DE19729544A1

DE19729544A1 - Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischung oder Derivate und deren Verwendung

Info

Publication number: DE19729544A1
Application number: DE19729544A
Authority: DE
Inventors: Thomas Subkowski; Wilfried Hornberger
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 1999-01-14
Also published as: EP1000087A2; NO20000079D0; CZ297216B6; AU8540698A; CN1262690A; KR20010021649A; US6365155B1; BR9810574A; WO1999002564A2; CA2295218A1; IL133224A0; JP2002511880A; NO20000079L; WO1999002564A3; AU748841B2; CZ200057A3; ZA986064B

Description

Die Erfindung betrifft Ancrod spezifische monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate und deren Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen oder in der Diagnostik sowie pharmazeutische Zubereitungen, die diese Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate enthalten.

Weiterhin betrifft die Erfindung Zellen, die diese Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate exprimieren.

Ancrod (Handelsname: Arwin®, Arvin®) ist ein Enzym aus dem Gift der Malaiischen Grubenotter (Agkistrodon rhodostoma). Es ist eine hochglycosylierte Serinprotease mit einem mittleren MW von etwa 38 000, die antikoagulierende Eigenschaften sowie die Fähigkeit zur Auflösung von Blutgerinnseln besitzt.

Die normale Blutgerinnung erfolgt durch Thrombin, indem Thrombin die Fibrinopeptide A und B aus dem Fibrinogenmolekül abspaltet und so zur Fibrinbildung führt (EP-B-0 556 906), dem Hauptbe standteil von Thromben neben beispielsweise roten Blutkörperchen oder Plättchen. Ancrod spaltet im Gegensatz zu Thrombin nur die Arginin-Glycin Bindung in der α-("A")-Kette des Fibrinogenmole küls und setzt dabei die Fibrinopeptide A, AP und AY frei (Cole et al., J. Vascular. Surgery, Vol 17, 1993: 288-292). Die β-(B)-Kette des Fibrinogenmoleküls wird durch Ancrod nicht ange griffen und damit nicht freigesetzt. Die nach der durch Ancrod verursachten Abspaltung der Fibrinopeptide entstehenden Bruch stücke (Des-"A"-Fibrinmonomere) können schließlich zu dünnen Filamenten polymerisieren. Das entstehende atypische, lösliche Fibrin wird durch körpereigenes Plasmin lysiert und/oder durch das Retikuloendotheliale System (= RES, Monozyten-Makrophagen- System) entfernt. Eine weitere Spaltung des Des-"A"-Fibrinogen moleküls durch Thrombin zu natürlichen Fibrin erfolgt nicht mehr, da das entstandene Molekül kein Substrat des Thrombins ist.

Ancrod senkt dosisabhängig die Fibrinogenkonzentration im Blut. Durch die therapeutisch induzierte und gesteuerte Hypofibrino genämie werden Plasmaviskosität und Aggregationsneigung der Erythrozyten so weit vermindert, daß die Fließeigenschaften des Blutes entscheidend verbessert werden. Damit ist die Voraus setzung für eine stärkere Durchblutung stenosierter Gefäße gegeben.

Mit Ancrod werden zur Zeit beispielsweise chronische periphere arterielle Durchblutungsstörungen behandelt, sowie klinische Phase III-Studien zum Schlaganfall unternommen.

Ancrod wird vorteilhafterweise subkutan injiziert. Die Behandlung kann stationär oder, falls die regelmäßige, zur Überwachung der Therapie erforderliche Kontrolle der Fibrinogenkonzentration sichergestellt ist, auch ambulant durchgeführt werden. Die intra venöse Gabe von Ancrod ist möglich, sollte aber nur in Ausnahme fällen und unter stationärer Beobachtung erfolgen.

Ancrod ist grundsätzlich individuell zu dosieren. Maßgebend ist das Verhalten der Fibrinogenkonzentration in Abhängigkeit von der Ancrodgabe. Sie ist langsam auf 70-100 mg/100 ml Plasma zu senken (= therapeutischer Bereich). Während der gesamten Behandlungs zeit ist die Fibrinogenkonzentration auf Werte innerhalb dieses Bereiches einzustellen. Die Fließeigenschaften des Blutes sind unter diesen Bedingungen ausreichend gut. Die Therapiedauer be trägt in der Regel 3-4 Wochen, kann jedoch, falls erforderlich, über diesen Zeitraum hinaus verlängert werden.

Bei subkutaner Anwendung werden in den ersten 4 Tagen täglich 70 I.E. (= Internationale Einheiten, 1 ml) und ab dem 5. Tag, je nach Verhalten der Fibrinogenkonzentration, 70-140 I.E. verabreicht. Liegt die Fibrinogenkonzentration im therapeutischen Bereich, werden 2-3mal wöchentlich 210-280 I.E. auf einmal injiziert.

Intravenös werden initial 2-3 I.E./kg Körpergewicht innerhalb von acht Stunden infundiert. Anschließend wird Ancrod abhängig von der erreichten Fibrinogenkonzentration nachdosiert. Im all gemeinen reicht es aus, alle 12 Stunden weitere je 1 I.E./kg Körpergewicht langsam zu injizieren.

Die initiale Halbwertszeit von Ancrod in der Zirkulation beträgt etwa 3-5 Stunden, verlangsamt sich aber mit fallender Konzen tration, so daß nach etwa 4 Tagen, innerhalb dieser Zeit werden im allgemeinen 90% des verabreichten Ancrods eliminiert, die Halbwertszeit auf 9-12 Tage verlängert ist.

Obwohl mit Ancrod im Gegensatz zu beispielsweise Heparin und Warfarin geringere Probleme mit unspezifischen Blutungen während der Behandlung auftauchen (siehe Z.S. Latallo, "Retrospective Study on Complications and Adverse Effects of Treatment with Thrombin-Like Enzymes - A Multicenter Trial", Thromb. Haemostasis, 50, pp. 604-609, 1983), ist eine gezielte Behandlung solcher Blutungen erforderlich und wünschenswert.

Kontraindikationen bei der Behandlung mit Ancrod sind beispiels weise hämorrhagische Diathese, Blutungsgefahr bei Verletzungen, nach Operationen und Entbindungen, bei ulzerösen Intestinaler krankungen, Neoplasmen, schlecht einstellbarem Hochdruck, akutem Hirninfarkt und aktiver Lungentuberkulose, Funktionsstörungen des RES und Störungen des Gerinnselabbaus, z. B. bei hochfieberhaften Zuständen, schweren Lebererkrankungen, manifesten und drohenden Schockzuständen oder Schwangerschaft.

Wie oben beschrieben ist das Risiko einer Blutung mit Ancrod relativ gering, wenn die Fibrinogenkonzentration langsam gesenkt und während der Therapiedauer auf 70-100 mg/100 ml eingestellt wird. Patienten, bei denen eine latente Blutungsneigung besteht, z. B. bei Nierensteinen oder Niereninsuffizienz, sollten besonders sorgfältig überwacht werden. Arterienpunktionen und intra muskuläre Injektionen anderer Arzneimittel sind zu vermeiden. Gewarnt wird vor der gleichzeitigen Gabe von RES-blockierenden sowie ulzerogenen Arzneimitteln, Antikoagulantien, Antifibrino lytika, Thrombolytika und Medikamente, welche die Plättchen aggregation hemmen, sowie vor der intramuskulären Gabe von Ancrod. Die Resorption aus dem Muskeldepot erfolgt im allgemeinen sehr rasch, so daß zu viele Des-"A"-Fibrinmonomere abfluten und die Gefahr thromboembolischer Komplikationen gegeben ist.

In einer Studie mit 429 Patienten (Crit. Rev. Oncol. Hematol. 15 (1993) 23-33), denen Ancrod ohne vorherige thrombolytische Therapie verabreicht wurde, lag die Gesamtinzidenz für Blutungen bei 9,8% (4,2% interne Blutungen; 5,6% externe Blutungen).

Zur Zeit wird zur Neutralisation der enzymatischen Aktivität des Ancrods ein Antidot verwendet, das auf einer Immunglobulin zubereitung aus Ziegenserum basiert (Firmenschrift der Knoll AG, Juni 1983, Titel Arwin®). Dieses aus polyklonalen Antikörpern bestehende Antidot wird bei schweren Blutungskomplikationen oder erhöhter Blutungsgefahr, z. B. bei Unfallverletzungen oder wegen plötzlicher Indikationsstellung zur Operation, angewendet. Im Anschluß an die Neutralisation von Ancrod sollten 4-5 g human-Fi brinogen verabreicht werden. Wird human-Fibrinogen, Plasma oder Blut ohne vorherige Neutralisation von Ancrod durch ein Antidot appliziert, so besteht die Gefahr einer akuten disseminierten Gerinnung.

Stocker et al (Thrombosis Research, Vol. 6, 1975: 189-194) untersuchten die Thrombenbildung in Gegenwart von Arwin® allein und in Gegenwart des polyklonalen Antidots und konnten die Antidotwirkung belegen.

Neben dieser Verwendung von polyklonalen Antikörpern aus Ziegen werden in EP-B-0 395 375, EP-B-0 556 906 und Burkhardt et al (FEBS, Vol 297, No. 3, 1992: 297-301) monoklonale oder poly klonale Antikörpern zur Detektion der Expression von Ancrodgenen, dem Nachweis von Fibrinogen im Blut mit Hilfe von Ancrod und Ancrodantikörpern oder die Aufreinigung des Ancrods mit Hilfe von Antikörpern beschrieben.

Von Nachteil bei den als Ancrod-Antidot verwendeten polyklonalen Antikörpern aus Ziegen ist beispielsweise, daß sie aus einem Gemisch von Antikörpern bestehen, von denen viele keine Ancrod neutralisierende Wirkung haben. Diese Vielzahl unterschiedlicher Antikörper kann zu einer raschen Immunreaktion führen und führt außerdem zu einer relativ niedrigen Ancrodneutralisationskapa zität. Darüberhinaus sind im Antidot Antikörper unterschiedlicher Affinität gegenüber Ancrod enthalten. Polyklonale Antikörper lassen sich, da sie aus dem Tier gewonnen werden, nur schlecht standardisieren, daß heißt es gibt Schwankungen in den unter schiedlichen Produktionschargen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es ein Antidot gegenüber Ancrod zu entwickeln, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist und sich einfach technisch produzieren läßt.

Diese Aufgabe wurde durch die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate, die an Ancrod binden und dessen Aktivität inhibieren, wobei die Bindungsaffinität in einem Bereich von 1 × 10⁻⁷ bis 1 × 10⁻¹² M liegt und Neutalisationswirkung gegenüber polyklonalen Anti körpern aus Ziegen in vivo um mindestens 100% verbessert ist, gelöst.

Die erfindungsgemäßen als Ancrod-Antidot verwendeten Antikörper zeichnen sich vorteilhafterweise durch eine Reihe verbesserter Eigenschaften aus. Sie bilden beispielsweise ein homogenes, gut charakterisiertes Produkt aus einem Antikörper oder einer Anti körpersubklasse, das keine Schwankungen innerhalb der unter schiedlichen Produktionschargen aufweist. Sie sind in beliebiger Menge herstellbar und bergen, da sie nicht im Tier hergestellt werden, bei ihrer Produktion nicht das Risiko einer viralen oder bakteriellen Kontamination. Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate sind Epitop-spe zifisch und weisen eine hohe Bindungs- und Neutralisations aktivität aus. Sie können deshalb in geringen Mengen bei der Behandlung verabreicht werden. Die Homogenität des Produkts zu sammen mit den geringeren Aufwandmengen durch die hohe Bindungs- und Neutralisationsaktivität führen dazu, daß das Risiko einer Immunreaktion im Patienten deutlich reduziert wird. Schwankungen in der Bindungs- und Neutralisationsaktivität innerhalb der verschiedenen Antikörper, Antikörperfragmente oder Derivate wie bei polyklonalen Antikörpern kommen nicht vor. Durch Mischung verschiedener monoklonaler Antikörper, Antikörperfragmente oder Derivate mit Bindungsaktivität gegen unterschiedliche Epitope des Ancrod, läßt sich dieses sehr effizient neutralisieren.

Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate haben vorteilhafterweise eine Bindungs affinität gegenüber Ancrod in einem Bereich von 1 × 10⁻⁷ bis 1 × 10⁻¹² M, bevorzugt von 1 × 10⁻⁸ bis 1 × 10⁻¹¹, besonders bevorzugt von 1 × 10⁻⁹ bis 5 × 10⁻¹⁰ M.

Das erfindungsgemäße Antidot hat gegenüber polyklonalen Anti körpern aus der Ziege in vivo eine um mindestens 100% ver besserte Ancrod-neutralisierende Wirkung, bevorzugt eine um 250%, besonders bevorzugt eine um 500% verbesserte Wirkung. Auch in vitro zeigen die monoklonalen Antikörper eine deutlich bessere Wirkung als die polyklonalen Antikörper.

Unter erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern oder deren Frag mente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihre Subklassen wie die Subklassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃ oder IgG_M. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG₁/κ oder IgG_2b/κ. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Anti körperfragmente mit einer oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, die eine hohe Bindungs- und Neutralisations aktivität gegenüber Ancrod aufweisen wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂-Frag mente oder Einzelstrangfragmente, genannt. Bevorzugt sind ver kürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')₂. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden. Auch genmani pulierte nichtverkürzte Fragmente können vorteilhaft verwendet werden.

Die Antikörper oder Fragmente können allein oder in Mischungen verwendet werden.

Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen lassen sich in dem Fachmann bekannterweise beispielsweise aus den Hybridomzellen isolieren. Dazu werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannterweise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipula tion beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu-Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expressian in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand sind Zellen, die die erfindungsgemäßen Antikörper synthetisieren. Dies können nach Transformation wie oben erwähnt tierische, pilzliche, bakterielle Zellen oder Hefezellen sein. Vorteilhafterweise handelt es sich um Hybridomzellen oder Triomazellen, bevorzugt um Hybridomzellen. Diese Hybridomzellen lassen sich beispielsweise in bekannterweise aus mit Ancrod immunisierten Tieren und Isolierung deren Anti körper produzierenden B-Zellen, durch Selektion dieser Zellen auf Ancrod bindende Antikörper und anschließender Fusion dieser Zellen mit beispielsweise menschlichen oder tierischen z. B. Maus- Myelomzellen, humanen Lymphoblastoidzellen oder Heterohybridoma zellen (Koehler et al., Nature 256, 1975: 496) oder durch Infektion dieser Zellen mit entsprechenden Viren zu unsterblichen Zellen, herstellen. Bevorzugt werden durch Fusion hergestellte Hybridomazellinien, besonders bevorzugt werden Maus-Hybrido mazellinien, ganz besonders bevorzugt werden Hybridomazellinien, die die Antikörper MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27 sezernieren und die bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig) unter den Nummern DSM ACC2317, DSM ACC2318 und DSM ACC2319 hinterlegt wurden.

Die oben genannten Hybridomazellinien sezernieren besonders be vorzugte Antikörper vom IgG-Typ. Bei den gebildeten Antikörpern MAK 1-2, MAK 2-29/3 und MAK 3-27 handelt es sich um folgende IgG-Subtypen IgG₁/κ, IgG_2b/κ und IgG₁/κ. Diese bevorzugten Antikörper binden an unterschiedliche Epitope des Ancrodmoleküls, wie Tests auf kompetitive Bindung der Antikörper untereinander zeigten. Die Bindung des besonders bevorzugten Antikörper MAK 1-2 an sein Epitop führt zur stärksten Neutralisation des Ancrodmoleküls, da durch werden für die Neutralisation der enzymatischen Wirkung die geringsten Antikörpermengen benötigt. Die monoklonalen Antikörper zeigen eine deutlich höhere neutralisierende Wirkung als das üblicherweise bei der Behandlung von Blutungen verwendete Antidot auf Basis polyklonaler Antikörper, die aus der Ziege gewonnen werden und von der Knoll AG (Ludwigshafen) als Antidot vertrieben werden.

Als Derivate der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern seien hier Peptide, Peptidomimetika, die sich von den Antigen-bindenden Bereichen der Antikörper ableiten, an feste oder flüssige Träger die Polyethylenglycol, Glas, synthetische Polymere wie Polyacryl amid, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen oder natürliche Poly mere wie Cellulose, Sepharose oder Agarose gebundene Antikörper, Fragmente oder Peptide oder Konjugate mit Enzymen, Toxinen oder radioaktiven oder nichtradioaktiven Markern wie 3H, 123I, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Se, Fluoreszenz-/Chemilumineszenzmarkern wie Rhodamin, Fluores cein, Isothiocyanat, Phycoerythrin, Phycocyanin, Fluorescamin, Metallchelaten, Avidin, Streptavidin oder Biotin kovalent ge bundene Antikörper, Fragmente, oder Peptide genannt.

Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente; deren Mischungen und Derivate können direkt, nach Trocknung beispiels weise Gefriertrocknung, nach Anbindung an die oben genannten Träger oder nach Formulierung mit anderen pharmazeutischen Wirk- und Hilfsstoffen zur Herstellung von pharmazeutischen Zuberei tungen verwendet werden. Als Wirk- und Hilfsstoffe seien bei spielsweise weitere Antikörper, antimikrobielle Wirkstoffe, die mikrobiozid oder mikrobiostatisch wirken wie Antibiotika all gemein oder Sulfonamide, Antitumormittel, Wasser, Puffer, Saline, Alkohole, Fette, Wachse, inerte Träger oder sonstige für Parenteralia übliche Stoffe wie Aminosäuren, Verdicker oder Zucker genannt. Diese pharmazeutischen Zubereitungen werden bei der Bekämpfung von Krankheiten, bevorzugt bei der Bekämpfung von Gerinnungsstörungen vorteilhafterweise Störungen des peripheren Blutsystems oder bei Schlaganfall, verwendet.

Das erfindungsgemäße Antidot kann oral oder parenteral - subcu tan, intramuskulär, intravenös oder interperitoneal - verabreicht werden, bevorzugt wird die intramuskuläre oder intravenöse Gabe.

Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate können direkt oder nach Kopplung an feste oder flüssige Träger, Enzymen, Toxinen, radioaktiven oder nichtradioaktiven Marker oder an Fluoreszenz-/Chemilumineszenz markern, wie oben beschrieben, in der Diagnostik verwandt werden. Wobei Ancrod in den verschiedensten Körperflüssigkeiten aus den verschiedensten Organismen wie Mensch oder Tier oder den unter schiedlichsten Flüssigkeiten wie beispielsweise Kulturmedien von Hefen, Bakterien, Pilzen oder humanen oder tierischen Zell kulturen nachgewiesen werden kann.

Beispiele 1. Herstellung der Hybridomzellinien

Die Immunisierung, Fusion, Selektion und Charakterisierung wurde nach Literatur-beschriebenen Techniken (z. B. J.H. Peters; Mono klonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, Kapitel 2 bis 7 und 8, 1991) durchgeführt.

Weibliche Balb/c-Mäuse wurden mit 100 µg Ancrod, das durch Quervernetzung bezüglich der enzymatischen Aktivität inaktiviert wurde, intraperitoneal im 2-3 Wochen Rhythmus nach folgender Verabreichungsschema immunisiert:

1. in 100 µl PBS + 100 µl komplettes Freundsches Adjuvans
2. in 100 µl PBS + 100 µl inkomplettes Freundsches Adjuvans
3.-5. in 200 µl PBS.

Drei Tage nach der letzten Antigenapplikation wurde die Milz ent nommen, die Zellen gewaschen, vereinzelt und die Lymphozyten mit der Myelomzellinie SP2/0-Ag14 (= ATCC CRL 1581) fusioniert. Dazu wurden sie im Verhältnis 5 : 1 gemischt, mit 1,5 ml PEG-Lösung (= Polyethylenglykollösung) 1 min. bei 37°C inkubiert und mit PBS (= phosphatgepufferte Saline) versetzt (1 ml während 30 sec., 3 ml während 30 sec., 16 ml während 60 sec.). Nach einem Wasch schritt wurden die Zellen im Selektionsmedium [DMEM (= Dulbecco's Modified Eagle Medium); 10% FCS (= Fötales Kälberserum); 10% Condimed H1 (Boehringer Mannheim); HAT-Supplement (= Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin-Supplement); ITS-Supplement (= Insulin, Transferrin, Selenit-Supplement); Pyruvat; Glutamin; Strepto mycin/Penicillin] bei 37°C/7,5% CO₂ kultiviert.

Die Identifizierung von Hybridomen, die spezifische anti-Ancrod- Antikörper sezernieren, erfolgte wie folgt mittels einem spezifi schen ELISA in einer Mikrotiterplatte:

- Mikrotiterplatten beschichten mit 0,1 ml/well Ancrod bzw. Referenzproteinen zur Bestimmung der Spezifität (1 µg/ml 0,05 M NaHCO₃ pH 9,2) während 16 h/4°C
- Absättigen mit 0,3 ml/well 1% BSA/PBS während 0,5-1 h/23°C (h = Stunde)
- 3× Waschen mit PBS/0,05% Tween® 20
- Inkubation mit Zellkulturüberständen (50 µl verdünnt mit 50 µl PBS/0,1% BSA [= Rinderserumalbumin)/0,05% Tween® 20) während 2-4 h/23°C
- Waschen wie oben
- Inkubation mit 0,1 ml/well biotinyliertem anti-Maus-IgG Antikörper in 0,1% BSA/PBS während 2-4 h/23°C
- Waschen wie oben
- Inkubation mit 0,1 ml/well Streptavidin-Peroxidase-Komplex in 0,1% BSA/PBS während 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
- 0,1 ml/well Peroxidasesubstrat
- Reaktion stoppen mit 0,1 ml/well 2 M H₂SO₄
- Messung der Absorption bei 450 nm.

Peroxidasesubstrat: 0,1 ml TMB-Lösung (42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO) und 10 ml Substratpuffer (0,1 M Na-Acetat pH 4,9) mischen; dann Zusatz von 14,7 µl H₂O₂.

Hybridome mit einer positiven Antikörperreaktion wurden durch Subklonierung vereinzelt und die Einzelklone erneut getestet. Antikörper mit der höchsten Reaktivität wurden im in vitro Neutralisationsassay eingesetzt. Auf diesem Weg konnte eine Vielzahl von positiven Hybridomen, das heißt Zellen die Anti körper gegen Ancrod bilden, isoliert werden.

2. Produktion und Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper erfolgte aus serum freien Zellkulturüberständen. Dazu wurden die Hybridome schritt weise vom DMEM/HAT/10% FCS-Medium über DMEM/HT/10% FCS und DMEM/10% FCS auf ein serumfreies Zellkulturmedium (HT = Hypo xanthin, Aminopterin) wie z. B. SF-3 (Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio Whittaker), Ultra Doma PF (Bio Whittaker) oder ähnliche überführt. Für die anschließende Aufreinigung über Affinitäts chromatographie wurden Protein A- bzw. Protein G-Sepharose ver wendet.

Nach dem Auftragen der Zellkulturüberstände auf die Chromatogra phiesäulen wurden die unspezifisch gebundenen Proteine mit 3 M NaCl/1,5 M Glycin pH 8,9 weggewaschen; die anti-Ancrod-Anti körperaktivität wurde mit 500 mM NaCl/0,59% Essigsäure eluiert.

Die Bestimmung des Antikörpersubtyps erfolgte analog zum oben be schriebenen ELISA, wobei jedoch anstelle des biotinylierten anti- Maus-IgG-Antikörpers folgende biotinylierten Subtyp-spezifischen Antikörper verwendet wurden: anti-Maus-IgG₁, anti-Maus-IgM, anti-Maus-IgG_2a, anti-Maus-κ, anti-Maus-IgG_2b, anti-Maus-λ und anti-Maus-IgG₃.

Die Antikörpertypen und -subtypen der isolierten Hybridom zellinien MAK 1-2, MAK 2-29/3 und MAK 3-27 (siehe Beispiel 1) wurden jeweils wie folgt bestimmt IgG₁/κ, IgG_2bκ und IgG₁/κ.

Die Affinitätskonstanten der monoklonalen Antikörper wurden durch verschiedene, literaturbekannte Techniken ermittelt, wie beispielsweise z. B. Gleichgewichtsdialyse, Immunpräzipitation oder ELISA (z. B. J.H. Peters; Monoklonale Antikörper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, Kapitel 11, 1991).

Nach der ELISA-Methode (J. Immunol. Methods 77 (1985) 305-319) ergaben sich folgende Affinitäten gegenüber dem natürlichen Ancrod (Tabelle I):

Tabelle I

Affinitäten der monoklonalen Antikörper gegenüber Ancrod

3. "in vitro" Neutralisation von Ancrod durch monoklonale Antikörper (= MAK) - Zellkulturüberstände -

Die Neutralisationskapazität der Antikörper wurde anhand der Ancrod-induzierten Fibrintrübung quantifiziert. Dazu wurden in BSA-abgesättigte Mikrotiterplatten verschiedene Konzentrations verhältnisse Ancrod zu Antikörper (Zellkulturüberstände bzw. gereinigte Antikörper) bei 37°C inkubiert und anschließend mit human-Fibrinogen (1,5 mg) versetzt. Nach Inkubation bei 37°C wurde das entstandene Fibrin bei 340 nm quantifiziert (= optische Dichte = OD).

Mit zunehmender Menge an neutralisierenden Antikörpern konnte die Ancrodaktivität neutralisiert werden. Dies zeigte sich an den verringerten Optischen Dichten (= OD, Tabelle II).

Besonders effektiv wirkte der Antikörper MAK 1-2, der auch bei höheren Ancrodkonzentrationen zu einer vollständigen Neutrali sation führte (Tabelle II, OD entspricht dem Leerwert). Der Leer wert in der Tabelle II enthielt alle Bestandteile außer Ancrod. Die höchsten OD-Werte wurden jeweils mit den verschiedenen Ancrodgaben (50, 25 und 12,5 ng/ml Ancrod) ohne Zugabe der unterschiedlichen monoklonalen Antikörper gemessen (Tabelle II).

Die MAK's 2-29 und 3-27 haben ähnlich gute oder bessere Affini täten zu Ancrod als MAK 1-2 (Tabelle I), die Antikörper-Antigen- Bindung führte jedoch erst bei höheren Antikörpergaben bezogen auf die Ancrodmenge zu einer Neutralisation der enzymatischen Aktivität.

Tabelle II

Neutralisation von Ancrod durch Zellkulturüberstände der MAK's

4. "in vitro" Neutralisation von Ancrod durch gereinigte monoklonale Antikörper

Eine Bewertung der in vitro Neutralisationseffizienz der gereinigten monoklonalen Antikörper konnte durch Vergleich der 50% Neutralisationswerte im Fibrintrübungsassay vorgenommen werden.

Der 50% Neutralisationswert ergab sich folgendermaßen:
OD Negativkontrolle + (OD Positivkontrolle - OD Negativ kontrolle)/2
Negativkontrolle: keine Ancrodzugabe (keine Fibrinbildung)
Positivkontrolle: Ancrod + Fibrinogen (maximale Fibrinbildung).

Durch unterschiedliche Verhältnisse Antikörper/Ancrod ergaben sich variierende OD-Werte, wobei der 50% Neutralisationspunkt bei folgenden Antikörperkonzentrationen lag:

Aus den Verhältnissen der zu einer 50%igen Neutralisation benötigten Antikörpermenge konnte man ableiten, daß unter den gewählten in vitro Bedingungen der monoklonale Antikörper MAK 1-2 bei 1 Stunde Vorinkubation mindestens um den Faktor 2, bei 2 Stunden Vorinkubation etwa um den Faktor 4 besser ist als das Antidot auf Basis polyklonaler Antikörper aus der Ziege.

5. Quantifizierung von Ancrod mittels eines "Sandwich-ELISA"

Die Bestimmung von Ancrod in Proben zu diagnostischen Zwecken, z. B. verschiedenen Körperflüssigkeiten, wurde durch Kombination von zwei Antikörpern mittels sandwich-ELISA nach folgendem Schema vorgenommen werden:

- Beschichtung der Microtiterplatten mit 5 µg/ml MAK 1-2 bzw. MAK 3-27 in 100 µl/well, verdünnt in 0,05 M NaHCO₃, pH 9,2; über Nacht/4°C
- Waschen der Microtiterplatten mit PBS/0,05% Tween® 20; 200 µl/well
- Absättigen mit 300 µl/well 1% BSA/PBS; 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
- 11 Standardverdünnungen in 2er Schritten von Ancrod, angefan gen mit 50 ng/ml in PBS/0,1% BSA/0,05% Tween® 20; 100 µl/well; die Proben werden parallel dazu in unterschiedlichen Verdünnungen eingesetzt; Inkubation 2 h/23°C
- Waschen wie oben
- Inkubation mit MAK 2-29; 1 µg/ml verdünnt in PBS/0,1% BSA/0,05% Tween® 20; 100 µl/well; 2 h/23°C
- Waschen wie oben
- Inkubation mit biotinyliertem anti-Maus IgG_2b; 1 : 10 000 ver dünnt in PBS/0,1% BSA/0,05% Tween® 20; 100 µl/well; 2 h/23°C
- Waschen wie oben
- Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase-Komplex, 1 : 10 000 verdünnt in PBS/0,1% BSA/0,05% Tween® 20; 100 µl/well; 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
- Zugabe von 100 µl/well Peroxidasesubstrat: (10 ml Substrat puffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) mischen mit 100 µl TMB-Lösung (42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO) und Zugabe von 14,7 µl H₂O₂ 3%)
- die Reaktion wird mit 100 µl/well 2 M H₂SO₄ abgestoppt
- Messung der Absorption bei 450 nm.

Für beide monoklonalen Antikörper MAK 1-2 bzw. MAK 3-27 und die verwendeten Kombinationen zeigte es sich, daß sich Ancrod in einem Konzentrationsbereich von etwa 3000 bis 100 pg/ml quanti fizieren und nachweisen läßt. Die absolute Nachweisgrenze liegt noch unter diesen quantifizierbaren Werten (Fig. 1).

6. Kompetitiver ELISA

Zur Charakterisierung der relativen Lage der MAK-Bindungsepitope auf dem Ancrod wurde ein kompetitiver ELISA durchgeführt:

- Beschichtung der Microtiterplatten mit 1 µg/ml Ancrod 100 µl/well, verdünnt in 0,05 M NaHCO₃, pH 9,2; über Nacht/4°C
- Waschen der Microtiterplatten mit PBS/0,05% Tween® 20; 200 µl/well
- Absättigen mit 300 µl/well 1% BSA/PBS; 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
- In die so vorbereiteten Mikrotiterplatten wurden in verschie denen Ansätzen je 10 ng/ml der monoklonalen biotinylierten, Antikörper MAK 1-2-Biotin, MAK 2-29/3-Biotin und MAK 3-27-Biotin gegeben und an Ancrod gebunden, anschließend wurden je nach vorgelegtem Antikörper variable Konzentratio nen (1 µg/ml - 1 ng/ml) je eines anderen Antikörpers (MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27) zu den Ansätzen gegeben, so daß alle möglichen Antikörperkombinationen bezüglich ihrer möglichen überlappenden Bindungsstellen getestet wurden. Die Ansätze mit den unterschiedlichen Antikörperkombinationen wurden in PBS/0,1% BSA/0,05% Tween® 20 zwei Stunden bei 23°C inkubiert und anschließend wie folgt weiter behandelt:
- Waschen wie oben
- Inkubation mit Streptavidin-Peroxidase-Komplex, 1 : 10 000 ver dünnt in PBS/0,1%, BSA/0,05% Tween® 20; 100 µl/well; 0,5 h/23°C
- Waschen wie oben
- Zugabe von 100 µl/well Peroxidasesubstrat: (10 ml Substrat puffer (0,1 M Natriumacetat pH 4,9) mischen mit 100 µl TMB-Lösung
(42 mM Tetramethylbenzidin in DMSO) und Zugabe von 14,7 µl H₂O₂ 3%)
- die Reaktion wird mit 100 µl/well 2 M H₂SO₄ abgestoppt
- Messung der Absorption bei 450 nm.

In keiner der eingesetzten Antikörperkombinationen war eine Abnahme der OD zu beobachten, das heißt die verschiedenen monoklonalen Antikörper verdrängten sich nicht bei der Bindung an Ancrod. Sie binden an unterschiedliche Epitope des Ancrod moleküls. Es können deshalb mehrere der Antikörper gleichzeitig mit Ancrod wechselwirken. Für eine rasche optimale Neutralisation der Ancrodwirkung können die verschiedenen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper deshalb falls erforderlich und gewünscht in Kombination verwendet werden.

4. "in vivo" Neutralisation von Ancrod

Ancrod wurde anästhesierten Ratten über 30 Minuten als Infusion von 10 IU/kg Körpergewicht in der Schwanzvene verabreicht. 10 Mi nuten nach dem Start der Ancrodinfusion wurden die verschiedenen Testsubstanzen - monoklonaler, polyklonaler Antikörper oder Placebo - als intravenöser Bolus mit 1 ml/kg Körpergewicht ver abreicht. Blutproben (8 Vol. Blut + 2 Vol. Antikoagulanz 0,11 M Citrat) wurden aus der Carotisarterie vor bzw. 30 und 60 Minuten nach dem Beginn der Ancrodinfusion abgenommen. Das Plasma wurde aus dem Citratblut durch Zentrifugation gewonnen und der Fibrino gengehalt nach der Claussgerinnungsmethode bestimmt (Eichkurve durch Zugabe definierter Mengen an Rattenfibrinogen zu defibrino geniertem Rattenplasma).

Es wurden jeweils 6 Ratten pro Gruppe (Testsubstanz) eingesetzt (Tabelle III).

Tabelle III

Testsubstanzen sowie eingesetzte Mengen

Tabelle IV

Messung der Fibrinogenkonzentration mit den ver schieden Antikörpern

Es zeigte sich, daß MAK 1-2 in der verwendeten Konzentration von 1,435 mg/kg Körpergewicht in der Lage war ein weiteres Absinken des Fibrinogenlevels 30 Minuten nach Beginn der Ancrodinfusion zu stoppen. Vom polyklonalen Antikörper aus Ziege werden für den gleichen Effekt 8,6 mg/kg Körpergewicht benötigt. In einer Konzentration von 1,5 mg/kg Körpergewicht, also vergleichbar der Konzentration des MAK 1-2, zeigte das Antidot auf der Basis poly klonaler Antikörper keinen Effekt (siehe Kontrolle Tabelle IV).

Aufgrund der nach 60 Minuten resultierenden Fibrinogenkonzentra tionen konnte abgeleitet werden, daß in vivo der MAK 1-2 unter den getesteten Bedingungen etwa um den Faktor 6 besser neutrali sierte, als das polyklonale Antidot. Vermutlich ist die neutrali sierende Wirkung des MAK 1-2 noch deutlich höher.

Claims

1. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate, die an Ancrod binden und dessen Aktivität inhibieren, wobei die Bindungsaffinität in einem Bereich von 1 × 10⁻⁷ bis 1 × 10⁻¹² M liegt und Neutralisationswirkung gegenüber polyklonalen Antikörpern aus Ziegen um mindestens 100% verbessert ist.

2. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich-um Antikörper des IgG-Typs handelt.

3. Monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Antikörper MAK 1-2, MAK 2-29/3 oder MAK 3-27 oder deren Mischungen handelt.

4. Zellen, die einen monoklonalen Antikörper, Antikörperfrag mente, deren Mischungen oder Derivate gemäß einem der Ansprü che 1 bis 3 exprimieren.

5. Zellen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hybridomzellinie handelt.

6. Zellen nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die Hybridomzellinien DSM ACC2317, DSM ACC2318 und DSM ACC2319 handelt.

7. Pharmazeutische Zubereitungen enthaltend einen monoklonalen Antikörper, Antikörperfragmente, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.

8. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfrag ments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 in pharmazeutischen Zubereitungen.

9. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfrag ments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Gerinnungsstörungen.

10. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Antikörperfrag ments, deren Mischungen oder Derivate gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 in der Diagnostik.