CN106645738A - 抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒包括：链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗环瓜氨酸多肽抗体的检测这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.5U/mL，相对于传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。

Description

抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
环瓜氨酸多肽（cyclic cirullinated peptide antibodies，CCP）抗体，是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎（RA）具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。
类风湿关节炎（RA）是一种常见的系统性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症以及对称性、破坏性的关节病变为主要临床特征，其病程长，易反复，给患者造成很大痛苦。该病在我国的发病率约为0.4%，全球为0.5～1.0%，患者发病年龄多在20～50岁，女性多于男性，男女之比为1:3。
研究表明，在RA患者的血清中可以检测到抗核周因子（APF）、抗角蛋白抗体（AKA），其抗原位点是环瓜氨酸多肽（CCP）。该肽段是在肽基精氨酸脱亚胺酶的催化下，由蛋白中的精氨酸转化而成。由于CCP可以通过人工合成，对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性，而且抗环瓜氨酸多肽抗体的检测较APF和AKA检测具有一定的优越性，因此抗环瓜氨酸多肽抗体的检测对与RA的诊断具有重要意义。
传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法包括酶联免疫吸附法和化学发光法，然而，传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法检测灵敏度较差。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
一种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。
在一个实施例中，所述链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒中，所述链霉亲和素与所述羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
在一个实施例中，所述鼠抗人IgG标记的化学发光标记物中，所述鼠抗人IgG与所述化学发光标记物的比例为50：1~10。
在一个实施例中，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
在一个实施例中，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
在一个实施例中，还包括抗环瓜氨酸多肽抗体定标品。
在一个实施例中，所述抗环瓜氨酸多肽抗体定标品为浓度分别为0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体的溶液。
一种上述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入链霉亲和素，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒；以及取鼠抗人IgG，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。
这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗环瓜氨酸多肽抗体的检测这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.5U/mL，相对于传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
附图说明
图1为一实施方式的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程图；
图2为实施例3得到的抗环瓜氨酸多肽抗体标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。
优选的，链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒中，链霉亲和素与羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
优选的，鼠抗人IgG标记的化学发光标记物中，鼠抗人IgG与化学发光标记物的比例为50：1~10。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
在其他的实施例中，上述抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
在其他的实施例中，上述抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括抗环瓜氨酸多肽抗体定标品。
抗环瓜氨酸多肽抗体定标品为浓度分别为0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体的溶液。
具体的，抗环瓜氨酸多肽抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗环瓜氨酸多肽抗体配制成浓度分别为0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体的溶液。
这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒用于抗环瓜氨酸多肽抗体检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对抗环瓜氨酸多肽抗体定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对抗环瓜氨酸多肽抗体全自动化学发光免疫分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗环瓜氨酸多肽抗体的检测这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.5U/mL，相对于传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
此外，这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、选用吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到1U/mL~ 100U/mL，而传统的抗环瓜氨酸多肽抗体的检测方法的检线性范围为2U/mL~ 50U/mL；
3、吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
4、化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
5、化学发光免疫分析系统可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
如图1所示的上述抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入链霉亲和素，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒。
MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2%BSA，pH为8.0。
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺）水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的比例为0.05：0.1~1。
优选的，链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒中，链霉亲和素与羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
取鼠抗人IgG，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。
碳酸盐缓冲液浓度为0.1M，pH为9.0~9.5，
除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液（40 mMTris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）处理离心脱盐柱，最后加入得到的链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
优选的，鼠抗人IgG标记的化学发光标记物中，鼠抗人IgG与化学发光标记物的比例为50：1~10。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
得到的链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒和鼠抗人IgG标记的化学发光标记物组合即可得到上述抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒。
这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物液和抗环瓜氨酸多肽抗体定标品。
化学发光底物液和抗环瓜氨酸多肽抗体定标品可以自行配制得到。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
具体的，抗环瓜氨酸多肽抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗环瓜氨酸多肽抗体配制成浓度分别为0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体的溶液。
这种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
实施例1：抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备
（1）链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒的制备：
取含有50mg粒径为0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒（MagnaBind21353）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg链霉亲和素（biorbyt，货号orb48780），室温下混悬6h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）鼠抗人IgG标记的吖啶酯的制备：
取50μL浓度为25mg/mL的鼠抗人IgG，加入150μL浓度为0.1M、pH为9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的鼠抗人IgG标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到鼠抗人IgG标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（3）抗环瓜氨酸多肽抗体定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 7.4）将抗环瓜氨酸多肽抗体配置成浓度为0U/mL、5U /mL和100 U /mL，每瓶1 mL分装，4 ℃保存备用。
实施例2：抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪（YHLO，货号iFlash3000）为检测工具，方法学模式为两步间接免疫测试法，即仪器依次加入5 μL的样品、100 μL的抗环瓜氨酸多肽抗体样本稀释液、50μL的生物素标记的环瓜氨酸多肽抗原以及50 μL的链霉亲和素包被的磁微粒，反应10min后，再加100 μL的鼠抗人IgG标记的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液（H2O2）及B液（NaOH）进行发光反应，最后记录发光值。
实施例3：抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒性能评价
采用实施例2中的方法对抗环瓜氨酸多肽抗体定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图2所示。
接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为0.5U /mL。
线性的检测：
对浓度为1 U/mL、5U/mL、20 U/mL、50 U/mL、100 U/mL 标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9996，另外，该试剂盒对抗环瓜氨酸多肽抗体样品检测的线性范围为1U/ml ~100U/mL。
精密度测定：
取浓度为20U/mL及100U/mL两个抗环瓜氨酸多肽抗体样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室抗环瓜氨酸多肽抗体 状况的准确评估。
实施例4、抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为1 U/mL、5U/mL、20 U/mL、50 U/mL、100 U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约20倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素包被的羧基化磁微粒和鼠抗人IgG标记的化学发光标记物、生物素标记的环瓜氨酸多肽抗原。
2.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素包被的的羧基化的磁微粒中，所述链霉亲和素与所述羧基化的磁微粒的比例为1：25~35。
3.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述鼠抗人IgG标记的化学发光标记物中，所述鼠抗人IgG与所述化学发光标记物的比例为50：1~10。
4.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
5.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
6.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
7.根据权利要求6所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
8.根据权利要求1所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括抗环瓜氨酸多肽抗体定标品。
9.根据权利要求8所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗环瓜氨酸多肽抗体定标品为浓度分别为0U/mL、5U/mL和100U/mL的抗环瓜氨酸多肽抗体的溶液。
10.一种根据权利要求1~9中任一项所述的抗环瓜氨酸多肽抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入链霉亲和素，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到链霉亲和素包被的羧基化的磁微粒；以及取鼠抗人IgG，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到鼠抗人IgG标记的化学发光标记物。
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