DE69435072T2

DE69435072T2 - Antikörper gegen menschliches lösliches fibrin, hybridome, die sie produzieren und immunmessverfahren

Info

Publication number: DE69435072T2
Application number: DE69435072T
Authority: DE
Inventors: Gilbu 13-1 Nishi-Goken-cho Shinjuku-ku SOE; Isao 13-1 Nishi-Goken-cho Shinjuku-ku KOHNO; Kimiko 13-1 Nishi-Goken-cho Shinjuku-ku INUZUKA; Yumiko 13-1 Nishi-Goken-cho Shinjuku-ku ITO
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 1993-11-02
Filing date: 1994-11-01
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: DK0678524T3; AU8004394A; DE69435072D1; US5821068A; EP0678524B1; WO1995012617A1; EP0678524A1; EP0678524A4; JP3517754B2; ES2300102T3; ATE385506T1; AU689147B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoclonalen Antikörper, der mit menschlichem löslichem Fibrin reagiert, der aber nicht mit menschlichem Fibrinogen reagiert, ein Hybridom, das den vorstehenden monoclonalen Antikörper sekretiert, und ein Verfahren zur Immununtersuchung von löslichem Fibrin mit dem vorstehenden monoclonalen Antikörper. Gemäß dem Immununtersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, den Gehalt an löslichem Fibrin in einer Plasmaprobe rasch und genau zu bestimmen, ohne dass dabei eine Umsetzung mit Fibrinogen, den verschiedenen Fibrinogen-Fragmenten, den verschiedenen Fibrinfragmente und den verschiedenen Plasmin-Abbauprodukte von stabilisiertem Fibrin, die in der Probe vorliegen, erfolgt oder eine Beeinflussung dadurch stattfindet, und dies sogar ohne eine Vorbehandlung der Plasmaprobe mit einem Protein-denaturierenden Agens wie z. B. Kaliumthiocyanat (KSCN), wobei die Bestimmung in einer spezifischen und reproduzierbaren Weise über ein immunologisches Verfahren erfolgt. Der Begriff „menschliches lösliches Fibrin", der hierin verwendet wird, bezeichnet einen Fibrin-Fibrinogen-Komplex, der durch die Bindung von Fibrinogen an des-AABB-Fibrin oder an des-AA-Fibrin gebildet wird.
HINTERGRUND DES FACHGEBIETS
Thrombin reagiert mit Fibrinogen, das normalerweise im Blut vorliegt, um schrittweise das Fibrinopeptid A von der Aα-Kette und das Fibrinopeptid B von der Bβ-Kette freizusetzen und so das Fibrin-Monomer I (des-AA-Fibrin) beziehungsweise das Fibrin-Monomer II (des-AABB-Fibrin) zu bilden. Die Fibrin-Monomere können im Blut bis zu einem bestimmten Spiegel als lösliches Fibrin vorhanden sein, das durch die Bindung an Fibrinogen im Blut gebildet wird. Wenn sich die Konzentration der Fibrin-Monomere jedoch erhöht, werden die Fibrin-Monomere polymerisiert und bilden ein Fibringerinnsel. Daher ist es wünschenswert, das lösliche Fibrin im Blut früh nachzuweisen, um die Bildung eines Fibringerinnsels, d. h. die Bildung eines Thrombus, früh vorhersagen zu können, um rechtzeitig eine Behandlung zur Hemmung der Blutgerinnung, d. h. der Bildung des Thrombus, durchführen zu können. Der Nachweis des löslichen Fibrins kann durch einen Antikörper erfolgen, der mit dem löslichen Fibrin, aber nicht mit Fibrinogen reagiert.
Für den vorstehenden Zweck wurde über die Herstellung von Antikörpern berichtet, die für Fibrin spezifisch sind. So offenbarten zum Beispiel Kudryk et al. monoclonale Antikörper, die unter Verwendung eines Fragments als Immunogen erhalten wurden, das durch die Behandlung des Aminoterminus des Fibrins mit Bromcyan hergestellt worden war, und die mit dem Aminoterminus der Fibrin-β-Kette reagieren [Macromolecular Immunology, 89–94 (1984)]. Des Weiteren offenbarten Hui et al. Antikörper, die durch die Immunisierung mit einem Peptid aus dem Aminoterminus der Fibrin-β-Kette erhalten wurden [Hybridoma 5, 215–222 (1985)]. Hierbei bestand jedoch der Nachteil darin, dass die Antikörper nur den Aminoterminus der Fibrin-β-Kette erkannten, die von dem Fibrinopeptid B durch Abspaltung freigesetzt wird, und sie daher nicht für den Nachweis von Fibrin I, d. h. von des-AA-Fibrin, verwendet werden können.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 152,612 und die japanische ungeprüfte Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 60-158353 offenbaren ein EIA-Verfahren für die Bestimmung von Fibrin unter Verwendung eines Antikörpers, der aus einem Tier stammt, das mit einem immunogenen Peptid aus dem Aminoterminus der α-Kette immunisiert wurde, welcher durch Abspaltung des Fibrinopeptids A neu hergestellt wird. Der Antikörper reagiert jedoch nicht mit dem Fibrinkomplex im Blut, weil der Aminoterminus der Fibrin-α-Kette nach der Bindung an Fibrinogen oder an anderes Fibrin, das in großer Menge im Blut vorliegt, maskiert wird. Um diesen Nachteil zu beheben, war es nötig, vor der Analyse den Fibrin-Komplex mit einer hohen Konzentration an Natriumthiocyanat zu behandeln und ihn so in Fibrin-Monomere umzuwandeln [Blond Coagulation and Fibrinolysis 4, 97–102 (1993)]. Darüber hinaus bestand der Nachteil, dass der Antikörper mit Plasmin-Abbauprodukten des Fibrins und mit den Fibrin-Fragmenten X, Y, D und E reagierte, die alle das gleiche Epitop aufweisen.
WO 8801514 offenbart einen monoclonalen Antikörper, der unter Verwendung des menschlichen Fibrins als Immunogen erhalten wurde. Der Antikörper reagiert jedoch auch mit den Fibrin-Fragmenten D, X und Y und mit der Fibrinogen-A-Kette und kann somit nicht als ein Antikörper bezeichnet werden, der für Fibrin spezifisch ist. Darüber hinaus offenbart die japanische ungeprüfte Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 2-28197 (entspricht der niederländischen Patentanmeldung Nr. 31,8801227) einen monoclonalen Antikörper, der mit einem Peptid von der 111. bis zur 207. Aminosäure der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-Aα-Kette reagiert. Der monoclonale Antikörper reagiert nicht mit Fibrinogen, sondern reagiert spezifisch mit Fibrin. Mit anderen Worten reagiert der monoclonale Antikörper sowohl mit Fibrin I (des-AA-Fibrin) als auch mit Fibrin II (des-AABB-Fibrin). Der monoclonale Antikörper reagiert jedoch auch mit dem D-Dimer, Degta und mit der Fibrinogen-A-Kette und kann somit nicht als ein Antikörper bezeichnet werden, der für Fibrin spezifisch ist. Darüber hinaus ist es nicht möglich, einen Einfluss der Plasmin-Abbauprodukte von Fibrin auszuschließen, wenn ein Testsystem unter Verwendung des vorstehenden Antikörpers aufgebaut wird.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung arbeiteten in der Forschung, um ein Verfahren für eine einfache und genaue Messung des löslichen Fibrins mit guter Reproduzierbarkeit zu entwickeln, und entdeckten als Ergebnis einen monoclonalen Antikörper, der mit menschlichem löslichem Fibrin an einem Neoantigen reagiert, das in einem Fibrinmolekül zu dem Zeitpunkt neu exponiert wird, wenn ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex durch Bindung von des-AABB-Fibrin oder von des-AA-Fibrin und Fibrinogen gebildet wird, der aber nicht mit menschlichem Fibrinogen reagiert, wobei ein Epitop, das durch den monoclonalen Antikörper erkannt wird, in der Aα-Kette (17–78) der E-Domäne vorliegt, von der das Fibrinopeptid A oder die Fibrinopeptide A und B freigesetzt werden, und wobei dieser monoclonale Antikörper an menschliches lösliches Fibrin bindet, das nicht mit einem Protein-denaturierenden Agens vorbehandelt wurde. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass, wenn einer der vorstehend erwähnten monoclonalen Antikörper oder eine Kombination aus beiden verwendet wird, es möglich ist, den Gehalt an löslichem Fibrin in der Plasmaprobe ohne eine Beeinflussung durch Fibrinogen, die verschiedenen Fibrinogen-Fragmente X, Y, D oder E, die verschiedenen Fibrin-Fragmente X, Y, D oder E und die verschiedenen Plasmin-Abbauprodukte des stabilisierten Fibrins, die in der Probe vorliegen, rasch, genau und spezifisch zu bestimmen, und dies sogar ohne eine Vorbehandlung der Plasmaprobe mit einem Protein-denaturierenden Agens wie z. B. Kaliumthiocyanat (KSCN). Daher besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung der vorstehenden neuen monoclonalen Antikörper, der Hybridome, die die vorstehenden monoclonalen Antikörper sekretieren, und in einem Immununtersuchungsverfahren unter Verwendung des oder der vorstehenden monoclonalen Antikörpers oder Antikörper.
Die vorliegende Erfindung betrifft den monoclonalen Antikörper, der mit menschlichem löslichem Fibrin reagiert, jedoch nicht mit menschlichem Fibrinogen reagiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Hybridom, das den vorstehenden monoclonalen Antikörper sekretiert.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung des menschlichen löslichen Fibrins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Probe in Kontakt mit dem vorstehenden monoclonalen Antikörper gebracht wird, der auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, und Agglunitation beobachtet wird.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur immunologischen Untersuchung des menschlichen löslichen Fibrins, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der vorstehende monoclonale Antikörper auf einem unlöslichen Träger als erster Antikörper immobilisiert wird, eine Probe mit dem ersten Antikörper und dann mit einem markierten zweiten Antikörper in Kontakt gebracht wird, wobei es sich um einen Antikörper der gleichen Art oder einer anderen Art als der vorstehende Antikörper handelt, und ein Signal ausgehend von der Markierung des zweiten Antikörpers nachgewiesen wird, der an den immobilisierten ersten Antikörper-menschliches unlösliches Fibrin gebunden ist oder ausgehend von dem zweiten Antikörper nachgewiesen wird, der nicht an den immobilisierten ersten Antikörper-menschliches unlösliches Fibrin gebunden hat.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren für die Diagnose einer disseminierten intravaskulären Gerinnung (DIC), umfassend den Nachweis des löslichen Fibrins in einer biologischen Probe durch das vorstehende Immununtersuchungsverfahren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Bestimmung des löslichen Fibrins in Proben aus gesunden Personen oder aus DIC-Patienten zeigt, wie sie in Beispiel 7 durchgeführt wird.
2 ist eine Standardkurve eines EIA, wie er in Beispiel 8 durchgeführt wird.
3 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse einer Molekülsieb-Chromatographie von normalem Serum, dem das in Essigsäure solubilisierte Fibrin-Monomer zugefügt wurde, mit Sephacryl S-300 zeigt, wie sie in Beispiel 9 durchgeführt wird.
4 stellt schematisch das Epitop dar, das in der E-Domäne zu dem Zeitpunkt neu exponiert wird, an dem die Fibrin-Monomere an Fibrinogene binden, um einen Fibrin-Fibrinogen-Komplex zu bilden.
DAS BESTE VERFAHREN ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend in der Reihenfolge monoclonale Antikörper, die Hybridome und das Immununtersuchungsverfahren erläutert.
Die monoclonalen Antikörper und die Hybridome können zum Beispiel unter Verwendung von menschlichem löslichem Fibrin als Immunogen hergestellt werden. Menschliches lösliches Fibrin, das als Immunogen verwendet wird, kann zum Beispiel entsprechend dem Verfahren von Remo Largo et al. [Blond 47, 991–1002 (1976)] hergestellt werden. Spezifischer beschrieben wird Fibrinogen in physiologischer Salzlösung gelöst. Es wird bevorzugt, dass die Salzlösung einen Hemmstoff (wie z. B. EDTA) für die Blut-Gerinnungsfaktoren (insbesondere Faktor XIII) enthält, die in Spurenmengen in dem Fibrin-Standard-Reagenz vorhanden sind. Dann wird der Fibrinogen-Lösung Thrombin zugegeben und das Gemisch wird ca. 90 Minuten bei etwa 37°C inkubiert, um ein Fibringerinnsel zu bilden. Das Fibringerinnsel wird abgetrennt, gewaschen und dann in einer Harnstoff-Lösung aufgelöst. Unlösliche Bestandteile werden abgetrennt, zum Beispiel durch Zentrifugation, um gereinigte Fibrin-Monomere zu erhalten. Das so erhaltene gereinigte und in Harnstoff solubilisierte Fibrin-Monomer kann als Immunogen oder als Standard-Reagenz bei dem Immununtersuchungsverfahren verwendet werden.
Alternativ kann das Fibringerinnsel, das durch die Zugabe von Thrombin gebildet wurde, in Acetat-Puffer gelöst und gegen diesen dialysiert werden, wie z. B. 50 mM Acetat-Puffer (pH-Wert 4,6), um ein in Acetat-Puffer solubilisiertes Fibrin-Monomer herzustellen, das als Standard-Reagenz bei dem Immununtersuchungsverfahren verwendet werden kann.
Anschließend wird die Immunogen-Lösung aus dem gereinigten und in Harnstoff solubilisierten menschlichen Fibrin-Monomer dazu verwendet, Säuger (zum Beispiel Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen und Pferde) unter Verwendung eines in vivo-Immunisierungsverfahrens zu immunisieren. Genauer gesagt wird die Immunogen-Lösung aus gereinigtem und in Harnstoff solubilisierten menschlichen Fibrin-Monomer zum Beispiel mit dem gleichen Volumen an komplettem Freundschen Adjuvanz oder an inkomplettem Freundschen Adjuvanz vermischt, bis eine Emulsion entstanden ist. Das Gemisch wird zum Beispiel subcutan Mäusen verabreicht (in einer ersten Immunisierung). Dann wird die gleiche Prozedur in Intervallen von zwei bis vier Wochen für mehrere Immunisierungen wiederholt. Einige Tage nach der abschließenden Immunisierung wird die Milz aseptisch entfernt und durch ein rostfreies Stahlnetz oder ähnliches gedrückt, um Milzzellen herzustellen, die für die Zellfusion verwendet werden.
Für die anderen Elternzellen, die für die Zellfusion verwendet werden, das heißt die Myelomzellen, können verschiedene Arten bekannter Zelllinien verwendet werden, wie z. B. p3 (p3/x63-Ag8) [Nature 256, 495–497 (1975), p3-U1 [Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1–7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol. 6, 511–519 (1976)], MPC-11 [Cell 8, 405–415 (1976)], SP2/0 [Nature 276, 269–270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth. 35, 1–21 (1980)], x63.6.55.3 [J. Immunol. 123, 1548–1550 (1979)], S194 [J. Exp. Med. 148, 313–323 (1978)], R210 aus Ratten [Nature 277, 131–133 (1979)] oder ähnliche.
Die Zellfusion zwischen den immunisierten Milzzellen und den Myelomzellen kann durch die üblichen Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein bekanntes Fusions-förderndes Mittel (Polyethylenglycol, Sendai-Virus oder ähnliches) und wahlweise ein Hilfsmittel (Dimethylsulfoxid oder ähnliches) verwendet werden. Das Verhältnis zwischen den immunisierten Milzzellen und den Myelomzellen kann das Gleiche wie bei den herkömmlichen Verfahren sein. Zum Beispiel können die Milzzellen in Mengen von etwa der einfachen bis zu der 10-fachen Menge an Myelomzellen verwendet werden. Als Fusionsmedium kann zum Beispiel das Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) mit 40% (Gew./Vol.) Polyethylenglycol verwendet werden. Die Fusion erfolgt durch intensive Durchmischung der immunisierten Milzzellen und der Myelomzellen in dem vorstehenden Medium.
Anschließend wird ein Selektionsmedium (zum Beispiel HAT-Medium) verwendet, um alle Zellen außer den Hybridom-Zellen zu entfernen. Die gesuchten Hybridome werden abgetrennt, dies erfolgt durch den Nachweis der Anwesenheit der Antikörper, die in den Überstand der Hybridom-Kultur hergestellt werden, zum Beispiel durch ein ELISA-Verfahren. Die so erhaltenen Hybridome der vorliegenden Erfindung, welche die gewünschten monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sekretieren, können schrittweise in gewöhnlichen Medien kultiviert werden, und sie können über lange Zeiträume in flüssigem Stickstoff oder ähnlichem aufbewahrt werden.
Als Medium zur Kultur der Hybridome kann jedes Medium verwendet werden, das für die Anzucht der Hybridome geeignet ist. Bevorzugt wird ein Medium verwendet, das DMEM einschließlich fötalem Kälberserum, L-Glutamin, L-Pyruvat und Antibiotika (Penicillin G und Streptomycin) umfasst. Die Kultur der Hybridome wird zum Beispiel bevorzugt etwa 3 Tage in einem Medium bei 5% CO₂ und 37°C im Falle einer in vitro-Kultur oder etwa 14 Tage im Falle einer in vivo-Kultur durchgeführt; diese erfolgt zum Beispiel in der Bauchhöhle von Mäusen.
Die gesuchten monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können durch ein übliches Verfahren von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und gereinigt werden, die durch die Kultur der Hybridome der vorliegenden Erfindung durch ein übliches Verfahren erhalten wurde, oder aus der Aszites-Flüssigkeit geeigneter Säuger (zum Beispiel Mäuse oder Ratten) abgetrennt und gereinigt werden, denen die Hybridome der vorliegenden Erfindung verabreicht wurden. Bei der Abtrennung und der Reinigung der monoclonalen Antikörper aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit oder aus der Aszites-Flüssigkeit von Mäusen ist es möglich, Verfahren zu verwenden, die üblicherweise für die Isolierung und die Reinigung von Proteinen verwendet werden. Als Beispiele dafür können das Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustausch-Chromatographie, die Säulen-Chromatographie unter Verwendung eines Molekularsieb-Gels, die Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung Protein A-bindender Polysaccharide, die Dialyse, die Gefriertrocknung oder ähnliche Verfahren erwähnt werden.
Die so erhaltenen monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung reagieren mit menschlichem löslichen Fibrin, aber sie reagieren nicht mit menschlichem Fibrinogen. Darüber hinaus reagieren die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung mit einem Neoantigen, das in einem Fibrinmolekül zu dem Zeitpunkt neu exponiert wird, wenn menschliches lösliches Fibrin, d. h. ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex, durch Bindung von des-AABB-Fibrin oder von des-AA-Fibrin und Fibrinogen gebildet wird, aber sie reagieren nicht mit menschlichem Fibrinogen.
Die bevorzugten monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind:

(1) der monoclonale Antikörper [hierin nachstehend gelegentlich als monoclonaler Antikörper (1) bezeichnet], insbesondere der monoclonale Antikörper FM Nr. 43-1, wie er in den nachstehenden Beispielen erwähnt wird, der mit Harnstoff-behandeltem (d. h. in Harnstoff solubilisiertem) des-AABB-Fibrin, mit Harnstoff-behandelten (d. h. in Harnstoff solubilisierten) Plasmin-Abbauprodukten des stabilisierten Fibrins und mit Harnstoff-behandelten Fibrin-Fragmenten (wie z. B. den Fragmenten X, Y und E) spezifisch reagiert, der aber weder mit Fibrinogen, mit Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukten (wie z. B. den Fraktionen X, Y, D und E) des Fibrinogens, mit Harnstoff-behandeltem des-AA-Fibrin noch mit Harnstoff-behandeltem des-BB-Fibrin reagiert, und
(2) der monoclonale Antikörper [hierin nachstehend gelegentlich als monoclonaler Antikörper (2) bezeichnet], insbesondere der monoclonale Antikörper FM Nr. 59-1, wie er in den nachstehenden Beispielen erwähnt wird, der mit Harnstoff-behandeltem des-AA-Fibrin, mit Harnstoff-behandeltem des-AABB-Fibrin, mit Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukten des stabilisierten Fibrins und mit Harnstoff-behandelten Fibrin-Fragmenten (wie z. B. den Fragmenten X, Y und E) spezifisch reagiert, der aber weder mit Fibrinogen, mit Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukten (wie z. B. den Fraktionen X, Y, D und E) des Fibrinogens noch mit des-BB-Fibrin reagiert.

Der Begriff „Harnstoff-behandelt", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass das Antigen üblicherweise in einer etwa 3 M Harnstoff-Lösung gelöst wird.
Dementsprechend sekretieren die Hybridome der vorliegenden Erfindung die monoclonalen Antikörper, die mit menschlichem löslichem Fibrin reagieren, die aber nicht mit menschlichem Fibrinogen reagieren, insbesondere die monoclonalen Antikörper, die mit einem Neoantigen reagieren, das in einem Fibrinmolekül zu dem Zeitpunkt neu exponiert wird, an dem menschliches lösliches Fibrin, d. h. ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex, durch Bindung von des-AABB-Fibrin oder von des-AA-Fibrin und Fibrinogen gebildet wird, die aber nicht mit menschlichem Fibrinogen reagieren. Die bevorzugten Hybridome der vorliegenden Erfindung sekretieren den monoclonalen Antikörper (1) oder (2).
Es ist möglich, eine Agglutinationsreaktion nur durch lösliches Fibrin zu bewirken, ohne dass dabei Agglutinationsreaktionen mit Fibrinogen, Plasmin-Abbauprodukten des Fibrinogens (wie z. B. den Fraktionen X, Y, D und E), Fibrin-Fragmenten (wie z. B. X, Y, D und E), Plasmin-Abbauprodukten des stabilisierten Fibrins und mit des-BB-Fibrin in einer Probe erfolgen, und zwar indem auf einem unlöslichen Träger mindestens einer der monoclonalen anti-lösliches-Fibrin-Antikörper immobilisiert wird, insbesondere die vorstehenden monoclonalen Antikörper (1) und (2), und die Probe in Kontakt mit dem monoclonalen Antikörper oder den monoclonalen Antikörpern gebracht wird. Daher sind diese Antikörper als Reagenzien für einen immunologischen Nachweis nützlich.
Weiterhin ist es möglich, ein Signal ausschließlich von dem menschlichen löslichen Fibrin, aber nicht von Fibrinogen, Plasmin-Abbauprodukten des Fibrinogens (wie z. B. den Fraktionen X, Y, D und E), Fibrinfragmenten (wie z. B. X, Y, D und E), Plasmin-Abbauprodukten des stabilisierten Fibrins und von des-BB-Fibrin in einer Probe nachzuweisen, und zwar indem auf einem unlöslichen Träger mindestens einer der monoclonalen anti-lösliches-Fibrin-Antikörper als erster Antikörper immobilisiert wird, insbesondere die vorstehenden monoclonalen Antikörper (1) und (2), die Probe in Kontakt mit dem immobilisierten ersten Antikörper gebracht wird, und dann in Kontakt mit einem markierten zweiten Antikörper gebracht wird, bei dem es sich um die monoclonalen anti-lösliches-Fibrin-Antikörper handelt, insbesondere die vorstehenden monoclonalen Antikörper (1) und (2), wobei es sich um den Gleichen oder um einen anderen als den ersten Antikörper handeln kann. Daher sind die Antikörper als Reagenzien für einen immunologischen Nachweis nützlich.
Somit ist es möglich das Immununtersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der monoclonalen anti-lösliches-Fibrin-Antikörper der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Die Probe, die bei dem Immununtersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterliegt keiner besonderen Einschränkung, sofern die Möglichkeit besteht, dass in ihr lösliches Fibrin enthalten ist. Beispiele dafür sind physiologische Proben, insbesondere Blut, Serum und Plasma oder Urin, insbesondere handelt es sich um Plasma. Bei dem Immununtersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Überlagerungen mit Fibrinogen und verwandten Stoffen zu vermeiden, die in der Probe vorliegen, sogar dann, wenn die Probe direkt und ohne Vorbehandlung verwendet wird.
Bei dem Immununtersuchungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Agglutinationsreaktion kann jeder beliebige unlösliche Träger verwendet werden, der üblicherweise bei immunologischen Nachweisverfahren verwendet wird, welche die Agglutinationsreaktion zwischen Antigenen und Antikörpern verwenden, wie z. B. Latex-Partikel (insbesondere Polystyrol-Latex-Partikel). Für die Immobilisierung der monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung auf dem unlöslichen Träger können bekannte Verfahren wie z. B. chemische Bindeverfahren (unter Verwendung von Carbodiimid, Glutaraldehyd oder ähnlichem als kreuzvernetzendes Mittel) oder physikalische Adsorptionsverfahren verwendet werden. Auf diese Weise kann ein Komplex aus dem monoclonalen Antikörper und dem unlöslichen Träger hergestellt und bei dem Immununtersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Bei dem immunologischen Bestimmungsverfahren (Agglutinationsreaktion) der vorliegenden Erfindung wird einer oder werden die beiden monoclonalen Antikörper verwendet, der/die auf dem vorstehenden unlöslichen Träger immobilisiert wird/werden. Es ist möglich, eine oder zwei Arten von Antikörper-Träger-Komplexen zu verwenden, welche durch die Immobilisierung von jeweils einem der monoclonalen Antikörper auf dem unlöslichen Träger hergestellt werden, beziehungsweise einen Antikörper-Träger-Komplex zu verwenden, der durch die Immobilisierung der beiden Typen der monoclonalen Antikörper auf dem unlöslichen Träger hergestellt wird. Darüber hinaus ist es möglich, eine Kombination aus dem einen Typ des Antikörper-Träger-Komplexes zu verwenden, der durch die Immobilisierung eines Typs der monoclonalen Antikörper auf dem unlöslichen Träger hergestellt wird, und dem anderen Typ des Antikörper-Träger-Komplexes zu verwenden, der durch die Immobilisierung des anderen Typs des monoclonalen Antikörpers auf dem anderen unlöslichen Träger hergestellt wird. Die Agglutinationsreaktion kann im Falle einer Objektträgerplatte visuell gemessen werden oder spektroskopisch unter Verwendung einer bestimmten Wellenlänge im Falle einer Reaktionszelle gemessen werden, um die Konzentration des löslichen Fibrins in der Probe zu bestimmen.
Spezifisch bedeutet dies, dass bei dem immunologischen Bestimmungsverfahren (Sandwich-Testansatz) der vorliegenden Erfindung der monoclonale Antikörper (1) oder (2) auf einem geeigneten unlöslichen Träger immobilisiert wird, um einen immobilisierten Antikörper zu erhalten. Anschließend wird die Oberfläche des unlöslichen Trägers mit einem geeigneten Blockierungsmittel wie z. B. Rinder-Serumalbumin (BSA) oder Kaninchen-Serumalbumin (RSA) bedeckt, um eine unspezifische Bindung zwischen der Probe und dem unlöslichen Träger zu vermeiden. Danach wird die unverdünnte Probe zugegeben und mit dem immobilisierten Antikörper über einen bestimmten Zeitraum (zum Beispiel 5 Minuten bis 3 Stunden) und bei einer bestimmten Temperatur (zum Beispiel 4 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur) in Kontakt gebracht, um eine Reaktion (eine primäre Reaktion) herbeizuführen. Dann wird der zweite Antikörper, bei dem es sich um einen markierten monoclonalen Antikörper (1) oder (2) handeln, zugegeben und mit dem Gemisch über einen bestimmten Zeitraum (zum Beispiel 5 Minuten bis 3 Stunden) und bei einer bestimmten Temperatur (zum Beispiel 4 bis 40°C, vorzugsweise bei etwa Raumtemperatur) in Kontakt gebracht, um eine Reaktion (eine sekundäre Reaktion) herbeizuführen. Das Gemisch wird mit einem geeigneten Detergenz wie z. B. physiologischer Salzlösung, die ein grenzflächenaktives Mittel enthält, gewaschen, und dann wird die Menge des markierten Antikörpers auf dem unlöslichen Träger bestimmt. Aus dem gefundenen Messwert ist es möglich, die Menge des löslichen Fibrins in der Probe zu berechnen. Es ist auch möglich, die erste und die zweite Reaktion gleichzeitig durchzuführen.
Der unlösliche Träger, der bei dem Sandwich-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Beispiele für einen solchen Träger sind Polymermaterialien wie z. B. Polyethylen, Polystyrol, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polyester, Polyacrylnitril, Fluororesin, kreuzvernetztes Dextran oder Polysaccharide oder Nitrocellulose, Papier, Agarose oder eine Kombination davon.
Es wird bevorzugt ein Enzym oder einen fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Stoff als Markierung zu verwenden. Es ist möglich, alkalische Phosphatase, Peroxidase oder β-D-Galactosidase als Enzym; Fluoresceinisothiocyanat als fluoreszierenden Stoff oder Acridiniumester oder Luciferin als phosphoreszierenden Stoff zu verwenden.
Wie vorstehend erwähnt, ist es möglich, die disseminierende intravaskuläre Gerinnung (DIC) zu diagnostizieren, die aus klinischer Hinsicht wichtig ist, oder den Fortschritt nach einer Behandlung genau aufzuzeichnen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ist aber keineswegs auf diese beschränkt.
Beispiel 1
(a) Reinigung des löslichen Fibrin-Monomers
Das menschliche lösliche Fibrin, das als Immunogen verwendet wird, kann zum Beispiel gemäß dem Verfahren von Remo Largo et al. [Blond 47, 991–1002 (1976)] hergestellt werden. Genauer beschrieben wurde 1 g (Trockengewicht) Fibrinogen (Kabi) in 2 Liter physiologischer Salzlösung gelöst, die 5% EDTA enthielt. Dann wurde Thrombin (50 NIH) zugegeben und das Gemisch wurde 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Das so erhaltene Fibringerinnsel wurde mit physiologischer Salzlösung durch Zentrifugation gewaschen (3 × 500 ml). Dann wurde das gewaschene Fibringerinnsel in 20–50 ml 5 M Harnstoff-Lösung gelöst. Nachdem die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation entfernt worden waren, wurde die Konzentration der Fibrin-Monomere auf 5 mg/ml eingestellt, und das Produkt [das hierin nachstehend gelegentlich als lösliches Fibrin-Monomer (U-FM) bezeichnet wird] wurde als Immunogen oder als Standardreagenz bei dem Immun-Testansatz verwendet.
Darüber hinaus wurde das Fibringerinnsel, das durch die Zugabe von Thrombin gebildet worden war, gegen 50 mM Acetat-Puffer (pH-Wert 3,5) dialysiert, um ein in Acetat-Puffer (pH-Wert 3,5) solubilisiertes Fibrin-Monomer herzustellen [das hierin nachstehend gelegentlich als lösliches Fibrin-Monomer (A-FM) bezeichnet wird], das für den gleichen Zweck verwendet wurde.
(b) Herstellung von immunisierten Milzzellen
Das lösliche Fibrin-Monomer (A280 nm = 0,1) wurde mit dem gleichen Volumen an komplettem Freundschen Adjuvanz gemischt, bis sich eine Emulsion gebildet hatte, und dann wurden 200 μl des Gemisches BALB/c-Mäusen intraperitoneal verabreicht, um diese zu immunisieren (erste Immunisierung). Nach 30 Tagen wurden 200 μl des vorstehend erwähnten Gemisches den Mäusen intraperitoneal verabreicht (zweite Immunisierung). 21 Tage nach der zweiten Immunisierung wurden 200 μl einer verdünnten Lösung des löslichen Fibrins, die durch Verdünnung der Immunogen-Lösung mit löslichem Fibrin-Monomer (U-FM) (A280 nm = 0,1) mit dem gleichen Volumen an physiologischer Salzlösung hergestellt worden war, den Mäusen intravenös verabreicht (letzte Immunisierung). 3 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz aus den Mäusen aseptisch entfernt, um sie bei der anschließenden Zellfusion zu verwenden.
(c) Zellfusion
Die vorstehend erwähnte aseptisch entfernte Milz wurde in eine Laborschale überführt, die 5 ml DME-Medium mit 15% fötalem Kälberserum enthielt. Dann wurde die Milz mit etwa 15 ml DME-Medium perfundiert, das 15% fötales Kälberserum enthielt, um die Milzzellen herauszuspülen. Die Suspension der Milzzellen wurde durch ein Nylonnetz passiert. Die Milzzellen wurden in einem 50 ml-Zentrifugationsröhrchen gesammelt und 10 Minuten bei 500 × g zentrifugiert. Dem so erhaltenen Sediment wurden 4 ml einer Hämolyse-Lösung (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 1 mM Na₂EDTA; pH-Wert 7,0) zugegeben, um das Sediment zu suspendieren. Die Suspension wurde 5 Minuten bei 0°C stehen gelassen, um die darin enthaltenen roten Blutzellen zu lysieren. Dann wurde DME-Medium zugegeben, das 15% fötales Kälberserum enthielt, und das Gemisch wurde zentrifugiert. Das so erhaltene Sediment wurde mit DME-Medium mittels Zentrifugation gewaschen und die Zahl der lebenden Milzzellen wurde gezählt.
Die vorstehenden Milzzellen (1 × 10⁸) wurden zu etwa 2 × 10⁷ vorkultivierten Maus-Myelomzellen SP2/0-Ag14 (Rikagaku Kenkyusho Gene Bank) gegeben, das Ganze wurde mit DME-Medium intensiv vermischt und dann zentrifugiert (10 Minuten, 500 × g). Der Überstand wurde abgesaugt und die Sedimente wurden vollständig abgelöst. Es wurden 0,5 ml einer 40%-igen Polyethylenglycol 4000-Lösung (auf 38°C vorgewärmt) tropfenweise zugegeben und dann wurde das Zentrifugationsröhrchen 1 Minute per Hand sanft rotiert, um dadurch die Polyethylenglycol-Lösung mit den Zellsedimenten zu durchmischen. Anschließend wurde alle 30 Sekunden auf 38°C vorgewärmtes DME-Medium in einer Menge von 1 ml zugegeben und das Röhrchen wurde sanft rotiert. Nachdem diese Prozedur zehnmal wiederholt worden war, wurden 20 ml DME-Medium zugegeben, das 15% fötales Kälberserum enthielt, und es wurde eine Zentrifugation durchgeführt (10 Minuten, 500 × g).
Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurden die Zellsedimente zweimal durch Zentrifugation mit HAT-Medium (hergestellt durch Zugabe von Aminopterin, Thymidin und Hypoxanthin zu DME-Medium, so dass die Endkonzentrationen 4 × 10^–7 M, 1,6 × 10^–5 M bzw. 1 × 10^–4 M betrugen), das 15% fötales Kälberserum enthielt, gewaschen und anschließend in 40 ml HAT-Medium suspendiert. Die Zellsuspension wurde aufgeteilt und in die Vertiefungen einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 200 μl gegeben, dann wurde mit der Kultur bei 37°C in einem Kohlendioxid-Gas-Inkubator begonnen, der 5% Kohlendioxid enthielt. Während der Kultivierung wurden etwa 100 μl des Mediums in 2 bis 3-tägigen Intervallen aus jeder Vertiefung entfernt und es wurden 100 μl frisches HAT-Medium zugegeben, um die Hybridome zu selektieren, die in dem HAT-Medium wuchsen. Ab dem achten Tag wurde das Medium (hergestellt durch Zugabe von Thymidin und Hypoxanthin zu DME-Medium, so dass die Endkonzentrationen 1,6 × 10^–5 M bzw. 1 × 10^–4 M betrugen), das 15% fötales Kälberserum enthielt, anstelle des HAT-Mediums eingesetzt und es wurden Hybridome beobachtet. Am zehnten Tag wurden die Hybridome, die anti-lösliches-Fibrin-Antikörper produzierten, mit Hilfe eines ELISA-Verfahrens durchmustert, das nachstehend beschrieben wird.
(d) Etablierung der Hybridome
Die Anwesenheit der produzierten Antikörper in den Überständen der Hybridom-Kulturflüssigkeit wurde durch ein ELISA-Verfahren bestimmt. In die Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Immulon; Nippon Dynatech K. K.) wurde die lösliches Fibrin-(U-FM)Immunogen-Lösung (A280 nm = 0,05, die mit physiologischer Salzlösung verdünnt worden war) in einer Menge von je 50 μl gegeben und 2 Stunden bei 25°C stehen gelassen. Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween 20 in physiologischer Salzlösung gewaschen und dann wurden 50 μl des Kulturflüssigkeit-Überstandes den Vertiefungen zugegeben und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 25°C durchgeführt.
Dann wurden 50 μl eines mit Peroxidase konjugierten anti-Maus-Antikörpers (Dako Co., Dänemark), der mit Tween 20 in physiologischer Salzlösung 200-fach verdünnt worden war, den Vertiefungen zugegeben. Nach dem Ende der Reaktion wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween 20 in physiologischer Salzlösung gewaschen. Anschließend wurden 250 μl einer Lösung, die 0,5 mM Aminoantipyrin, 10 mM Phenol und 0,005% Wasserstoffperoxid enthielt, den Vertiefungen zugegeben, die Reaktion wurde 30 Minuten bei 25°C durchgeführt und dann wurde die Extinktion der Lösung in den Vertiefungen bei 490 nm gemessen. Als Ergebnis wurde eine Produktion der Antikörper in drei von 192 Vertiefungen beobachtet. Die Hybridome in den drei Vertiefungen wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen überführt und 4 bis 5 Tage in HAT-Medium kultiviert, das 15% fötales Kälberserum enthielt. Anschließend wurde die Anwesenheit der produzierten anti-lösliches-Fibrin-Antikörper durch das ELISA-Verfahren bestätigt und dann erfolgte die Clonierung durch das Verfahren der begrenzenden Verdünnung. Bei dem Verfahren der begrenzenden Verdünnung wurden jeweils 100 μl der Zellsuspension, die mit HT-Medium verdünnt worden war, so dass die Konzentration der Hybridome 5 Hybridome pro ml betrug, in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, wobei in jede Vertiefung zuvor 2 × 10⁴ abdominale Zellen aus normalen BALB/c-Mäusen im Voraus gegeben worden waren. Nach 10 Tagen wurden Clone der Hybridome, die spezifische anti-lösliches-Fibrin-Antikörper herstellten, durch das ELISA-Verfahren durchmustert.
Als Ergebnis wurden für jedes Hybridom 20 bis 40 Clone erhalten, die Antikörper produzierten. Aus diesen Clonen wurden stabile Clone, die eine starke Poliferation und eine hohe Fähigkeit zur Sekretion der Antiköper aufwiesen, selektiert und durch das gleiche Verfahren wie vorstehend erneut cloniert, und es wurden die beiden Hybridome FM Nr. 43-1 und FM Nr. 59-1 erhalten, die anti-lösliches-Fibrin-Antikörper herstellten. Die vorstehenden Hybridome wurden im Inland beim National Institute of Biosciences and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology Agency of Industrial Science and Technology (Adresse: 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan) am 27. Oktober 1993 hinterlegt und sie wurden in die internationale Hinterlegung am 27. Oktober 1994 überführt. Die internationalen Hinterlegungs-Nummern (die Nummern in Klammern [], die den internationalen Hinterlegungsnummern folgen, sind die inländischen Hinterlegungs-Nummern) sind FERMBP-4846 [FERMP-13925] für das Hybridom FM Nr. 43-1 und FERMBP-4847 [FERMP-13926] für das Hybridom FM Nr. 59-1. Die Reaktionsfähigkeit der beiden monoclonalen Antikörper FM Nr. 43-1 und FM 59-1, die von den vorstehenden zwei Hybridomen sekretiert werden, mit Fibrinogen, den Fibrinogen-Fragmenten X, Y, D und E, den Fibrin-Fragmenten X, Y, D und E und den Plasmin-Abbauprodukten des stabilisierten Fibrins wurden durch das ELISA-Verfahren wie vorstehend untersucht, dies erfolgte indem die vorstehenden Antikörper auf einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen immobilisiert wurden. Nachfolgend wird hierin das Hybridom FM Nr. 43-1 als Hybridom FM-1, das Hybridom FM Nr. 59-1 als Hybridom FM-2, der monoclonale Antikörper FM Nr. 43-1 als monoclonaler Antikörper FM-1 und der monoclonale Antikörper FM Nr. 59-1 als monoclonaler Antikörper FM-2 bezeichnet.
Beispiel 2: Herstellung der monoclonalen Antikörper
(a) in vitro-Verfahren
Die Maus-Hybridome FM-1 und FM-2 wurden in DME-Medium, das 15% fötales Kälberserum enthielt, 72 bis 96 Stunden bei 37°C unter einer 5%-igen Kohlendioxid-Atmosphäre angezogen. Anschließend wurden die Kulturen zentrifugiert (10 Minuten, 10.000 × g) und den Überständen wurde schrittweise festes Ammoniumsulfat zugegeben, so dass die Endkonzentration davon 50% betrug. Die Mischung dauerte etwa 30 Minuten, währenddessen auf Eis gekühlt wurde, dann wurden die Gemische 60 Minuten stehen gelassen und anschließend zentrifugiert (10 Minuten, 10.000 × g). Die Sedimente wurde in einer kleinen Menge 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) gelöst und auf eine DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit der 1000-fachen Menge an 10 mM Phosphatpuffer äquilibriert worden war. Die monoclonalen Antikörper wurden mit einem Dichtegradienten eluiert, der von 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) bis zu 10 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) mit 0,2 M NaCl reichte. Die eluierten monoclonalen Antikörper wurden durch ein Ultrafiltrations-Verfahren aufkonzentriert und gegen 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) dialysiert. Um das Rinderserum-IgG zu entfernen, wurden das dialysierte Produkt über eine Ziegen-anti-Rinderserum-IgG-Sepharose 4B-Säule passiert. Die passierte Lösung wurde auf eine Protein A-Sepharose 4B-Säule aufgetragen, die mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 8,0) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem Puffer (pH-Wert 3,5) eluiert, um eine Lösung mit dem gereinigten spezifischen monoclonalen anti-FM-Antikörper FM-1 und auf die gleiche Weise den monoclonalen Antiköper FM-2 zu erhalten.
(b) In vivo-Verfahren
Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) (0,5 ml) wurde intraperitoneal 10 bis 12 Wochen alten BALB/c-Mäusen verabreicht. Nach 14 bis 20 Tagen wurde das in vitro vermehrte Hybridom FM-1 oder FM-2 in die Bauchhöhle der Mäuse in einer Menge von 2 × 10⁶ Zellen/Maus geimpft.
Für jedes Hybridom wurden etwa 10 bis 15 ml der Aszites-Flüssigkeit aus einer Maus erhalten. Die Konzentrationen der Antikörper betrugen 2 bis 10 mg/ml. Die Reinigung der monoclonalen Antikörper aus der Aszites-Flüssigkeit wurde durch das gleiche Verfahren wie bei der in vitro-Reinigung durchgeführt (jedoch außer dem Schritt der Passage durch eine Säule mit Ziegen-anti-Rinderserum-IgG-Sepharose).
Beispiel 3: Bestimmung der Immunglobulin-Klasse und der Spezifität der monoclonalen Antikörper

Die Immunglobulin-Klasse und die Spezifität der spezifischen monoclonalen anti-FM-Antikörper FM-1 und FM-2 wurden durch das Ouchterlony-Immundiffusions-Verfahren beziehungsweise das Enzym-Immununtersuchungsverfahren untersucht. Die Immunglobulin-Klasse der spezifischen monoclonalen anti-FM-Antikörper FM-1 und FM-2 war IgG₂a. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Antigen	Monoclonaler Antikörper
Antigen	FM-1	FM-2
Fibrinogen (a)	–	–
Fibrinogen (b)	–	–

Des-AABB-Fibrin-Monomer (a)	+	+
Des-AABB-Fibrin-Monomer (b)	–	–
Des-AA-Fibrin (a)	–	+
Des-AA-Fibrin (b)	–	–
Des-BB-Fibrin (a)	–	–
Des-BB-Fibrin (b)	–	–

Fibrinogen-Fragment X (a)(b)	–	–
Fibrinogen-Fragment Y (a)(b)	–	–
Fibrinogen-Fragment E (a)(b)	–	–

Dcate (a)(b)	–	–
Degta (a)(b)	–	–

Fibrin-Fragment X (a)	+	+
Fibrin-Fragment Y (a)	+	+
Fibrin-Fragment E1, E2 (a)	+	+
Fibrin-Fragment E3 (a)	+	+
Fibrin-Fragment X (b)	–	–
Fibrin-Fragment Y (b)	–	–
Fibrin-Fragment E1, E2 (b)	–	–
Fibrin-Fragment E3 (b)	–	–

D-Dimer (a)(b)	–	–
DD/E (a)	+	+
DD/E (b)	–	–

Abbauprodukte (Gemisch) des stabilisierten Fibrins mit Plasmin (a)	+	+
Abbauprodukte (Gemisch) des stabilisierten Fibrins mit Plasmin (b)	–	–

Aα-Ketten-Peptid 17–26 (GHRPLDKKRE)	–	–
Bβ-Ketten-Peptid 15–24 (GPRVVERHQS)	–	–
γ-Ketten-Peptid 312–324 (FSTWDNDNDKFEG)	–	–

Aα-Kette (1–625) (a)	–	–
Bβ-Kette (1–461) (a)	–	–
γ-Kette (1–411) (a)	–	–

In Tabelle 1 wurde die Reaktivität jedes monoclonalen Antikörpers durch die direkte Beschichtung jedes Antigens auf einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen untersucht. Das Symbol „+" bedeutet, dass bei dem ELISA eine Reaktion beobachtet wurde, während das Symbol „–„ bedeutet, dass bei dem ELISA keine Reaktion beobachtet wurde. Die Aminosäuresequenzen des Aα-Ketten-Peptids 17–26, des Bβ-Ketten-Peptids 15–24 und des γ-Ketten-Peptids 312–324 sind in der Ein-Buchstaben-Abkürzung angegeben. Die vorstehend verwendeten drei Peptide sind kommerziell erhältlich (Peputido Kenkyujo).

(a): Die ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit jedem Antigen beschichtet, das in 5 M Harnstoff solubilisiert worden war.
(b): Die ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit jedem Antigen beschichtet, das in 50 mM Acetatpuffer (pH-Wert 3,5) solubilisiert worden war.

Die Antigene ohne die Kennzeichnung (a) oder (b) wurden auf der ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen befestigt, nachdem sie in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) gelöst worden waren.
Die Fibrinogen-Fragmente X, Y, E, Dcate, Degta und das D-Dimer reagierten nicht mit den monoclonalen Antikörpern FM-1 oder FM-2, und dies sogar nach einer Behandlung mit 5 M Harnstoff. Jedoch reagierten die Fibrin-Fragmente X, Y und E mit den monoclonalen Antikörpern FM-1 und FM-2, nachdem sie mit 5 M Harnstoff behandelt worden waren. Die monoclonalen Antikörper FM-1 und FM-2 reagieren nicht mit der mit 5 M Harnstoff behandelten Aα-Kette (1–625) des Fibrinogens, der Aα-Kette (1–208) des Fibrinogen-Fragments X oder der Aα-Kette (1–78) des Fibrinogen-Fragments E, aber sie reagieren mit der mit 5 M Harnstoff behandelten Aα-Kette (17–625) des Fibrin-Monomers, der Aα-Kette (17–208) des X-Monomers und der Aα-Kette (17–78) des Fibrin-Fragments E.
Die vorstehenden Ergebnisse legen nahe, dass das Epitop, welches die vorstehenden monoclonalen Antikörper FM-1 und FM-2 erkennen, in der E-Domäne vorliegt; das Epitop existiert nämlich in der mit Harnstoff behandelten E-Domäne, von der das Fibrinopeptid A oder die Fibrinopeptide A und B freigesetzt werden. Diese Ergebnisse zeigen insbesondere, dass die vorstehenden monoclonalen Antikörper die Aα-Kette (17–78) in der E-Domäne erkennen, das heißt die Aα-Kette (17–78) in der E-Domäne, aus der das Fibrinopeptid A oder die Fibrinopeptide A und B freigesetzt werden, und die mit Harnstoff behandelt worden war.
Beispiel 4: Bindung der Antikörper und der unlösliche Träger (Latex)
Eine Lösung (2 ml), die den monoclonalen Antikörper FM-1 (2,0 mg/ml) enthielt, und eine Latex-Lösung (2 ml) (2% Polystyrol, Dow Chemical Co.; Partikelgröße: 0,482 μm) wurden miteinander vermischt und etwa 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (20.000 × g, 10 Minuten) und anschließend wurde das Präzipitat in einer 0,1%-igen BSA-Lösung suspendiert und etwa 1 Stunde gerührt. Die so erhaltene Suspension wurde erneut zentrifugiert (20.000 × g, 10 Minuten) und dann wurden das Präzipitat in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) suspendiert und etwa 2 Stunden gerührt. Auf diese Weise wurde eine Flüssigkeit erhalten, die einen Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM-1 und Latex enthielt. Der monoclonale Antikörper FM-2 wurde auf die gleiche Weise verwendet, um eine Flüssigkeit herzustellen, die einen Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM-2 und Latex enthielt.
Ein Komplex aus einem Gemisch der monoclonalen Antikörper mit Latex wurde wie folgt hergestellt: 2 ml einer wässrigen Lösung, die jeweils 0,66 mg/ml der monoclonalen Antikörper FM-1 und FM-2 enthielt, wurde mit 2 ml einer Latex-Lösung (2% Polystyrol, Dow Chemical Co., Partikelgröße: 0,482 μm) vermischt und das Gemisch wurde etwa 1 Stunde gerührt. Anschließend wurde das Gemisch auf die gleiche Weise wie vorstehend behandelt, um einen Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM1, dem monoclonalen Antiköper FM-2 und Latex herzustellen.
Das gleiche Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass wässrige Lösungen, die jeweils 1 mg/ml des monoclonalen Antikörpers FM-1 und des monoclonalen Antikörpers FM-2 enthielten, mit den gleichen Mengen an Latexlösung vermischt wurden, um einen Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM1, dem monoclonalen Antiköper FM-2 und Latex herzustellen.
Beispiel 5: Bestimmung der Agglutination auf einem Objektträger

Die den Antikörper-Latex-Komplex enthaltende Lösung (40 μl), die in Beispiel 4 hergestellt wurde, und wässrige Lösungen (15 μl), die verschiedene Konzentrationen an in Harnstoff solubilisiertem Fibrin-Monomer enthielten, wurden auf einem Glas-Objektträger gemischt und geschüttelt. Nach 3 Minuten wurde die Agglutination visuell untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Für die Verdünnung wurde 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH Wert 8,0) verwendet, der 5 M Harnstoff enthielt. Tabelle 2

Monoclonaler Antikörper/Latex-Komplex	Konzentration des in Harnstoff solubilisierten Fibrin-Monomers (μg/ml)
Monoclonaler Antikörper/Latex-Komplex	128–256	64–128	64–32	16–32	8–16	4–8	2–4	0–2
FM-1	+	+	+	+	+	+	+	–
FM-2	+	+	+	+	+	+	+	–
FM-1 + FM-2	+	+	+	+	+	+	+	–
FM-1/FM-2	+	+	+	+	+	+	+	–

In der Tabelle 2 bedeutet „+", dass eine Agglutination erfolgte, während „–„ bedeutet, dass keine Agglutination stattfand. In der Spalte Antikörper/Latex-Komplex in der Tabelle 2 wird die Art des Komplexes durch den monoclonalen Antikörper beschrieben, der in dem Komplex gebunden ist. Daher bedeutet zum Beispiel FM-1 den Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM-1 und Latex und FM-1 + FM-2 bedeutet ein Gemisch aus gleichen Mengen von Komplexen des monoclonalen Antikörpers FM-1 und Latex und des monoclonalen Antikörper FM-2 und Latex. FM-1/FM-2 bedeutet den Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM1, dem monoclonalen Antiköper FM-2 und Latex.
Beispiel 6: Wiedergewinnungs-(Recovery)Test für zugefügten gereinigten FM

Die Konzentrationen an löslichem Fibrin in fünf Proben (Plasma aus der gesunden Person A, der gesunden Person B, des DIC-Patienten C, des DIC-Patienten D und des DIC-Patienten E) wurden unter Verwendung der Lösung mit dem Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM-1 und Latex aus Beispiel 5 gemessen. Dann wurden 2 μg/ml, 4 μg/ml und 16 μg/ml gereinigtes und in Harnstoff solubilisiertes Fibrin-Monomer den Proben hinzugefügt und es wurden Untersuchungen zur Wiedergewinnung durchgeführt. Die Messwerte wurden semiquantitativ aus der Zahl an Verdünnungen der Probe erhalten, bei der keine Agglutination mehr stattfand. Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde eine gute Wiedergewinnung beobachtet. Darüber hinaus wurden 2 μg/ml, 4 μg/ml und 16 μg/ml des gereinigten und in Säure solubilisierten Fibrin-Monomers den Proben hinzugefügt und Untersuchungen zur Wiedergewinnung durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse wie bei dem vorstehenden Verfahren erhalten wurden. Tabelle 3

Probe	Konzentration des löslichen Fibrins (μg/ml)	Zugegebene Menge an in Harnstoff solubilisiertem Fibrin-Monomer (μg/ml)	Nach Zugabe
A	<2	5 10 20	4–8 8–16 16–32
B	<2	5 10 20	4–8 8–16 16–32
C	2–4	5 10 20	4–8 8–16 16–32
E	16–32	5 10 20	16–32 32–64 32–64

Beispiel 7: Konzentration des löslichen Fibrins in gesunden Personen und in Patienten, die unter DIC leiden
Die Lösung mit dem Komplex aus dem monoclonalen Antikörper FM-1 und Latex, die in Beispiel 6 verwendet worden war, wurde verwendet, um die Mengen an löslichem Fibrin in 12 Plasmaproben aus gesunden Personen und in 15 Plasmaproben aus DIC-Patienten zu messen. Die Ergebnisse werden in 1 gezeigt. Die Menge an löslichem Fibrin bei den gesunden Personen betrug in allen Fällen weniger als 2 μg/ml. Im Gegensatz dazu lagen die Werte bei den DIC-Patienten in allen Fällen über 32 μg/ml.
Beispiel 8: Testansatz für lösliches Fibrin mittels EIA
(a) Herstellung eines unlöslichen Antikörpers
Aus dem monoclonalen Antikörper FM-1 und 50 mM phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH-Wert 7,5) wurde eine Antikörperlösung hergestellt, so dass die Proteinkonzentration der IgG-Fraktion des monoclonalen Antikörpers FM-1 5 μg/ml betrug. Die Antikörperlösung wurde in einer Menge von 50 μl in die Vertiefungen einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Immulon; Nippon Dynatech K. K.) gegeben und 24 Stunden bei 4°C stehen gelassen.
(b) Herstellung des markierten Antikörpers
Die IgG-Fraktion des monoclonalen Antikörpers FM-2 wurde mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert, um einen markierten Antikörper zu erhalten.
(c) Herstellung der Standardkurve
Die ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen, welche den in (a) hergestellten immobilisierten monoclonalen Antikörper FM-1 enthielt, wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurde normales Plasma (50 μl), das 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2 μg/ml 1 μg/ml oder 0,5 μg/ml des in Harnstoff solubilisierten Fibrin-Monomers enthielt, das in Beispiel 1(a) erhalten worden war, in die Vertiefungen gegeben und die Reaktion wurde 10 Minuten bei 25°C durchgeführt. Die Platte wurde dreimal mit 0,05% Tween 20 in physiologischer Salzlösung gewaschen. Dann wurden 50 μl einer Lösung des monoclonalen Antikörpers FM-2, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), wie in (b) beschrieben, in 0,05% Tween 20 in physiologischer Satzlösung (pH-Wert 7,5) markiert worden war, den Vertiefungen zugegeben und die Reaktion wurde 10 bei 25°C durchgeführt. Anschließend wurde die Platte dreimal mit 0,05% Tween 20 in physiologischer Salzlösung gewaschen und es wurden 200 μl einer HRP-Substratlösung (50 mM Phosphatpuffer, der 0,5 mM Aminoantipyrin, 10 mM Phenol, 0,005% Wasserstoffperoxid; pH-Wert 7,5) jeder Vertiefung zugegeben und die Reaktion wurde 10 Minuten bei 25°C durchgeführt. Die Extinktion jeder Vertiefung bei 490 nm wurde gemessen. Die so erhaltene Standardkurve wird in 2 gezeigt. Wenn normales Plasma, das 40 μg/ml, 20 μg/ml, 10 μg/ml, 5 μg/ml, 2 μg/ml, 1 μg/ml oder 0,5 μg/ml des in Acetat solubilisierten Fibrin-Monomers enthielt, verwendet wurde, wurden die gleichen Ergebnisse erhalten.
Beispiel 9: Bestehender Modus und Reaktivität des löslichen Fibrins in normalem Plasma, dem in Essigsäure solubilisiertes Fibrin-Monomer zugegeben worden war
Das in Acetat solubilisierte des-AABB-Fibrin-Monomer wurde normalem Plasma hinzugegeben, so dass die Konzentration 200 μg/ml betrug, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Das so erhaltene Reagenz wurde mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0), der 0,15 M NaCl enthielt, auf das vierfache Volumen verdünnt. Das verdünnte Reagenz wurde auf eine Sephacryl S-300-Säule (Pharmacia, Schweden) geladen, die mit dem gleichen Puffer äquilibiert worden war, und mittels Molekularsieb-Chromatographie behandelt. Es wurden die Proteinkonzentration und das lösliche Fibrin in den eluierten Fraktionen gemessen. Das lösliche Fibrin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8 gemessen. 3 zeigt das Muster des Chromatogramms und die Aktivität des löslichen Fibrins.
Der Aktivitätspeak des löslichen Fibrins liegt in dem Molekulargewichtsbereich zwischen 900.000 und 2.000.000. Das bedeutet, dass das in Acetat solubilisiertes des-AABB-Fibrin-Monomer an Fibrinogen gebunden ist und sich ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex gebildet hat. Die Ergebnisse in Beispiel 3 zeigen, dass keiner der anti-FM-spezifischen monoclonalen Antikörper FM-1 und FM-2 mit dem in Acetat solubilisierten Fibrin-Monomer reagiert hat. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse in Beispiel 9, dass, wenn der Fibrin-Fibrinogen-Komplex durch Bindung des in Acetat solubilisierten Fibrin-Monomers mit Fibrinogen gebildet wird, die anti-FM-spezifischen monoclonalen Antikörper FM-1 und FM-2 mit dem Komplex reagieren. Mit anderen Worten und wie in 4 schematisch gezeigt, bedeutet dies, dass, wenn das in Acetat solubilisierte Fibrin-Monomer (= Fibrin-Monomer in 4) an Fibrinogen gebunden wird, um den Fibrin-Fibrinogen-Komplex zu bilden, ein neu exponiertes Epitop (= Neoantigen) entsteht, das mit den anti-FM-spezifischen monoclonalen Antikörpern FM-1 und FM-2 reagiert. Das vorstehende „Fibrin-Monomer" bedeutet ein Fibrin, das in Form eines Monomers vorliegt. Das Fibrin-Monomer liegt in vivo vorübergehend vor und es kann mit einer Säure in vitro ohne Denaturierung gebildet werden. Dies wird im Allgemeinen als Fibrin-Monomer bezeichnet.
Durch die vorstehenden Ergebnisse kann bestätigt werden, dass die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung mit dem Neoantigen reagieren, das in einem Fibrinmolekül zu dem Zeitpunkt neu exponiert wird, wenn ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex durch Bindung von des-AA-Fibrin oder des-AABB-Fibrin und Fibrinogen gebildet wird.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Mit den monoclonalen Antikörpern der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Menge an löslichem Fibrin im Plasma eines Patienten spezifisch, leicht und schnell zu bestimmen und dies sogar in Form des komplexierten Fibrins, wenn es an Fibrinogen gebunden ist; dies erfolgt durch ein Agglutinations- oder ein EIA-Verfahren und ohne eine Beeinflussung durch Fibrinogen, Plasmin-Abbauprodukte von Fibrinogen, d. h. die Fraktionen X, Y, D und E, Fibrinfragmente X, Y, D und E und die Plasmin-Abbauprodukte des stabilisierten Fibrins, die im Plasma vorliegen, und dies sogar ohne eine Vorbehandlung der Plasmaprobe. Dies wurde zum ersten Mal durch die vorliegende Erfindung ermöglicht. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein nützliches Hilfsmittel für die Diagnose und die klinische Untersuchung der DIC oder ähnlichem bereit.
Wie vorstehend erwähnt, wurde die vorliegende Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen erläutert, aber Modifikationen und Verbesserungen, die den Fachleuten ersichtlich sind, sind in den Rahmen der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.

Claims

Monoclonaler Antikörper, welcher mit menschlichem löslichen Fibrin an einem Neoantigen reagiert, das in einem Fibrinmolekül zu dem Zeitpunkt neu exponiert ist, wenn ein Fibrin-Fibrinogen-Komplex durch Bindung von des-AABB-Fibrin oder des-AA-Fibrin und Fibrinogen gebildet wird, aber welcher nicht mit menschlichem Fibrinogen reagiert, wobei ein Epitop, welches von dem monoclonalen Antikörper erkannt wird, in der Aα-Kette (17–78) der E-Domäne existiert, aus welcher das Fibrinopeptid A oder die Fibrinopeptide A und B freigesetzt wird, und wobei der monoclonale Antikörper an menschliches lösliches Fibrin bindet, welches nicht mit einem Protein-denaturierenden Agens vorbehandelt ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, welcher spezifisch mit Harnstoff-behandeltem des-AABB-Fibrin, einem Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukt von stabilisiertem Fibrin, und einem Harnstoff-behandelten Fibrinfragment reagiert, aber weder mit Harnstoff-behandeltem Fibrinogen, einem Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukt von Fibrinogen, Harnstoff-behandeltem des-AA-Fibrin noch Harnstoff-behandeltem des-BB-Fibrin reagiert.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei die Reaktion mit dem Harnstoff-behandelten des-AABB-Fibrin nicht durch ein Peptid aus den Aminosäuren 17 bis 26 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-Aα-Kette und ein Peptid aus den Aminosäuren 15 bis 24 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-Bβ-Kette inhibiert wird.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 3, wobei die Reaktion mit dem Harnstoff-behandelten des-AABB-Fibrin nicht durch ein Peptid aus den Aminosäuren 312 bis 324 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-γ-Kette inhibiert wird.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1, welcher spezifisch mit Harnstoff-behandeltem des-AA-Fibrin, Harnstoff-behandelten des-AABB-Fibrin, einem Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukt von stabilisiertem Fibrin und einem Harnstoff-behandelten Fibrinfragment reagiert, aber weder mit Harnstoff-behandeltem Fibrinogen, einem Harnstoff-behandelten Plasmin-Abbauprodukt von Fibrinogen, noch Harnstoff-behandeltem des-BB-Fibrin reagiert.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, wobei die Reaktion mit dem Harnstoff-behandelten des-AA-Fibrin und dem Harnstoff-behandelten des-AABB-Fibrin nicht durch ein Peptid aus den Aminosäuren 17 bis 26 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-Aα-Kette und ein Peptid aus den Aminosäuren 15 bis 24 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-Bβ-Kette inhibiert wird.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, wobei die Reaktion mit dem Harnstoff-behandelten des-AA-Fibrin und dem Harnstoff-behandelten des-AABB-Fibrin nicht durch ein Peptid aus den Aminosäuren 312 bis 324 in der Aminosäuresequenz der Fibrinogen-γ-Kette inhibiert wird.
Hybridom, dadurch gekennzeichnet, dass es den monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 sezerniert.
Verfahren zum Untersuchen von menschlichem löslichem Fibrin, gekennzeichnet durch das Inkontaktbringen einer Probe mit dem monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welcher auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist, und Beobachten von Agglutination.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei mindestens einer der monoclonalen Antikörper nach Anspruch 2 und 5 verwendet wird.
Verfahren zum immunologischen Untersuchen von menschlichem löslichem Fibrin, gekennzeichnet durch das Immobilisieren eines monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auf einem unlöslichen Träger als einem ersten Antikörper, Inkontaktbringen einer Probe mit diesem ersten Antikörper, und dann mit einem markierten zweiten Antikörper, welcher ein Antikörper derselben Art oder einer unterschiedlichen Art des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ist, und Nachweisen eines Signals ausgehend von der Markierung des zweiten Antikörpers, welcher an den immobilisierten ersten Anti-menschliches lösliches Fibrin-Antikörper gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der monoclonale Antikörper nach Anspruch 2 oder 5 als der erste Antikörper verwendet wird, und der monoclonale Antikörper nach Anspruch 5 oder 2 als der zweite Antikörper verwendet wird.
Verfahren zum Diagnostizieren einer disseminierten intravaskulären Koagulation, umfassend das Nachweisen von löslichem Fibrin in einer biologischen Probe durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12.