CN111060695A - 检测抗lrp4抗体的电化学发光试剂盒及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型的从被测样本中检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）抗体的电化学发光试剂盒及其制备方法。制备的试剂盒包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的LRP4工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，抗LRP4抗体的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素生物反应信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现样本中抗LRP4抗体的准确定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
重症肌无力(MG)是一种自身免疫性疾病，它是一种自身抗体介导、补体参与、细胞免疫依赖的神经肌肉接点(NMJ)处神经递质的信号传递障碍。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。
如上所述，MG为自身抗体介导的免疫疾病，其主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR)和肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)。约有80％的MG患者为抗AChR抗体阳性的MG，称为AChR-MG；仅有不足10％的MG患者属于抗MuSK抗体阳性的MG，称为 MuSK-MG[2]。然而，仍有少部分MG患者血清抗AChR抗体和抗MuSK抗体均呈阴性，这部分 MG被称之为血清双阴性重症肌无力[3]。
LRP4是一个低密度脂蛋白受体家族成员，是由一个跨膜结构、一个长的细胞外N末端以及一个短的细胞内C末端组成的单跨膜蛋白，是对MuSK激活、AChR聚集和NMJ形成至关重要的蛋白的受体。2013年，美国乔治亚医学院的梅林课题组发现并证实了抗LRP4抗体的致病性，可以诱导MG样表现[4]。抗LRP4抗体的病理作用主要是通过干扰LRP4和agrin的结合，破坏AChR介导的神经肌肉信号转导。目前，抗LRP4抗体已被鉴定为自身免疫性疾病的第三个病因，在血清双阴性重症肌无力患者中，其阳性率为7％～33％[5]，它能够单独或与抗AChR抗体、抗MuSK抗体等共同导致MG发生。与AChR-MG和MuSK-MG相比，抗LRP4抗体阳性的MG病症状较轻，多为眼肌型[6]，极少伴随胸腺瘤或出现肌无力危象，对药物治疗的反应良好。抗LRP4抗体阳性检出率与种族、地域、性别、年龄相关。抗LRP4抗体检测技术的标准化将有助于进一步评估其特异与其临床表型的相关性。我国针对该指标相关报道仍然较少，对该抗体引起MG的研究亟待进行。
虽然文献报道的检测抗LRP4抗体的方法很多[6-9]，包括间接荧光免疫法、酶联免疫吸附法、放射免疫沉淀法、荧光免疫沉淀法、细胞荧光免疫染色法等，但这些方法均未形成比较完善的体系，均未在临床上普及。建立高灵敏度、高特异性的检测抗LRP4抗体方法是尚待解决问题。
电化学发光免疫分析法是继酶联免疫分析、放射免疫分析、荧光免疫分析之后的新一代标记免疫测定技术，具有高度敏感、特异性强、测定范围宽、试剂稳定、操作简单等优点。目前尚未有文献报道电化学发光免疫分析法检测抗LRP4抗体的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测抗LRP4抗体的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒及制法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的LRP4工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，抗LRP4抗体的校准品和 /或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的牛血清白蛋白(BSA)和/或酪蛋白、0.05～1wt％的月桂醇聚氧乙烯醚(Brij-35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(Triton X-100)和/或山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚(Tween-20)、0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮化钠。
优选地，所述抗人IgG抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
优选地，所述生物素标记的LRP4抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH 为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO 缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％氯化钠、1～5 wt％蔗糖、0.05～2wt％小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100 和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒还包括抗LRP4抗体校准品工作液和/ 或质控品工作液，所述抗LRP4抗体校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01 mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05mol/L～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05mol/L～0.4mol/L三丙胺、0.01～2wt％的 Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
优选地，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
本发明还提供一种上述检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的LRP4工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG 抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
优选地，所述生物素标记的LRP4抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的生物素与LRP4按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的LRP4。
优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将NHS活化的三联吡啶钌 (Ru-NHS)与pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中抗LRP4抗体的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的抗LRP4抗体，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒的制备方法
1)包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备
将链霉亲和素包被磁珠微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬至浓度为0.75mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的BSA、0.05 wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮化钠。
2)生物素标记的LRP4抗原的制备
准确称取1mg LRP4抗原，加入适量PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)调整抗体总浓度至1mg/mL，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；
将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1 小时，得生物素标记的LRP4抗原溶液粗产品；
将生物素标记的LRP4抗原溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的LRP4抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
3)三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备
用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗人IgG抗体溶液；
于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
4)生物素标记的LRP4抗原工作液以及三联吡啶钌标记抗人IgG抗体工作液的制备
配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的LRP4抗原工作液，以及抗体浓度为8 mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液。
5)校准品和质控品工作液的配制
配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、 0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗LRP4抗体校准品和质控品工作液，校准品共6个点，抗LRP4抗体的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL。质控品分高、低两个浓度，抗LRP4抗体的浓度分别为2ng/mL、50ng/mL。
6)清洗液的配制
配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％的Brij-35。
7)化学发光底物液的配制
配制pH＝6.5，0.15mol/L的三丙胺、0.05wt％的Brij-35、0.01wt％的proclin300。
8)试剂分装及组装
将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的LRP4抗原工作液12mL/ 瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独包装，保存于20～25℃。
实施例2使用本发明的试剂盒检测抗LRP4抗体的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的LRP4抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人 IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；
于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液，37℃孵育10 分钟，形成磁性复合物悬浮液；
将磁性复合物悬浮液置于磁场内，清洗液流过并洗涤所述磁性复合物；
向洗涤后的磁性复合物中注入电化学发光底物液，使用光电倍增管检测其发光强度。由光电倍增管所得信号值和定标曲线推算出抗LRP4抗体的含量。
实施例3本发明的试剂盒的性能评估
1)试剂灵敏度的研究
试剂灵敏度是根据最低检测限(Limit of Blank,LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M 和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(1ng/mL) 之间的浓度-RLU均值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即LOB。
以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂LOB为0.015ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.02ng/mL以下。
表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
2)本发明试剂盒的重复性的研究
检测抗LRP4抗体浓度为5.22ng/mL、35.84ng/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于4％。得益于电化学发光技术的优势，该试剂盒的重复性十分优良。
表2本发明试剂盒的重复测定结果
3)本发明试剂盒的准确度测定结果
由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为10ng/mL、40ng/mL、160ng/mL三个浓度的抗LRP4抗体标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于5％。
表3本发明试剂盒的准确度测定结果
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
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Claims (10)
1.一种检测抗低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液，生物素标记的LRP4工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，抗LRP4抗体的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
2.根据权利要求1所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG抗体（即第二抗体）为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。
3.根据权利要求1所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8~7.6，浓度为0.01 mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05~1wt%的牛血清白蛋白（BSA）和/或酪蛋白、0.05~1 wt%的月桂醇聚氧乙烯醚（Brij-35）和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚（Triton X-100）和/或山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚（Tween-20）、0.05~0.5 wt%的proclin 300或叠氮化钠。
4.根据权利要求1所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的LRP4抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01 mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5~5 wt%牛血清白蛋白、0.5~5 wt%氯化钠、1~5 wt%蔗糖、0.05~2 wt%小牛血清、0.02~1 wt%酪蛋白、0.02~1 wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5 wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
5.根据权利要求1所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒还包括抗LRP4抗体校准品工作液和/或质控品工作液，所述抗LRP4抗体校准品和/或质控品工作液由pH为6.0~7.6，浓度为0.01 mol/L~0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5~5 wt%牛血清白蛋白、10~50 wt%人血清、0.5~3 wt%氯化钠、2~20 wt%乙二醇、0.02~1wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
6.根据权利要求1所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述电化学发光底物液由pH为6.0~7.2，浓度为0.05 mol/L~0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05 mol/L~0.4 mol/L三丙胺、0.01~2 wt%的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05~0.5 wt% proclin 300和/或叠氮化钠。
7.根据权利要求1任一项所述的检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述清洗液是pH ≥ 13，浓度为0.1 mol/L~0.5 mol/L的氢氧化钾溶液，所述清洗液含有0.01~2 wt%的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
8.一种检测抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的LRP4工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
9.根据权利要求8所述的抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述生物素标记的LRP4的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的生物素（NHS-biotin）与LRP4按照1 : 1 ~ 20 : 1的摩尔比在2~8 ℃或室温条件下混匀反应0.5~2小时，透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的LRP4。
10.根据权利要求8所述的抗LRP4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将NHS活化的三联吡啶钌（Ru-NHS）与pH为6.5~8.0的抗人IgG抗体溶液按照1 : 1 ~ 20 : 1的摩尔比在室温或37 ℃条件下，避光混匀反应1~4小时，加入甘氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
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2019
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