CN111007261A - 检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及其制法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型的从血液样本中检测抗兰尼碱受体抗体（RyR）的电化学发光试剂盒及其制备方法。制备的试剂盒包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的RyR抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，RyR‑Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素生物反应信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中RyR‑Ab的准确定量检测。

Description

检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及其制法
技术领域
本发明涉及一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病(以下简称“自免”)是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下，免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当作外来物并对其进行攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。若不及时有效地加以控制，其后果十分严重：免疫系统的攻击会影响人体器官，且通常会终身对其进行攻击；有时还可能同时对身体众多部位造成损伤。早期筛查、诊断对管理和治疗自免来说非常重要，在早期阶段发现可避免或延迟目标器官或组织发生无法补救的损伤。
重症肌无力(MG)是由自身抗体引起的、细胞免疫依赖的、补体参与的主要累及神经肌肉接头突触后膜，引起神经肌肉接头传递障碍，出现骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。MG在各个年龄阶段均可发病。在40岁之前，女性发病率高于男性；40～50岁男女发病率相当；50岁之后，男性发病率略高于女性。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。
MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体 (AChR)，乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)与NMJ上的乙酰胆碱受体(AChR)相结合，导致AChR数量减少和功能的丧失，AchR-Ab阳性是MG的主要免疫学致病机制，AchR-Ab在MG 中的阳性率为80％以上。但AchR-Ab并非存在于所有的MG患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无相关性。近年研究发现，部分MG患者血清中存在针对骨骼肌和心肌横纹肌组分的抗体，包括肌球蛋白、肌动蛋白、细丝蛋白等，这些抗体称为横纹肌抗体。在约95％重症肌无力伴胸腺瘤(MGT)及50％晚发型MG患者血清中存在2种横纹肌抗体，即肌联蛋白(titin)和兰尼碱受体(RyR)抗体[2]。其中Titin-Ab对诊断MGT的敏感性高，而RyR-Ab 对诊断MGT的特异性高[3]。
兰尼碱受体(RyR)是肌浆网中的钙离子释放通道，连接肌纤维膜的T管和肌质网。T管的压力感受器二氢吡啶受体传递神经冲动至RyR，导致通道开放。肌浆网中的钙离子顺浓度差释放到胞质中，胞质中的钙离子与肌钙蛋白(troponin C,TnC)结合触发肌肉收缩。RyR受体有2种亚型：心肌RyR 2受体和骨骼肌RyR 1受体，MG患者血清中的RyR抗体可与这2种受体产生交叉反应。RyR-Ab可能通过干扰RyR和二氢吡啶受体的作用，从而抑制RyR通道的开放和钙离子的释放，使骨骼肌不能有效的收缩，导致肌无力的发生[4]。RyR-Ab在MG患者中的阳性率为13％～38％，在MGT中的阳性率为70％～80％，并且与MG患者的病情严重程度相关。 RyR-Ab对MGT的灵敏度为70％，特异度为95％[5]。目前RyR-Ab的检测方法主要包括ELISA 检测和免疫印迹法(Western blotting)检测[6]。这两种方法都存在重现性不高，结果不够准确，操作不便等缺陷。目前随着免疫检测技术的发展，磁珠法化学发光技术的优势愈发明显，特别是磁珠法电化学发光技术的准确性，灵敏度，重现性等性能明显好于ELISA等方法。目前尚无电化学发光技术用于RyR-Ab的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测 RyR-Ab的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及制法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的RyR工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，RyR-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的BSA(牛血清白蛋白)和/或酪蛋白、0.05～1wt％的Brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)和/或Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)和/或Tween-20(山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚)、0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮化钠。
优选地，所述抗人IgG抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
优选地，所述生物素标记的RyR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH 为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO 缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％氯化钠、1～5 wt％蔗糖、0.05～2wt％小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100 和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒还包括RyR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述RyR-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、 0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris 缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L三丙胺、0.01～2wt％的Brij-35和/或 Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
本发明还提供一种上述检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的RyR工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
优选地，所述生物素标记的RyR抗原的制备方法为：将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化的生物素与RyR按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的RyR。
优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将Ru-NHS(NHS活化的三联吡啶钌)与pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液样本中RyR-Ab的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的RyR-Ab含量，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制备方法
1)包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备
将链霉亲和素包被磁珠微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用pH＝7.4，浓度为0.1mol/L 的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬至浓度为0.75mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的BSA、 0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮化钠。
2)生物素标记的RyR抗原的制备
准确称取1mg RyR抗原，加入适量PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)调整抗体总浓度至1mg/mL，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；
将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1 小时，得生物素标记的RyR抗原溶液粗产品；
将生物素标记的RyR抗原溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的RYR抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
3)三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备
用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗人IgG抗体溶液；
于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
4)生物素标记的RyR抗原工作液以及三联吡啶钌标记抗人IgG抗体工作液的制备
配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的RYR抗原工作液，以及抗体浓度为8 mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液。
5)校准品和质控品工作液的配制
配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、 0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制RyR-Ab校准品和质控品工作液，校准品共6个点， RyR-Ab的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、4ng/mL、15ng/mL、40ng/mL。质控品分高、低两个浓度，RyR-Ab的浓度分别为0.8ng/mL、15ng/mL。
6)清洗液的配制
配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％Brij-35。
7)化学发光底物液的配制
配制pH＝6.5，0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。
8)试剂分装及组装
将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的RyR抗原工作液12mL/瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独包装，保存于 20～25℃。
实施例2使用本发明的试剂盒检测RyR-Ab的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的RyR抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；
于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液，37℃孵育10 分钟，形成磁性复合物悬浮液；
将磁性复合物悬浮液置于磁场内，清洗液流过并洗涤所述磁性复合物；
向洗涤后的磁性复合物中注入电化学发光底物液，使用光电倍增管检测其发光强度。由光电倍增管所得信号值和定标曲线推算出RyR-Ab的含量。
实施例3本发明的试剂盒的性能评估
1)试剂灵敏度的研究
试剂灵敏度是根据最低检测限(Limit of Blank,LoB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M 和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(0.2ng/mL) 之间的浓度-RLU均值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即LoB。
以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂LoB为0.009ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.01ng/mL以下。
表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
Figure BDA0002330340340000041
2)本发明试剂盒的重复性的研究
检测抗RyR抗体浓度为1.89ng/mL、10.65ng/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。优良的重复性是电化学发光平台的一个显著优点，可实现准确可重现的测定。
表2本发明试剂盒的重复测定结果
Figure BDA0002330340340000042
3)本发明试剂盒的准确度测定结果
由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为0.5ng/mL、2ng/mL、8ng/mL三个浓度的RyR-Ab标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于5％。
表3本发明试剂盒的准确度测定结果
Figure BDA0002330340340000051
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
参考文献
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Claims (10)

1.一种检测抗人抗兰尼碱受体钙释放通道抗体（RyR-Ab）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的RyR抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，RyR-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体（即第二抗体）为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。
3.根据权利要求1所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8~7.6，浓度为0.01 mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05~1 wt%的牛血清白蛋白（BSA）和/或酪蛋白、0.05~1 wt%的Brij-35（月桂醇聚氧乙烯醚）和/或TritonX-100（聚乙二醇对异辛基苯基醚）和/或Tween-20（山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚）、0.05~0.5 wt%的proclin 300或叠氮化钠。
4.根据权利要求1所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的RYR抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5~5 wt%牛血清白蛋白、0.5~5 wt%氯化钠、1~5 wt%蔗糖、0.05~2wt%小牛血清、0.02~1 wt%酪蛋白、0.02~1 wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5 wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
5.根据权利要求1所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒还包括RyR-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述RyR-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01 mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5~5 wt%牛血清白蛋白、10~50 wt%人血清、0.5~3 wt%氯化钠、2~20 wt%乙二醇、0.02~1 wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
6.根据权利要求1所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述电化学发光底物液由pH为6.0~7.2，浓度为0.05 mol/L~0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05 mol/L~0.4 mol/L三丙胺、0.01~2 wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5 wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
7.根据权利要求1任一项所述的检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1 mol/L~0.5 mol/L的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01~2 wt%的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
8.一种检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的RyR抗原工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
9.根据权利要求8所述的RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述生物素标记的RyR抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的生物素（NHS-biotin）与RyR按照1 : 1 ~ 20 : 1的摩尔比在2~8 ℃或室温条件下混匀反应0.5~2小时，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的RyR。
10.根据权利要求8所述的RyR-Ab的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将NHS活化的三联吡啶钌（Ru-NHS）与pH为6.5~8.0的抗人IgG抗体溶液按照1 : 1 ~ 20 : 1的摩尔比在室温或37 ℃条件下，避光混匀反应1~4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
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