JP3370717B2 - キャリブレーター及びイムノアッセイにおけるその使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特にフィブリノペプチ
ドＡ放出化合物を含有する組成物に係る。
ドＡ放出化合物を含有する組成物に係る。
【０００２】本発明は更に、フィブリノーゲンを含有す
る血漿中へのキャリブレーター（ｃａｌｉｂｒａｔｏ
ｒ）としての該組成物の使用にも係る。
る血漿中へのキャリブレーター（ｃａｌｉｂｒａｔｏ
ｒ）としての該組成物の使用にも係る。
【０００３】該組成物を含むテストキット及び血漿中の
可溶性フィブリンの定量方法も本発明の一部を構成す
る。
可溶性フィブリンの定量方法も本発明の一部を構成す
る。
【０００４】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】血栓症
は血餅（血栓）が血管又は心臓中の正常な血流を妨げる
という重大でしばしば致死性の疾患である。フィブリン
は血液凝固タンパク質であるトロンビンがフィブリノー
ゲンに作用することにより生成されるタンパク質であ
る。血栓は、例えばフィブリンと血管又は心臓腔中の赤
血球及び／又は凝集血小板とにより形成される血液成分
の沈積物である。血栓は、後でフィブリン溶解により分
解される不溶性フィブリンポリマーを含む。血栓は正常
な血流を妨げ、重大でしばしば死に至らしめる。
は血餅（血栓）が血管又は心臓中の正常な血流を妨げる
という重大でしばしば致死性の疾患である。フィブリン
は血液凝固タンパク質であるトロンビンがフィブリノー
ゲンに作用することにより生成されるタンパク質であ
る。血栓は、例えばフィブリンと血管又は心臓腔中の赤
血球及び／又は凝集血小板とにより形成される血液成分
の沈積物である。血栓は、後でフィブリン溶解により分
解される不溶性フィブリンポリマーを含む。血栓は正常
な血流を妨げ、重大でしばしば死に至らしめる。
【０００５】他の疾患も血栓症の強い傾向を示す。これ
らの疾患の非限定的な例としては、癌、妊娠、老化、外
傷、経口避妊薬の使用、糖尿病、肝疾患、腎疾患、肥
満、及び主要外科介入（例えば高齢者の選択的股関節置
換術）を挙げることができる。
らの疾患の非限定的な例としては、癌、妊娠、老化、外
傷、経口避妊薬の使用、糖尿病、肝疾患、腎疾患、肥
満、及び主要外科介入（例えば高齢者の選択的股関節置
換術）を挙げることができる。
【０００６】抗凝血剤療法により患者の血栓症の危険を
最小にする方法は現場で頻繁に使用されている処置であ
る。抗凝血剤を投与する場合、治療効果を維持するため
に必要な薬剤レベルを決定することが必要である。現状
では患者のプロトロンビン時間（ＰＴ）を監視し、正常
血漿で得られる時間の約１．５〜２．５倍に維持するこ
とにより、経口抗凝血剤療法の適切な用量が設定されて
いる。ヘパリン療法の概算用量は、患者の活性化部分ト
ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を監視し、対照の
１．５倍以上に維持することにより設定される。
最小にする方法は現場で頻繁に使用されている処置であ
る。抗凝血剤を投与する場合、治療効果を維持するため
に必要な薬剤レベルを決定することが必要である。現状
では患者のプロトロンビン時間（ＰＴ）を監視し、正常
血漿で得られる時間の約１．５〜２．５倍に維持するこ
とにより、経口抗凝血剤療法の適切な用量が設定されて
いる。ヘパリン療法の概算用量は、患者の活性化部分ト
ロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を監視し、対照の
１．５倍以上に維持することにより設定される。
【０００７】血液凝固は高度に複雑なプロセスであり、
今日でも完全には解明されていない。凝血経路の最終段
階の結果として血栓形成に必要な成分であるフィブリン
が形成される。フィブリン形成にはプロトロンビン活性
化及び関連するトロンビンの生成が必要である。
今日でも完全には解明されていない。凝血経路の最終段
階の結果として血栓形成に必要な成分であるフィブリン
が形成される。フィブリン形成にはプロトロンビン活性
化及び関連するトロンビンの生成が必要である。
【０００８】フィブリン形成はトロンビンにより開始さ
れる多段階プロセスである。まず活性化凝血系の産物で
あるトロンビンは、２つのフィブリノーゲンＡα鎖のア
ミノ末端からフィブリノペプチドＡを放出する。
れる多段階プロセスである。まず活性化凝血系の産物で
あるトロンビンは、２つのフィブリノーゲンＡα鎖のア
ミノ末端からフィブリノペプチドＡを放出する。
【０００９】同時に、もっとゆっくりであるが２つのフ
ィブリノーゲンＢβ鎖のアミノ末端からフィブリノペプ
チドＢも放出される。フィブリノペプチドの放出の結果
として、新しいアミノ末端がフィブリンα（及びβ）鎖
上に露呈され、フィブリノーゲン中に既に存在している
相補的部位に結合する。このように、これらのフィブリ
ン分子はフィブリノーゲンと共に可溶性複合体を形成す
る。
ィブリノーゲンＢβ鎖のアミノ末端からフィブリノペプ
チドＢも放出される。フィブリノペプチドの放出の結果
として、新しいアミノ末端がフィブリンα（及びβ）鎖
上に露呈され、フィブリノーゲン中に既に存在している
相補的部位に結合する。このように、これらのフィブリ
ン分子はフィブリノーゲンと共に可溶性複合体を形成す
る。
【００１０】従って、これらの複合体は可溶性フィブリ
ン（複合体）と呼称される。所定のフィブリン濃度を超
えると、フィブリン部分は複合体から分離して凝集し、
巨視的ゲルを形成し、このようなゲル中でフィブリンサ
ブユニットはトロンビンにより活性化されたＸＩＩＩ因
子により架橋する。
ン（複合体）と呼称される。所定のフィブリン濃度を超
えると、フィブリン部分は複合体から分離して凝集し、
巨視的ゲルを形成し、このようなゲル中でフィブリンサ
ブユニットはトロンビンにより活性化されたＸＩＩＩ因
子により架橋する。
【００１１】可溶性フィブリンは血管内フィブリン形成
及び切迫血栓症例の分子マーカーとして非常に注目され
ている。
及び切迫血栓症例の分子マーカーとして非常に注目され
ている。
【００１２】数種の可溶性フィブリンアッセイが報告さ
れている。これらのアッセイは、エタノールゲル化試
験、連続希釈硫酸プロタミン試験及びリストセチン沈殿
試験のような疑似凝固に基づくアッセイを含む。
れている。これらのアッセイは、エタノールゲル化試
験、連続希釈硫酸プロタミン試験及びリストセチン沈殿
試験のような疑似凝固に基づくアッセイを含む。
【００１３】媒質変化に基づくこれらの方法は感度がか
なり低く、特異性が制限され、定性的な結果しか得られ
ないという欠点がある。他の型のアッセイは、可溶性フ
ィブリンの存在下におけるフィブリンで被覆された赤血
球の凝集、ゲル排除クロマトグラフィー並びに固定化フ
ィブリノーゲン及びフィブリンへの可溶性フィブリンの
吸着に基づく。
なり低く、特異性が制限され、定性的な結果しか得られ
ないという欠点がある。他の型のアッセイは、可溶性フ
ィブリンの存在下におけるフィブリンで被覆された赤血
球の凝集、ゲル排除クロマトグラフィー並びに固定化フ
ィブリノーゲン及びフィブリンへの可溶性フィブリンの
吸着に基づく。
【００１４】既存の方法は定性的、半定量的又は労力を
要し、時間がかかるため、日常的な臨床応用には不適切
である。更に、特異性もかなり低い。高特異性ＭｏＡｂ
（モノクローナル抗体）の組み合わせに基づくＥＩＡ
は、例えばＳｃｈｅｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈｅｌら（１
９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ Ｖｏｌ．８２， ｐｐ．７０９１−７０９５に記
載されているようにこれらの欠点を克服することができ
る。しかしながら、この文献に記載されているＥＩＡ
（エンザイムイムノアッセイ）は、可溶性フィブリン及
びある種のフィブリンの分解産物（即ちＡα−［１７−
２２］）により発現されるネオエピトープに特異的なＭ
ｏＡｂと、フィブリン（フィブリノーゲン）関連物質に
対するポリクローナル抗体のＨＲＰ複合体とを組み合わ
せたものである。これらの特異性に基づき、該エピトー
プを含む可溶性フィブリン分解産物を検出することも期
待される。
要し、時間がかかるため、日常的な臨床応用には不適切
である。更に、特異性もかなり低い。高特異性ＭｏＡｂ
（モノクローナル抗体）の組み合わせに基づくＥＩＡ
は、例えばＳｃｈｅｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈｅｌら（１
９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ Ｖｏｌ．８２， ｐｐ．７０９１−７０９５に記
載されているようにこれらの欠点を克服することができ
る。しかしながら、この文献に記載されているＥＩＡ
（エンザイムイムノアッセイ）は、可溶性フィブリン及
びある種のフィブリンの分解産物（即ちＡα−［１７−
２２］）により発現されるネオエピトープに特異的なＭ
ｏＡｂと、フィブリン（フィブリノーゲン）関連物質に
対するポリクローナル抗体のＨＲＰ複合体とを組み合わ
せたものである。これらの特異性に基づき、該エピトー
プを含む可溶性フィブリン分解産物を検出することも期
待される。
【００１５】上記日常的臨床応用では、血栓症併発の危
険のある患者の血液中のフィブリンの量を正確に分析す
ることがしばしば必要である。
険のある患者の血液中のフィブリンの量を正確に分析す
ることがしばしば必要である。
【００１６】血栓症の発病の有無及び発病時点を予想す
るためには、血液試料中の可溶性フィブリンの量を各時
点で定量的に検出することが必要である。
るためには、血液試料中の可溶性フィブリンの量を各時
点で定量的に検出することが必要である。
【００１７】特に問題となるのは、明確に定義されたキ
ャリブレーターを準備することである。例えば、以前に
使用されたような低濃度のトロンビンで血漿を短時間処
理することにより血漿フィブリノーゲンを部分的に転化
させることができる（Ｓｃｈｅｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈ
ｅｌら，１９８５）。しかしながら、その場合、放出さ
れるフィブリノペプチドＡの濃度を測定することにより
キャリブレーター中の可溶性フィブリン濃度を各バッチ
毎に間接的に調べなければならない。
ャリブレーターを準備することである。例えば、以前に
使用されたような低濃度のトロンビンで血漿を短時間処
理することにより血漿フィブリノーゲンを部分的に転化
させることができる（Ｓｃｈｅｅｆｅｒｓ−Ｂｏｒｃｈ
ｅｌら，１９８５）。しかしながら、その場合、放出さ
れるフィブリノペプチドＡの濃度を測定することにより
キャリブレーター中の可溶性フィブリン濃度を各バッチ
毎に間接的に調べなければならない。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明では、この問題を
解決するために、フィブリンが溶液中に残留する条件下
で既知のフィブリノーゲン濃度を有する血漿中の全フィ
ブリノーゲンをフィブリンに転化させる。
解決するために、フィブリンが溶液中に残留する条件下
で既知のフィブリノーゲン濃度を有する血漿中の全フィ
ブリノーゲンをフィブリンに転化させる。
【００１９】驚くべきことに、フィブリノーゲン、糖ア
ルコール、保存剤、金属ハロゲン化物、アミノ酸及びフ
ィブリノペプチドＡ放出化合物を含有する組成物はこの
問題を解決することが判明した。
ルコール、保存剤、金属ハロゲン化物、アミノ酸及びフ
ィブリノペプチドＡ放出化合物を含有する組成物はこの
問題を解決することが判明した。
【００２０】好ましくは、糖アルコールがマンニトール
であり、保存剤がナトリウムアジドであり、金属ハロゲ
ン化物が臭化ナトリウムであり、アミノ酸がグリシンで
あり、場合により、フィブリノペプチドＡ放出化合物が
酵素Ａｒｖｉｎ（登録商標）であるような化合物を使用
することができる。
であり、保存剤がナトリウムアジドであり、金属ハロゲ
ン化物が臭化ナトリウムであり、アミノ酸がグリシンで
あり、場合により、フィブリノペプチドＡ放出化合物が
酵素Ａｒｖｉｎ（登録商標）であるような化合物を使用
することができる。
【００２１】Ａｒｖｉｎ（登録商標）は、フィブリノー
ゲンからフィブリノペプチドＡのみを放出するＡｇｋｉ
ｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ毒に由来する酵
素である。Ａｒｖｉｎの代わりに、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉ
ｎ又はＲｅｐｔｉｌａｓｅを使用することもできる。更
に、マンニトールの代わりに、グルシトール、ソルビト
ール、グリセロール又はイノシトールのような他の糖ア
ルコールも使用できる。
ゲンからフィブリノペプチドＡのみを放出するＡｇｋｉ
ｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ毒に由来する酵
素である。Ａｒｖｉｎの代わりに、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉ
ｎ又はＲｅｐｔｉｌａｓｅを使用することもできる。更
に、マンニトールの代わりに、グルシトール、ソルビト
ール、グリセロール又はイノシトールのような他の糖ア
ルコールも使用できる。
【００２２】使用される酵素の活性部位を攻撃する抗Ａ
ｒｖｉｎ抗体又は所謂ペプチドクロロケトンのようなＡ
ｒｖｉｎ不活性化化合物が存在する本発明の組成物が最
適である。
ｒｖｉｎ抗体又は所謂ペプチドクロロケトンのようなＡ
ｒｖｉｎ不活性化化合物が存在する本発明の組成物が最
適である。
【００２３】フィブリノーゲンを含有する血漿中へのキ
ャリブレーターとしての前記組成物の使用も本発明の一
部を構成し、該血漿中には場合によりヘパリン、ヒルジ
ン又はＰＰＡＣＫのようなトロンビンインヒビターが存
在する。
ャリブレーターとしての前記組成物の使用も本発明の一
部を構成し、該血漿中には場合によりヘパリン、ヒルジ
ン又はＰＰＡＣＫのようなトロンビンインヒビターが存
在する。
【００２４】前記所期使用のためには、マンニトール、
グリシン、ナトリウムアジド、リン酸ナトリウム及び臭
化ナトリウムを含有する緩衝液を、好ましくは緩衝液１
リットル当たりマンニトール１３ｇ、グリシン７．５
ｇ、ナトリウムアジド１０ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ
９．０ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 １．４ｇ及び臭化ナトリウ
ム１０２．９ｇの割合でｐＨ＝７．４で調製することが
好ましい。
グリシン、ナトリウムアジド、リン酸ナトリウム及び臭
化ナトリウムを含有する緩衝液を、好ましくは緩衝液１
リットル当たりマンニトール１３ｇ、グリシン７．５
ｇ、ナトリウムアジド１０ｇ、ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ
９．０ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 １．４ｇ及び臭化ナトリウ
ム１０２．９ｇの割合でｐＨ＝７．４で調製することが
好ましい。
【００２５】既知フィブリノーゲン濃度の正常血漿を前
記緩衝液で（４０μｇ／ｍｌの最終フィブリノーゲン濃
度が得られるまで）希釈した。
記緩衝液で（４０μｇ／ｍｌの最終フィブリノーゲン濃
度が得られるまで）希釈した。
【００２６】この希釈した血漿を次にＡｒｖｉｎ（最終
濃度０．２７ＩＵ／ｍｌ）で２時間処理した。このイン
キュベーション段階の間に全フィブリノーゲンはフィブ
リンに転化することが後述のＥＩＡ手順により確認さ
れ、即ちインキュベーション時間を延長又はＡｒｖｉｎ
添加量を増加しても反応はそれ以上増加しなかった。透
明溶液にポリクローナル抗Ａｒｖｉｎ抗血清を加えるこ
とにより、Ａｒｖｉｎ活性を阻止した。フィブリノーゲ
ンの完全な転化は、別の（フィブリノーゲンの）ＥＩＡ
における反応性の完全な喪失により更に確認された。
濃度０．２７ＩＵ／ｍｌ）で２時間処理した。このイン
キュベーション段階の間に全フィブリノーゲンはフィブ
リンに転化することが後述のＥＩＡ手順により確認さ
れ、即ちインキュベーション時間を延長又はＡｒｖｉｎ
添加量を増加しても反応はそれ以上増加しなかった。透
明溶液にポリクローナル抗Ａｒｖｉｎ抗血清を加えるこ
とにより、Ａｒｖｉｎ活性を阻止した。フィブリノーゲ
ンの完全な転化は、別の（フィブリノーゲンの）ＥＩＡ
における反応性の完全な喪失により更に確認された。
【００２７】完全な転化の結果として、この溶液（保存
溶液と称する）中の可溶性フィブリンの濃度は、最初に
存在していたフィブリノーゲンの濃度に等しい。
溶液と称する）中の可溶性フィブリンの濃度は、最初に
存在していたフィブリノーゲンの濃度に等しい。
【００２８】組成物をシリコーン処理したガラスチュー
ブにアリコートとして充填し、凍結乾燥した。使用前
に、本発明のテストキット中に場合により存在する凍結
乾燥キャリブレーターをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商
標）で容易に再構成することができる。
ブにアリコートとして充填し、凍結乾燥した。使用前
に、本発明のテストキット中に場合により存在する凍結
乾燥キャリブレーターをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商
標）で容易に再構成することができる。
【００２９】血漿中の可溶性フィブリンを再現可能且つ
確実に定量するために、フィブリン（フィブリノーゲ
ン）分解産物を検出せずに該可溶性フィブリンを定量す
るためのＥＩＡが開発された。
確実に定量するために、フィブリン（フィブリノーゲ
ン）分解産物を検出せずに該可溶性フィブリンを定量す
るためのＥＩＡが開発された。
【００３０】以下の実施例から明らかなように、本発明
の組成物をキャリブレーターとして使用するこのような
エンザイムイムノアッセイは日常的臨床応用及びヘパリ
ン療法の効果の監視に非常に適している。
の組成物をキャリブレーターとして使用するこのような
エンザイムイムノアッセイは日常的臨床応用及びヘパリ
ン療法の効果の監視に非常に適している。
【００３１】
【実施例】材料
マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ， Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ）は、オランダ国、Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ａｌ
ｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎから購入した。３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）はＦｌｕ
ｋａ（Ｂｕｃｈｓ， スイス）から、Ｎ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕ
ｐｐｓａｌａ， スウェーデン）から、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）はＢａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ， 米国）か
ら購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，
グレードＩＩ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ドイツ）から購入した。フ
ィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを放出す
るＡｒｖｉｎ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓ
ｔｏｍａ毒由来の酵素）及び全Ａｒｖｉｎ活性を阻止す
る抗Ａｒｖｉｎ抗血清はＫｎｏｌｌ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈ
ａｆｅｎ， ドイツ）から恵与された。
ａｔｅｃｈ）は、オランダ国、Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ａｌ
ｐｈｅｎ ａ／ｄ Ｒｉｊｎから購入した。３，３’，
５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）はＦｌｕ
ｋａ（Ｂｕｃｈｓ， スイス）から、Ｎ−スクシンイミ
ジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ及びＳｅ
ｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕ
ｐｐｓａｌａ， スウェーデン）から、ジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）はＢａｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈｉｌｉｐｓｂｕｒｇ， 米国）か
ら購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，
グレードＩＩ）はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ドイツ）から購入した。フ
ィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを放出す
るＡｒｖｉｎ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓ
ｔｏｍａ毒由来の酵素）及び全Ａｒｖｉｎ活性を阻止す
る抗Ａｒｖｉｎ抗血清はＫｎｏｌｌ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈ
ａｆｅｎ， ドイツ）から恵与された。
【００３２】ＰＰＡＣＫ（Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−
プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン）、２．
５ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍＣｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から購入し
た。
プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン）、２．
５ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍＣｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から購入し
た。
【００３３】ｔ−ＰＡによって仲介されるプラスミノー
ゲン活性化に及ぼす可溶性フィブリンの速度増大効果に
基づくテストキット「ＣＯＡ−ＳＥＴフィブリンモノマ
ー」は、ＫＡＢＩ（Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）
から入手した。
ゲン活性化に及ぼす可溶性フィブリンの速度増大効果に
基づくテストキット「ＣＯＡ−ＳＥＴフィブリンモノマ
ー」は、ＫＡＢＩ（Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）
から入手した。
【００３４】フィブリノペプチドＡ用テストキット（Ｒ
ＩＡ−ｍａｔ（登録商標）ＦＰＡ）は、Ｂｙｋ−Ｓａｎ
ｇｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｄｉｅｔｚｅｎ
ｂａｃｈ， ドイツから入手した。
ＩＡ−ｍａｔ（登録商標）ＦＰＡ）は、Ｂｙｋ−Ｓａｎ
ｇｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ， Ｄｉｅｔｚｅｎ
ｂａｃｈ， ドイツから入手した。
【００３５】Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
Ｔ）は、Ｎａ2ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２
１５ｇ、ＮａＣｌ ８．７５ｇ及びＴｗｅｅｎ２０
０．５ｍｌを蒸留水１リットルに溶解させることにより
調製した。
Ｔ）は、Ｎａ2ＨＰＯ4 １．４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２
１５ｇ、ＮａＣｌ ８．７５ｇ及びＴｗｅｅｎ２０
０．５ｍｌを蒸留水１リットルに溶解させることにより
調製した。
【００３６】ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2基質溶液は次のように調製
した。ＤＭＳＯ中のＴＭＢの４２ｍＭ溶液１００μｌを
一定撹拌下に０．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）１０ｍｌに加えた。使用直前にＨ2Ｏ
2（３０％ｗ／ｖ）１．５μｌを加えた。
した。ＤＭＳＯ中のＴＭＢの４２ｍＭ溶液１００μｌを
一定撹拌下に０．１Ｍ酢酸ナトリウム／クエン酸緩衝液
（ｐＨ６．０）１０ｍｌに加えた。使用直前にＨ2Ｏ
2（３０％ｗ／ｖ）１．５μｌを加えた。
【００３７】抗体
フィブリン特異的モノクローナル抗体抗Ｆｂ−１／２
（Ａα−［１４８−１６０］中のエピトープ）を使用し
た。この抗体はκＬ鎖を有するＩｇＭであり、０．００
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＳｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−２００カラム（３０×３．０ｃｍ）上のゲ
ル濾過により腹水から容易に精製される。抗Ｆｂ−１／
２を含有する腹水をカラムに載せ、溶出液の吸光度が≦
０．０２になるまでカラムを少なくとも４カラム容量で
洗った。次に１．４Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ６．０でほぼ純粋な抗Ｆｂ−１／２
を溶離した。
（Ａα−［１４８−１６０］中のエピトープ）を使用し
た。この抗体はκＬ鎖を有するＩｇＭであり、０．００
５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡化したＳｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−２００カラム（３０×３．０ｃｍ）上のゲ
ル濾過により腹水から容易に精製される。抗Ｆｂ−１／
２を含有する腹水をカラムに載せ、溶出液の吸光度が≦
０．０２になるまでカラムを少なくとも４カラム容量で
洗った。次に１．４Ｍ ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ６．０でほぼ純粋な抗Ｆｂ−１／２
を溶離した。
【００３８】モノクローナル抗体Ｇ８（Ａα鎖のカルボ
キシル末端ドメイン中のエピトープ）を使用した。該抗
体はκＬ鎖を有するＩｇＧ１クラスに属する。該抗体は
プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用することによ
り腹水から精製した。
キシル末端ドメイン中のエピトープ）を使用した。該抗
体はκＬ鎖を有するＩｇＧ１クラスに属する。該抗体は
プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用することによ
り腹水から精製した。
【００３９】ＭｏＡｂ Ｇ８とＨＲＰとの結合
ＳＰＤＰに関するＰｈａｒｍａｃｉａパンフレットに記
載されているように精製ＭｏＡｂ Ｇ８を結合した。結
合混合物を０．３Ｍ ＮａＣｌ中でＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００カラム（１５０×１．２ｃｍ）に通すこと
により、残留する遊離ＨＲＰから結合体を精製した。結
合体を含有するフラクションをプールし、−８０℃で凍
結保存した。結合体（Ｇ８／ＨＲＰ）を０．５％（ｗ／
ｖ）のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）
で使用前に適切な濃度まで希釈した。
載されているように精製ＭｏＡｂ Ｇ８を結合した。結
合混合物を０．３Ｍ ＮａＣｌ中でＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−２００カラム（１５０×１．２ｃｍ）に通すこと
により、残留する遊離ＨＲＰから結合体を精製した。結
合体を含有するフラクションをプールし、−８０℃で凍
結保存した。結合体（Ｇ８／ＨＲＰ）を０．５％（ｗ／
ｖ）のＢＳＡを含有するＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ／ＢＳＡ）
で使用前に適切な濃度まで希釈した。
【００４０】マイクロタイタープレートのコーティング
精製ＭｏＡｂ抗Ｆｂ−１／２を０．０５Ｍリン酸ｐＨ
７．４で１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。この
溶液の１３５μｌのアリコートをピペットでマイクロタ
イタープレートのウェルに移し、一晩４℃でインキュベ
ートした。このインキュベーション後、ウェルを空に
し、ＰＢＳＴで洗って使用した。
７．４で１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。この
溶液の１３５μｌのアリコートをピペットでマイクロタ
イタープレートのウェルに移し、一晩４℃でインキュベ
ートした。このインキュベーション後、ウェルを空に
し、ＰＢＳＴで洗って使用した。
【００４１】キャリブレーション（検量）材料
キャリブレーターの調製については本明細書中で上述し
た。
た。
【００４２】保存溶液の血漿媒質希釈液をキャリブレー
ターとしてＥＩＡで使用することが望ましく、この場
合、血漿は既に（低い）未知濃度の可溶性フィブリン
（通常範囲は０．５〜１３μｇ／ｍｌである）を含有し
ているかもしれないので、この血漿プール中の可溶性フ
ィブリンの濃度を次のように決定した。
ターとしてＥＩＡで使用することが望ましく、この場
合、血漿は既に（低い）未知濃度の可溶性フィブリン
（通常範囲は０．５〜１３μｇ／ｍｌである）を含有し
ているかもしれないので、この血漿プール中の可溶性フ
ィブリンの濃度を次のように決定した。
【００４３】５倍希釈の血漿の連続２倍希釈液、及び、
（血漿１ｍｌに夫々０．０５、０．１００及び０．１５
０ｍｌの保存溶液を加えることにより）２、４及び６μ
ｇ／ｍｌだけ濃度を増加するようにキャリブレーター保
存溶液を加えておいた同一血漿の連続２倍希釈液の用量
−応答曲線は、以下に記載するＥＩＡによると互いに平
行である。血漿がｘμｇ／ｍｌの可溶性フィブリンを含
有しているならば、５、１０、２０及び４０倍希釈の血
漿は夫々０．２ｘ、０．１ｘ、０．０５ｘ及び０．０２
５ｘμｇ／ｍｌを含有する。内標準化（ｓｐｉｋｅｄ）
した血漿希釈液は夫々０．２（ｘ＋２）／（１＋０．０
５）、０．１（ｘ＋２）／（１＋０．０５）．．．、
０．２（ｘ＋４）／（１＋０．１）、０．１（ｘ＋４）
／（１＋０．１）．．．、０．２（ｘ＋６）／（１＋
０．１５）、０．１（ｘ＋６）／（１＋０．１
５）．．．μｇ／ｍｌを含有する。
（血漿１ｍｌに夫々０．０５、０．１００及び０．１５
０ｍｌの保存溶液を加えることにより）２、４及び６μ
ｇ／ｍｌだけ濃度を増加するようにキャリブレーター保
存溶液を加えておいた同一血漿の連続２倍希釈液の用量
−応答曲線は、以下に記載するＥＩＡによると互いに平
行である。血漿がｘμｇ／ｍｌの可溶性フィブリンを含
有しているならば、５、１０、２０及び４０倍希釈の血
漿は夫々０．２ｘ、０．１ｘ、０．０５ｘ及び０．０２
５ｘμｇ／ｍｌを含有する。内標準化（ｓｐｉｋｅｄ）
した血漿希釈液は夫々０．２（ｘ＋２）／（１＋０．０
５）、０．１（ｘ＋２）／（１＋０．０５）．．．、
０．２（ｘ＋４）／（１＋０．１）、０．１（ｘ＋４）
／（１＋０．１）．．．、０．２（ｘ＋６）／（１＋
０．１５）、０．１（ｘ＋６）／（１＋０．１
５）．．．μｇ／ｍｌを含有する。
【００４４】例えば０．２ｘ（５倍希釈の非内標準化血
漿）の応答が０．１（ｘ＋２）／（１＋０．０５）（１
０倍希釈で２μｇ／ｍｌとなるように内標準化した血
漿）に等しいとき、０．２ｘ＝０．１（ｘ＋２）／（１
＋０．０５）、従ってｘ＝１．８μｇ／ｍｌである。
漿）の応答が０．１（ｘ＋２）／（１＋０．０５）（１
０倍希釈で２μｇ／ｍｌとなるように内標準化した血
漿）に等しいとき、０．２ｘ＝０．１（ｘ＋２）／（１
＋０．０５）、従ってｘ＝１．８μｇ／ｍｌである。
【００４５】この手順を使用して、血漿プールが２．４
μｇ／ｍｌの可溶性フィブリンを含有していることを確
証した。
μｇ／ｍｌの可溶性フィブリンを含有していることを確
証した。
【００４６】次にＰＰＡＣＫ（血漿ｍｌ当たり５ｍＭ溶
液０．０５ｍｌ）で前処理した正常血漿をフィブリン保
存溶液で５μｇ／ｍｌの最終濃度に調整した。これを以
下に記載するＥＩＡのキャリブレーターとして使用し
た。
液０．０５ｍｌ）で前処理した正常血漿をフィブリン保
存溶液で５μｇ／ｍｌの最終濃度に調整した。これを以
下に記載するＥＩＡのキャリブレーターとして使用し
た。
【００４７】ＥＩＡ手順
キャリブレーターを、５ＩＵヘパリン／ｍｌを加えたＰ
ＢＳＴ（ＰＢＳＴ／ｈｅｐ）で５倍に希釈した。次に、
ＰＢＳＴ／ｈｅｐで連続２倍希釈することにより１０、
２０、４０及び８０倍の希釈液を調製した。テストサン
プルをＰＢＳＴ／ｈｅｐで５及び１０倍に希釈した。キ
ャリブレーター及びサンプル希釈液の１００μｌのアリ
コートを抗Ｆｂ−１／２で被覆したマイクロタイタープ
レートのウェルにピペットで移した。３０分間４〜８℃
でインキュベーションした後、プレートを２５０μｌの
ＰＢＳＴで４回洗った。次に、Ｇ８／ＨＲＰのＰＢＳＴ
／ＢＳＡ溶液の１００μｌアリコートをウェルに加え、
４５分間４〜８℃でインキュベートした。プレートをＰ
ＢＳＴ２５０μｌで４回洗浄後、ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2基質の
１００μｌアリコートを加え、２０分間室温でインキュ
ベートした。青色が現れ、各ウェルに１Ｍ Ｈ2ＳＯ4の
１００μｌアリコートを加えることにより反応を停止す
ると、黄変した。マルチチャネル分光光度計（Ｍｕｌｔ
ｉｓｋａｎ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌ
ｔｄ．， Ａｙｒｓｈｉｒｅ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を
使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取った。キャリブレ
ーターウェル中の最終可溶性フィブリン濃度（即ち１、
０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５μｇ／ｍ
ｌ）に対する吸光度をプロットすることにより検量線を
作成した。サンプル中の可溶性フィブリン濃度をこの曲
線から読み取った。
ＢＳＴ（ＰＢＳＴ／ｈｅｐ）で５倍に希釈した。次に、
ＰＢＳＴ／ｈｅｐで連続２倍希釈することにより１０、
２０、４０及び８０倍の希釈液を調製した。テストサン
プルをＰＢＳＴ／ｈｅｐで５及び１０倍に希釈した。キ
ャリブレーター及びサンプル希釈液の１００μｌのアリ
コートを抗Ｆｂ−１／２で被覆したマイクロタイタープ
レートのウェルにピペットで移した。３０分間４〜８℃
でインキュベーションした後、プレートを２５０μｌの
ＰＢＳＴで４回洗った。次に、Ｇ８／ＨＲＰのＰＢＳＴ
／ＢＳＡ溶液の１００μｌアリコートをウェルに加え、
４５分間４〜８℃でインキュベートした。プレートをＰ
ＢＳＴ２５０μｌで４回洗浄後、ＴＭＢ／Ｈ2Ｏ2基質の
１００μｌアリコートを加え、２０分間室温でインキュ
ベートした。青色が現れ、各ウェルに１Ｍ Ｈ2ＳＯ4の
１００μｌアリコートを加えることにより反応を停止す
ると、黄変した。マルチチャネル分光光度計（Ｍｕｌｔ
ｉｓｋａｎ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌ
ｔｄ．， Ａｙｒｓｈｉｒｅ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を
使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取った。キャリブレ
ーターウェル中の最終可溶性フィブリン濃度（即ち１、
０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５μｇ／ｍ
ｌ）に対する吸光度をプロットすることにより検量線を
作成した。サンプル中の可溶性フィブリン濃度をこの曲
線から読み取った。
【００４８】試験で０．１μｇ／ｍｌ程度の低濃度は容
易に測定可能である。使用される最低希釈率は５倍であ
るので、これは０．５μｇ／ｍｌ血漿のレベルに対応す
る。
易に測定可能である。使用される最低希釈率は５倍であ
るので、これは０．５μｇ／ｍｌ血漿のレベルに対応す
る。
【００４９】他のアッセイとの相関
血漿をトロンビンで処理する際、可溶性フィブリン濃度
の増加がフィブリノペプチドＡ濃度の増加に相関するか
否かを調べるために、トロンビン濃度（０．０５〜０．
２５ＮＩＨ／ｍｌ）及び処理時間（２〜４５分間）を変
化させて血漿サンプルを処理した。血漿２ｍｌ当たり１
００μｌのＰＰＡＣＫ（５ｍＭ）を加えることによりト
ロンビン反応を停止した。次に各サンプルを２分割し
た。サンプルの一方の部分（１ｍｌ）にはフィブリノペ
プチドＡ用テストキット（ＲＩＡ−ｍａｔ（登録商標）
ＦＰＡ）に含まれる抗凝血剤溶液２００μｌを加え、
他方の部分（１ｍｌ）はＥＩＡ（上記参照）を使用して
可溶性フィブリン濃度を決定するために使用した。可溶
性フィブリン及びフィブリノペプチドＡの検出値は各希
釈液に関して補正した。放出されたフィブリノペプチド
Ａと形成された可溶性フィブリンとの量の相関は非常に
良好である。相関係数は０．９９８である。
の増加がフィブリノペプチドＡ濃度の増加に相関するか
否かを調べるために、トロンビン濃度（０．０５〜０．
２５ＮＩＨ／ｍｌ）及び処理時間（２〜４５分間）を変
化させて血漿サンプルを処理した。血漿２ｍｌ当たり１
００μｌのＰＰＡＣＫ（５ｍＭ）を加えることによりト
ロンビン反応を停止した。次に各サンプルを２分割し
た。サンプルの一方の部分（１ｍｌ）にはフィブリノペ
プチドＡ用テストキット（ＲＩＡ−ｍａｔ（登録商標）
ＦＰＡ）に含まれる抗凝血剤溶液２００μｌを加え、
他方の部分（１ｍｌ）はＥＩＡ（上記参照）を使用して
可溶性フィブリン濃度を決定するために使用した。可溶
性フィブリン及びフィブリノペプチドＡの検出値は各希
釈液に関して補正した。放出されたフィブリノペプチド
Ａと形成された可溶性フィブリンとの量の相関は非常に
良好である。相関係数は０．９９８である。
【００５０】別の組のサンプルを使用して、ＥＩＡの結
果と「ＣＯＡ−ＳＥＴフィブリンモノマー」試験の結果
との相関を検討した。
果と「ＣＯＡ−ＳＥＴフィブリンモノマー」試験の結果
との相関を検討した。
【００５１】本発明のＥＩＡにより検出された可溶性フ
ィブリン値と、組織型プラスミノーゲンアクチベータ
（ＣＯＡ ＳＥＴフィブリンモノマー）によるプラスミ
ノーゲンの活性化におけるフィブリンの刺激機能に基づ
くアッセイで検出された値との相関も良好であった（相
関係数は０．９８４）。
ィブリン値と、組織型プラスミノーゲンアクチベータ
（ＣＯＡ ＳＥＴフィブリンモノマー）によるプラスミ
ノーゲンの活性化におけるフィブリンの刺激機能に基づ
くアッセイで検出された値との相関も良好であった（相
関係数は０．９８４）。
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フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭58−24862（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−158353（ＪＰ，Ａ)
特開 昭60−66996（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−178000（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
C12Q 1/56
Claims (10)
- 【請求項１】 可溶性フィブリンのイムノアッセイにお
いてキャリブレーターとして使用するための組成物の製
造方法であって、既知量のフィブリノーゲンを糖アルコ
ール、保存剤、金属ハロゲン化物及びアミノ酸を含む緩
衝溶液中で希釈し、続いてフィブリノペプチドＡ放出化
合物で処理することを特徴とする前記製造方法。 - 【請求項２】 フィブリノーゲンの供給源として正常ヒ
ト血漿を使用することを特徴とする請求項１に記載の製
造方法。 - 【請求項３】 前記正常ヒト血漿がトロンビンインヒビ
ターを含むことを特徴とする請求項２に記載の製造方
法。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか一項に記載の
製造方法によって製造されるフィブリノーゲンを実質的
に含んでいない可溶性フィブリンを含む組成物。 - 【請求項５】 可溶性フィブリンのイムノアッセイにお
いてキャリブレーターとして使用するための組成物であ
って、水溶性フィブリン、糖アルコール、保存剤、金属
ハロゲン化物、アミノ酸及びフィブリノペプチドＡ放出
化合物を含んでなる前記組成物。 - 【請求項６】 糖アルコールがマンニトールであり、保
存剤がナトリウムアジドであり、金属ハロゲン化物が臭
化ナトリウムであり、アミノ酸がグリシンであることを
特徴とする請求項４または５に記載の組成物。 - 【請求項７】 フィブリノペプチドＡ放出化合物がフィ
ブリノーゲンからフィブリノペプチドＡのみを放出する
Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ毒に由
来する酵素であることを特徴とする請求項４から６のい
ずれか一項に記載の組成物。 - 【請求項８】 前記酵素を不活性化する化合物が存在す
ることを特徴とする請求項７に記載の組成物。 - 【請求項９】 イムノアッセイにおける可溶性フィブリ
ンの検出方法であって、請求項５から８のいずれか一項
に記載の組成物をキャリブレーターとして使用すること
を特徴とする前記検出方法。 - 【請求項１０】 請求項５から８のいずれか一項に記載
の組成物を含んでなる可溶性フィブリンの検出用キッ
ト。
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