CN108982872B - 一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了本发明提供的技术方案为：一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：包括以下步骤：a)将捕获单元均匀交联到微球表面，制作成捕获微球；b)将检测抗体、检测荧光素a和标准品交联，形成竞争复合物一；c)将检测荧光素a直接与失去与检测抗体结合能力的标准品交联，形成竞争复合物二；d)将检测抗体和检测荧光素b交联，形成检测复合物；e)将捕获微球、竞争复合物一、检测复合物与含有检测目标的样本混合；本发明提供的技术优点为：不需要抗原和捕获微球充分结合，检测速度快，耗时较短，可用于门诊检测，操作步骤简单，不需要绘制标准曲线，从而节省试剂成本和检测步骤，便于实现自动化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法。
背景技术
一般来说，诊断感染性疾病，如能从标本中直接检测到病原体是最理想的，但由于某些病原体生长所需条件高，生长时间长、检出的阳性率低，给临床诊断带来一定困难，近年来逐步发展起来的用免疫学方法测定标本中的病原抗原，无疑对感染性疾病的早期诊断是一个巨大的进步，目前检测抗原或抗体的方法主要是在抗体或抗原上标记荧光素或者放射性元素，然后使用该抗体或抗原捕获样本中的抗原或抗体，再通过测定荧光或放射信号来测定抗原或抗体浓度。但现有技术中检测抗原或抗体方法需要使抗原和捕获微球充分结合，否则测量结果不准确，因此耗时较长，并且要根据同时测量的抗原标准品检测荧光素信号强度，绘制标准曲线，从而计算出样本中未知抗原的浓度，从而产生较多的试剂成本和检测步骤。
发明内容
本发明要解决的问题是：现有技术中检测抗原或抗体方法需要使抗原和捕获微球充分结合，否则测量结果不准确，因此耗时较长，并且需要用标准品绘制标准曲线，从而产生较多的试剂成本和检测步骤。
本发明提供的技术方案为：根据附图1，一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，包括以下步骤：
a)将捕获单元均匀交联到微球表面，制作成捕获微球；
b)将检测抗体、检测荧光素a和标准品交联在一起，形成竞争复合物一；
c)将检测荧光素a直接与改造后失去与检测抗体结合能力的标准品交联在一起，形成竞争复合物二；
d)将检测抗体和检测荧光素b交联在一起，形成检测复合物；
e)将捕获微球、竞争复合物一、检测复合物与含有检测目标的样本混合，或者将捕获微球、竞争复合物二、检测复合物与含有检测目标的样本混合；
f)室温避光孵育15分钟，竞争复合物一或竞争复合物二、检测目标均匀结合到捕获微球表面，检测复合物充分结合到检测目标上；
g)上流式检测，测出竞争复合物一或竞争复合物二与检测复合物的荧光比例，根据已知的竞争复合物一或竞争复合物二的浓度，计算出样本中检测目标的浓度。
作为改进，微球的大小为0.01-100um，微球的大小适合被流式细胞仪检测，微球可采用纳米复合材料、二氧化硅，陶瓷，金属等材质。
作为改进，微球表面能够均匀链接荧光标记和捕获单元，检测荧光素a和检测荧光素b荧光信号稳定，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、红色藻胆蛋白(R-PE)、别藻蓝蛋白(APC)等，捕获单元能特异结合检测目标，捕获单元为抗体或抗原，检测抗体能特异结合检测目标，且不与捕获单元冲突，二者不相互影响对方结合检测目标的能力。
标准品与检测目标有拮抗作用，标准品能够与捕获单元结合，结合方式和效率与检测目标相同，标准品的浓度已知，且可以被调整控制，标准品可以是通过改造后失去与检测抗体结合能力的材料。
通过检测并计算标准品和检测目标所交联的荧光分子信号强度比例，来获得未知目标浓度。
本发明提供的技术优点为：不需要抗原和捕获微球充分结合，检测速度快，耗时较短，可用于门诊检测，操作步骤简单，不需要绘制标准曲线，从而节省试剂成本和检测步骤，便于实现自动化。
附图说明
图1是本发明一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法的原理示意图。
图2是本发明一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法的实施例一的示意图。
图3是实施例一的FSC/SSC散点图。
图4是实施例一的APC直方图。
图5是实施例一的的FITC/PE散点图。
具体实施方式
实施例一
根据附图2，一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，包括以下步骤：
a)将检测荧光素APC均匀共价交联到5um大的羧基聚苯乙烯微球表面，制成APC含量不同的微球一和微球二，可以在流式细胞仪上通过APC荧光信号的差别来区分这两组微球；
b)克隆抗IL-2(白介素2)单抗，筛选出不相互影响对方与抗原结合的克隆抗体一和克隆抗体二；
克隆抗IL-6(白介素6)单抗，筛选出不相互影响对方与抗原结合的克隆抗体三和克隆抗体四；
c)将克隆抗体一均匀共价交联到微球一表面，制成IL-2捕获微球；
将克隆抗体三均匀共价交联到微球二表面，制成IL-6捕获微球；
d)将检测荧光素FITC共价交联到克隆抗体二上面，制成复合物，然后与原核表达纯化的蛋白IL-2孵育，使IL-2充分结合在克隆抗体二上，制作成IL-2竞争复合物(记作IgG-IL2-FITC)；
将检测荧光素FITC共价交联到克隆抗体四上面，制成复合物，然后与原核表达纯化的蛋白IL-6孵育，使IL-6充分结合在克隆抗体四上，制作成IL-6竞争复合物(记作IgG-IL6-FITC)；
e)将克隆抗体二和检测荧光素R-PE共价交联在一起，制成IL-2检测抗体(记作IL2-PE)；
将克隆抗体四和检测荧光素R-PE共价交联在一起，制成IL-6检测抗体(记作IL6-PE)；
f)将IL-2捕获微球、IL-6捕获微球、IL-2竞争复合物、IL-6竞争复合物、IL-2检测抗体、IL-6检测抗体与含有检测目标IL-2、IL-6的样本混合，检测样本类型为：抗凝外周血、血清、血浆、脑脊液、尿液、羊水、细胞培养上清等液体样本。
g)室温避光孵育15分钟，IL-2竞争复合物、检测目标IL-2均匀结合到IL-2捕获微球表面，IL-2检测抗体充分结合到检测目标IL-2上；IL-6竞争复合物、检测目标IL-6均匀结合到IL-6捕获微球表面，IL-6检测抗体充分结合到检测目标IL-6上；
h)上流式检测，分别测出IL-2竞争复合物与IL-2检测抗体、IL-6竞争复合物与IL-6检测抗体的荧光比例，根据已知的IL-2、IL-6竞争复合物的浓度，计算出样本中检测目标IL-2、IL-6的浓度。
实验步骤：以100T为例，产品于2-8℃避光存储。
A试剂(混合捕获微球)：2.6mL。浓度：每毫升含有IL2和IL6捕获微球各25000个，试剂A在使用前需涡旋混匀；
B试剂(竞争复合物)：6mL。浓度：IgG-IL2-FITC 1μg/mL(相当于6.66pmol/L)、IgG-IL6-FITC 0.8μg/mL(相当于4.88pmol/L)；
C试剂(检测抗体IgG)：1.1mL。浓度：IL2-PE 100μg/mL、IL6-PE 100μg/mL
D试剂(标准品)：重组IL2和IL6各100pg冻干粉。(溶解到1mL体积后相当于6.66pmol/L IL2和4.88pmol/L IL6)。
第一步：样本处理
1、取一支试管，分别吸取50μL试剂B和10μL试剂C加到试管底部；
2、反向法吸取50μL EDTA抗凝外周血加到试管，涡旋混匀；
3、将试剂A涡旋混悬，吸取25μL加入试管底部，涡旋混均，室温避光孵育15分钟。
4、加入300μL 1X PBS缓冲液，混均，上机检测。
第二步：仪器校准试剂准备
1、将试剂C用1mL 1X PBS缓冲液或生理盐水溶解；
2、取三支试管，分别标记为“FITC”、“PE”和“FITC+PE”；
3“FITC”管中加入50μL试剂B和25μL试剂A；
4“PE”管中加入10μL试剂C、50μL试剂D和25μL试剂A；
5“FITC+PE”管中加入50μL试剂B、10μL试剂C和50μL试剂D，涡旋混匀，然后加入25μL试剂A，再次涡旋混匀；此时“FITC+PE”管中的IL2-FITC和IL2-PE，IL6-FITC和IL6-PE的分子数量理论上是相等的。
6、避光孵育15分钟后，各加入300μL 1X PBS缓冲液，混均，上机检测。
第三步：仪器校准(以BD流式细胞仪Canto II为例)
1、在流式细胞仪上建立FSC/SSC散点图，使用log坐标，画Beads门，阈值放在APC上，值为500，见附图。建立APC直方图，使用log坐标，画IL2门和IL6门，见附图4。建立FITC/PE散点图，显示Beads门，使用log坐标，画beads门，见附图5。
2、上机检测“FITC+PE”管，调节APC通道电压，使APC直方图上最左边的峰MFI(平均荧光强度，使用几何平均荧光强度，下同)值约为1500。调节FSC和SSC通道电压，使用FSC和SSC的MFI值约为75000，用Beads门圈到Beads。调节FITC和PE通道电压，使FITC和PE通道MFI值约为1000。
3、分别上“FITC”和“PE”管，调节FITC-PE和PE-FITC的荧光补偿；
4、上机检测“FITC+PE”管，收集600events。
第四步：上机检测
将第一步处理好的样本使用第三步调整好的机器条件上机检测，收集600个events。
第五步：数据计算
计算原理：流式检测后可得到“FITC+PE”管中IL2和IL6的FITC和PE的平均荧光强度值(记作CMFI-FITC和CMFI-PE)，样本中IL2和IL6的FITC和PE的平均荧光强度值(记作SMFI-FITC和SMFI-PE)。
下面以IL2为例计算，根据第三步操作2可知：CMFI-FITC＝CMFI-PE＝1000。
设“FITC+PE”管中IgG-IL2-FITC的摩尔浓度为Ccon.FITC，重组IL2的摩尔浓度为Ccon.PE(经过抗体特异结合后重组IL2和抗体的复合物IgG-IL2-PE)，则根据试剂用量可知Ccon.FITC＝Ccon.PE＝6.66pmol/L。因此可知：CMFI-FITC/CMFI-PE＝Ccon.FITC/Ccon.PE＝1
即在所校准调整后的仪器条件下，两个IL2的浓度比等于对应的FITC和PE的荧光强度比。如果IL2浓度比发生变化，则荧光强度比值会发生相应的变化，进而可得公式：
设样本浓度为Scon.PE，竞争复合物浓度为Scon.FITC，
Scon.PE/Scon.FITC＝SMFI-PE/SMFI-FITC
Scon.PE＝SMFI-FITC×Scon.FITC/SMFI-PE
其中SMFI-FITC和Scon.FITC由流式检测得到，SMFI-PE在产品设计的时候给出，从而可以计算出样品中IL2的摩尔浓度。
但由于受流式细胞仪信号采集方式、不同抗体上标记的荧光分子数量差异和荧光补偿等的影响，我们在校准机器的时候，可以将CMFI-FITC和CMFI-PE的值调到1000左右，却很难准确调到1000，也就是说CMFI-FITC/CMFI-PE比值可能并不是1。对此，我们需要进行纠正，纠正的方式是在CMFI-FITC/CMFI-PE上乘以一个系数a，a表示荧光强度比值受到的影响大小，即荧光强度比值增加或者减小的比例，因此公式为：
Ccon.FITC/Ccon.PE＝a×CMFI-FITC/CMFI-PE＝1
a＝(CMFI-PE×Ccon.FITC)/(CMFI-FITC×Ccon.PE)＝CMFI-PE/CMFI-FITC
Scon.FITC/Scon.PE＝a×SMFI-FITC/SMFI-PE
Scon.PE＝a×Scon.FITC×SMFI-PE/SMFI-FITC
＝CMFI-FITC×Scon.FITC×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
设样本IL2的质量浓度为Sm，标准品IL2的质量浓度为Cm，IL2的相对分子量为M则：
Ccon.FITC＝Scon.FITC＝6.66pmol/L(根据试剂用量可知)
Cm＝Ccon.FITC×M＝Scon.FITC×M
Sm＝Scon.PE×M
＝CMFI-FITC×Scon.FITC×M×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
＝CMFI-FITC×Scon.FITC×M×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
＝CMFI-FITC×Cm×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
举例计算：
例如：检测得到如下数据，
| 项目 | CMFI-FITC | CMFI-PE | SMFI-FITC | SMFI-PE |
| IL2 | 926 | 1100 | 821 | 2620 |
| IL6 | 932 | 1049 | 976 | 5321 |
根据公式，IL2浓度计算如下：
Sm＝CMFI-FITC×Cm×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
＝926×100pg/mL×2620/(821×1100)
＝268.64pg/mL
同样，可计算出IL6的浓度为：
Sm＝CMFI-FITC×Cm×SMFI-PE/(SMFI-FITC×CMFI-PE)
＝932×100pg/mL×5321/(976×1049)
＝484.38pg/mL
根据实施例一可知，本发明可以在同一样本中同时检测多种检测目标，在本领域技术上是一个很大的突破。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：包括以下步骤：
a)将捕获单元均匀交联到微球表面，制作成捕获微球；
b)将检测抗体、检测荧光素a和标准品交联在一起，形成竞争复合物一；
c)将检测荧光素a直接与改造后失去与检测抗体结合能力的标准品交联在一起，形成竞争复合物二；
d)将检测抗体和检测荧光素b交联在一起，形成检测复合物；
e)将捕获微球、竞争复合物一、检测复合物与含有检测目标的样本混合，或者将捕获微球、竞争复合物二、检测复合物与含有检测目标的样本混合；
f)室温避光孵育15分钟，竞争复合物一或竞争复合物二、检测目标均匀结合到捕获微球表面，检测复合物充分结合到检测目标上；
g)上流式检测，测出竞争复合物一或竞争复合物二与检测复合物的荧光比例，根据已知的竞争复合物一或竞争复合物二的浓度，计算出样本中检测目标的浓度；
所述检测荧光素a为检测荧光素FITC；所述检测荧光素b为检测荧光素R-PE。
2.根据权利要求1所述的一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：所述微球的大小为0.01-100um。
3.根据权利要求2所述的一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：所述微球的大小为5um。
4.根据权利要求1所述的一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：检测荧光素a和检测荧光素b荧光信号稳定。
5.根据权利要求1所述的一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：标准品和捕获单元的结合方式、效率与检测目标和捕获单元的结合方式、效率相同。
6.根据权利要求1所述的一种基于微球和荧光标记的快速检测抗原或抗体方法，其特征在于：通过检测并计算标准品和检测目标所交联的荧光分子信号强度比例，来获得未知目标浓度。
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