CN108872609A - 一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，属于体外诊断技术领域，试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原、分析缓冲液、洗涤液和增强液，抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合。本发明试剂盒采用双抗原夹心法，检测的灵敏度和准确性更高。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒。
背景技术
犬细小(CP)是由犬细小病毒(CPV)感染犬所引起的急性、高度接触性传染病。犬细小病毒传染性极强，其能导致犬类和其他一些肉食动物患病甚至死亡。目前，犬细小病毒抗体的检测，多涉及到犬细小疫苗接种后免疫效果的检测，方法有多种，如胶体金免疫层析法、ELISA法等。针对犬类病毒抗体的检测，一直是检测的重点和难题之一。
时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved Fluorescence Immunoassay，TRFIA)是一种新型的体外超微量分析定量技术，它采用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点，使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为90年代后非放射性免疫分析发展的一个新里程碑。
双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似，用特异性抗原进行包被和制备抗原标记物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接测定，因此其敏感度相对高于间接法抗体检测。
因此，有必要设计出一种新型的双抗原夹心检测试剂盒，该检测试剂盒将时间分辨应用于犬细小病毒抗体的检测中，使检测的灵敏度和准确性更高。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，其检测的灵敏度和准确性更高。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，其包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液；所述犬细小病毒重组抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合；
所述包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板是通过以下步骤进行制备：
犬细小病毒重组抗原是由犬细小病毒的VP2蛋白基因序列进行原核表达的病毒样颗粒蛋白，用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将所述犬细小病毒重组抗原稀释成1～5μg/ml，然后加入包被液，4℃过夜后弃去包被液；再加入封闭液，封闭过夜后弃去封闭液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存。
本发明试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液，洗涤液和增强液，通过包被有抗原的固相载体结合样本中的抗体，形成抗原-抗体的复合物；抗原-抗体复合物再与铕标记的抗原进行结合，形成抗原-抗体-抗原-铕标记复合物；最后通过荧光检测，计算抗体的含量；本发明调整铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液中各种组分的含量和pH值，使铕标记的犬细小病毒重组抗原可以和抗体充分结合，有利于提高检测的灵敏度。
作为上述技术方案的改进，所述铕标记的犬细小病毒重组抗原是通过以下步骤进行制备：
S1)将犬细小病毒重组抗原置于带有滤膜的离心管中，再向离心管中加入标记缓冲液，离心收集；
S2)向步骤S1)收集的溶液中加入铕标记试剂，混匀后室温震荡过夜，即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品；
S3)将所述铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品上柱，用洗脱液进行洗脱，纯化后即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液。
作为上述技术方案的进一步改进，所述标记缓冲液为20mM NaH2PO4溶液，所述标记缓冲液的pH值为8.4。
作为上述技术方案的进一步改进，所述洗脱液为含1.2％KCl的50mM Tris-HCl缓冲液。
本发明对铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液进行限定：标记缓冲液中的组分和pH值，洗脱液中的组分和pH值；使抗原更好地标记铕，达到荧光量最大值。
作为上述技术方案的改进，所述包被液为含0.6％BSA和1.3％NaN3的50mM碳酸盐缓冲液，所述包被液的pH值为9.6。
作为上述技术方案的改进，所述封闭液为含2％～4％BSA、1.1％Tween-40和0.5％NaN3的50mM磷酸盐缓冲液，所述封闭液的pH值为7.4
作为上述技术方案的改进，所述分析缓冲液为含50mmol/L且pH值为7.8的Tris-HCl、9g/L NaCl、0.02％BSA(w/v)、0.05％Tween-20(v/v)和0.05％NaN3(w/v)，余量为水，分析缓冲液的pH值为7.8～8.3；洗涤液为含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤液的pH值为7.5(按照1：25倍稀释使用)；增强液为冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾组成的缓冲体系，并含有β-NTA(β-萘基甲酰三氯丙酮)、TOPO(正三辛基氧膦)和Triton x-100。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，本发明试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液，本发明调整铕标记的犬细小病毒抗原溶液和分析缓冲液中各种组分的含量和pH值，使待测抗体更好地结合包被有抗原的酶联板和铕标记的抗原，有利于提高检测的灵敏度和准确性。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，该试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液；犬细小病毒重组抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合；
包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板是通过以下步骤进行制备：
犬细小病毒重组抗原是由VP2蛋白基因序列进行原核表达的病毒样颗粒蛋白；先使用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将上述犬细小病毒重组抗原稀释成1μg/ml，然后以150μl/孔向ELISA板中加入包被液，4℃过夜后弃去包被液；再以200μl/孔向ELISA板中加入封闭液，封闭过夜后弃去封闭液液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存；
本实施例所述铕标记的抗原溶液是通过以下步骤进行制备：
S1)将犬细小病毒重组抗原置于带有滤膜的离心管中，再向离心管中加入标记缓冲液，离心收集；
S2)向步骤S1)收集的溶液中加入铕标记试剂，混匀后室温震荡过夜，即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品；
S3)将所述铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品上柱，用洗脱液进行洗脱，纯化后即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液；
本实施例中标记缓冲液为标记缓冲液为20mM NaH2PO4溶液，标记缓冲液的pH值为8.4；洗脱液为含1.2％KCl的50mM Tris-HCl缓冲液；包被液为含0.6％BSA和1.3％NaN3的50mM碳酸盐缓冲液，包被液的pH值为9.6；封闭液为含2％BSA、1.1％Tween-40和0.5％NaN3的50mM磷酸盐缓冲液，封闭液的pH值为7.4；分析缓冲液含50mol/L且pH值为7.8Tris-HCl、9g/L NaCl、0.02％BSA(w/v)、0.05％Tween-20(v/v)和0.05％NaN3(w/v)，余量为水，分析缓冲液的pH值为7.8；洗涤液为含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤液的pH值为7.5(按照1：25倍稀释使用)；增强液为冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾构成的缓冲体系，并含有β-NTA、TOPO和Triton x-100。
实施例2
本实施例提供一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，该试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液；犬细小病毒重组抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合；
包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板是通过以下步骤进行制备：
犬细小病毒重组抗原是由VP2蛋白基因序列进行原核表达的病毒样颗粒蛋白；先使用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将上述犬细小病毒重组抗原稀释成3μg/ml，然后以150μl/孔向ELISA板中加入包被液，4℃过夜后弃去包被液；再以200μl/孔向ELISA板中加入封闭液，封闭过夜后弃去封闭液液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存；
本实施例所述铕标记的抗原溶液是通过以下步骤进行制备：
S1)将犬细小病毒重组抗原置于带有滤膜的离心管中，再向离心管中加入标记缓冲液，离心收集；
S2)向步骤S1)收集的溶液中加入铕标记试剂，混匀后室温震荡过夜，即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品；
S3)将所述铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品上柱，用洗脱液进行洗脱，纯化后即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液；
本实施例中标记缓冲液为标记缓冲液为20mM NaH2PO4溶液，标记缓冲液的pH值为8.4；洗脱液为含1.2％KCl的50mM Tris-HCl缓冲液；包被液为含0.6％BSA和1.3％NaN3的50mM碳酸盐缓冲液，包被液的pH值为9.6；封闭液为含3％BSA、1.1％Tween-40和0.5％NaN3的50mM磷酸盐缓冲液，封闭液的pH值为7.4；分析缓冲液含50mol/L且pH值为7.8Tris-HCl、9g/L NaCl、0.02％BSA(w/v)、0.05％Tween-20(v/v)和0.05％NaN3(w/v)，余量为水，分析缓冲液的pH值为8.1；洗涤液为含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤液的pH值为7.5(按照1：25倍稀释使用)；增强液为冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾构成的缓冲体系，并含有β-NTA、TOPO和Triton x-100。
实施例3
本实施例提供一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，该试剂盒包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液；犬细小病毒重组抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合；
包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板是通过以下步骤进行制备：
犬细小病毒重组抗原是由VP2蛋白基因序列进行原核表达的病毒样颗粒蛋白；先使用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将上述犬细小病毒重组抗原稀释成5μg/ml，然后以150μl/孔向ELISA板中加入包被液，4℃过夜后弃去包被液；再以200μl/孔向ELISA板中加入封闭液，封闭过夜后弃去封闭液液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存；
本实施例所述铕标记的抗原溶液是通过以下步骤进行制备：
S1)将犬细小病毒重组抗原置于带有滤膜的离心管中，再向离心管中加入标记缓冲液，离心收集；
S2)向步骤S1)收集的溶液中加入铕标记试剂，混匀后室温震荡过夜，即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品；
S3)将所述铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品上柱，用洗脱液进行洗脱，纯化后即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液；
本实施例中标记缓冲液为标记缓冲液为20mM NaH2PO4溶液，标记缓冲液的pH值为8.4；洗脱液为含1.2％KCl的50mM Tris-HCl缓冲液；包被液为含0.6％BSA和1.3％NaN3的50mM碳酸盐缓冲液，包被液的pH值为9.6；封闭液为含4％BSA、1.1％Tween-40和0.5％NaN3的50mM磷酸盐缓冲液，封闭液的pH值为7.4；分析缓冲液含50mol/L且pH值为7.8Tris-HCl、9g/L NaCl、0.02％BSA(w/v)、0.05％Tween-20(v/v)和0.05％NaN3(w/v)，余量为水，分析缓冲液的pH值为8.3；洗涤液为含0.9％NaCl的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，洗涤液的pH值为7.5(按照1：25倍稀释使用)；增强液为冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾构成的缓冲体系，并含有β-NTA、TOPO和Triton x-100
实施例4
本实施例提供一种用于检测犬细小病毒抗体的方法步骤，所述试剂盒为实施例1～3所述的试剂盒，其包括以下步骤：
1)向包被好的酶联板中依次加入25μL待测样本或标准品，再加入200μL分析缓冲液，混合后进行室温温育，形成复合物；
2)去除上清液，洗涤除去未结合的物质；
3)向酶标板中继续加入150μL铕标记的犬细小病毒抗原溶液，再加入100μL分析缓冲液，混合均匀后进行温育；
4)去除上清液，洗涤除去未结合的物质；
5)加入200μL增强液，时间分辨仪上测定荧光强度，计算得到抗体含量。
实施例5线性关系考察
用样品稀释液将犬细小病毒抗体标准品稀释成0，1，10，50，100，500，1000ng/ml系列参考标准溶液，计算线性关系；结果发现，标准曲线的相关系数为R2＝0.9995，线性相关性良好；抗体的检测灵敏度为2.4ng/ml。
实施例6精密度考察
采用本发明试剂盒对精确定量的高中低三个标准品浓度进行测定，各设置10个复孔；本试剂盒的批内变异系数和批间变异系数均≤10％，测定结果见表1。
表1
如表1所述，本发明试剂盒的精密度良好。
实施例7回收率考察
采用本发明试剂盒对精确定量的高中低三个标准品浓度进行回收率的测定，测定结果见表2。
表2
如表2所示，高中低三个浓度的回收率在101.30％～104.4％之间，回收率效果良好。
实施例8
对待测抗体样品进行测定。选择经过犬细小疫苗接种的血清样本200例，未经过接种并未感染过犬细小的犬阴性血清10例。采用梯度稀释的血清中和实验检测血清中犬细小抗体效价，同时采用本发明试剂盒进行检测。检测结果发现：200个阳性样品均显示为阳性，10个呈阴性均显示为阴性。并依此确定本试剂盒阴阳性临界点:待测样本抗体浓度≥4.5ng/ml，为阳性；待测样本抗体浓度≤4.5ng/ml，为阴性。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.一种用于检测犬细小病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，包括包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板、铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液、分析缓冲液、洗涤液和增强液；所述犬细小病毒重组抗原与犬细小病毒抗体能特异性结合；
所述包被有犬细小病毒重组抗原的酶联板是通过以下步骤进行制备：
犬细小病毒重组抗原是由犬细小病毒的VP2蛋白基因序列进行原核表达的病毒样颗粒蛋白，用50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液将所述犬细小病毒重组抗原稀释成1～5μg/ml，然后加入包被液，4℃过夜后弃去包被液；再加入封闭液，封闭过夜后弃去封闭液，洗涤后拍干，真空-20℃冷冻保存。
2.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述铕标记的犬细小病毒重组抗原是通过以下步骤进行制备：
S1)将犬细小病毒重组抗原置于带有滤膜的离心管中，再向离心管中加入标记缓冲液，离心收集；
S2)向步骤S1)收集的溶液中加入铕标记试剂，混匀后室温震荡过夜，即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品；
S3)将所述铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液粗品上柱，用洗脱液进行洗脱，纯化后即得铕标记的犬细小病毒重组抗原溶液。
3.如权利要求2所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述标记缓冲液为20mMNaH2PO4溶液，所述标记缓冲液的pH值为8.4。
4.如权利要求2所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为含1.2％KCl的50mM Tris-HCl缓冲液。
5.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述包被液为含0.6％BSA和1.3％NaN3的50mM碳酸盐缓冲液，所述包被液的pH值为9.6。
6.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含2％～4％BSA、1.1％Tween-40和0.5％NaN3的50mM磷酸盐缓冲液，所述封闭液的pH值为7.4。
7.如权利要求1所述的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为含50mmol/L且pH值为7.8的Tris-HCl、9g/L NaCl、0.02％BSA、0.05％Tween-20和0.05％NaN3，余量为水，分析缓冲液的pH值为7.8～8.3；所述洗涤液为含0.9％NaCl的5 0mmol/L Tris-HCl缓冲液，洗涤液的pH值为7.5；所述增强液为冰醋酸和邻苯二甲酸氢钾构成的缓冲体系，并含有β-NTA、TOPO和Triton x-100。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181123 |