CN111007250A - 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法 - Google Patents

检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法 Download PDF

Info

Publication number
CN111007250A
CN111007250A CN201911255030.6A CN201911255030A CN111007250A CN 111007250 A CN111007250 A CN 111007250A CN 201911255030 A CN201911255030 A CN 201911255030A CN 111007250 A CN111007250 A CN 111007250A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thrombin
solution
antibody
antithrombin
tat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911255030.6A
Other languages
English (en)
Inventor
泮锋纲
丁俊杰
施启尧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sunlant Biological Engineering Co ltd
Original Assignee
Sunlant Biological Engineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sunlant Biological Engineering Co ltd filed Critical Sunlant Biological Engineering Co ltd
Priority to CN201911255030.6A priority Critical patent/CN111007250A/zh
Publication of CN111007250A publication Critical patent/CN111007250A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种从血液中检测新型血栓标志物TAT（凝血酶‑抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法。制备的试剂盒包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，TAT的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素‑生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现凝血酶‑抗凝血酶复合物的准确定量。

Description

检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、 制法
技术领域
本发明涉及一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶，具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构。它含A、B两条多肽链，由一个链间二硫键相连。β链为功能链，具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构，含有1个位于两个β折叠桶之间的活性中心，2个外结合位点，1个Na离子结合位点，一个自我催化水解环以及一个W60d环。凝血酶具有Na离子诱导的变构酶特性，在血液中有Na离子结合型和Na离子解离型两种构象。这两种构象是可以相互转化的，其相互转化的部分机理是由于效应因子或底物结合到凝血酶的特定位点而引起构象发生变化和能量转移，从而改变了Na离子结合与解离的平衡状态1。
凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。还具有激活受体，产生细胞生物学效应，如诱发炎症、诱导细胞释放细胞因子、引起细胞增殖、组织器官再生等。中枢神经系统的凝血酶还具有神经毒性，会引起脑细胞损伤。
凝血酶半衰期较短，很难检测到，因此我们可以检测凝血酶与抗凝血酶所形成的复合物。升高说明与DIC，DVT，PE以及心房颤动等其他凝血系统激活状态有关2。
目前已有的检测凝血酶-抗凝血酶复合物的方法很少，主要是Elisa方法和极少的管式化学发光方法。Elisa方法有显著的缺陷，灵敏度低，重现性差，操作不便等。而管式化学发光方法也存在酶标抗体稳定性较差，结果重现性低等多个问题。作为免疫分析技术中优势明显的电化学发光免疫分析技术，在测定结果的准确性和操作便利性等方面都具有显著优势。目前尚未有电化学发光技术用于TAT检测的成熟方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为提升现有技术中对TAT检测的效果和水平，提供一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒及制法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。
优选地，所述凝血酶抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
优选地，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚(Triton X-100)和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)和/或月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
优选地，所述生物素标记的凝血酶抗体以及三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1mg/L～100 mg/L的鼠IgG、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0 .02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
优选地，所述检测TAT的电化学发光试剂盒还包括TAT校准品工作液和/或质控品工作液，所述TAT校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20 wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
优选地，所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的KOH液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L的三丙胺、0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
本发明还提供一种上述检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒的制法，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的凝血酶抗体工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液的制备，清洗液的配制，电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。
优选地，所述生物素标记的凝血酶抗体的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与凝血酶抗体按照1-20:1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析除去多余的生物素，得生物素标记的凝血酶抗体。
优选地，所述三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗抗凝血酶抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使抗抗凝血酶抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20:1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法，制备的试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测灵敏度高、线性范围宽，检测结果重复性好，可以实现TAT的准确定量；尤其是将该试剂盒用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本即可定量检测样本中的TAT，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
现在对本发明作进一步详细的说明。
实施例1检测TAT的电化学发光试剂盒的制备方法
1) 链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备
将链霉亲和素偶联的磁微粒悬浮液，磁分离去除上清，用pH为6.8，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液重悬至浓度为0.5 mg/mL，所述缓冲液含有0.5 wt％的牛血清白蛋白、0.05 wt％的Triton X-100、0.05 wt％proclin 300和0.05 wt％叠氮钠；
2) 生物素标记的凝血酶抗体的制备
取1mg凝血酶鼠单克隆抗体，加入适量PBS缓冲液(0.05M，pH7.0-7.6)调整抗体总浓度至1 mg/ml，并加入透析袋中进行透析，每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-Biotin)，加入适量水调整其浓度为2 mg/ml，得NHS-Biotin水溶液；
将NHS-Biotin水溶液加入抗体中，使NHS-Biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的凝血酶抗体溶液；
将生物素标记的凝血酶抗体溶液转移至透析袋进行透析（透析液为0.1M PBS，pH7.4），每隔3-4小时换一次透析液，更换3-4次，透析后收集生物素标记的凝血酶抗体至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用；
3) 三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体的制备
用DMSO配制浓度为10 mg/mL的Ru-NHS酯溶液；用0.1M、pH7.4的磷酸盐缓冲液配制浓度为1 mg/mL的抗抗凝血酶抗体溶液；
于1 mL抗抗凝血酶抗体溶液中加入10 µL配制好的Ru-NHS酯溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于0.1M、pH7.4的PBS缓冲液透析过夜，期间换液3次，回收三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用；
4) 生物素标记的凝血酶抗体工作液以及三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液的制备
配制pH为6.5，浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％的牛血清白蛋白、0.1wt％的酪蛋白、60mg/L的鼠IgG、1wt％的氯化钠、1wt％的蔗糖、2wt％的小牛血清、0.5wt％的Triton X-100、0.2wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的凝血酶抗体工作液，以及抗体浓度为1mg/L三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液；
5) 校准品和质控品工作液的配制
配制pH为7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％的牛血清白蛋白、20wt％的人血清、1wt％的氯化钠、5wt％的乙二醇、0.1 wt％的Tween-20、0.2wt％的proclin 300；然后用该缓冲液配制TAT校准品和质控品工作液，校准品共6个点，TAT的浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、120ng/mL。质控品分高，低两个浓度，TAT的浓度分别为3ng/mL、60ng/mL；
6）清洗液的配制
配制176 mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15%的十二醇乙二醇醚；
7）化学发光底物液的配制
配制pH为6.5，0.15mol/L的三丙胺溶液，所配溶液含有0.05wt％的十二醇乙二醇醚、0.01 wt％的proclin 300；
8) 试剂分装及组装，将链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液12ml/瓶、生物素标记的凝血酶抗体工作液12ml/瓶、三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶工作液12ml/瓶、校准品/质控品工作液1.0ml/瓶分装后，组装在一起，保存于2-8℃，将清洗液380ml/瓶、化学发光底物液380ml/瓶单独包装，保存于20℃-25℃。
实施例2 使用本发明的试剂盒检测凝血酶的方法以全自动电化学发光免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的凝血酶抗体工作液和三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗体-抗原-抗体夹心复合物溶液；
于抗体-抗原-抗体夹心复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁性微粒工作液，37℃孵育10分钟，形成磁性复合物悬浮液；
将磁性复合物悬浮液置于磁场内，进行磁性分离，清洗液流过，洗涤所述磁性复合物；
向洗涤后的磁性复合物中先后注入电化学发光底物液，检测其光子强度。由光子强度和定标曲线推算出TAT的含量。
本发明的试剂盒的性能评估
实施例3 试剂灵敏度的研究
试剂灵敏度是根据最低检测限(LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(相邻浓度是1ng/mL)之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即最低检测限(LOB)。
以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂最低检测限(LOB)为0.017ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.02 ng/mL以下。
表1 本发明试剂盒的灵敏度测定结果
Figure 680035DEST_PATH_IMAGE002
实施例4 本发明试剂盒的重复性的研究
检测浓度为 3.34ng/mL、15.68ng/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。
表2 本发明试剂盒的重复性研究结果
Figure 534858DEST_PATH_IMAGE004
实施例5 本发明试剂盒的准确度测定结果
由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为3.6、22、89ng/mL三个浓度的TAT标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于10％。由此可见，本试剂盒的准确度令人满意。
表3 本发明试剂盒的准确度测定结果
Figure 252279DEST_PATH_IMAGE006
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
参考文献
1.Li, W., et al., Structure of the antithrombin-thrombin-heparin ternarycomplex reveals the antithrombotic mechanism of heparin. Nature Structural &Molecular Biology, 2004. 11(9): p. 857-862
2.许善峰等, 凝血酶的结构及其变构特性. 中国医学生物技术应用, 2004: 第18-23页。

Claims (10)

1.一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液，生物素标记的凝血酶抗体工作液，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，清洗液。
2.根据权利要求1所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述凝血酶抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab片段或多克隆抗体Fab片段。
3.根据权利要求1或2所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01 mol/L～0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～2wt％的牛血清白蛋白和/或酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的凝血酶抗体以及三联吡啶钌标记的凝血酶抗体工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01 mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、1mg/L～100mg/L的鼠IgG、0.5～5wt％的氯化钠、1～5wt％的蔗糖、0.05～2wt％的小牛血清、0.02～1wt％的酪蛋白、0.02～1wt％的十二烷基聚乙二醇醚和/或聚乙二醇对异辛基苯基醚和/或聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯和/或月桂醇聚氧乙烯醚、0.05～0.5wt％的proclin300和/或叠氮钠。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒还包括TAT校准品工作液和/或质控品工作液，所述TAT校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％的牛血清白蛋白、10～50wt％的人血清、0.5～3wt％的氯化钠、2～20wt％的乙二醇、0.02～1wt％的Brij35和/或Triton X-100和/或Tween 20和/或平平加O-20、0.05～0.5wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述清洗液为pH为13以上，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的KOH，所述清洗液含有0.01～2 wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒，其特征在于，所述电化学发光底物液为pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L的三丙胺、0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类表面活性剂、0.05～0.5 wt％的proclin 300和/或叠氮钠。
8.一种检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，包括：链霉亲和素偶联的磁性微粒工作液的制备，生物素标记的凝血酶抗体工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗抗凝血酶抗体工作液的制备，清洗液的配制，电化学发光底物液的配制，将上述制备的试剂进行分装及组装。
9.根据权利要求8所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述生物素标记的凝血酶抗体的制备方法为：将N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素与凝血酶抗体按照1 ~20: 1的摩尔比在2-8℃或室温条件下混匀反应0.5-2小时，透析或过柱除去多余的生物素，得生物素标记的凝血酶抗体。
10.根据权利要求8或9所述的检测TAT（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒的制法，其特征在于，所述三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体的制备方法为：将pH为6.5-8.0的抗抗凝血酶抗体溶液与Ru-NHS酯溶液混合，使凝血酶抗体与Ru-NHS酯的质量比为5-20:1，37℃避光反应1-3小时，然后加入甘氨酸溶液终止反应，将反应液透析除去多余的Ru-NHS酯，得三联吡啶钌标记抗抗凝血酶抗体。
CN201911255030.6A 2019-12-10 2019-12-10 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法 Pending CN111007250A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911255030.6A CN111007250A (zh) 2019-12-10 2019-12-10 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911255030.6A CN111007250A (zh) 2019-12-10 2019-12-10 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111007250A true CN111007250A (zh) 2020-04-14

Family

ID=70115818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911255030.6A Pending CN111007250A (zh) 2019-12-10 2019-12-10 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111007250A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111812330A (zh) * 2020-06-23 2020-10-23 江苏奥雅生物科技有限公司 一种用于d-二聚体检测的试剂盒
CN112816713A (zh) * 2020-12-30 2021-05-18 北京联众泰克科技有限公司 用于人生长激素检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN112834756A (zh) * 2020-12-30 2021-05-25 北京联众泰克科技有限公司 用于白细胞介素6检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN114544977A (zh) * 2022-03-25 2022-05-27 武汉市长立生物技术有限责任公司 一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒
CN114689875A (zh) * 2022-06-02 2022-07-01 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种测定tat含量的试剂盒及其制备方法
CN116284417A (zh) * 2023-02-09 2023-06-23 山东大学 一种凝血酶-抗凝血酶复合物抗体、制备方法及其应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111812330A (zh) * 2020-06-23 2020-10-23 江苏奥雅生物科技有限公司 一种用于d-二聚体检测的试剂盒
CN112816713A (zh) * 2020-12-30 2021-05-18 北京联众泰克科技有限公司 用于人生长激素检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN112834756A (zh) * 2020-12-30 2021-05-25 北京联众泰克科技有限公司 用于白细胞介素6检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
CN114544977A (zh) * 2022-03-25 2022-05-27 武汉市长立生物技术有限责任公司 一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒
CN114689875A (zh) * 2022-06-02 2022-07-01 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种测定tat含量的试剂盒及其制备方法
CN114689875B (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 深圳市帝迈生物技术有限公司 一种测定tat含量的试剂盒及其制备方法
CN116284417A (zh) * 2023-02-09 2023-06-23 山东大学 一种凝血酶-抗凝血酶复合物抗体、制备方法及其应用
CN116284417B (zh) * 2023-02-09 2023-10-31 山东大学 一种凝血酶-抗凝血酶复合物抗体、制备方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111007250A (zh) 检测tat（凝血酶-抗凝血酶复合物）的电化学发光试剂盒、制法
Amiral et al. Development and performance characteristics of a competitive enzyme immunoassay for fibrinopeptide A
CN109085333A (zh) 一种类风湿因子抗原的制备、检测试剂盒及制备方法
CN111044719A (zh) 一种检测肌联蛋白抗体的电化学发光试剂盒及其制法
CN103076456A (zh) 一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒
EP4279922A1 (en) Latex enhanced competitive turbidimetric immunoassay detection method and kit
CN112014577B (zh) 一种提高gpc3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法
JPH0220064B2 (zh)
CN111024939A (zh) 检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及其制法
Zugker et al. Preparation of quality control specimens for coagulation
CN113238055A (zh) 空间邻近化学发光法检测降钙素原的试剂盒及其检测方法和应用
CN110988335A (zh) 检测电压门控钾离子通道抗体的电化学发光试剂盒、制法
CN113009151B (zh) 一种基于化学发光法的糖基化cd59检测试剂盒及其应用
JPH06104064B2 (ja) 安定化酵素結合体組成物
CN106645751B (zh) 一种纤维蛋白原含量检测试剂盒
CN113702647B (zh) 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
CN113735958A (zh) 一种chi3l1抗原、抗体及预测自体动静脉内瘘失功的试剂盒
US4891311A (en) Stabilized enzyme conjugate composition
CN111007259A (zh) 一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒的制备
JP3370717B2 (ja) キャリブレーター及びイムノアッセイにおけるその使用
CN111007261A (zh) 检测RyR-Ab的电化学发光试剂盒及其制法
CN111983239A (zh) 一种t-PAI-C标志物检测试剂盒及其配制方法
CA2193344C (en) Immunological determination method
Martinez et al. Selection and performance of monoclonal anti-C-reactive protein in ELISA quantitative assay
EP0085402B1 (en) Method of determination of human urine kallikrein and kit for the same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information

Address after: No. 35-305, Changjiang South Road, Xinwu District, Wuxi, Jiangsu 214111

Applicant after: Jiangsu Sanlian Bioengineering Co.,Ltd.

Address before: 214000 floor 3, building a, Xingye building, No. 97, Linghu Avenue, Wuxi City, Jiangsu Province

Applicant before: SUNLANT BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD.

CB02 Change of applicant information
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination