DE3587714T2

DE3587714T2 - Menschliches alpha 2-Plasmin spezifischer monoklonaler Antikörper.

Info

Publication number: DE3587714T2
Application number: DE3587714T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Aoki; Yataro Ichikawa; Yukiya Koike; Yoshihiko Sumi; Nobuhiko Jichiidai-Sho Yoshida
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1984-04-17
Filing date: 1985-04-17
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2005-04-18
Also published as: US5534255A; DK170485A; DE3587714D1; NO171169C; EP0159025B1; EP0159025A3; NO171169B; DK170485D0; NO851518L; EP0159025A2; DK166627B1

Description

Diese Erfindung betrifft einen für menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor spezifischen monoklonalen Antikörper oder α&sub2;-Antiplasmin, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors blockiert, das heißt die Stelle des α&sub2;-Plasmininhibitors, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert und folglich die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibierende Wirkung des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors unterdrückt und die Fibrinolyse durch Plasmin fördert; ein zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers befähigtes Hybridom; ein Verfahren zur Herstellung des Hybridoms.
Es ist bekannt, daß der menschliche α&sub2;-Plasmininhibitor (nachstehend als "menschlicher α&sub2;-PI" abgekürzt) ein einzelkettiges Glycoprotein mit einem Kohlehydratanteil von 11,7% ist und ein Molekulargewicht von etwa 67.000 hat, der zuerst in reiner Form von Aoki und Moroi aus menschlichem Plasma isoliert wurde und als starker Inhibitor wirkt, der in der Lage ist, die Esterase-Aktivität von Plasmin, einem fibrinolytischen Enzym, sofort zu inhibieren (siehe Moroi und Aoki, The Journal of Riological Chemistry 251 (1976), 5956-5965)
Andererseits hat der menschliche α&sub2;-PI drei Funktionen. Erstens besitzt er eine Stelle, um die fibrinolytische Aktivität von Plasmin zu inhibieren (in der vorliegenden Beschreibung wird diese Stelle als "reaktive Stelle" bezeichnet) (siehe B. Wiman und D. Collen, The Journal of Biological Chemistry 254 (1979), 9291-9297). Zweitens besitzt er eine Stelle, um Plasmin am Carboxylgruppen-Terminus zu binden (B. Wiman und D. Collen, European Journal of Biochemistry 84 (1978), 573-578). Drittens besitzt er eine Stelle, um Fibrin am Aminogruppen-Terminus zu binden (Y. Sakata et al., Thrombosis Research 16 (1979), 279-282).
Wenn es möglich ist, einen monoklonalen Antikörper bereitzustellen, der selektiv die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI unter diesen drei aktiven Stellen blockiert, dann wird dieser für die Behandlung von thrombotischen Krankheiten und dergleichen medizinisch sehr interessant, weil die Verwendung eines solchen monoklonalen Antikörpers direkt die Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI unterdrücken kann, um die Fibrinolyse von Plasmin zu inhibieren und die Fibrinolyse durch Plasmin zu fördern.
Es ist in der klinischen Medizin bekannt, daß der Spiegel des menschlichen α&sub2;-PI im Blut bei Krankheiten der parenchymatischen Leberzellen abfällt und es wurde berichtet, daß der Spiegel des menschlichen α&sub2;-PI im Blut ein auffallendes Absinken bei dekompensierter Leberzirrhose und plötzlich auftretender Hepatitis zeigt (siehe N. Aoki und T. Yamanaka, Clinica Chimica Acta 84 (1978), 99-105)
Vor kurzem wurden die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften des menschlichen α&sub2;-PI im Detail aufgeklärt und es wurde festgestellt, daß der menschliche α&sub2;-PI den fibrinolytischen Mechanismus des Plasmins spezifisch kontrolliert und reguliert und eine wichtige Wirkung auf diesen Mechanismus ausübt (siehe beispielsweise N. Aoki und B. C. Harpel, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 10 (1984) , 24-41)
Demgemäß würde die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers, der zur spezifischen Blockierung der reaktiven Stelle des menschlichen α&sub2;-PI befähigt ist, eine genaue und einfache Bestimmung der Menge des menschlichen α&sub2;-PI im Blut ermöglichen und wäre für die Vorbeugung und Diagnose von zahlreichen Krankheiten gut verwendbar.
Der einzige Literaturverweis, der einen monoklonalen Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI beschreibt, ist die am 16. August 1983 offengelegte belgische Patentschrift Nr.
896,543. Diese Patentschrift beschreibt, daß 23 monoklonale Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erhalten wurden, die in 11 Antikörpergruppen mit unterschiedlichen Epitopspezifitäten unterteilt werden können, aber beschreibt nicht, welche Epitope des menschlichen α&sub2;-PI diese monoklonalen Antikörper erkennen und damit binden.
Deshalb ist ein Gegenstand dieser Erfindung, einen hochspezifischen monoklonalen Antikörper oder sein Fragment bereitzustellen, der die Funktion einer spezifischen Blockierung der reaktiven Stelle des menschlichen α&sub2;-PI, die die fibrinolytische Aktivität von Plasmin inhibiert, aufweist und dadurch die Wirkung des menschlichen α&sub2;-PI unterdrückt, um zu inhibieren.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist es, ein diesen Antikörper sekretierendes Hybridom und ein Verfahren für dessen Herstellung bereitzustellen.
Ein weiterer Gegenstand und Vorteile dieser Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
Gemäß eines erfindungsgemäßen Gesichtspunkts wird ein für den menschlichen α&sub2;-PI spezifischer monoklonaler Antikörper bereitgestellt, wobei der Antikörper die Funktion einer spezifischen Blockierung der Stelle des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert, und die Funktion der Unterdrückung der inhibierenden Funktion des α&sub2;-Plasmininhibitors für die fibrinolytische Aktivität aufweist.
Erfindungsgemäß kann der monoklonale Antikörper erhalten werden, indem eine Hybridomzellinie, die zur Herstellung des Antikörpers befähigt ist, etabliert und das Hybridom gezüchtet wird.
Das Hybridom, das zur Herstellung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers befähigt ist, kann durch eine Technik, bekannt als Köhler und Millstein-Verfahren, hergestellt werden (Köhler und Millstein, Nature 256 (1975), 495-497) Insbesondere wird ein Säuger, wie eine Maus, mit dem menschlichen α&sub2;-PI immunisiert und Antikörper-erzeugende Zellen des Tieres, beispielsweise Milzzellen, mit Myelomzellen fusioniert. Die fusionierten Zellen werden durch Klonierung der fusionierten Zellen, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers befähigt sind, abgesucht. Beispielsweise werden die erzeugten fusionierten Zellen systematisch nach einem Antikörper abgesucht, der mit dem an Mikrotiterplatten gebundenen menschlichen α&sub2;-PI reagiert. Auf diese Weise werden die Hybridomzellen selektiert, die den Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erzeugen und sekretieren. Die so erhaltenen Hybridomzellen werden in einem Medium mit oder ohne Serum gezüchtet. Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI, die in den Überstand der Kulturflüssigkeit sekretiert werden, werden auf Fibrinplatten auf die Wirkung der Unterdrückung der Fibrinolyse-inhibierenden Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI untersucht. Als ein Ergebnis kann ein Hybridom isoliert werden, das zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers befähigt ist, dessen Wirkung die Fibrinolyse-inhibierende Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI spezifisch unterdrückt.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann aus dem von diesem Hybridom gewonnenen Produkt erhalten werden. Der so erhaltene monoklonale Antikörper wirkt monospezifisch auf die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper und das Verfahren zu dessen Herstellung wird nun ausführlicher beschrieben.

(A) Isolierung und Reinigung des Antigens

Der menschliche α&sub2;-PI, der als Antigen verwendet wird, wird in reiner Form aus einer menschlichen Plasmaprobe, gemäß des vorgenannten Verfahrens von Aoki und Moroi, isoliert.

(B) Immunisierung von Säugern mit dem menschlichen α&sub2;-PI

Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich der zu immunisierenden Tiere und verschiedene Säuger, wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Schafe, Ziegen, Hunde und Katzen, können verwendet werden. Für eine einfachere Handhabung werden im allgemeinen männliche Balb/c-Mäuse verwendet. Mäuse anderer Stämme können ebenso verwendet werden. Die Immunisierung sollte geplant und die für die Immunisierung verwendete Konzentration des menschlichen α&sub2;-PI sollte so gewählt werden, daß ausreichende Mengen der durch das Antigen stimulierten Lymphocyten gebildet werden können. Beispielsweise wird eine Maus mehrmals mit einer kleinen Menge des menschlichen α&sub2;-PI in bestimmten Abständen intraperitoneal immunisiert, und das Antigen wird ferner mehrmals intravenös verabreicht, um den Antikörperspiegel zu erhöhen. Mehrere Tage nach der letzten Immunisierung werden Antikörper-erzeugende Zellen, beispielsweise Lymphocyten, vorzugsweise Milzzellen, dem immunisierten Tier entnommen. Die folgende Beschreibung ist auf die Verwendung von Milzzellen als Antikörper-erzeugende Zellen ausgelegt, aber es ist selbstverständlich, daß andere, aus immunisierten Tieren isolierte Antikörper-erzeugende Zellen gleichermaßen für die Zellfusion verwendet werden können.

(C) Zellfusion

Die Milz wird dem immunisierten Tier aseptisch entnommen und daraus eine Milzzellen-Suspension hergestellt. Die Milzzellen werden dann mit Myelomzellen, die aus einer geeigneten Zellinie genommen wurden, im Fusionsmedium in Gegenwart eines geeigneten Fusionspromotors fusioniert. Die für die Fusion verwendeten Myelomzellen können aus irgendeinem Säuger erhalten werden, aber im allgemeinen werden solche bevorzugt, die aus der selben Tierart wie das immunisierte Tier stammen. Das bevorzugte Mischungsverhältnis von Milzzellen und Myelomzellen liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 20 : 1 bis 2 : 1, vorzugsweise von 10 : 1 bis 2 : 1. Üblicherweise ist die Verwendung von 0,5 bis 1,5 ml des Fusionsmediums für etwa 108 Milzzellen geeignet. Geeignete Fusionsmedien sind beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, eine gepufferte Kochsalzlösung, ein Serum-freies Medium, die alle den Fusionspromoter in einer Konzentration von 30 bis 70% enthalten.
Es sind viele für eine Zellfusion geeignete Myelomzellen bekannt. Beispiele werden nachfolgend aufgeführt, wie P3-X63- Ag8-U1-Zellen (abgekürzt als P3-U1) (siehe D. E. Yelton et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 81 (1978), 1). Diese sind eine 8-Azaguanin-resistente Zellinie. Diesen fehlt die Hypoxanthin-Guanin Phosphoribosyltransferase und können daher nicht in HAT-Medium (das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält) überleben. Ferner, da diese Zellinie ein nicht-sekretierender Typ ist, der selbst keine Antikörper sekretiert, ist sie außerdem für die Herstellung des in der vorliegenden Erfindung beabsichtigten Hybridoms geeignet. Andere Myelomzellen können ebenfalls verwendet werden. Beispiele beinhalten P3-NS1-1-Ag4-1, NS1-Ag4/1, P3-X63-Ag8, (MPCH-45, 6.TG1.7), SP2/0-Ag14, FO, X-63- Ag8-6.5.3, 210.RCY3.Agc1.2.3, S194/5XXO.BU.1, SKO-007 und GM15006TG-A12.
Beispielsweise kann Polyethylenglycol, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von 1.000 bis 4.000 aufweist, vorteilhafterweise als Fusionspromotor verwendet werden. Es können auch andere, im Stand der Technik bekannte Fusionspromotoren, wie beispielsweise das Sendai-Virus, verwendet werden. In den folgenden Beispielen wurde Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichem Molekulargewicht von 1.540 verwendet.

(D) Nachweis der fusionierten Zellen

Ein Gemisch der fusionierten Zellen, der nicht-fusionierten Milzzellen und der nicht-fusionierten Myelomzellen wird in einem eigenen Gefäß (wie einer Mikrotiterplatte) mit einem selektiven Medium, in dem die nicht-fusionierten Myelomzellen nicht überleben können, verdünnt und für genügend lange Zeit gezüchtet, so daß die nicht-fusionierten Zellen absterben (etwa eine Woche). Das Kulturmedium kann gegen eine Substanz, wie 8-Azaguanin, resistent sein, in dem nicht-fusionierte Myelomzellen nicht überleben können, beispielsweise das vorstehend aufgeführte RAT-Medium. In dem selektiven Medium sterben die nicht-fusionierten Myelomzellen ab. Da die nicht-fusionierten Milzzellen keine Tumorzellen sind, sterben sie nach einem gewissen Zeitraum (etwa einer Woche) ab. Andererseits können die fusionierten Zellen in dem selektiven Medium überleben, da sie sowohl das Tumor-tragende Wesen der Myelom-Elternzellen als auch das Wesen der elterlichen Milzzellen aufweisen.

(E) Bestimmung eines für den menschlichen α&sub2;-PI spezifischen Antikörper in jedem Gefäß

Nachdem die Hybridomzellen, wie oben angegeben, nachgewiesen wurden, wird der Überstand der Kulturflüssigkeit gesammelt und nach einem Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI durch Enzym-gebundenen Immunosorbenttest (ELISA) abgesucht (siehe beispielsweise A. H. W. M. Schuurs und B. K. van Weemen, Clin. Chim. Acta 81 (1977), 1-40)

(F) Selektion eines Hybridoms, befähigt zur Erzeugung eines Antikörpers mit einer Aktivität gegen den menschlichen α&sub2;-PI

Der Überstand der Kulturflüssigkeit, der durch Züchtung des einen Antikörpers gegen menschlichen α&sub2;-PI erzeugenden Hybri'doms erhalten wurde, wird konzentriert und mit dem menschlichen α&sub2;-PI für einen bestimmten Zeitraum inkubiert. Plasmin wird zum Gemisch hinzugegeben und das Gemisch wird auf eine Fibrinplatte aufgebracht. Der Bereich des aufgelösten Fibrins wird gemessen. Auf diese Weise wird ein Hybridom ausgewählt, das zur Herstellung eines Antikörpers mit einer Aktivität gegen den menschlichen α&sub2;-PI befähigt ist.

(G) Klonierung des Hybridoms, das zur Herstellung des gewünschten Antikörpers befähigt ist

Das Hybridom, das zur Herstellung des gewünschten Antikörpers befähigt ist, kann gemäß eines geeigneten Verfahrens, wie der eingeschränkten Verdünnung, auf zwei unterschiedliche Weisen kloniert werden. Einerseits wird das Hybridom in einem geeigneten Medium über einen gegebenen Zeitraum gezüchtet, und der vom Hybridom erzeugte monoklonale Antikörper kann aus dem Überstand der Kulturflüssigkeit erhalten werden. Andererseits kann das Hybridom intraperitoneal in eine syngene Maus injiziert werden. Nach einem gewissen Zeitraum kann der vom Hybridom erzeugte monoklonale Antikörper aus dem Blut und der Ascitesflüssigkeit des Wirtstieres erhalten werden.
Der resultierende monoklonale Antikörper ist hochspezifisch für den menschlichen α&sub2;-PI und hat die Funktion, die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI spezifisch zu blockieren, das heißt die Stelle des menschlichen α&sub2;-PI, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert, und die inherente Wirkung des menschlichen α&sub2;-PI zu unterdrücken, um die fibrinolytische Aktivität des Plasmins zu inhibieren.
In der vorliegenden Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen bedeutet der Begriff "blockiert die reaktive Stelle" die Anlagerung oder Bindung des monoklonalen Antikörpers an die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI solchermaßen, daß der monoklonale Antikörper die reaktive Stelle selbst oder irgendwelche Epitope des menschlichen α&sub2;-PI erkennt und dadurch den Aktivitätsverlust der reaktiven Stelle bewirkt.
Es wird angenommen, daß der erfindungsgemäß bereitgestellte monoklonale Antikörper, wie auch andere Antikörper, in seiner variablen Region eine Antigen-bindende Stelle besitzt, die zur Ausübung der oben genannten Funktion befähigt ist.
Der resultierende monoklonale Antikörper wird gemäß des Porter-Verfahrens, unter Verwendung von Papain, ein proteolytisches Enzym, gespalten (siehe R. R. Porter, Biochemical Journal 73 (1959), 119-126) und eine Teilstruktur, in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung mit einer gestrichelten Linie umrundet und mit "Fab" bezeichnet, wird isoliert.
Die Teilstruktur Fab des monoklonalen Antikörpers wird auf einer Fibrinplatte auf ihre Wirkung zur Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI für die Inhibierung der fibrinolytischen Aktivität des Plasmins untersucht. Dies führt zu der Feststellung, daß sogar die Teilstruktur Fab alleine die Funktion der spezifischen Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI für die Inhibierung der fibrinolytischen Aktivität des Plasmins aufweist.
Deshalb wird, gemäß einer weiteren Ausführungsform, ein monoklonales Antikörper-Fragment bereitgestellt, das mindestens die Fab-Region eines monoklonalen Antikörpers, der für einen menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor spezifisch ist und die Funktion der spezifischen Blockierung der Stelle des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors aufweist, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert, das heißt die reaktive Stelle, umfaßt und die Funktion der Unterdrückung der Wirkung des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors für die Inhibierung der fibrinolytischen Aktivität des Plasmins aufweist. Solch ein Fragment schließt beispielsweise nicht nur ein Papain-gespaltenes Fragment ein, sondern auch andere Fragmente, die die nach der Spaltung mit Trypsin, Plasmin etc. erhaltene Fab-Region enthalten. Die Trypsin- und Plasmin-Spaltstellen sind in Fig. 1 durch Pfeile gekennzeichnet.
Wie vorstehend aufgeführt, hat der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper oder sein, die Fab-Region enthaltendes Fragment die Funktion der spezifischen Blockierung der reaktiven Stelle des menschlichen α&sub2;-PI, das heißt die Stelle des menschlichen α&sub2;-PI, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert und der Unterdrückung der Wirkung des menschlichen α&sub2;-PI für die Inhibierung der fibrinolytischen Aktivität des Plasmins. Demgemäß wird, wenn der monoklonale Antikörper oder sein Fragment einem Patienten verabreicht wird, in dem die fibrinolytische Aktivität von Plasmin durch die Wirkung des menschlichen α&sub2;-PI inhibiert wird und ein Thrombus in dem Gefäß gebildet wird, die inhibierende Wirkung des menschlichen α&sub2;-PI blockiert und Plasmin kann direkt auf den Thrombus wirken und diesen auflösen. Der Effekt des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers oder seines Fragments, die Fibrinolyse von Thromben zu fördern, kann beispielsweise durch die beiden folgenden in vitro- Tests festgestellt werden. Der erste dieser Tests ist ein Lyse-Test in einem gereinigten System unter Verwendung einer Fibrinplatte und der zweite ist ein Lyse-Test auf Thromben, die unter Verwendung von Plasma oder Blut hergestellt wurden. Im ersten Test wird der Bereich der Fibrinplatte bestimmt, die durch Plasmin in Gegenwart von menschlichem α&sub2;-PI und in Gegenwart von menschlichem α&sub2;-PI und dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper oder seines Fragments aufgelöst wurde und mit dem Bereich der Fibrinplatte verglichen, die nur in Gegenwart von Plasmin aufgelöst wurde. Im zweiten Test wird menschliches Plasma oder Blut mit Thrombin koaguliert und der koagulierte Klumpen wird in menschlichem Plasma oder Blut suspendiert, zu dem der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper oder dessen Fragment hinzugefügt wurde. Die Zeit, die bis zum Auflösen des koagulierten Klumpens verstreicht, wird mit der im Falle der Verwendung von normalem menschlichem Plasma oder Blut verglichen. Es wurde, wie in den Beispielen ausführlich beschrieben, bestätigt, daß in jedem der Tests die Fibrinplatte oder der koagulierte Klumpen in Gegenwart des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers oder seines Fragments schnell aufgelöst wird.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper oder sein die Fab-Region enthaltendes Fragment kann deshalb für die Behandlung von menschlichen thrombotischen Krankheiten, einschließlich Myocardinfarkt, zerebraler Infarkt, Venenverschluß und Arterienverschluß, verwendet werden.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper oder sein Fragment kann parenteral, vorzugsweise intravenös, verabreicht werden. Die Dosis variiert, abhängig vom Geschlecht, dem Alter, der Verfassung, dem Körpergewicht, etc. des zu behandelnden Patienten. Im allgemeinen kann die Dosis täglich etwa 0,01 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht als eine wirksame Menge zum Auflösen von Thromben, entweder einmal oder mehrmals pro Tag, betragen. Gemäß der Einschätzung eines Arztes kann es selbstverständlich in höheren Dosen verabreicht werden.
Der monoklonale Antikörper oder sein Fragment kann in einer geeigneten Form für die Verabreichung formuliert sein, beispielsweise als injizierbare Lösung, als Tropfinfusion, als lyophilisiertes Pulver, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Beispiele für pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel sind Wasser, Puffer, Blut-isotonisierende Mittel, Stabilisatoren (beispielsweise menschliches Plasmaalbumin, Mannit) und menschliche Antikörper oder ihre Fragmente. Eine injizierbare Lösung oder eine Tropfinfusion kann durch das Auflösen des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers oder seines Fragments in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 0,001 ug/ml bis 100 ng/ml und ferner, falls erforderlich, unter Zusatz von 0,01 M Natriumphosphat als Puffer und 1% Mannit und 0,1% menschliches Serumalbumin als Stabilisatoren, hergestellt werden. Die Konzentrationen der Zusatzstoffe können auf geeignete Weise verändert werden. Falls erforderlich, kann ein menschlicher Antikörper oder sein Fragment zugesetzt werden. Die injizierbare Lösung oder Tropfinfusion kann in Form einer Lösung oder in lyophilisierter Form hergestellt werden. Das lyophilisierte Produkt kann vor der Verwendung in einem Medium wie Wasser aufgelöst werden. Die injizierbare Lösung, die Tropfinfusion, ein lyophilisiertes Produkt davon und eine Lösung des lyophilisierten Produkts sollten aseptisch hergestellt und gelagert werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern spezifischer die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1

(1) Herstellung des menschlichen α&sub2;-PI

Gemäß vorstehend aufgeführten Verfahren von Aoki und Moroi wurden 7,7 mg des menschlichen α&sub2;-PI aus 2.360 ml menschlichem Plasma erhalten.

(2) Immunisierung von Mäusen

Männliche Balb/c-Mäuse wurden intraperitoneal mit einer Emulsion von 100 Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors und vollständigem Freund's Adjuvans zweimal im Abstand von 21 Tagen immunisiert. 7 Tage und 88 Tage später wurden zusätzlich 30 Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI in physiologischer Kochsalzlösung intravenös verabreicht. Vier Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzzellen für die Zellfusion isoliert.
(3) Herstellung einer Suspension aus Milzzellen Die Milzzellen wurden aseptisch entnommen und durch ein rostfreies Stahlnetz durchgeleitet, um eine Suspension der Milzzellen zu erhalten. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (ein Produkt von GIBCO) überführt, dem 0,39 g/l L-Glutamin, 0,2 g/l Kanamycinsulfat und 2,0 g/l NaHCO&sub3; zugesetzt wurde. Die sich proliferierenden Zellen wurden dreimal mit RPMI-1640 gewaschen und erneut in RPMI-1640-Medium suspendiert.

(4) Herstellung der Myelomzellen

Die Myelomzellen der Maus, P3-U1 wurden in RPMI-1640-Medium gezüchtet, dem 0,39 g/l L-Glutamin, 0,2 g/l Kanamycinsulfat, 2,0 g/l NaHCO&sub3; und 10% fetalem Kälberserum zugesetzt wurde (abgekürzt als 10% FCS-RPMI-1640). Zum Zeitpunkt der Zellfusion waren die Myelomzellen in der log-Phase der Zellteilung.

(5) Zellfusion

Die Milzzellen und die Myelomzellen wurden im Verhältnis 10 : 1 in Serum-freiem RPMI-1640-Medium suspendiert und anschließend bei etwa 200 G für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment zusammen mit 1 ml einer 50%igen Lösung aus Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1.540 (pH 8,2) bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert. Dann wurden 9 ml Serum-freies RPMI- 1640-Medium hinzugegeben und die Zellen erneut vorsichtig für 5 Minuten suspendiert. Die Suspension wurde bei etwa 200 G für 5 Minuten zentrifugiert und erneut in 10% FCS-RPMI- 1640-Medium suspendiert, so daß eine Konzentration von 8 ·10&sup6; Zellen/ml erhalten wurde. Die Suspension wurde dann auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verteilt (etwa 100 Mikroliter pro Vertiefung). Die fusionierten Zellen wurden bei 37ºC unter Verwendung von 5% CO&sub2; gezüchtet.

(6) Selektion und Züchtung der fusionierten Zellen, die in der Lage sind, einen Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI zu erzeugen

Einen Tag nach der Zellfusion wurde HAT-Medium in einer Menge von 100 Mikrolitern pro Vertiefung hinzugegeben. Danach wurde in Abständen von 2 Tagen die Hälfte des Mediums gegen eine frische Menge des HAT-Mediums ausgetauscht und die Züchtung fortgesetzt. Acht Tage später wurde der Überstand der Kulturflüssigkeit der Hybridomzellen nach Antikörpern gegen den menschlichen α&sub2;-PI mittels Enzym-gebundenem Immunosorbenttest abgesucht. Das für das Absuchen verwendete Antigen war menschlicher α&sub2;-PI und der zweite Antikörper war alkalische Phosphatase-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus- Antikörper.
Insgesamt wurden 349 Vertiefungen nachgewiesen, die im Enzym-gebundenen Immunosorbenttest positiv waren und somit Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erzeugten.
Wenn beobachtet wurde, daß die Proliferation der Zellen aktiv war, wurde HT-Medium hinzugegeben. Das Medium wurde viermal in Abständen von einem Tag durch HT-Medium ausgetauscht. Danach wurde die Züchtung unter Verwendung des gewöhnlichen 10% FCS-RPMI-1640-Mediums durchgeführt.

Beispiel 2

Selektion von fusionierten Zellen, die Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erzeugen:

Die fusionierten Zellen, die Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erzeugen, wurden gemäß des folgenden Verfahrens nach fusionierten Zellen abgesucht, die die Wirkung der Unterdrückung der Fibrinolyse inhibierenden Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI hatten.
Die fusionierten Zellen in jeder Vertiefung wurden in 10% FCS-RPMI-1640-Medium gezüchtet, bis die Zahl der Zellen ungefähr 2 · 10&sup7; erreichte. Die Zellen wurden danach bei etwa 200 G für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen mit 10 ml Serum-freiem RPMI-1640- Medium gewaschen und anschließend bei etwa 200 G für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen mit 10 ml eines gemischten, Serum-freien Mediums (abgekürzt als "MITES-Medium"), bestehend aus RPMI-1640-Medium, dem 5,0 ml/l 2-Mercaptoethanol, 7,5 ml/l Insulin, 5,0 ml/l Transferrin, 5,0 ml/l Ethanolamin, 5,0 ml/l Natriumselenit, 0,39 g/l L-Glutamin, 0,2 g/l Kanamycinsulfat und 2,38 g/l Hepes, Dulbecco's MEM und Ham's F-12 (2 : 1 : 1) zugesetzt wurde, suspendiert und für 3 Tage gezüchtet.
Der Überstand der Kulturflüssigkeit wurde gewonnen und 25-fach konzentriert. Zu 25 Mikrolitern des Konzentrats wurden 0,4 Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI hinzugegeben und das Gemisch bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase hinzugegeben und die Menge der Gesamtlösung auf 40 Mikroliter eingestellt. 10 Mikroliter davon wurden auf eine Fibrinplatte aufgebracht. Die Fibrinplatte wurde bei einer Temperatur von 37ºC und einer Feuchtigkeit von mehr als 95% für 18 Stunden stehengelassen, und der Bereich des aufgelösten Fibrins wurde gemessen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Fibrinolyse-inhibierende Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI, der zu den von den 1D10- fusionierten Zellen erzeugten Antikörpern hinzugegeben wurde, vollständig unterdrückt wurde.

Beispiel 3

Klonierung der fusionierten Zellen:

Die fusionierten Zellen (1D10), die im Aktivitätstest der Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI für positiv befunden wurden, wurden gemäß des folgenden Verfahrens kloniert.
Die 1D10-Zellen wurden verdünnt, so daß jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen 0,9 Zellen enthielt. Thymuszellen von Balb/c-Mäusen wurden als Futterzellen hinzugegeben und auf der Platte verteilt und in 10% FCS-RPMI- 1640-Medium gezüchtet. Die mikroskopische Beobachtung zeigte die gebildeten Einzelzellkolonien genau an. Der Überstand der Kulturflüssigkeit der fusionierten Zellen wurde durch Enzym-gebundenen Immunosorbenttest nach Antikörpern gegen den menschlichen α&sub2;-PI abgesucht.
Insgesamt wurden 26 Vertiefungen gefunden, die im Enzymgebundenen Immunosorbenttest positiv waren und somit monoklonale Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI erzeugten.

Reinigung der monoklonalen Antikörper:

Um große Mengen der monoklonalen Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI herstellen zu können, wurden etwa 10&sup7; fusionierte Zellen intraperitoneal in mit Pristan vorbehandelte Balb/c-Mäuse injiziert. Etwa eine Woche später wurden die Antikörper aus der Ascitesflüssigkeit isoliert und gemäß des Verfahrens von Ey et al. (P. L. Ey, S. J. Prowse und C. R. Jenkin, Immunochemistry 15 (1978), 429-436) gereinigt. 20 Milligramm der monoklonalen Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI wurden aus 2,5 ml der Ascitesflüssigkeit erhalten.

Charakterisierung der gereinigten monoklonalen Antikörper:

Die einzelnen Klassen der gereinigten monoklonalen Antikörper wurden gemäß des Ouchterlony-Geldiffusions-Tests unter Verwendung von Klassen-spezifischen Anti-Maus-Immunglobulin- Antisera bestimmt. Die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß viele der Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI vom H-Kette γ&sub1;-Typ und vom L-Kette κ-Typ sind. Tabelle 1 Antikörper

Beispiel 4

Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI durch Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI:

Ein Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI und 5 Mikrogramm eines jeden der vorstehend aufgeführten monoklonalen Antikörper wurden in 50 Mikrolitern 0,05 M Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (als PBS abgekürzt) gelöst und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase hinzugegeben und die Menge der Lösung auf 60 Mikroliter eingestellt. 10 Mikroliter wurden auf eine Fibrinplatte aufgebracht. Die Fibrinplatte wurde bei einer Temperatur von 37ºC und einer Feuchtigkeit von mehr als 95% für 18 Stunden stehengelassen und der Bereich des aufgelösten Fibrins bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die in Tabelle 2 dargestellten Werte sind relative Werte, die durch Gleichsetzen des mit 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase aufgelösten Bereichs als 100% erhalten wurden.

Tabelle 2

Antikörper aufgelöster Bereich (%)
1D10C1 100
1D10F10 97
1D10-1F5 109
1D10B11 85
1D10-2H8 100
1D10-1H2 70

Beispiel 5

Effekt des monoklonalen Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI auf die Bindung des menschlichen α&sub2;-PI mit Fibrin:

0,01 uM des I¹²&sup5;-markierten menschlichen α&sub2;-PI und 0,05 uM eines monoklonalen Antikörpers gegen α&sub2;-PI wurden bei 37ºC für 30 Minuten zusammen mit 2% Rinderserumalbumin-0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4)-0,15 M NaCl inkubiert und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Zu dem Antigen-Antikörper-Reaktionsgemisch wurde 2,5 mM CaCl&sub2;, 7 MM einer Fibrinogenfraktion und 2 Einheiten/ml Thrombin hinzugegeben und die Gesamtmenge des Gemisches auf 100 Mikroliter eingestellt. Es wurde bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Bildung von koaguliertem Material (Fibrinklumpen) wurde beobachtet. 30 Minuten später wurden 100 Mikroliter 200 mM EDTA hinzugegeben und die Calciumionen entfernt. Dann wurde das koagulierte Material durch Aufwickeln auf ein dünnes, aus Bambus hergestelltes Stöckchen herausgenommen. Das koagulierte Material wurde dreimal mit Waschflüssigkeit (2% BSA, 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4), 0,15 NaCl, 2 mM EDTA) gewaschen. Schließlich wurde das koagulierte Material vom Bambusstöckchen entfernt und in ein Teströhrchen gegeben. Die Radioaktivität (cpm) des koagulierten Materials wurde dann gemessen. Die Radioaktivität des koagulierten Materials bezogen auf die Radioaktivität des ursprünglichen Reaktionsgemisches ist für jeden Ansatz in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 gibt ebenfalls das Ergebnis an, das unter Verwendung von gewöhnlichem, im Handel erhältlichen IgG der Maus als Vergleichsantikörper erhalten wurde.

Tabelle 3

Antikörper Prozent Bindung (%)
1B10C4 14,3
1B10G11 16,2
1D10C1 17,4
1D10F10 17,8
1D10-1F5 17,1
1D10B11 17,6
1D10-2H8 18,5
IgG der Maus 14,0
Die Ergebnisse zeigen, daß die getesteten monoklonalen Antikörper gegen den menschlichen α&sub2;-PI monoklonale Antikörper sind, die nicht die Fibrin-Bindestelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennen.

Beispiel 6

Selektion eines monoklonalen Antikörpers, der die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennt:

In diesem Beispiel wurde die Wirkung eines monoklonalen Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI auf die Inaktivierung von Plasmin durch den menschlichen α&sub2;-PI untersucht.
0,6 Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI und 6,6 Mikrogramm eines monoklonalen Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI wurden in 60 Mikrolitern 2% Rinderserumalbumin-Lösung (0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl) gelöst, bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und anschließend über Nacht bei 4ºC stehen gelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 20 Mikrolitern einer Plasminlösung (0,47 uM) vermischt und 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4) und 0,15 M NaCl hinzugegeben und die Gesamtmenge der Flüssigkeit auf 500 Mikroliter eingestellt. Für jeden monoklonalen Antikörper wurden zwei Proben dieses Gemisches hergestellt und bei 37ºC für 2 Minuten beziehungsweise 20 Minuten inkubiert. Dann wurden 200 Mikroliter einer wäßrigen Lösung von 3,5 mM des synthetischen Substrats 5-2251 (H-D-Valyl-L- Leucyl-L-Lysyl-p-Nitroanilid Dihydrochlorid) hinzugegeben und mit einem Spektralphotometer (Beckmann, DU-8) die Änderungen der Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm pro Minute gemessen. Bei den Kontrollen wurden die Änderungen der Absorption ähnlich hinsichtlich einer Probe, die aus der Reaktion von Plasmin allein resultiert und einer Probe die durch Reaktion des menschlichen α&sub2;-PI mit Plasmin ohne den monoklonalen Antikörper erhalten wurde, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Antikörper Änderung der Absorbtion Reaktionszeit Plasmin alleine menschlicher α&sub2;-PI + Plasmin
Die in Beispiel 5 und 6 erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennen und die Plasmin-Bindungsstelle und die Fibrin-Bindungsstelle des menschlichen α&sub2;-PI nicht erkennen.

Beispiel 7

Spaltung eines die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennenden monoklonalen Antikörpers durch Papain:

Ein Milligramm des im vorausgegangenen Beispiels beschriebenen monoklonalen Antikörpers 1D10C1, der spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennt, wurde in 300 Mikrolitern einer Lösung (2 mM EDTA, 12,5 mM Cystein, 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl) gelöst und 100 Mikroliter einer Papa in-Lösung in einer Konzentration von 1 mg/ml wurden zugegeben und bei 37ºC für 18 Stunden umgesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde einer Flüssigkeitschromatographie unterworfen und der Fab-Bestandteil des Antikörpers abgetrennt. Sein Molekulargewicht wurde durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt. Es wurde ermittelt, daß der Fab- Bestandteil aus einem Fragment des Aminogruppen-Terminus der schweren Kette des Antikörpers mit einem Molekulargewicht von etwa 23.000 und der gesamten leichten Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 23.000 zusammengesetzt war.

Beispiel 8

Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI durch den Fab-Bestandteil des Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI:

Ein Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI und 3 Mikrogramm eines jeden der in Tabelle 5 aufgeführten monoklonalen Antikörper wurden in 50 Mikrolitern 0,05 M PBS gelöst und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase hinzugegeben und die Gesamtmenge der Lösung auf 60 Mikroliter eingestellt. 10 Mikroliter davon wurden auf eine Fibrinplatte aufgebracht und die Fibrinplatte bei einer Temperatur von 37ºC und einer Feuchtigkeit von mehr als 95% stehengelassen. Der Bereich des gelösten Fibrins wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Die in der folgenden Tabelle gezeigten Werte sind relative Werte, die durch Gleichsetzung des Bereichs von aufgelöstem Fibrin, indem die von 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase als 100% erhalten wurde.

Tabelle 5

Antikörper aufgelöster Bereich (%)
1D10C1 100
1D10C1 Fab 100
Darüberhinaus wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 die Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI durch den Fab-Bestandteil dieses monoklonalen Antikörpers untersucht.
0,6 Mikrogramm (9 Pikomol) des α&sub2;-PI und 40 Pikomol eines monoklonalen Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI wurden in 60 Mikrolitern einer 2% Rinderserumalbumin-Lösung (0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl) gelöst, bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und anschließend über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 20 Mikrolitern einer Plasminlösung (0,47 uM) gemischt und die Gesamtmenge der Lösung auf 500 Mikroliter eingestellt. Dann wurden 200 Mikroliter einer wäßrigen Lösung von 3,5 mM des synthetischen Substrats S-2251 hinzugegeben und die Änderungen der Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm pro Zeiteinheit mit einem Spektralphotometer (Hitachi 100-50) gemessen. Als Kontrolle wurden die Änderungen in der Absorption ebenso hinsichtlich einer durch Reaktion von Plasmin alleine erhaltenen Probe und einer durch Reaktion von menschlichem α&sub2;-PI und Plasmin erhaltenen Probe untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6

Antikörper Änderungen der Absorption (405 nm/min)
1D10C1 24,8 · 10&supmin;&sup5;
1D10C1 Fab 26,0 · 10&supmin;³
Plasmin alleine 24,0 · 10&supmin;³
menschlicher α&sub2;-PI + Plasmin 8,4 · 10&supmin;³
Die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der die Fab-Region enthaltende monoklonale Antikörper gemäß dieser Erfindung spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennt und die Fibrinolyse-inhibierende Funktion des menschlichen α&sub2;-PI unterdrückt.

Beispiel 9

Spaltung eines die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennenden monoklonalen Antikörpers durch Pepsin:

0,39 mg des im vorausgegangenen Beispiel beschriebenen monoklonalen Antikörpers 1D10C1, der spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennt, wurde in 0,5 ml 0,1 M Natriumacetat (pH 4,6) gelöst, 1,0 ml einer Pepsinlösung (0,1 M Natriumacetat, pH 4,6) mit einer Konzentration von 0,33 mg/ml hinzugegeben und bei 37ºC für 14 Stunden umgesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde einer Flüssigkeitschromatographie unterworfen und der F(ab')2-Bestandteil des Antikörpers abgetrennt. Das Molekulargewicht dieses Bestandteils wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen bestimmt. Es wurde festgestellt, daß es sich um den F(ab')2-Bestandteil handelte, der aus einem Fragment des Aminogruppen-Terminus der schweren Kette des Antikörpers mit einem Molekulargewicht von etwa 28.000 und der gesamten leichten Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 23.000 zusammengesetzt war.

Beispiel 10

AUnterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI durch den F(ab')2-Bestandteil eines Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI:

Ein Mikrogramm des menschlichen α&sub2;-PI und 2 Mikrogramm eines monoklonalen Antikörpers wurden in 50 Mikrolitern 0,05 M PBS gelöst und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase hinzugegeben und die Gesamtmenge der Lösung auf 60 Mikroliter eingestellt. 10 Mikroliter davon wurden auf eine Fibrinplatte aufgebracht und die Fibrinplatte bei einer Temperatur von 37ºC und einer Feuchtigkeit von mehr als 95% für 18 Stunden stehengelassen. Der Bereich des gelösten Fibrins wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die in der folgenden Tabelle gezeigten Werte sind relative Werte, die durch Gleichsetzung der durch 0,025 Einheiten Plasminogen und 0,031 Einheiten Urokinase aufgelösten Bereich als 100% erhalten wurde.

Tabelle 7

Antikörper aufgelöster Bereich (%)
1D10C1 100
1D10C1 F(ab')2 100
Durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wurde die Unterdrückung der Aktivität des menschlichen α&sub2;-PI durch den F(ab')2-Bestandteil dieses monoklonalen Antikörpers untersucht.
0,6 Mikrogramm (9 Pikomol) des α&sub2;-PI und 40 Pikomol des monoklonalen Antikörpers gegen den α&sub2;-PI wurden in 60 Mikrolitern einer 2% Rinderserumalbumin-Lösung (0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl) gelöst, bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und anschließend über Nacht bei 4ºC stehengelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde mit 20 Mikrolitern einer Plasminlösung (0,47 uM) gemischt, 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,4) und 0,15 M NaCl wurden hinzugegeben und die Gesamtmenge der Lösung wurde auf 500 Mikroliter eingestellt. Dann wurden 200 Mikroliter einer wäßrigen Lösung von 3,5 mM des synthetischen Substrats S-2251 hinzugegeben. Die Änderungen der Absorption wurden bei einer Wellenlänge von 405 nm pro Zeiteinheit mit einem Spektralphotometer (Hitachi 100-50) gemessen. Als Kontrollen wurden die Änderungen in der Absorption ebenso hinsichtlich einer durch Reaktion von Plasmin alleine erhaltenen Probe und einer durch Reaktion von menschlichem α&sub2;-PI und Plasmin ohne Zusatz des monoklonalen Antikörpers erhaltenen Probe untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8

Antikörper Änderungen der Absorption (405 nm/min)
1D10C1 24,8 · 10&supmin;&sup8;
1D10C1 F(ab')2 24,4 · 10&supmin;³
Plasmin alleine 24,0 · 10&supmin;³
α&sub2;-PI und Plasmin 8,4 · 10&supmin;³
Die vorstehend erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der F(ab')2 enthaltende monoklonale Antikörper gemäß dieser Erfindung spezifisch die reaktive Stelle des menschlichen α&sub2;-PI erkennt und die Fibrinolyse-inhibierende Funktion des menschlichen α&sub2;-PI unterdrückt.

Beispiel 11

Test für die Auflösung eines Thrombus unter Verwendung von menschlichem Plasma:

60 Mikroliter einer Thrombinlösung (200 Einheiten/ml) wurden zu 150 Mikrolitern einer von einem normalen, gesunden Menschen entnommenen Plasmaprobe gegeben. Das Gemisch wurde auf 37ºC für 2 Minuten erwärmt, um das Plasma zu koagulieren und um einen Klumpen zu erhalten. Getrennt davon wurden 27 Mikroliter einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers gegen den menschlichen α&sub2;-PI (1D10C1; 3,39 mg/ml) zu 290 Mikrolitern einer von einem normalen, gesunden Menschen entnommenen Plasmaprobe gegeben. Das Gemisch wurde auf 37ºC für 30 Minuten erwärmt. Zur Lösung wurden 100 Mikroliter einer Plasminlösung (1.000 Einheiten/ml) gegeben und gleichzeitig wurde der Klumpen in sie hineingetaucht. Die Lösung wurde dann auf 37ºC erwärmt. Zum Vergleich wurde das vorstehende Verfahren unter Verwendung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung anstelle der Lösung des monoklonalen Antikörpers wiederholt. Die für das Auflösen des Klumpens benötigten Zeiträume wurden verglichen. Die Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen den α&sub2;-PI führte zur vollständigen Auflösung des Klumpens in etwa 2 Stunden. Ohne den monoklonalen Antikörper war eine Dauer von über 10 Stunden erforderlich, um es aufzulösen.

Beispiel 12

Test für die Auflösung eines Thrombus unter Verwendung von menschlichem Blut:

Zu 150 Mikrolitern einer von einem normalen, gesunden Menschen entnommenen Blutprobe wurden 60 Mikrogramm einer Thrombinlösung (200 Einheiten/ml) gegeben. Das Gemisch wurde auf 37ºC für 2 Minuten erwärmt, um das Blut zu koagulieren und um einen Klumpen zu erhalten. Getrennt davon wurden 27 Mikroliter einer Lösung eines monoklonalen Antikörpers gegen den α&sub2;-PI (1D10C1; 3,39 mg/ml) hinzugegeben und das Gemisch auf 37ºC für 30 Minuten erwärmt. Zur Lösung wurden 100 Mikroliter einer Plasminlösung (1.000 Einheiten/ml) gegeben und gleichzeitig wurde der Klumpen in sie hineingetaucht. Die Lösung wurde dann auf 37ºC erwärmt. Zum Vergleich wurde das vorstehende Verfahren unter Verwendung von Phosphatgepufferter Kochsalzlösung anstelle der Lösung des monoklonalen Antikörpers wiederholt. Die für das Auflösen des Klumpens benötigten Zeiträume wurden verglichen. Die Verwendung des monoklonalen Antikörpers gegen den α&sub2;-PI führte zur vollständigen Auflösung des Klumpens in etwa 2 Stunden. Ohne den monoklonalen Antikörper war eine Dauer von über 10 Stunden erforderlich, um es aufzulösen.

Claims

1. Für einen menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor spezifischer monoklonaler Antikörper, wobei der Antikörper die Funktion einer spezifischen Blockierung der Stelle des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert, und die Funktion der Unterdrückung der inhibierenden Funktion des α&sub2;-Plasmininhibitors für die fibrinolytische Aktivität aufweist.

2. Fragment eines monoklonalen Antikörpers, umfassend mindestens einer Fab-Region eines für einen menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor spezifischen monoklonalen Antikörpers, wobei der monoklonale Antikörper die Funktion einer spezifischen Blockierung der Stelle des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors, die die fibrinolytische Aktivität des Plasmins inhibiert, und die Funktion der Unterdrückung der inhibierenden Funktion des menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitors für die fibrinolytische Aktivität aufweist.

3. Hybridom, das den monoklonalen Antikörper von Anspruch 1 erzeugt.

4. Hybridom nach Anspruch 3, das von Antikörper-erzeugenden Zellen stammt, die von einem mit einem menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor immunisierten Säuger und Myelomazellen erhalten worden sind.

5. Hybridom nach Anspruch 4, wobei die Antikörper-erzeugenden Zellen Milzzellen der Maus sind.

6. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms, das zur Erzeugung des monoklonalen Antikörpers von Anspruch 1 befähigt ist, umfassend die Fusion Antikörper-erzeugender Zellen, die von einem mit einem menschlichen α&sub2;-Plasmininhibitor immunisierten Säuger erhalten worden sind, mit Myelomazellen und die Klonierung der fusionierten Zellen zum Erhalt des Hybridoms.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Antikörpererzeugenden Zellen Milzzellen einer Maus sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Myelomazellen von einer Maus stammen.

9. Arzneimittel zur Verwendung für die Behandlung von thrombotischen Erkrankungen, umfassend den monoklonalen Antikörper von Anspruch 1 oder das Fragment eines monoklonalen Antikörpers von Anspruch 2.

10. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder das Fragment eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 2 zur Verwendung für die Behandlung thrombotischer Erkrankungen.