CN110988335A - 检测电压门控钾离子通道抗体的电化学发光试剂盒、制法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从血液中检测Kv1.4（电压门控钾离子通道）抗体的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的Kv1.4抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，Kv1.4抗体的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液，试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现Kv1.4抗体的准确定量。

Description

检测电压门控钾离子通道抗体的电化学发光试剂盒、制法
技术领域
本发明涉及一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
自身免疫性疾病是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下，免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。如果不及时有效加以控制，其后果十分严重：免疫系统的攻击会影响每个人体器官，且通常会终身对其进行攻击；有时还可能同时对身体众多部位造成损伤。早期诊断对管理自免来说非常重要，在早期阶段发现可避免或延迟目标器官或组织发生无法补救的损伤。
重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是由自身抗体引起的、细胞免疫依赖的、补体参与的主要累及神经肌肉接头突触后膜，引起神经肌肉接头传递障碍，出现骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病年龄广、致残率高、易复发、预后差，严重威胁人类健康。其全球患病率为15/100万～300/100万，年发病率为10/100万[1]。MG在各个年龄阶段均可发病。在40岁之前，女性发病率高于男性；40～50岁男女发病率相当；50岁之后，男性发病率略高于女性。
MG是典型的抗体介导的自身免疫性疾病，主要靶抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体（AChR），乙酰胆碱受体抗体与 NMJ 上的乙酰胆碱受体 (AChR) 相结合，导致AChR 数量减少和功能的丧失，是AChRAb 阳性 MG 的主要免疫学致病机制，乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab) 在MG中的阳性率为85％～90％。MG患者血清中乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)阳性称为血清反应阳性MG(SPMG)，但在研究中发现，但10%～20% 的 MG 患者血清 AChRAb 阴性，称为血清 AChRAb 阴性的重症肌无力(SNMG) ，是近年来 MG 发病机制的研究重点。
在多种检测重症肌无力的自身免疫指标中，Kv1.4具有重要的意义和作用。Kv1.4在突触前膜释放乙酰胆碱的过程中发挥着重要的作用，它由4个跨膜α亚基组成，Kvl.4是其中1个亚基，相对分子质量约为73 000，主要存在于脑、周围神经、骨骼肌与心肌中[2]。Kv1.4抗体同样属于横纹肌抗体， Kv1.4抗体在MG患者中的阳性率为12%～15%，在伴胸腺瘤重症肌无力患者中的阳性率为40-70％。Kv1.4抗体与重型MG及心脏并发症相关，Kvl.4抗体阳性的MG患者易发生延髓型肌无力、胸腺瘤及心肌炎。准确测定样本中Kv1.4抗体含量有助于重症肌无力患者的类型诊断及对症治疗，而且可以减少误诊为其他疾病的风险，具有重要意义。
目前Kv1.4抗体检测方法主要包括：RIPA(放射免疫法)，ELISA（酶联免疫法）检测，其中RIPA法具有放射性风险，而且试剂效期短，使用不方便，已基本被淘汰。ELISA方法虽然克服了放射性风险，但由于ELISA方法固有的灵敏度较低，结果重复性较低，操作繁琐等缺点，难以实现准确、简便的Kv1.4抗体测定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中尚未有快速、准确地定量检测Kv1.4抗体方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒及制法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的Kv1.4抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。
优选地，所述Kv1.4抗原为外购的重组Kv1.4抗原。该抗原利用生物工程技术将含有编码人重组Kv1.4多肽（hKv1.4）的表达载体转染大肠杆菌中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，菌体裂解物进行SDS-PAGE电泳确认。
优选地，所述抗人IgG抗体为外购的单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
优选地，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6 ，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2 wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1 wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(TritonX-100)和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
优选地，所述生物素标记的Kv1.4抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、1 mg/L～100 mg/L的抗干扰剂A、0.5～5 wt％的氯化钠、1～5 wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0 .02～1 wt％的Brij35和/或TritonX-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5 wt％的proclin300和/或叠氮钠。
优选地，所述检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒还包括Kv1.4抗体校准品工作液和/或质控品工作液，所述Kv1.4抗体校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01 mol/L～0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5 wt％的牛血清白蛋白、10～50 wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20 wt％的乙二醇、0.02～1 wt％的Brij 35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
优选地，所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1 mol/L～0.5 mol/L的KOH液，所述清洗液含有0.01～2 wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4 mol/L的三丙胺、0.01～2 wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
本发明还提供一种上述检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒的制法，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的Kv1.4抗原工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，清洗液的配制，电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。
优选地，所述生物素标记的Kv1.4抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与Kv1.4抗原按照1-20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析除去多余的生物素，得生物素标记的Kv1.4抗原。
优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗人IgG抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗人IgG抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20: 1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗人IgG抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现Kv1.4抗体的准确定量；尤其是将该试剂盒用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的Kv1.4抗体，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1 检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒的制备方法
（1）链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备
将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/ L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5mg/mL，所述缓冲液含有0.5 wt％的牛血清白蛋白、0.05 wt％的Triton X-100、0.05 wt％ proclin300和0.05 wt％叠氮钠；
（2）生物素标记的Kv1.4抗原的制备
取1mg 重组Kv1.4抗原，加入适量PBS缓冲液(0.05M，pH7.0-7.6)调整抗体总浓度至1mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后将抗原转移至离心管或冻存管内；
准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素（NHS-Biotin），加入适量水调整其浓度为2 mg/ml，得NHS-Biotin水溶液；
将NHS-Biotin水溶液加入抗原溶液中，使NHS-Biotin与抗原按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的Kv1.4抗原溶液；将生物素标记的Kv1.4抗原溶液转移至透析袋进行透析（透析液为0.1M PBS，pH7.4），每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后收集生物素标记的Kv1.4抗原至离心管或冻存管内，≤-20℃冷冻保存备用；
（3）三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体的制备
用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS酯溶液；用0.1M、pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1 mg/mL的抗人IgG抗体抗体溶液；
于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10µL配制好的Ru-NHS酯溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于0.1M、pH7.4的PBS缓冲液透析过夜，期间换液3次，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-20℃冷冻保存备用；
（4）生物素标记的Kv1.4抗原工作液以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备
配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2 wt％的牛血清白蛋白、0.1 wt％的酪蛋白、1 wt％的氯化钠、1 wt％的蔗糖、2 wt％的小牛血清、0.5 wt％的Triton X-100、0.2 wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1 mg/L的生物素标记的Kv1.4抗原工作液，以及抗体浓度为10 mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液；
（5）校准品和质控品工作液的配制
配制pH为7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1 wt％的牛血清白蛋白、20 wt％的人血清、1 wt％的氯化钠、5 wt％的乙二醇、0.1 wt％的Tween-20、0.2wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制Kv1.4抗体校准品和质控品工作液，校准品共5个点，Kv1.4抗体的浓度分别为30pg/mL、500pg/mL、1500pg/mL、5000pg/mL、10000pg/ml。质控品分高，低两个浓度，Kv1.4抗体的浓度分别为1000pg/mL、8000 pg/mL；
（6）清洗液的配制
配制176 mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15%的十二醇乙二醇醚；
（7）化学发光底物液的配制
配制pH为6.5，0.15mol/L的三丙胺溶液，该溶液含有0.05 wt％的十二醇乙二醇醚、0.01 wt％的proclin 300；
（8）试剂分装及组装，将链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液12 ml/瓶、生物素标记的Kv1.4抗原工作液12 ml/瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12 ml/瓶、校准品/质控品工作液1.0 ml/瓶分装后，组装在一起，保存于2-8℃，将清洗液380 ml/瓶、化学发光底物液380 ml/瓶单独包装，保存于20℃-25℃。
实施例2 使用本发明的试剂盒检测Kv1.4抗体的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的Kv1.4抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁性微粒工作液，37℃孵育10分钟，形成磁性复合物悬浮液；
将磁性复合物悬浮液置于磁场内，清洗液流过，洗涤所述磁性复合物；向洗涤后的磁性复合物中先后注入电化学发光底物液，检测其光子强度。由光子强度和定标曲线推算出Kv1.4抗体的含量。
本发明的试剂盒的性能评估
实施例3 试剂灵敏度的研究
试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(相邻浓度是30 pg/mL)之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。
以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)为6.16 pg/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到10 pg/mL以下。
表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
Figure 651104DEST_PATH_IMAGE002
实施例4 本发明试剂盒的重复性的研究
检测浓度为 592pg/mL、3918pg/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于4％。该CV值明显小于ELISA等传统方法，主要是由磁珠法电化学发光技术的高性能带来的。
表2本发明试剂盒的重复性测定结果
Figure 505928DEST_PATH_IMAGE004
实施例5 本发明试剂盒的准确度测定结果
由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为137、886、5270pg/mL三个浓度的Kv1.4抗体标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于10％。
表3 本发明试剂盒的准确度测定结果
Figure 223348DEST_PATH_IMAGE006
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
参考文献：
[1] Carr, A.S., Cardwell, C.R., McCarron, P.O. & McConville, J. (2010) Asystematic review of population based epidemiological studies in MyastheniaGravis. BMC Neurol. 10(1), 46
[2] 雷国华, 刘建军, 李尊波. 重症肌无力相关抗体及检测方法研究进展[J]. 中国现代医生, 2018, 56(5):165-168。

Claims (10)

1.一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的Kv1.4抗原工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。
2.根据权利要求1所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述Kv1.4抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。
3.根据权利要求1或2所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的Kv1.4抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、1mg/L～100mg/L的抗干扰剂A、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒还包括Kv1.4抗体校准品工作液和/或质控品工作液，所述Kv1.4抗体校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij 35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1 mol/L～0.5 mol/L的KOH，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述电化学发光底物液为pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4 mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4 mol/L的三丙胺、0.01～2 wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
8.一种检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的Kv1.4抗原工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，清洗液的配制，电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。
9.根据权利要求8所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述生物素标记的Kv1.4抗原的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与Kv1.4抗原按照1~20: 1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析或过柱除去多余的生物素，得生物素标记的Kv1.4抗原。
10.根据权利要求8或9所述的检测Kv1.4抗体的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗人IgG抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗人IgG抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20: 1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗人IgG抗体。
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CN114184784A (zh) * 2020-09-14 2022-03-15 深圳普门科技股份有限公司 新型冠状病毒抗体检测试剂盒及新型冠状病毒抗体检测装置

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