CN106053802B - 一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法 - Google Patents

一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸及其制备方法，试纸包括粘性底层、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；在硝酸纤维素膜上相间隔依次设置肺炎支原体抗原的检测带以及兔抗鼠多克隆抗体的质控带，结合垫表面喷涂标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球与标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球。本发明能够在一个时间分辨荧光免疫层析试纸上同时进行肺炎支原体IgG和IgM抗体的定量检测，可以保证同一样品液体中的肺炎支原体IgG和IgM抗体的检测结果精确度高、误差小，为临床使用提供了极大便利。

Description

一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量 试纸及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸及其制备方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术
支原体肺炎(mycoplasmal pneumonia，MP)是由肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，MP)与宿主呼吸道粘膜上皮细胞的神经氨酸受体粘结，同时释放有毒代谢产物致病，引起的肺炎。MP起病缓慢，有发热、阵发性刺激性咳嗽，少量黏液性或黏液脓性痰(偶有血痰)，肺部体征多不明显，但易引起肺外多系统受累，也可威胁生命或死亡。MP好发于儿童或青少年，血清流行病学研究显示我国社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia，CAP)患者中20.7％-38.9％由MP引起，居成人社区获得性肺炎病原体的首位。MP除导致呼吸道症状外，20％-25％的病例可出现脑膜炎、心肌炎、溶血性贫血、血小板减少性紫癜等肺外表现。及时有效的诊断可有效控制MP感染病情的加重，降低死亡率。
肺炎支原体的诊断方法主要依靠分离培养和血清学试验。血清学检测在MP感染实验室诊断中占重要地位，以被动凝集法、免疫层析试验(immunochromatography assay,ICA)和酶联免疫分析法(Enzyme immunoassay，ELISA)应用最为广泛。被动凝集法主要检测混合的MP-IgM和MP-IgG，可以半定量；相较于凝集法，ELISA的优势是可以分型检测特异性IgM、IgG等抗体，而这些亚型与感染的病程相关。MP-IgM阳性可作为早期或急性感染的诊断指标。一般在感染约7天后可被检测到，10-30天后达到峰值，76.5％的患者2周后降到无法检测到的程度。MP-IgG常发病2周后出现，是MP感染最可靠的指标。双份血清4倍以上滴度上升提示近期感染，否则为既往感染。虽然单次测定MP-IgM阳性即可判定为MP新近感染，但是阴性却不能排除感染。因此临床强调配对同时检测MP-IgM和MP--IgG对评价MP感染状况更有意义，同时也强调了对微量、更加快速、准确可靠、高灵敏、宽量程的定量诊断技术的需求。
免疫层析试验(immunochromatography assay，ICA)是一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗原(或抗体)先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，在硝酸纤维素膜的一端加入样品后，由于毛细管虹吸作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原(或抗体)的区域时，样品中相应的抗体(或抗原)即与该抗原(或抗体)发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。ICA的特点是可进行单份标本检测、简便、快速(5-15分钟可出结果)、标本用量少、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。但存在敏感度略低、精密度较差、质控困难、不易制备定量试剂等缺点。时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10- 18mol/L，较ELISA、CLIA、ECLIA等的10-9-10-15mol/L更高，非常符合超微量检测对灵敏度的要求。但TRFIA完成一次测试需要3个小时左右，需洗板机等其它设备，一般适用于大批量检测，在单份测定时存在操作复杂、费时、仪器要求高等不足。将镧系元素包裹到合适的纳米微球内形成时间分辨荧光微球(不需加解离增强溶液，即可在紫外光的激发下发出高强度的荧光信号)，把高灵敏的TRFIA技术与方便的免疫层析试验相结合，建立一种时间分辨荧光免疫层析分析。镧系元素的检测窗口和检测波长不一样，可进行多标记分析。采用包裹Eu3+和Sm3+的纳米微球可以建立双标记纳米时间分辨荧光免疫层析方法。
本发明提供了一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析方法，在一个免疫层析板上同时进行MP-IgM和MP-IgG定量检测，为临床提供一种新的方便、快速、灵敏度高、定量、可用末梢血的检测技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有肺炎支原体抗体检测方法如免疫层析试验(ICA)和酶联免疫分析法(ELISA)技术等仅能定性或半定量检测，且进行MP-IgM和MP-IgG检测必须进行2次实验等存在的不足，提供一种肺炎支原体抗体(MP-IgM和MP-IgG)双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，包括粘性底层、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
所述粘性底层上依次设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；其中硝酸纤维素膜直接设置于粘性底层上，结合垫的后端搭接在硝酸纤维素膜前端上，样品垫的后端搭接在结合垫的前端上，样品垫的前端直接粘结在粘性底层上；所述吸水纸的前端搭接在硝酸纤维素膜的后端上；
其中硝酸纤维素膜上设有检测带(T)和质控带(C)。
优选的，所述质控带检测带平行设置；两者之间相距0.5-0.6cm；检测带T与结合垫3之间的距离为0.5-0.6cm。
所述硝酸纤维素膜上相间隔依次设置有由肺炎支原体抗原涂层形成的的检测带T和兔抗鼠多克隆抗体涂层形成的质控带C；
所述结合垫表面喷涂有鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体；所述鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体分别偶联有2种不同的镧系稀土离子的纳米微球。
进一步的，所述镧系稀土离子为铕离子、钐离子。包裹铕离子的纳米微球标记鼠抗人IgG抗体，包裹钐离子的纳米微球标记鼠抗人IgM抗体的。
进一步的，所述纳米微球的直径为10～500nm。
进一步的，所述吸水纸与硝酸纤维素膜相重叠的部分在粘性底层长度方向的长度为2mm，且重叠部分中吸水纸位于硝酸纤维素膜的上方；所述结合垫与硝酸纤维素膜相重叠的部分在粘性底层长度方向的长度为2mm，且重叠部分中结合垫位于硝酸纤维素膜的上方。
进一步的，所述样品垫与结合垫相重叠的部分在粘性底层长度方向的长度为2mm，且重叠部分中样品垫位于结合垫的上方，结合垫直接与粘性底层相接触部分的长度大于4mm。
本发明利用纳米微球作为Eu3+标记、Sm3+标记的载体将时间分辨荧光与免疫层析技术结合建立一种新型的具备两者优点的双标记时间分辨荧光免疫层析技术用于肺炎支原体的检测。为临床提供一种新的方便、快速、灵敏度高、定量、可用末梢血的检测技术，在一个免疫层析板的一个检测位置上同时进行MP-IgM和MP-IgG的定量检测。
本发明原理如图1所示，具体如下：将包裹Eu3+的纳米微球标记鼠抗人IgG，包裹Sm3 +的纳米微球标记鼠抗人IgM，使用定量喷膜仪喷涂于聚酯膜上，当样品垫上加入样品液后，在毛细作用下，样品液向吸水纸一段泳动，同时样本中的待测物与时间分辨荧光微球上的二抗(Eu3+-鼠抗人IgG和Sm3+-鼠抗人IgM)形成二抗-待测物复合物(Eu3+-鼠抗人IgG—MP-IgG和Sm3+-鼠抗人IgM—MP-IgM)，随着层析作用，复合物向前移动，到达识别待测物(MP-IgM和MP-IgG)的检测线T处，形成二抗-待测物-针对待测物的特异性抗体夹心复合物(Eu3+-鼠抗人IgG—MP-IgG—MP抗原和Sm3+-鼠抗人IgM—MP-IgM—MP抗原)，在T线处出现时间分辨荧光微球的聚集。未结合的时间分辨荧光微球继续前行，到达质控线C时，针对二抗的抗体(兔抗鼠IgG)与时间分辨荧光微球上的二抗结合，在C线处出现时间分辨荧光微球的聚集，过量的时间分辨荧光微球二抗则继续向吸水块迁移。采用时间分辨荧光免疫层析分析仪读卡，T线和C线产生相应的荧光信号，参照标准浓度曲线就可以得到待测样品溶液的浓度。
所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)原材料准备：准备符合要求的粘性底层、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
(2)抗体的预处理：用0.05mol/L，pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液在4℃下用10kDa的膜分别透析鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体，过夜，得到预处理后的抗体；
(3)标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球的制备：取包裹铕离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1％的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中加入碳二亚胺和步骤(2)预处理过的鼠抗人IgG抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球与鼠抗人IgG抗体的质量比为50:1；室温反应2小时，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量浓度为1％的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，用pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
(4)标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球的制备：取包裹钐离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1％的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中入碳二亚胺和步骤(2)预处理过的鼠抗人IgM抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球与鼠抗人IgM抗体的质量比为50:1，室温反应2h，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量浓度为1％的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
(5)结合垫的制备：将步骤(3)制备纳米微球溶液与步骤(4)制备的纳米微球溶液按照质量比1：1混合，得到混合纳米微球溶液；用定量喷膜仪以3-5μL/cm的量将混合微球溶液喷涂于聚酯膜形成的结合垫上，避光的条件下于35-38℃烘干1小时，加入硅胶干燥剂封存备用；
(6)硝酸纤维素膜的制备：使用0.02mol/L，pH为7.35-7.45的、含质量浓度1％蔗糖的磷酸盐缓冲液，分别用10kDa的膜透析肺炎支原体抗原和兔抗鼠多克隆抗体，然后分别将两者的浓度最终稀释到1μg/L，使用定量喷膜仪以1μL/cm的量将二者喷于硝酸纤维素膜上，得到依次设置的肺炎支原体抗原检测带(C)和兔抗鼠多克隆抗体质控带(T)，35-38℃烘干1h，加入硅胶干燥剂封存备用；
(7)样品垫的制备：使用含质量浓度为1％BSA、0.1％Triton100的0.02M pH7.35-7.45的磷酸盐缓冲液浸泡样品垫1h后，35-38℃烘干3小时；
(8)免疫层析膜条的组装：将上述步骤所制得的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次组装在粘性底层上，即得到产品肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸。
本发明的有益效果：
一、本发明中所述硝酸纤维素膜上相间隔依次设置肺炎支原体抗原的检测带C以及兔抗鼠多克隆抗体的质控带T，结合垫表面喷涂有标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球与标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球；该试纸条将时间分辨荧光免疫技术、免疫层析技术、双标记分析技术相结合，形成了一种可同时检测MP-IgM和MP-IgG含量的试纸条，解决了现有技术中MP-IgM和MP-IgG试纸盒无法同时检测MP-IgM和MP-IgG的问题，采用该种试纸条对MP-IgM和MP-IgG检测，可以保证同一样品液体中的MP-IgM和MP-IgG的检测检测结果精确度高、误差小，为临床使用提供了极大便利；
二、本发明将MP-IgM和MP-IgG的检测带设置于同一检测试纸上，在检测过程中只会出现相同的误差，比如同时出现正的误差或同时出现负的误差，在计算比值的时候，该误差就基本可以相抵，从而计算MP-IgM和MP-IgG比值结果更准确；
三、本发明在结合垫表面喷涂有标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球与标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球，减少了稀土离子在样品溶液的猝灭，提高了稀土离子发出的荧光强度，因此不仅提高了检测的精确度，而且便于检测结果的显示和操作者的观察；
四、本发明采用铕离子和钐离子作为稀土离子、直径为10～500nm的纳米微球，提高了检测的精确度，减少了误差。
附图说明
图1本发明原理示意图；
图2本发明结构示意图；
图3MP-IgM和MP-IgG抗体的荧光数值标准曲线图。
标记说明：1、粘性底层；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中的肺炎支原体抗原购自加拿大microbix biosystems公司，鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体购自美国sigma公司，包裹铕离子的纳米微球和包裹钐离子的纳米微球购自上海西宝生物公司。
实施例1
一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，包括粘性底层1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；
所述粘性底层1上依次设置样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；其中硝酸纤维素膜4直接设置于粘性底层1上，结合垫3的后端搭接在硝酸纤维素膜4前端上，样品垫2的后端搭接在结合垫3的前端上，样品垫2的前端直接粘结在粘性底层1上；所述吸水纸5的前端搭接在硝酸纤维素膜4的后端上；其中硝酸纤维素膜4上设有检测带T和质控带C。
所述质控带C和检测带T平行设置，两者之间相距0.5-0.6cm；检测带T与结合垫3之间的距离为0.5-0.6cm。
所述检测带T由肺炎支原体抗原涂层形成；质控带C由兔抗鼠多克隆抗体涂层形成。
所述结合垫3表面喷涂有鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体；所述鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体分别偶联有2种不同的镧系稀土离子的纳米微球。
所述镧系稀土离子为铕离子Eu3+和钐离子Sm3+。
所述纳米微球的直径为10-500nm。
所述吸水纸5与硝酸纤维素膜4相重叠的部分在粘性底层1长度方向的长度为2mm，且重叠部分中吸水纸5位于硝酸纤维素膜4的上方；
所述结合垫3与硝酸纤维素膜4相重叠的部分在粘性底层1长度方向的长度为2mm，且重叠部分中结合垫3位于硝酸纤维素膜4的上方；
所述样品垫2与结合垫3相重叠的部分在粘性底层1长度方向的长度为2mm，且重叠部分中样品垫2位于结合垫3的上方，结合垫3直接与底板1相接触部分的长度大于4mm。
实施例2
肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)原材料准备：准备符合要求的粘性底层1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5；
(2)抗体的预处理：用0.05mol/L，pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液在4℃下用10kDa的膜分别透析鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体，过夜，得到预处理后的抗体；
(3)标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球的制备：取包裹铕离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1％的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中加入碳二亚胺和步骤(2)预处理过的鼠抗人IgG抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球与鼠抗人IgG抗体的质量比为50:1；室温反应2小时，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量浓度为1％的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，用pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
(4)标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球的制备：取包裹钐离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1％的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中入碳二亚胺和步骤(2)预处理过的鼠抗人IgM抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球与鼠抗人IgM抗体的质量比为50:1，室温反应2h，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量浓度为1％的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
(5)结合垫的制备：将步骤(3)制备纳米微球溶液与步骤(4)制备的纳米微球溶液按照质量比1：1混合，得到混合纳米微球溶液；用定量喷膜仪以3-5μL/cm的量将混合微球溶液喷涂于聚酯膜形成的结合垫3上，避光的条件下于35-38℃烘干1小时，加入硅胶干燥剂封存备用；
(6)硝酸纤维素膜的制备：使用0.02mol/L，pH为7.35-7.45的、含质量浓度1％蔗糖的磷酸盐缓冲液，分别用10kDa的膜透析肺炎支原体抗原和兔抗鼠多克隆抗体，然后分别将两者的浓度最终稀释到1μg/L，使用定量喷膜仪以1μL/cm的量将二者喷于硝酸纤维素膜4上，得到依次设置的肺炎支原体抗原检测带C和兔抗鼠多克隆抗体质控带T，35-38℃烘干1h，加入硅胶干燥剂封存备用；
(7)样品垫的制备：使用含质量浓度为1％BSA、0.1％Triton100的0.02M pH7.35-7.45的磷酸盐缓冲液浸泡样品垫1h后，35-38℃烘干3小时；
(8)免疫层析膜条的组装：将上述步骤所制得的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水纸5依次组装在粘性底层1上，即得到产品肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸。
纳米材料由于具有良好的光学性能、良好的稳定性(相对于酶标)、高灵敏度(单个纳米粒子可释放出上千的原子)等优点，常常被用作标记物或标记物载体来放大信号，提高检测灵敏度。本发明购买的包裹Eu3+或Sm3+的纳米微球，利用包覆技术将稀土配合物纳米团簇包埋微球中，合成具有核壳结构的复合微球。复合微球表面光滑、尺寸分布均匀，其中的稀土离子可表现出很强的特征发光，与纯的稀土配合物相比量子效率、稳定性均有较大的提高。
免疫层析膜条的组装中，样品垫2是使用过程中待测样品滴加的部位，结合垫3中固定有标记物-抗体(抗原)复合物，在加入待测样品后，其可在试纸条上发生免疫反应，硝酸纤维素膜4是层析试纸的核心部分，抗体或抗原事先被固定于其上分别作为检测带T与质控带C，吸水纸5在整个检测过程中，通过毛细管虹吸作用提供液体流过整个试纸条的动力。
应用实施例1
使用实施例2制备的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸对检测MP-IgM和MP-IgG的定量检测。
在制备好的免疫层析试纸条的加样区加入不同浓度的MP-IgM和MP-IgG抗体的标准品(取6个不同的浓度)或病人的血清样本。膜层析反应15min后，通过时间分辨荧光免疫层析分析仪，读取T线Eu3+和Sm3+的荧光信号、C线的Eu3+的荧光信号数值，并与电脑连接，分析荧光信号，根据保存的标准曲线计算样本中MP-IgM和MP-IgG抗体的浓度，具体为：
(1)绘制标准曲线：
以MP-IgG标准品作为样品，进行检测，检测结果如表1所示。将检测结果以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合标准曲线，具体如图3所示。
MP-IgG标准品(取6个不同的浓度，分别为1U/mL、3U/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、300U/mL，每个浓度做5个平行样)。
表1：MP-IgG标准品的检测结果
以MP-IgM标准品作为样品，进行检测，检测结果如表2所示。将检测结果以荧光信号值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，建立方程并拟合标准曲线，具体如图3所示。
MP-IgM标准品(取6个不同的浓度，分别为1U/mL、3U/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、300U/mL，每个浓度做5个平行样)。
表2：MP-IgM标准品的检测结果
(2)血清样品检测：
1、准备：
a、打开仪器电源开关，预热30分钟；
b、准备肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸、样品稀释液(pH为7.35-7.45的磷酸盐缓冲液)、样品室温平衡；
2、检测
c、取20μL样品滴加在试纸卡的加样孔中，再加入50μL样品稀释液，等待15min后立即检测；
d、荧光扫描所述质控线C，分别测定所述质控线C区域的荧光强度，若所述质控线C区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效。
(3)数值分析与整理：根据测定的MP-IgG标准品的荧光值及标准品浓度绘制标准曲线，样本的荧光值代入标准曲线计算样品中的MP-IgG的含量；同样根据测定的MP-IgM标准品的荧光值及标准品浓度绘制标准曲线，样本的荧光值代入标准曲线计算样品中的MP-IgM的含量。取5份临床样本进行检测，结果见表3。
表3：5份临床样本检测结果

Claims (4)

1.一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：包括粘性底层（1）、样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；
所述粘性底层（1）上依次设置样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；
其中硝酸纤维素膜（4）直接设置于粘性底层（1）上，结合垫（3）的后端搭接在硝酸纤维素膜（4）前端上，样品垫（2）的后端搭接在结合垫（3）的前端上，样品垫（2）的前端直接粘结在粘性底层（1）上；所述吸水纸（5）的前端搭接在硝酸纤维素膜（4）的后端上；其中硝酸纤维素膜（4）上设有检测带（T）和质控带（C）;
所述质控带（C）和检测带（T）平行设置，两者之间相距0.5-0.6cm；检测带（T）与结合垫（3）之间的距离为0.5-0.6cm;
所述检测带（T）由肺炎支原体抗原涂层形成；质控带（C）由兔抗鼠多克隆抗体涂层形成;
所述结合垫（3）表面喷涂有鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体；所述鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体分别偶联有2种不同的镧系稀土离子的纳米微球;
所述镧系稀土离子为铕离子Eu3+和钐离子Sm3+。
2.如权利要求1所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：所述纳米微球的直径为10-500nm。
3.如权利要求1所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸，其特征是：所述吸水纸（5）与硝酸纤维素膜（4）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中吸水纸（5）位于硝酸纤维素膜（4）的上方；
所述结合垫（3）与硝酸纤维素膜（4）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中结合垫（3）位于硝酸纤维素膜（4）的上方；
所述样品垫（2）与结合垫（3）相重叠的部分在粘性底层（1）长度方向的长度为2mm，且重叠部分中样品垫（2）位于结合垫（3）的上方，结合垫（3）直接与底板（1）相接触部分的长度大于4mm。
4.权利要求1-3之一所述的肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸条的制备方法，其特征是包括如下步骤：
（1）原材料准备：准备符合要求的粘性底层（1）、样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）和吸水纸（5）；
（2）抗体的预处理：用0 .05mol/L，pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液在4℃下用10kDa的膜分
别透析鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体，过夜，得到预处理后的抗体；
（3）标记鼠抗人IgG抗体的包裹铕离子的纳米微球的制备：取包裹铕离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1%的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中加入碳二亚胺和步骤（2）预处理过的鼠抗人IgG抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球
与鼠抗人IgG抗体的质量比为50:1；室温反应2小时，14000r/min离心，去除上清液后，加入
质量浓度为1%的BSA溶液，至BSA终浓度为0 .05 mol/L，用pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
（4）标记鼠抗人IgM抗体的包裹钐离子的纳米微球的制备：取包裹钐离子的纳米微球，用蒸馏水配置成质量浓度为1%的纳米微球溶液；取纳米微球溶液250μL，向其中入碳二亚胺和步骤（2）预处理过的鼠抗人IgM抗体，碳二亚胺的终浓度为19.5-20.5mmol/L，纳米微球
与鼠抗人IgM抗体的质量比为50:1，室温反应2h，14000r/min离心，去除上清液后，加入质量
浓度为1%的BSA溶液，至BSA终浓度为0.05mol/L，pH为7.15-7.25的磷酸盐缓冲液至纳米微球微球浓度为0.99-1.01μg/L，待用；
（5）结合垫的制备：将步骤（3）制备纳米微球溶液与步骤（4）制备的纳米微球溶液按照质量比1：1混合，得到混合纳米微球溶液；用定量喷膜仪以3-5μL/cm的量将混合微球溶液喷涂于聚酯膜形成的结合垫（3）上，避光的条件下于35-38℃烘干1小时，加入硅胶干燥剂封存备用；
（6）硝酸纤维素膜的制备：使用0 .02mol/L，pH为7.35-7.45的、含质量浓度1%蔗糖的磷酸盐缓冲液，分别用10kDa的膜透析肺炎支原体抗原和兔抗鼠多克隆抗体，然后分别将两者的浓度最终稀释到1μg/L，使用定量喷膜仪以1μL/cm的量将二者喷于硝酸纤维素膜（4）上，得到依次设置的肺炎支原体抗原检测带（T）和兔抗鼠多克隆抗体质控带（C），35-38℃烘干1h，加入硅胶干燥剂封存备用；
（7）样品垫的制备：使用含质量浓度为1% BSA、0.1% Triton100的0.02M pH7.35-7.45的磷酸盐缓冲液浸泡样品垫1h后，35-38℃烘干3小时；
（8）免疫层析膜条的组装：将上述步骤所制得的样品垫（2）、结合垫（3）、硝酸纤维素膜（4）、吸水纸（5）依次组装在粘性底层（1）上，即得到产品肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析试纸。
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