻轻振荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；
（7）将试管利用离心机5000r/min离心5min，静置2分钟，然后弧线倾倒上清液；
（8）用连续移液器在试管中加入300μl清洗液，置于振荡器上1500~2000rpm震荡20秒，至彻底混匀，重复第（7）操作1次；
（9）重复第（8）操作2次；
（10）每个试管加入1000μl清洗液，用流式细胞仪检测发光强度FL2-H。
临界值确定：阴性对照平均FL2-H值×2.1（若阴性对照平均FL2-H值≤5时，按5计算；OD>5时，按实际测定阴性对照平均FL2-H值×2.1计算）。测试标本的FL2-H值小于临界值则为HCV阴性。测试标本中的FL2-H值等于或大于临界值则为HCV阳性。
本发明试剂盒的反应原理图，如图1所示。
通过本发明的技术方案，可以获得一种同时检测丙型肝炎病毒抗原-抗的体联合检测试剂盒，该试剂盒通过在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，在加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构，在480nm激发光作用下，不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。利用荧光显色效果，增强了反应的灵敏度，同时利用FITC标记微球同时检测抗原和抗体的方式，可以同时对丙型肝炎病毒抗体和核心抗原进行检测。该高通量检测试剂盒，可以在流式细胞仪上实现对丙肝核心抗原和丙肝抗体的同时监控，更直观识别丙肝的感染时期，对临床丙肝检测具有很高的应用价值。
本发明试剂盒检测阳性的结果图，如图2所示。
本发明的丙型肝炎病毒抗原-抗体联合检测的试剂盒的创新之处在于：
（1）利用高浓度FITC标记的微球包被抗丙肝核心抗原抗体，同时利用低浓度FITC标记的微球包被丙肝其它片段抗原（NS3、NS4、NS5），通过免疫反应可以将样本中的丙肝核心抗原及多种片段抗原的抗体都可以通过免疫反应吸附到微球表面，避免了漏检。
（2）试剂盒中的PE标记物，是对包被抗体和抗原配对的对应抗体和抗原进行PE酶标记，能够与包被抗体和抗原配对应用，保证了试剂盒检测的特异性，准确检测丙肝病毒。
（3）本发明的试剂盒，选用流式细胞术的原理，利用荧光显色技术计算结果，有效地保证了试剂盒的灵敏度，即使在微量状态下也可以检测，达到早发现的效果。
（4）本发明试剂盒组分为液体组分，摆脱了酶联免疫吸附法采用固相载体的影响，不受检测样本的约束，检测结果更直观。有研究采用酶联免疫吸附法对丙肝核心抗原-丙肝抗体进行联合检测，由于样本数量原因会造成板条浪费，而且无法直观表现出丙肝核心抗原或抗体的含量，本发明试剂盒采用不同FITC含量标记的微球来区分不同检测项目，可以达到同时分别检测丙肝核心抗原和丙肝抗体的目的，对丙肝的检测和治疗跟踪都具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1为反应原理示意图；
图2为检测阳性结果图;
图3为实施例1不同感染天数样本结果图，其中，a、感染1-6天的检测结果（核心抗原与抗体均为阴性）；b、感染7-38天的检测结果（核心抗原阳性、抗体阴性）；c、感染39天后的检测结果（核心抗原与抗体均为阳性）。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1
检测试剂的组分及浓度为
组分1（R1）FITC荧光微球试剂：
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0.1%
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.1%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
组分2（R2）PE标记试剂：
PE标记的HCV-cAg抗体 0.1%
PE标记的NS3蛋白 0.1%
PE标记的NS4蛋白 0.1%
PE标记的NS5蛋白 0.1%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
清洗液：
磷酸氢二钠 1.974g/L
磷酸二氢钾 0.224g/L
氯化钠 0.9g/L
吐温-20 0.5%
所有组分都用去离子水进行溶解，配制成溶液状态。
阳性对照：
丙型肝炎病毒核心抗原 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS3） 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS4） 1%
丙型肝炎病毒抗体（抗NS5） 1%
用小牛血清溶解。
阴性对照：
BSA 4%
用小牛血清溶解。
本发明的试剂盒的使用方法如下：
（1）根据实验需要准备平底试管，做好编号；
（2）在试管中加入15μl阳性对照、阴性对照或样本；
（3）用连续移液器在试管中加入30μl R2（PE标记试剂）；
（4）置于振荡器上轻轻震荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；
（5）用连续移液器在试管中加入30μl R1（FITC荧光微球试剂），加样时要保证荧光微球试剂充分混匀；
（6）置于振荡器上轻轻振荡至彻底混匀后，37℃温育5分钟；
（7）将试管利用离心机5000r/min离心5min，静置2分钟，然后弧线倾倒上清液；
（8）用连续移液器在试管中加入300μl清洗液，置于振荡器上1500~2000rpm震荡20秒，至彻底混匀，重复第（7）操作1次；
（9）重复第（8）操作2次；
（10） 每个试管加入1000μl清洗液，用流式细胞仪检测发光强度FL2-H。
实施例2
检测试剂的组分及浓度为
组分1（R1）FITC荧光微球试剂：
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0.5%
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.5%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
组分2（R2）PE标记试剂：
PE标记的HCV-cAg抗体 0.5%
PE标记的NS3蛋白 0.5%
PE标记的NS4蛋白 0.5%
PE标记的NS5蛋白 0.5%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
清洗液、阳性对照、阴性对照及检测方法如实施例1。
实施例3
检测试剂的组分及浓度为
组分1（R1）FITC荧光微球试剂：
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 1%
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 1%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
组分2（R2）PE标记试剂：
PE标记的HCV-cAg抗体 1%
PE标记的NS3蛋白 1%
PE标记的NS4蛋白 1%
PE标记的NS5蛋白 1%
Tris 12.1g/L
BSA 0.5g/L
PC-300 0.1%
用去离子水配制，HCl调整pH为7.6。
清洗液、阳性对照、阴性对照及检测方法如实施例1。
效果测试1：
对流式细胞术联合检测丙肝病毒抗原-抗体的试剂盒进行准确度分析，利用ortho公司的试剂盒作为金标准，对于40例临床样本进行检测，对于结果进行比对，如果检测结果出现差异，送第三方检验机构利用丙型肝炎病毒PCR检测方法进行验证，检测结果如表1所示：
经过对比检测，其中8号和24号样本检测结果出现异常，经过第三方检测验证，实施例1（本发明）检测的结果更加准确，出现异常的两例样本主要是出现了自身免疫抗体，而丙型肝炎病毒核心抗原的浓度比较低，造成漏检。根据该检测结果，说明本发明的试剂盒检测结果更准确，防止了漏检的出现。
效果测试2：
通过对阳性样本稀释的方法，验证试剂盒的灵敏性。具体实施方式如下：
将一丙型肝炎病毒阳性样本利用正常阴性样本进行梯度稀释，利用实施例1、实施例2、实施例3以及ortho公司的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（酶联免疫法）分别对各稀释梯度的阳性样本检测，检测结果如表2所示。
根据表2的结果显示，ortho公司的灵敏度为1/8，而实施例1、实施例2、实施例3的灵敏度可以达到1/32，这个结果说明本发明的试剂盒具有更高的灵敏度，即使样本中的丙型肝炎病毒浓度很低也可以很好的检测到，能够达到早发现早预防的效果。
效果测试3：
对1例HCV患者感染周期系列血清样本利用实施例1、Roche 公司的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)、ortho公司的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（酶联免疫法）和丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)进行监测，将PCR-荧光法检测为阳性定为第一天，统计HCV患者感染后各方法学检测结果如表3所示：
实施例1对不同感染天数样本结果附图3所示。
通过表3的结果显示，本发明的实施例1比ortho司的丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（酶联免疫法）能够更早检测到丙肝感染，同时利用高亮微球和低亮微球区分不同检测项目，能够直观获得丙肝核心抗原和丙肝抗体的阴阳性状况，对于不同感染周期具有指导意义。
传统的丙型肝炎病毒检测试剂盒采用酶联免疫法检测，机动性差，灵敏度较低，准确性无法保证，本发明利用流式细胞术的原理，通过通过在不同浓度FITC荧光素标记的微球对应包被抗体和抗原，在加入检测样本后，与PE标记的配对抗体和抗原组成三明治夹心结构（如附图1），在480nm激发光作用下，不同浓度荧光素发射光强度不同，能够高通量达到同时检测丙肝抗原和抗体的效果。试剂盒组分为液体试剂，摆脱了96孔板的板条限制，能够更加机动，PE荧光的灵敏度远远高于酶免显色，增强了反应的灵敏度，同时利用采用不同FITC含量标记的微球来区分不同检测项目，可以达到同时分别检测丙肝核心抗原和丙肝抗体的目的，对于丙肝检测更加准确，不会漏检，达到了早发现的效果，对丙肝的预防具有很高的应用价值。

Claims (1)

1.一种高通量联合检测丙肝病毒抗原抗体的试剂，其特征在于，包括组分1、组分2、清洗液、阳性对照和阴性对照，其具体的组成如下：
1）所述组分1为FITC荧光微球试剂，包括以下浓度的组分：
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球 0.1%-1%；
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球 0.1%-1%；
Tris 12.1g/L；
BSA 0.5g/L；
PC-300 0.1%；
以上试剂用去离子水配制，HCl调整pH为7.6；
其中FITC高亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：1的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤，15000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；
FITC低亮微球制备流程为：将异硫氰酸荧光素溶解到二甲基亚砜中配制1mg/mL的浓染液，与表面被同时氨基化和羧基化的聚苯乙烯微球按照1：3的比例混匀，避光保存2h后，利用无水乙醇洗涤， 5000r/min离心5min，去除液体，将离心的固体分散到100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；
包被丙肝核心抗原抗体的FITC高亮微球制备流程：取上述FITC高亮微球1mL，加入1mL含0.005g N-羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的pH=8.0的碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝核心抗原包被抗体，加入1mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液，室温震荡孵育4h，加入含0.1%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液洗涤离心三次，加入100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；
包被丙肝病毒蛋白的FITC低亮微球制备流程：取上述FITC低亮微球1mL，加入1mL 含0.005g N-羟基丁二酰亚胺和0.005g 碳化二亚胺的 pH=8.0碳酸盐缓冲液，室温，避光，放置2h后，5000r/min离心5min，加入100μL丙肝病毒混合蛋白NS3、NS4和NS5，各种类浓度比例为1：1：1，加入1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液，室温震荡孵育4h，加入含0.1%BSA和0.5%吐温20的溶液1mL，4℃震荡孵育12h，用1mL pH=7.4磷酸盐缓冲液，洗涤离心三次，加入100mL的pH=7.4的HEPES缓冲液中，2-8℃放置，保存；
2）所述组分2由以下浓度的试剂制备而成：
PE标记的HCV-cAg抗体 0.1%-1%；
PE标记的NS3蛋白 0.1%-1；
PE标记的NS4蛋白 0.1%-1%；
PE标记的NS5蛋白 0.1%-1%；
Tris 12.1g/L；
BSA 0.5g/L；
PC-300 0.1%；
组分2用去离子水配制，HCl调整pH到7.6；
其中PE标记抗体或蛋白制备流程为：（1）巯基化藻红蛋白的制备：取600μL的15.5mg/mL盐酸巯醇亚胺加到1.2mL的3.6mg/mL的藻红蛋白PE中，和1.2mL， pH6.8磷酸盐缓冲液， 混合，装入透析袋置入50mmol/L pH6.8 磷酸盐缓冲液中透析，4℃过夜，再换用pH7.5，50mmol/L 磷酸盐缓冲液透析6h；（2）PE标记抗体或蛋白：取30μL含3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺SPDP 1.1mg/mL的乙醇溶液，加入700μL含4.2mg/mL 抗体或蛋白的pH7.5的磷酸盐缓冲液，在室温中反应2.5h；再加入上述巯基化藻红蛋白400μL，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用50mmol/L pH7.5 磷酸盐缓冲液4℃透析过夜，加入0.01%Na3N3分装，2-8℃放置，保存；
3）所述清洗液包括如下浓度的组分：
磷酸氢二钠 1.974g/L；
磷酸二氢钾 0.224g/L；
氯化钠 0.9g/L；
吐温-20 0.5%；
所有组分都用去离子水进行溶解，配制成溶液状态；
4）所述阳性对照含有如下浓度的组分：
丙型肝炎病毒核心抗原 1%；
抗NS3丙型肝炎病毒抗体 1%；
抗NS4丙型肝炎病毒抗体 1%；
抗NS5丙型肝炎病毒抗体 1%；
所用溶剂为小牛血清；
5）所述阴性对照为小牛血清溶解的4%BSA 溶液。
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