DE69132352T2

DE69132352T2 - Protein-antagonisten der blut-koagulation und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69132352T2
Application number: DE69132352T
Authority: DE
Inventors: K. Brunck; R. Soule
Original assignee: Corvas International Inc
Current assignee: Dendreon Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2011-10-18
Also published as: EP0554383A1; ATE195149T1; JP2680192B2; CA2094372A1; EP0554383A4; JPH06502307A; ES2151880T3; US5506134A; AU654311B2; AU9029891A; EP0554383B1; DE69132352D1; WO1992006711A1

Description

Fachbereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper und funktionelle Fragmente davon zur Verwendung bei der Behandlung von Patienten mit thrombotischen Erkrankungen oder der Verhütung von thrombotischen Erkrankungen.

Hintergrund der Erfindung

Bei der Hämostase handelt es sich um einen natürlich auftretenden Prozess, der zur spontanen Stillung einer Blutung aus verletzten Blutgefäßen führt. Zum Beispiel ziehen sich vorkapilläre Gefäße unmittelbar zusammen, nachdem sich ein Mensch geschnitten hat. Innerhalb von Sekunden nach solch einem Schnitt setzt der Prozess der Hämostase ein. An der Stelle einer Verletzung bei Unterbrechung eines Blutgefäßes oder Freilegung von subendotheüalem vaskulärem Gewebe treten schnell zwei Ereignisse ein: die beiden Zweige des hämostatischen Systems, von dem jeder aus vielen Molekülen besteht, werden aktiviert. Das Koagulations- (Gerinnungs-)-System wird sofort zur Erzeugung von Thrombin angeregt; und Blutplättchen heften sich an Matrixproteine an. Die Blutplättchen werden zum Teil durch Thrombin aktiviert und setzen Adenosindiphosphat ("ADP") frei, was zur Aggregation weiterer Blutplättchen zu einem anwachsenden Thrombozytenpfropf, einhergehend mit der Umwandlung des Fibrinogens im Blut zum unlöslichen Fibringel führt. Dieser hämostatische Pfropf wird durch zusätzliche enzymatische Vernetzung verstärkt. Mit der Zeit wird er während der Gewebeheilung aufgelöst und ergibt normales Gewebe und Blutgefäße mit oder ohne zurückbleibende krankhafte Veränderungen der lokalen Gefäßwand oder des Gewebes.
Bei der Thrombogenese handelt es sich um einen veränderten pathogenen Zustand einer oder beider Zweige des hämostatischen Systems. Bei derartigen Zuständen führt eine pathologische Störung der Hämostase zu einem intravasalen (arteriellen oder venösen) Thrombus. Man stellt sich zum Beispiel einen Blutplättchen-reichen Thrombus so vor, dass er durch das Haftenbleiben zirkulierender Blutplättchen an der Wand eines Arteriengefäßes entsteht. Dieses anfängliche Haftenbleiben, die Aktivierung durch Thrombin oder andere Agonisten und die begleitende Freisetzung von ADP aus den Blutplättchen ist gefolgt von einer Thrombozyten-Thrombozyten- Wechselwirkung oder Aggregation. Mit dem Plättchenthrombus hängt eine Bildung von Fibrin zusammen, stellt aber die geringer beteiligte Komponente dar. Der Arterienthrombus kann in Bereichen eines langsameren Blutstroms zu verschließenden Proportionen anwachsen.
Im Gegensatz dazu entwickeln sich vorwiegend Fibrin-haltige Thrombi anfänglich in Bereichen von Stillstand oder langsamerem Blutfluss in den Blutgefäßen und können einem in vitro gebildeten Blutpfropf ähneln. Die Masse der Venenthrombi umfasst ein Fibrinnetzwerk mit eingewobenen roten Blutkörperchen und Blutplättchen. Ein Venenthrombus kann einen "Schwanz" entwickeln, der sich ablösen und zur Embolusbildung in den Lungenarterien-führen kann. Daraus wird zu verstehen sein, dass Arterienthrombi zu ernstlichen Erkrankungen durch lokale Ischämie führen können, wohingegen Venenthrombi dies in erster Linie durch entfernt gelegene Embolusbildung bewirken.
Ein Thrombozytenpfropf, der lediglich durch ADP-stimulierende Wechselwirkung der Blutplättchen gebildet wird, ist instabil. Unmittelbar nach der ursprünglichen Aggregation und viskösen Metamorphose der Blutplättchen, wie oben angemerkt, wird Fibrin zu einem Bestandteil des Blutplättchen-reichen Thrombus. Die Produktion von Thrombin erfolgt durch Aktivierung der Reaktionen der Blutgerinnung an der Stelle der Plättchenmasse. Dieses Thrombin kann die ersten haftenbleibenden Blutplättchen aktivieren und weitere Thrombozyten-Aggregationen stimulieren. Die Thrombozyten-Aggregation wird nicht nur durch Induzieren der Freisetzung von ADP aus den Blutplättchen stimuliert, sondern auch durch Stimulierung der Synthese von Prostaglandinen, die als aggregierende Substanzen kraftvoller sind als ADP und durch die Ansammlung des Prothrombinase-Komplexes auf den aktivierten Plättchen zur Beschleunigung der Bildung von weiterem Thrombin, des sehr kraftvollen Aktivierers der Blutplättchen.
Die Gerinnung des Blutes führt zur Bildung von Fibrin. Sie umfasst eine Wechselwirkung von mehr als zwölf Proteinen in einer kaskadierenden Reihe proteolytischer Reaktionen. Bei jedem Schritt vollzieht ein Gerinnungsfaktor-Zymogen eine begrenzte Proteolyse und wird selbst zu einer aktiven Protease. Dieses Gerinnungsfaktor-Enzym aktiviert das nächste Gerinnungsfaktor-Zymogen bis zum Erhalt von Thrombin, das Fibrinogen an den unlöslichen Fibrinpfropf bindet. Die Blutgerinnungsfaktoren umfassen Faktor I (Fibrinogen), Faktor II (Prothrombin), Gewebefaktor (früher bekannt als Faktor III), Faktor IV (Ca²&spplus;), Faktor V (labiler Faktor), Faktor VII (Prokonvertin), Faktor VIII (antihämophiles Globulin, oder "AHG"), Faktor IX (Christmas-Faktor), Faktor X (Stuart-Faktor), Faktor XI (Plasmathromboplastin-Vorläufer, oder "PTA"), Faktor XII (Hageman-Faktor), Faktor XIII (Fibrinstabilisierender Faktor) und Faktoren HMW-K (hochmolekulares Kininogen, oder Fitzgerald-Faktor), PRE-K (Prekallikrein, oder Fletcher-Faktor), Ka (Kallikrein) und PL (Phospholipid).
Fibrinogen stellt das Substrat für das Enzym Thrombin (Faktor IIa) dar, eine Protease, die während des Gerinnungsprozesses durch die Aktivierung eines zirkulierenden Zymogens, Prothrombin (Faktor II), gebildet wird. Prothrombin wird zu dem aktiven Enzym Thrombin durch den aktivierten Faktor X in Gegenwart des aktivierten Faktors V, Ca²&spplus; und Phospholipid umgewandelt.
Zwei getrennte Wege, benannt das "intrinsische" und "extrinsische" System, führen zur Bildung von aktiviertem Faktor X. Im intrinsischen System sind all die Gerinnungsfaktoren, die für die Gerinnung erforderlich sind, im zirkulierenden Blut vorhanden. Im extrinsischen System wird der Gewebefaktor, der im zirkulierenden Blut nicht vorhanden ist, auf verletztem Endothel, auf aktivierten Monozyten durch Zellen in der arteriosklerotischen Plaque oder durch Zellen außerhalb der Gewebewand exprimiert. Der Gewebefaktor dient dann als der Rezeptor und wesentliche Kofaktor für die Bindung des Faktors VII, was ein bimolekulares Enzym [Gewebefaktor : VIIa] zur Anregung des extrinsischen Gerinnungsweges ergibt. Dieser Mechanismus aktiviert auch den intrinsischen Gerinnungsweg. Der Gewebefaktor- Weg kann eine sehr schnelle Blutgerinnung bewirken.
Das Blut kann auch durch das Kontaktsystem über den intrinsischen Koagulationsweg verklumpen. Der Mechanismus ist vermutlich aufgrund der größeren Zahl an erforderlichen Reaktionen etwas langsamer als die Gewebefaktor-Wege. Sowohl die Wege des intrinsischen Systems als auch des extrinsischen Systems müssen für eine adequate Hämostase intakt sein. (Siehe Zwaal, R. F. A., und Hemker, H. C. "Blood cell membranes and hemostasis." Haemostasis, 11: 12-39 (1982).
Thrombose und eine Vielzahl verwandter Formen von Erkrankungen sind mit der Aktivierung einer oder mehrerer der Koagulations-Protease-Kaskadenwege und Regulationsstörungen der kombinierten Koagulations-/Antikoagulations-/ fibrinolytischen Wege verbunden und resultieren daraus. Diese Erkrankungen befallen jährlich etwa 2,5 Mio. Menschen in den USA. Etwa drei Prozent der amerikanischen Bevölkerrang über 45 Jahren entwickeln irgendeine Form von thrombotischer Erkrankung oder disseminierter Blutgerinnung jedes Jahr. Weitere thrombotische Erkrankungen sind erblich bedingt und mögen etwa 100.000 Personen pro Jahr betreffen. Siebzig Prozent dieser Erkrankungen führen bereits bis zum 45. Lebensjahr zum Tode.
Von den erworbenen thrombotischen Erkrankungen überwiegen die Koronarthrombose mit etwa 1,5 Mio. Fällen pro Jahr, die Lungenthrombembolie mit etwa 400.000 Fällen pro Jahr und der schwere septische Schock mit mehr als 300.000 Fällen pro Jahr, die disseminierte intravasale Gerinnung (DIG) mit etwa 350.000 Fällen pro Jahr und die tiefe Venenthrombose mit etwa 175.000 Fällen pro Jahr. Allerdings ergeben Erkrankungen wie Meningokokkämie, hämorrhagisches Fieber-Virusinfektionen und eine Vielzahl weiterer Erkrankungen ebenfalls eine signifikante Morbidität und Mortalität. Siehe z. B. Kaplan, K. "Coagulation Proteins in Thrombosis." In Hemostasis and Thrombosis, Colman, R. W., et al. Hrg., Seiten 1098 et seq. (2te Aufl. J. B. Lippincott Co. 1987). Einige der akut schwersten Formen der disseminierten intravasalen Gerinnung befallen Kinder als Sekundärerscheinung auf eine Vielzahl von Infektionskrankheiten hin. Die derzeitige Therapie für thrombembolische Erkrankungen ist in keiner Weise zufriedenstellend und beinhaltet die Verwendung von Antikoagulantien, antithrombotischen Wirkstoffen und thrombolytischen Mitteln. Eines der wohlbekanntesten Antikoagulantien ist Heparin. Entdeckt im Jahre 1922, stellt Heparin eine heterogene Gruppe geradkettiger anionischer Mucopolysaccharide, genannt Glucosaminoglykane, mit einem Molekulargewicht von durchschnittlich 15.000 Dalton dar. Das kommerzielle Heparin umfasst üblicherweise Polymere aus zwei sich wiederholenden Disaccharid-Einheiten: D-Glucosamin-L-iduronsäure und D-Glucosamin-D-glucuronsäure. Es wird typischerweise sowohl aus Rinderlungen- als auch Schweinedarm-Schleimhaut präpariert und wurde auch aus Schafen und Walen gewonnen.
Während Heparin intrazellulär in Säugergeweben auftritt, die Mastzellen enthalten, ist es auf eine makromolekulare Form von mindestens 750.000 Dalton begrenzt. Darüber hinaus besitzt dieses Heparin lediglich 10-20% der gerinnungshemmenden Wirksamkeit des kommerziellen Heparins. Heparansulfat, eine Verbindung ähnlich dem Heparin, doch mit geringerer gerinnungshemmender Wirksamkeit, stellt eine allgegenwärtige Komponente an der Säugerzelloberfläche dar. Wird natives Heparin aus seinem gebundenen und inaktiven Zustand in den metachromatischen Granula der Mastzellen freigesetzt, so wird es von Makrophagen aufgenommen und schnell zerstört. Heparin ist im zirkulierenden Blut nicht nachweisbar.
Wird es intravenös verabreicht, so beeinflusst für den Handel präpariertes Heparin die Blutgerinnung. Es wirkt durch Komplexbildung mit Antithrombin III, einem Serinprotease-Inhibitor, der mehrere aktivierte Gerinnungsfaktoren neutralisiert, d. h. Faktoren XIIa, Kallikrein (aktivierter Fletcher-Faktor), XIa, IX, Xa und Thrombin (IIa). Am wirksamsten ist es jedoch in seiner Hemmung des freien Thrombins und aktivierten Faktors X (Xa). Obschon Antithrombin III für das einzige Makromolekül gehalten wurde, das zur Inaktivierung des Thrombins fähig ist, sind jetzt weitere Plasmaproteine für diese Aktivität bekannt. Antithrombin III kann irreversible Komplexe mit Serinproteasen bilden und als Folge dessen die obigen Proteinfaktoren inaktivieren. Griffith, M. J., "Heparin-Catalyzed Inhibitors/Protease Reactions:
Kinetic Evidence for a Common Mechanism of Action of Heparin," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 5460-5464 (1983). Heparin beschleunigt die Geschwindigkeit deutlich, wenn auch nicht den Umfang dieser Reaktion. Zwischen Heparin, Antithrombin III und den Gerinnungsfaktoren wird offenbar ein ternärer Komplex gebildet. Bjork, I., und Lindahl, U. "Mechanism of the Anticoagulant Action of Heparin" Mol. Cell. Biochem., 48: 161-182 (1982). Geringe Konzentrationen des Heparins erhöhen die Aktivität des Antithrombin III, im besonderen gegen den Faktor Xa und Thrombin, was die Grundlage für die Verabreichung niedriger Heparindosen als therapeutisches Behandlungsschema bildet.
Zwar sind die gereinigten handelsüblichen Präparationen des Heparins relativ ungiftig, doch besteht eine Hauptkomplikation der Therapie mit Heparin in der Hämorrhagie. Heparin führt außerdem zu einer vorübergehenden leichten Thrombozytopenie bei etwa 25% der Patienten, schweren Thrombozytopenie bei einigen wenigen Patienten und gelegentlich zu Arterienthrombi. Die leichten Reaktionen resultieren aus der durch Heparin bewirkten Thrombozyten-Aggregation, wohingegen die schwere Thrombozytopenie der Bildung eines Heparin-abhängigen Anti-Thrombozyten-Antikörper-Komplexes folgt. Es muss verstanden sein, dass bei allen Patienten mit Heparin-Gabe die Thrombozyten-Zählungen ständig überwacht werden müssen und neue Thrombi die Folge der Heparin-Therapie sein könnten, eine ausreichende schwere Thrombozytopenie zur Bewirkung einer Hämorrhagie als Heparin-induziert betrachtet werden sollte und dass eine als Folge von Heparin entstandene Thrombose durch Absetzen und Substituieren durch ein Mittel, das die Blutplättchen-Aggregation hemmt und/oder ein orales Antikoagulans behandelt werden sollte.
Schwere Thrombozytopenie, Hämorrhagie und Tod traten selbst bei Patienten ein, die eine niederdosierte Heparin-Therapie erhalten hatten. Eine Heparin-Therapie ist darüber hinaus kontraindiziert bei Patienten, die große Mengen an Ethanol konsumieren, die Arzeimittel-empfindlich sind, die aktiv bluten oder die an Hämophilie, Purpura, Thrombozytopenie, intrakranialer Hämorrhagie, bakterieller Endokarditis, aktiver Tuberkulose, erhöhter Kapillardurchlässigkeit, allen Arten von Läsionen des Magen-Darm-Trakts, schwerem Bluthochdruck, drohendem Abort oder Viszeralkarzinom leiden. Darüber hinaus ist Heparin nicht zu verabreichen während oder nach einem operativen Eingriff am Gehirn, Auge oder dem Rückenmark und darf nicht verabreicht werden an Patienten, denen eine Lumbalpunktur oder ein regionaler anästhetischer Block bevorsteht. Goodman und Gillman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Seiten 1339-1344 (7. Auflage 1985).
Eine Anzahl oraler Antikoagulantien steht ebenfalls für die klinische Anwendung zur Verfügung. Viele gerinnungshemmende Wirkstoffe wurden als Derivate von 4- Hydroxycumann oder der verwandten Verbindung Idan-1,3-dion synthetisiert. Die wesentlichen chemischen Eigenschaften der Cumann-Derivate für die gerinnungshemmende Aktivität sind ein intakter 4-Hydroxycumann-Rest mit einem Kohlenstoff- Bestandteil an der 3-Position. Es gibt allerdings eine Reihe von Unterschieden bei den pharmakokinetischen Eigenschaften und Toxizitäten dieser Agentien, wobei razemisches Warfarinnatrium das in den USA am breitesten verabreichte Antikoagulans ist.
Die wichtigste pharmakologische Wirkung der oralen Antikoagulanten besteht in der Hemmung der Blutgerinnung durch Behinderung der hepatischen posttranlationalen Modifizierung der Vitamin-K-abhängigen Proteine, zu denen die Gerinnungsfaktoren zählen, d. h. Faktoren II, VII, IX und X. Diese Wirkstoffe werden häufig als indirekte Antikoagulantien bezeichnet, da sie ausschließlich in vivo wirken, wohingegen Heparin als direktes Antikoagulans bezeichnet wird, da es auch in vitro wirkt. Auch hier stellt Hämorrhagie die wichtigste, durch Therapie mit oralen Antikoagulantien verursachte Nebenwirkung dar, weshalb die Therapie immer überwacht werden muss. In einer berichteten Reihenfolge von abnehmender Häufigkeit zählen zu den Komplikationen Ecchymosis, Hämaturie, Uterusblutung, Meläna oder Hämatochezie, Epistaxis, Hämatom., Nasenbluten, Hämoptysis und Hämatemesis. Alle oben bezüglich der Verwendung von Heparin beschriebenen Kontraindikationen gelten auch für die Antikoagulantien.
Anti-Blutplättchen-Wirkstoffe unterdrücken die Blutplättchen-Funktion und werden in erster Linie für thrombotische Arterienerkrankungen verwendet, wohingegen die Antikoagulans-Wirkstoffe wie z. B. Warfarin und Heparin, die Synthese oder Funktion der Gerinnungsfaktoren unterdrücken und zur Kontrolle venöser thrombembolischer Störungen eingesetzt werden. Es gibt eine Reihe von Anti-Blutplättchen-Wirkstoffen, von denen das bekannteste Aspirin ist. Die Wirksamkeit dieser Agentien für die Akutbehandlung wurde allerdings nicht nachgewiesen, und es besteht ein wirkliches Problem bezüglich einer Aspirin-Blutung.
Zu thrombolytischen Wirkstoffen zählen Streptokinase, Urokinase, Gewebeplasminogenaktivator und APSAC (acylierter Plasminogen-Streptokinase-Komplex). Hierbei handelt es sich um Proteine, deren Wirksamkeit für die Behandlung der akuten thrombotischen Behandlung nachgewiesen wurde. Sie fördern die Auflösung der Thrombi durch Stimulierung der Umwandlung von endogenem Plasminogen zu Plasmin, einem proteolytischen Enzym, das Fibrin hydrolysiert. Die Anwendungsmöglichkeit dieser Agentien ist allerdings auf akute thrombotische Erkrankungen begrenzt. Fibrinolytische Mittel werden in erster Linie zur Behandlung von Patienten mit nachgewiesener Koronararterienthrombose eingesetzt.
Die wirksame Therapie für eine Vielzahl von Formen der intravasalen Aktivierung der Gerinnungs-Protease-Kaskaden, ob nun eine Thrombose oder eine katastrophalere Form, wie z. B. die mit einem vasomotorischen Kollaps (septischen Schock) und weiteren Formen der disseminierten intravasalen Gerinnung zusammenhängenden Formen, ist nicht gänzlich zufriedenstellend und im Falle des septischen Schocks ganz und gar unbefriedigend. Der Bedarf nach einer wirksamen Therapie, die zum schnellen Stillstand der arteriellen Thrombogenese führt, ist als ein wichtiges therapeutisches Defizit erkannt worden. Dies wird aus dem kürzlich erfolgten Beweis ersichtlich, dass Heparin in der Prävention einer wiederkehrenden Thrombose bei den 11-20% der Patienten gänzlich unwirksam ist, die nach Abschluss der thrombolytischen Therapie mit Gewebeplasminogenaktivator erneut thrombieren. Die vorliegende Erfindung wurde als Reaktion auf diesen Bedarf gemacht und betrifft Antagonisten des Faktors VII und spezifische Antagonisten der prokoagulierenden Aktivität des Faktors VIIa und des Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes. Die Erfindung umfasst Antikörper vom Typ der monoklonalen Antikörper, wie durch Zellsysteme einschließlich von Bakterien wie E. coli oder durch Hybridzelllinien erzeugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Antikörper oder deren funktionelle Fragmente eine zuvor festgelegte Spezifität für Faktor VII, für Faktor VIIa und/oder den bimolekularen Komplex aus Gewebefaktor und Faktor VIIa ausweisen, in der Neutralisierung dieser Ziele wirksam sind und Anwendung als antithrombotische Mittel für Syndrome wie die disseminierte intravasale Gerinnung ("DIG") und die Venenthrombose finden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Anwendung dieser monoklonalen Antikörper bei Methoden zur Ausreinigung von Faktor VII, Faktor VIIa und des oben benannten bimolekularen Komplexes, und bei Verfahren für den Immunoassay oder den Immunonachweis von Faktor VII, Faktor VIIa und des bimolekularen Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes. Die Ausreinigung von Faktor VII, Faktor VIIa und Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex aus einer biologischen Probe, die diese Antigene enthält, kann mittels Immunoaffinitäts- Chromatographie vorgenommen werden, bei der die biologische Probe durch eine Immunadsorbens-Säule oder -Aufschlämmung geschickt wird, die die neuartigen monoklonalen Antikörper oder Antikörper-Fragmente dieser Erfindung in Bindung an einen feststofflichen Träger enthält, um dabei diese antigenen Ziele selektiv zu adsorbieren. Der Immunoassay von Faktor VII, Faktor VIIa und dem bimolekularen Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Konzentration dieser Ziel-Antigene in einer biologischen Probe, in der sie enthalten sind, kann durch Zusammenbringen dieser Probe mit einer bekannten Menge des neuartigen monoklonalen Antikörpers dieser Erfindung und Messen des resultierenden adsorbierten monoklonalen Antikörpers vorgenommen werden.
Bei Faktor VII handelt es sich um ein Vitamin K-abhängiges Zymogen der aktiven Serinprotease VIIa. Faktor VII dient der Bindung eines Komplexes mit Gewebefaktor im Blut und bildet bei Umwandlung zu VIIa den Komplex, der dann den Faktor X durch Umwandlung von Faktor X zu Faktor Xa aktiviert. Die prokoagulierende Aktivität ist lediglich mit dem Gewebefaktor: VIIa-Komplex assoziiert. Weder die freien Faktoren VII und VIIa noch der Gewebefaktor: Faktor VII-Komplex besitzen eine prokoagulierende Aktivität. Faktor VII besteht in einer einzelnen Polypeptidkette von etwa 15.000 Dalton, die in einem gereinigten System durch proteolytische Spaltung der Disulfid-Bindungen durch Faktor Xa, Faktor IXa, Thrombin und Faktor XIIa aktiviert werden kann. Takase, T. et al., "Monoclonal Antibodies to Human Factor VII: A One Step Immunoradiometric Assay for VIIag", J. Clin. Pathol., 41: 337- 341 (1988). Der Humanfaktor VII ergibt bei teilweiser oder vollständiger Aktivierung ein Protein, das aus zwei, durch Sulfid-Brücken verknüpfte Polypeptid-Ketten besteht. Faktor VII und VIIa können in dieser Schrift in austauschbarer Weise verwendet werden und werden als VII/VIIa bezeichnet, wenn die Ziel-Austauschbarkeit angegeben werden soll.
Mit dem Aufkommen der Hybridom-Technologie, die zuerst von Kohler und Milstein entwickelt wurde, ist es heute möglich, die Erzeugung monoklonaler Antikörper anzustreben, die im wesentlichen homogene Zusammensetzungen mit gleicher Affinität für eine bestimmte Bindungsstelle sind. Die Produktion von Mäuse- Hybridomen durch die vorliegenden Erfinder ist beschrieben in Nature, 256: 495-497 (1975) und Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976). Weitere Verfahrensweisen sind beschrieben bei Harlow, E., und Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory 1988). Gemäß der Hybridom-Methode werden einer Gewebekultur angepasste Mäuse-Myelom-Zellen mit Milzzellen aus immunisierten Mäusen verschmolzen, um die Hybrid-Zellen, genannt "Hybridome", zu erhalten, die große Mengen an einem einzelnen Antikörper-Molekül erzeugen. Allgemein wird den Tieren eine Antigen-Präparation injiziert, woraufhin dann, wenn sich eine angemessene humorale Reaktion im immunisierten Tier gezeigt hat, ein geeignetes Screening-Verfahren entwickelt wird. Die Seren aus den Testblutungen der immunisierten Tiere werden zur Entwicklung und Validierung des Screening-Verfahrens verwendet, woraufhin dann nach Festlegung eines wirksamen Screenings die eigentliche Erzeugung von Hybridomen in Angriff genommen wird. Mehrere Tage vor der Verschmelzung, die allgemein in Gegenwart von Polyethylenglycol durchgeführt wird, wie beschrieben bei Galfe et al. Nature, 266: 550-552 (1977), gefolgt von einer Auswahl in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin), wie beschrieben bei Littlefield, Science, 145: 709-710 (1964), erhalten die Tiere eine Auffrischung mit einer Probe der Antigen-Präparation. Für die Verschmelzung werden Antikörper-sekretierende Zellen von immunisierten Tieren präpariert, mit den Myelom-Zellen gemischt und vereinigt. Nach der Verschmelzung werden die Zellen in selektiven Medien verdünnt und in Multiwell-Kulturschalen ausgestrichen. Die Hybridome können schon etwa eine Woche nach der Verschmelzung testbereit sein, doch ist dies nicht unbedingt der Fall. Die Zellen aus positiven Wells werden gezüchtet, subkloniert und dann Einzelzellen kloniert.
Es ist so, dass die Hybridom-Produktion selten weniger als zwei Monate vom Beginn bis zum Abschluss erfordert und sogar über ein Jahr dauern kann. Die Erzeugung monoklonaler Antikörper wurde in drei Stufen beschrieben: (1) Immunisieren der Tiere, (2) Entwickeln des Screening-Verfahrens, und (3) Erzeugen der Hybridome. Es ist auch so, dass eine dieser Stufen sehr schnell verlaufen könnte, doch dass allen Probleme innewohnen. Zum Beispiel kann zwar die Immunisierung mit nahezu jedem Fremd-Antigen von Interesse vorgenommen werden, doch entstehen viele Schwierigkeiten und können Abwandlungen für einen spezifischen Fall erforderlich sein, um die gewünschten monoklonalen Antikörper zu erzeugen. Wird die Präparation eines gegebenen Hybridoms versucht, so gibt es keine Sicherheit darüber, ob das gewünschte Hybridom erhalten werden wird, dass es, sofern erhalten, Antikörper produzieren wird oder dass die so erzeugten Antikörper die gewünschte Spezifität oder Eigenschaften aufweisen werden. Harlow, E., und Lane, D., supra bei Kapitel 6.
Die Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen den Humanfaktor VII wurde berichtet, und es wird angegeben, dass diese Reagentien zur Herstellung immunabgereicherten Plasmas oder zum Nachweis von Faktor VII-kreuzreaktivem Material bei Faktor VII-defizienten Patienten verwendet wurde. Id. Die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Faktor VII für ihre Verwendung in einem einstufigen immunoradiometrischen Assay für Faktor VII:ag wurde ebenfalls berichtet. Id. Die Autoren berichteten von der Präparation dreier monoklonaler Maus-Antikörper, von denen zwei als bindungsfähig an Faktor VII:ag und zwei als in vitro-Hemmstoffe von Faktor VII angegeben wurden. Siehe auch Howard et al., J. Clin. Chem., 35: 1161 (1989). Es wurden keine monoklonalen Antikörper weder gegen Faktor VII noch gegen Faktor VIIa beschrieben, die die Bindung des Faktors VIIa an Gewebefaktor therapeutisch beeinflussen oder die Aktivität des Gewebefaktor/Faktor VIIa-Komplexes neutralisieren.
Higashi et al. (J. Biochem, 108 Nr. 4 (1990) 654-661) beschreiben monoklonale Antikörper, die gegen Rinder-Faktor IV gezüchtet wurden, welche Antikörper nicht mit Humanfaktor VII kreuzreagieren.
In WO-A91/07432, das Teil des Stands der Wissenschaft kraft Artikel 54 (3) und (4) EPC darstellt, sind neuartige Peptid-Reagenzien beschrieben, speziell Faktor VII- Peptide, und außerdem die Herstellung von Antikörpern gegen ausgewählte Peptide. Keiner der gegen die Humanfaktor VII-Peptide gezüchteten monoklonalen Antikörper scheint zur Bindung des Gewebefaktor: Faktor VII-Komplexes fähig zu sein.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neuartige monoklonal-artige Antikörper oder Antikörper-Fragmente bereitgestellt, die mittels rekombinanter Zelllinien oder mittels Hybridzelllinien erzeugt werden können, wobei die Antikörper dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine bestimmte, zuvor festgelegte Spezifität für bestimmte Ziele, d. h. Faktor VII, Faktor VIIa, den bimolekularen Komplex von Gewebefaktor und Faktor VIIa und für bestimmte epitope Regionen davon aufweisen und eine Neutralisationsfähigkeit in Kombination mit diesen Zielen besitzen. Dank ihrer Bindung an Faktoren VII und VIIa als kompetitive, nicht-funktionelle Surrogate des Gewebefaktors dienen sie als Antagonisten zur Neutralisierung der funktionellen Aktivierung der Koagulations-Protease-Kaskaden. Diese Antikörper sind zur Verhütung und therapeutischen Behandlung thrombotischer Bedingungen und verwandter Erkrankungen nützlich, bei denen die Aktivierung der obengenannten Koagulations-Protease-Kaskaden eine signifikante pathogene Rolle spielt. Bestimmte Antikörper sind außerdem bei Methoden zur Ausreinigung der Faktoren VII und VIIa und des bimolekularen Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes und im Immunoassay dieser Ziel-Antigene nützlich.
Demgemäß ist die vorliegende Zusammensetzung nützlich bei einem Verfahren zur Verhütung oder Behandlung einer Säugerspezies auf einen beginnenden oder existierenden thrombotischen Erkrankungszustand, der durch ein Mittel erleichtert werden würde, das selektiv die extrinsische Koagulationskaskade beeinflusst, welches Verfahren das Verabreichen an eine Säugerspezies, die einer solchen Behandlung bedarf, einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge eines Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex-Antagonisten umfasst. Die vorliegende Zusammensetzung ist nützlich in der Verhütung oder Behandlung thrombotischer Erkrankungszustände, einschließlich akuter disseminierter intravasaler Gerinnung, septischem Schock, Koronarthrombose, Organtransplantatabstoßung und tiefer Venenthrombose. Zu wirksamen Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex-Antagonisten zählen monoklonal-artige Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, mit den Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex-Antagonist- Eigenschaften der mittels der Hybridomzelllinie ATCC HB 10558 erzeugten Antikörpern. Die Erfindung stellt außerdem monoklonale Antikörper mit der Fähigkeit zur Komplexbildung mit der gesamten oder einem Teil der Schleifenregion des Faktor VII/VIIa-Moleküls, vorzugsweise der strukturellen Schleifenregion, die die Aminosäuren 195-208 auf dem Faktor VII/VIIa-Molekül umfasst.
Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die bei der Verhütung oder Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustandes nützlich sind, welche eine wirksame Menge eines Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex-Antagonisten umfassen. Diese Zusammensetzungen enthalten die oben genannten monoklonalen Antikörper und/oder monoklonalen Antikörper-Fragmente. Die Erfindung stellt außerdem im wesentlichen gereinigte und ganz gereinigte Präparationen monoklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörper-Fragmente bereit, die im wesentlichen die prokoagulierende Wirksamkeit des Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes hemmen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Hybridomzelllinien bereit, die die Erzeugung solcher monoklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörper-Fragmente ermöglichen. Verfahren zur Herstellung dieser Hybridomzelllinien sind ebenfalls hierin beschrieben und beansprucht, die das immunisieren einer Tierspezies mit einem Immunogen umfassen, dasein oder mehrere strukturelle Faktor VIIa- Schleifenregion-Peptide enthält.
Auch Verfahren zur Hemmung der prokoagufierenden Aktivität des Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes in vivo sind beschrieben, die die Verabreichung an eine Säugerspezies eines monoklonal-artigen Antikörpers oder Antikörper- Fragments umfassen, das spezifisch mit dem Komplex reagiert, doch den freien Faktor VIIa im wesentlichen nicht hemmt.
Der Faktor VIIa und der bimolekulare Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex, gegen den die monoklonal-artigen Antikörper dieser Erfindung Spezifität aufweisen, kann aus biologischen Proben in den hierin beschriebenen Verfahren isoliert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Zwar wird diese Beschreibung durch die Ansprüchen abgeschlossen, in denen der Gegenstand der vorliegenden Erfindung besonders hervorgehoben und deutlich beansprucht wird, doch gehen wir davon aus, daß die Erfindung aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen besser zu verstehen sein wird, worin:
Abb. 1 eine schematische Darstellung der Gerinnungskaskade zeigt, unterteilt in jene Sequenzen, die in der Oberflächen-(Kontakt)-Aktivierung, intrinsischen und extrinsischen Aktivierung und dem gemeinsamen Wegende beteiligt sind. Die durchgezogenen Linien zeigen die Direktaktivierung vom Vorläufer-Zymogen zum Enzym an; die gestrichelten Linien zeigen Wege sowohl des positiven als auch des negativen Feedback. PL steht für Phospholipid.
In Abb. 2 ist die Fähigkeit der 12D10-monoklonalen Antikörper und der 12D10 F(ab)- Fragmente gezeigt, die Gerinnung des recalcifizierten Humanplasmas in einem zweistufigen Prothrombin-Zeittest zu hemmen.
In Abb. 3 ist eine graphische Darstellung gezeigt, die die Plasma-PZ (Prothrombinzeit) und Faktor VII-koagulierende Aktivität im Zeitverlauf auf die intravenöse Verabreichung von 12D10 F(ab)-Fragment hin darstellt.
In Abb. 4 ist ein graphische Darstellung gezeigt, die die PZ und Faktor VIIkoagulierende Aktivität im Zeitverlauf auf die intravenöse Verabreichung von 12D10 F(ab)-Fragment hin zeigt.
In Abb. 5 ist eine graphische Darstellung gezeigt, die die PZ und das freie Faktor VIINlIa-Antigen im Zeitverlauf auf die intravenöse Verabreichung von 12D10 F(ab)- Fragment hin zeigt.
In Abb. 6 ist eine graphische Darstellung gezeigt, die die PZ und 12D10-Fab- Konzentration im Zeitverlauf auf die intravenöse Verabreichung von 12D10 F(ab)- Fragment hin zeigt.
In Abb. 7 ist eine graphische Darstellung gezeigt, die die PZ vor und nach Verabreichung des 12D10 F(ab) an einen einzelnen Schimpansen darstellt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie in Abb. 1 spezifisch gezeigt, kann die Blutgerinnung einsetzen, sobald der Hageman-Faktor (XII) eine Kontaktaktivierung erfährt und an die Oberflächen gebunden wird. Dieser Oberflächen-gebundene Faktor VII erfährt eine proteolytische Aktivierung durch Kallikrein (ka) in Gegenwart eines hochmolekularen Kininogens (HMW-K). Diese Oberflächen-Aktivierung (Kontaktsystem, intrinsischer Weg) scheint die Gerinnung in vitro auszulösen, doch wird nicht für einen relevanten in vivo- Mechanismus gehalten. Defizienzen bei diesem Weg (XII, Präkallikrein und HMWK) führen zu längeren in vitro-Gerinnungszeiten, doch bewirken keine hämostatischen Störungen.
Faktor XIIa stellt einen Arm einer Feedback-Schleife dar und aktiviert weiteres Ka aus Präkallikrein (Prä-K oder Fletcher-Faktor) in Gegenwart von HMW-K. Faktor XIIa aktiviert in Gegenwart von HMW-K auch Faktor XI. Faktor XIa vollzieht in Gegenwart von Ca²&spplus; eine proteolytische Aktivierung von Faktor IX zu IXa. Faktor VIII, Faktor IXa, Ca²&spplus; und Phospholipid-Mizellen (PL) aus Blutplättchen bilden einen Lipoprotein- Komplex mit Faktor X und führen zur Faktor-X-Aktivierung. Faktor V, Faktor Xa, Ca²&spplus; und PL bilden ebenfalls einen Lipoprotein-Komplex mit Faktor II oder Prothrombin und aktivieren es zu IIa oder Thrombin. Innerhalb von Sekunden spaltet Thrombin zwei kleine Peptid-Paare vom großen Fibrinogen-Molekül ab, gefolgt von einer schnellen, nicht-kovalenten Aggregation der löslichen Fibrin-Monomere. Faktor XIII, aktiviert durch Thrombin zu XIIIa, vernetzt die angrenzenden Fibrin-Monomeren zum Erhält des unlöslichen Fibrin-Pfropfen kovalent.
Es liegen bemerkenswert viele Beweise dafür vor, dass der Gewebefaktor die Gerinnung in der generalisierten Schwartzman-Reaktion (DIG) als Folge von Endotoxinämie auslöst. Kaplan, K. Coagulation Proteins in Thrombosis. In "Hemostasis and Thrombosis" (Colman, R. W., Hirsh, J., Marder, V. J., und Salzman, E. W.; Hrg.) 2. Aufl. J. B. Lippincott Co., S. 1098, 1987. Fibrin-Mikrothrombi werden durchgehend festgestellt bei fatalem DIG, und eine Thrombose der großen Arterien und Venen ist bei 40% aller Fälle feststellbar. Minna, J. D., Robboy, S. J., Colman, R. W. Disseminated Intravascular Coagulation in Man. C. C. Thomas, 1974.
Leukozyten sind unbedingt daran beteiligt und werden durch Endotoxin zu einem prokoagulierenden (thrombogenen) Zustand induziert, Semararo, N., et al., "Role of leukocyte procoagulant activity in endotoxin-induced DIC: Evidence from comparative studies in rats and rabbits." Aaents Actions 11: 646, 1981, 26, expressing tissue factor. Colucci, M., "Cultured human endothelial cells generate tissue factor in response to endotoxin." J. Clin. Invest. 73: 1893, 1983. Gleichzeitig werden auch Endothelzellen zum Exprimieren des Gewebefaktors, Auslösen der Gerinnung und Herabsetzung ihrer gerinnungshemmenden Eigenschaften induziert.
Moore, K. L., "Endotoxin enhances tissue factor and suppresses thrombomodulin expression of human vascular endothelium in vitro." J. Clin. Invest. 79: 124-130, 1987.
Die extrinsische Koagulationskaskade beginnt, wie derzeit betrachtet, mit der Bildung der [Gewebefaktor: VIII- und [Gewebefaktor: VIIa]-Komplexe auf der Oberfläche der Gewebefaktor-exprimierenden Zellen. Gewebefaktor wird normalerweise nicht durch Blutzellen oder vaskuläre Endothelzellen exprimiert, doch auf eine Stimulation mit LPS, TNFalpha oder IL-1 hin transkribieren oder exprimieren Endothelzellen dieses Molekül. Obschon weniger Moleküle des Gewebefaktors exprimiert werden, wird der Faktor VII gebunden und schnell zu Faktor VIIa durch eine Faktor Xa-Feedback- Aktivierung des gebundenen Faktors VII umgewandelt. Der Endothelzell-Faktor IX/IXa-Rezeptor (IX-R) und Faktor VIII (aktiviert zu Faktor Villa durch Xa oder Thrombin-Feedback) fördert die Kinetik der Faktor Xa-Erzeugung durch eingeschränkte proteolytische Aktivierung des Faktors X deutlich. Der Zelloberflächenassoziierte Faktor V (aktiviert durch Thrombin-Feedback) verstärkt den Vmax des Faktors Xa weiter und verhindert die Hemmung durch Plasmaheparin: AT-III- Protease-Inhibitor. Prothrombin wird zu Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin wirksam zu Thrombin umgewandelt, bewirkt die Freisetzung des Plasminogen aktivator-Inhibitors I, dient als ein chemotaktisches Mittel, aggregiert Blutplättchen, aktiviert den Mac-1-Rezeptor der Monozyten und zeigt weitere entzündliche Wirkungen.
Es gibt derzeit keine wirksamen Arzneistoffe zur Hemmung des extrinsischen Weges. Die Verwendung von Heparin, von der kein Nutzen gezeigt werden konnte, wird nichtsdestotrotz klinisch fortgesetzt, trotz der begleitenden Sekundärprobleme ihrer Blutplättchen-Wirkungen. Bei DIG mit seiner Abreicherung des Antithrombin III zeigt Heparin keinen Nutzen, da es kein direktes Antikoagulans ist, sondern lediglich ein Kofaktor für den Thrombin-Inhibitor Antithrombin III, wenn als ein [Heparin: Antithrombin-III]-Komplex vorhanden. Die Anti-Blutplättchen-Wirkstoffe hemmen die Koagulationsproteasekaskade nicht und vermindert die erforderlichen hämostatischen Eigenschaften der Blutplättchen. Eine Warfarin-Therapie zur Beeinflussung der Vitamin-K-geförderten Gamma-Carboxylierung der Faktoren VII, X, IX und des Prothrombins ist zu langsam und mit einer verminderten Aktivität der natürlichen Antikoagulationswege aufgrund der Hemmung der Gamma- Carboxylierung von Protein C und Protein S verbunden. Die vorliegende Erfindung ist auf diesen Bedarf gerichtet, indem der Reaktionsweg auf der frühestmöglichen Stufe, der Anregung des proteolytischen Komplexes von [Gewebefaktor: VIIa], gehemmt wird, was die intravasale Bewirkung der Gerinnung durch Gewebefaktorpositive Zellen, zum Beispiel Endothelzellen, Monozyten und Gewebefaktorpositive Schaumzellen in arteriosklerotischen Plaque, blockiert.
Die vorliegende Erfindung verwendet einen neutralisierenden Antagonist-Surrogat- Kofaktor, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper oder ein Antikörper- Fragment, zum funktionellen bimolekularen Anregungskomplex aus Gewebefaktor und VII/VIIa, und, bevorzugter, zu (einem) auf dem bimolekularen Gewebefaktor: VIIa-Komplex ausgelösten Neoantigen(en), oder alternativ dazu einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper zu VII oder VIIa, und vorzugsweise eine strukturelle Schleifenregion davon. Die Bindung dieser monoklonalen Antikörper an [Gewebefaktor: VIIa], um die Wirkstelle von VII/VIIa zu blockieren, trennt VIIa vom Gewebefaktor oder hemmt die Bindung der Substratserinprotease-Zymogene kompetitiv, woraufhin Faktoren X und IX die Gerinnung auf vaskulären Zellen hemmen und einen der wesentlichen pathogenen Prozesse bei thrombotischen Erkrankungen zum Stillstand bringen.
Obschon die Aktivierung der Gerinnung lange als zentral und für die Thrombusbildung und sein Wachstum als auch die disseminierte intravasale Gerinnung als erforderlich erachtet wurde, werden viele Mechanismen in Gang gesetzt, besonders in den virulentesten Formen des septischen Schocks. Es wurde gezeigt, dass monoklonale Antikörper zu TNFalpha dazu fähig sind, Paviane vor einem Endotoxinvermittelten septischen Schock zu schützen, Tracey K. J., "Anti-cachectinlTNFmonoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteraemia." Nature 330: 662, 1987, da TNFalpha durch Endotoxin, IL-1 und das Toxin 1 des toxischen Schocks ausgelöst wird. Michie, H. R., "Detection of circulating tumor necrosis factor after endotoxin administration." N. Eng. J. Med. 318: 1481, 1988, Jupin, C., et al., "Protein C prevents the coagulopathic and lethal effects of escherichia coli infusion in the baboon." J. Clin. Invest. 79 : 18, 1987. Allerdings können Anti-TNFalpha oder Anti- LPS-monoklonale Antikörper eine geringe Wirksamkeit zeigen, sobald der pathologische Prozess einmal eingesetzt hat. Vor kurzem wurde gezeigt, dass aktiviertes Protein C, das natürliche gerinnungshemmende Protein bei Gabe in hohen Dosen zum Aufhalten und sogar Umkehren des Frühstadiums eines septischen Schocks in der Lage ist. Taylor, F. B., "Protein C prevents the coagulopathic and lethal effects of Escherichia coli infusion in the baboon." J. Clin. Invest. 79: 918, 1987. Nun hat dieselbe Gruppe mit demselben Modell Beweise dafür vorgelegt, dass das Aufhalten der Koagulationsanregung mit monoklonalem Antikörper gegen Gewebefaktor bei der Behandlung von septischem Schock bei lethaler Herausforderung von Pavianen mit E. coli wirksam ist (Edgington, et al., "Tissue Factor: Molecular Biology and Significance in the Pathophysiology of Gram-Negative Septic Shock," In: Microbiological, Chemotherapeutical and Immunological Problems in Hiah Risk Patients. E. Garaci, et al., Hrg., Raven Press, New York, Bd. 61, S. 29-37 (1989). Eine zur Erzeugung von Anti-Protein-Antikörpern nützlich Methode umfasst die Verwendung synthetischer Peptide aus Regionen der Proteinsequenz, die an der Oberfläche des Proteins liegen, um das Protein zu züchten und/oder auf gewünschte Antikörper zu screenen. Im Falle des Faktors VIIa jedoch stehen keine experimen tellen Daten zur Struktur zur Verfügung. Lediglich die Aminosäure-Sequenz ist bekannt. Faktor VIIa weist eine gewisse Sequenz- und Strukturhomologie in seiner katalytischen Domäne mit verschiedenen anderen Proteasen auf, deren Strukturen mittels Röntgenstrahlen-Kristallographie bestimmt wurden. Die Sequenzen dieser Proteasen wurden analysiert und mit der Sequenz der katalytischen Domäne von Faktor VIIa verglichen. Es wurden Regionen des Faktor VIIa-Moleküls entdeckt, die sowohl in einer Struktur, die oftmals die Kernstruktur des Proteins darstellt, in hohem Maße konserviert waren, als auch in Regionen, die variabler waren. Die Regionen in der Sequenz mit variablen Strukturen, hierin als "Schleifen" bezeichnet, wurden auf der Oberfläche der katalytischen Domänen entdeckt.
Elf Schleifenregionen wurden in der Sequenz der katalytischen Domäne des Faktors VIIa identifiziert. Dazu zählen Peptide, umfassend die Aminosäuren 165-177, 195- 208, 209-218, 234-248, 248-258, 263-278, 285-295, 313-321, 330-339, 348-360 und 367-390. Ein Computer-Modell der Struktur der katalytischen Domäne des Faktors VIIa wurde konstruiert und der Sitz der strukturell variablen Schleifen bestimmt. Ein Schleifensatz wurde als nahe der katalytischen Stelle des Faktors VIIa lokalisiert entdeckt und ein anderer um die Aktivierungsstelle herum zusammengeballt, wobei verschiedene Proteasen die enzymatisch inaktive einzelkettige Form, Faktor VII, zur aktiven zweikettigen Form, Faktor VIIa, spalten.
Die Anti-Faktor VII/VIIa-Antikörper-Epitope, die für die Neutralisation angezielt wurden, wurden zur Erzeugung von Antikörpern verwendet, die anschließend zur Neutralisation oder Hemmung der Aktivität von Faktor VIIa durch Bindung an eine Schleifenregion bestimmt wurden. Befinden sich diese Schleifen nahe der Wirkstelle, so blockiert die Bindung dieser Antikörper den Zugang z. B. zu der Stelle durch Substrate wie Faktor X und hemmt dabei die Funktion des Faktors VIIa. In dieser Weise werden Antikörper hergestellt, die den extrinsischen Koagulationsweg blockieren.
Die Beschreibung der Hybridom-Präparation und anfängliche Charakterisierung der monoklonalen Antikörper gegen Faktor VII/VIIa und den Gewebefaktor: Faktor VIIa- Komplex ist im unten stehenden Beispiel 1 ausgeführt. Es werden Parameter beschrieben, die sich auf die Präparation des Antigens, die Dosis und Form des Antigens, den Weg der Beimpfung und das Immunisierungs-Protokoll, die Hybridom- Präparation und das Screening, die Isolierung und die anfängliche Charakterisierung der monoklonalen Antikörper beziehen. Die Eigenschaften eines monoklonalen Antikörpers, bezeichnet als 12D10 (ATCC HB 10558), sind angegeben und beschrieben. Es wurde gezeigt, dass der Antikörper den Faktor VII/VlIa bindet und die Aktivität des Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes enorm hemmt. Wie aus den Ergebnissen in Beispiel 2 zu ersehen, war der 12D10-Antikörper auch zur Hemmung der Aktivität des freien Faktors VIIa fähig. Der monoklonale 12D10-Antikörper wurde in Beispiel 3 als spezifisch für die Aminosäureregion 195-208 des Faktor VIINIIa- Moleküls gezeigt. Die in Beispiel 5 beschriebene Fragmentierung des 12D10- monoklonalen Antikörpers wurde darüber hinaus vorteilhafterweise als die gerinnungshemmende Aktivität nicht beeinträchtigend nachgewiesen.
Die Antikörper oder die gewünschten bindenden Abschnitte davon, einschließlich F(ab)- oder Fv-Fragmente, können ebenfalls unter Anwendung der Prozesse erzeugt werden, die das Klonieren einer lmmunglobulin-Genbank in vivo umfassen. Huse et al., "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246: 1275-1281 (8. Dezember 1989). Unter Anwendung dieser Methoden wird ein Vektor-System auf die PCR-Amplifikation der Messenger- RNA (mRNA) hin konstruiert, die aus Milzzellen mit Oligonukleotiden isoliert wurde, die Restriktionsstellen in die Enden des amplifizierten Produkts einbauen. Separate schwere Kette- und leichte Kette-Banken werden konstruiert und können zur gemeinsamen Exprimierung dieser Moleküle willkührlich miteinander kombiniert und auf die Antigen-Bindung gescreent werden. Es können auch einzelkettige Antikörper hergestellt und genutzt werden.
Auch weitere monoklonale Antikörper, die den bimolekularen Faktor VIIa/Gewebefaktor-Zelloberflächen-aktivierenden Komplex neutralisieren, können hergestellt und aus drei Klassen der antithrombotischen monoklonalen Antikörper ausgewählt werden. Die Spezifität der drei Klassen der Antikörper umfasst jene, die mit Faktor VII und VIIa reaktiv sind und die amidolytische Aktivität neutralisieren. Es werden zwei Untergruppen der Antikörper erzeugt. Eine hemmt die Faktor VIIa- Aktivität durch Verhütung der Zusammenlagerung von Gewebefaktor und Faktor VII/VIIa und der andere hemmt die Aktivität des Faktors VIIa direkt. Die zweite Klasse umfasst jene monoklonalen Antikörper, die lediglich mit Faktor VIIa reaktiv sind und die amidolytische Aktivität neutralisieren, wohingegen die dritte jene umfasst, die mit neutralisierenden Neoepitopen reaktiv sind, die als Folge der Zusammenlagerung von Gewebefaktor und Faktor VII exprimiert werden. Diese Neoepitope würden weder auf freiem Gewebefaktor noch auf Faktor VII exprimiert werden und sind daher auf den Gerinnungs-auslösenden Komplex beschränkt.
Jede der drei Klassen von Antikörpern stellt darüber hinaus einzigartige mechanistische Ansätze für die antithrombotische Therapie dar. Die Antikörper der ersten Klasse sind durch die Spezifität des 12D10-monoklonalen Antikörpers definiert. Die Antikörper der zweiten Spezifitäts-Klasse werden durch Immunisieren von Mäusen mit rekombinantem Faktor VIIa entwickelt. Jene monoklonalen Antikörper, die mit Faktor VIIa, doch nicht mit Faktor VII reagieren, werden ausgewählt. Das gewünschte Reagenz hemmt die Aktivität der zuvor gebildeten Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexe. Die auf dem funktionellen bimolekularen Komplex exprimierten Neoepitope sind die immunogenen Ziele für die Entwicklung monoklonaler Antikörper, die die Aktivität neutralisieren. Diese Antikörper werden mittels Durchführung einer in vitro-Immunisierung muriner Splenozyten unter Verwendung zuvor gebildeter Komplexe aus Gewebefaktor: Faktor VIIa in einer optimalen Umgebung von Phospholipiden präpariert. Die in vitro-Immunisierung ist aufgrund der proteolytisch labilen Beschaffenheit des Komplexes gegenüber in vivo bevorzugt; es kann jedoch auch eine standardmäßige in vivo-Immunisierung der heparinisierten Mäuse vorgenommen werden. Das Screening wird zur Identifizierung lediglich jener Antikörper eingesetzt, die mit dem Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplex reaktiv sind, gegenüber jenen, die entweder mit freiem Gewebefaktor oder Faktor VIIa reaktiv sind. Diese Antikörper hemmen lediglich die Gerinnung an der Stelle der Verletzung oder Aktivierung, wobei die normale Hämostase nicht beeinträchtigt wird.

Beispiel 1

Die Präparation von Hybridomen und die Identifizierung der gewünschten monoklonalen Antikörper war wie folgt: Weibliche balb/c-Mäuse wurden mit gereinigtem Humanfaktor VII (Faktor VII), der aus gepooltem Humanplasma über einen Zeitraum von etwa sechs Monaten hinweg isoliert worden war, immunisiert. Komplettes Freundsches Adjuvans wurde für die Primär-Immunisierung und inkomplettes Freundsches Adjuvans für die Booster-Immunisierung verwendet. Ein bis zehn Mikrogramm Protein wurden pro Immunisierung verwendet. Der Immunisierungsweg war sowohl intraperitoneal als auch subkutan. Drei Tage vor der Verschmelzung erhielten die Mäuse eine intravenöse Perfusions-Auffrischung an gereinigtem Faktor VII (20 ug) in Kochsalzlösung. Die Milzen wurden entfernt und die Milzzellen im Anschluss an standardmäßige Hybridom-Methoden mit dem SP210- Myelom vereinigt.
Die Screening-Strategie ging von einer dreistufigen Methodik aus. Mit dem Primär- Screening wurden Hybridom-Antikörper identifiziert, die mit Faktor VII- oder Faktor VIIa-Antigen reagierten. Mit dem Sekundär-Screening wurden Antikörper identifiziert, die zur Hemmung der funktionellen Aktivität des Faktor VIIa fähig waren, wie indirekt bei einem Faktor X-Aktivierungs-Assay mit chromogenem Substrat ausgewertet. Mit dem Tertiär-Screening wurde die Gerinnungshemmung von recalcifiziertem Plasma in einem zweistufigen Prothrombin-Zeittest ausgewertet.
Der Primär-Screening-Assay bestand in einem Radioimmunoassay, bei dem Antikörper auf ihre Bindung an ¹²&sup5;I-Faktor VII getestet wurden. Kurz umschrieben wurden 96-Well-Polyvinylchlorid-Mikrotiter-Platten passiv mit Affinitäts-gereinigtem Ziege-Anti-Maus-IgG, erhalten von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, eingestrichen. Die Antikörper-beschichteten Platten wurden mit Rinderalbumin blockiert, und die Kulturüberstände (mindestens 1 : 50 verdünnt) wurden an die Platten gebunden. Die Platten wurden zur Entfernung ungebundenen Antikörpers gewaschen, und im Anschluss an die Inkubation wurde ¹²&sup5;I-Faktor VII oder VIIa (100.000 cpm/Well; spezifische Aktivität des Faktors VII = 6 uCi/ug; spezifische Aktivität des Faktors VIIa = 4 uCi/ug) zugegeben. Die Platten wurden zur Entfernung von ungebundenem Faktor VII gewaschen und die Wells in einen Gammazähler zur Bestimmung des gebundenen markierten Faktor VII eingebracht. Die negativen Kontrollen umfassten Hybridom-Kulturüberstand aus einem Zeillinie-sekretierenden irrelevanten monoklonalen Antikörper, wie z. B. Anti-tPA, steriles Kulturmedium und Puffer. Die Kompetition der Bindung von ¹²&sup5;I-Faktor VII an Antikörper mit einer Überschussmenge an unmarkiertem Liganden wird zum weiteren Nachweis der Spezifität angewandt.
Das zweite Screening wurde zur Auswertung der Fähigkeit isolierter Antikörper eingesetzt, die Gewebefaktor-katalysierte Faktor-ViI-Aktivität zu hemmen, wie durch die Umwandlung von Faktor X zu Faktor Xa wiedergespiegelt. Die Humanblasenkarzinom-Zelllinie J-82 (ATCC HTB-1) exprimiert Zelloberflächen-gebundenen Gewebefaktor und wird als Quelle von Gewebefaktor und Phospholipiden verwendet. Ein chromogenes Substrat für Faktor Xa wird verwendet, das eine Farbe proportional zur Menge der Faktor VIIa-Aktivität entwickelt. Umgekehrt wird keine Farbe entwickelt, wenn die Faktor VII-Aktivität blockiert ist. Der Assay wird wie folgt durchgeführt. Die J-82-Zellen werden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung bei einer Konzentration von 1 · 10&sup5; Zellen pro ml suspendiert. 50 ul der Zellsuspension werden einzelnen Wells einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiter-Platte zugegeben. 50 ul des bei mindestens 1 : 10 verdünnten Hybridom-Kulturüberstands werden in geeignete Wells eingebracht, gefolgt von 25 ul an 20 mM CaCl&sub2;. Die negative Kontrolle ist ein irrelevanter Hybridom-Kulturüberstand (wie etwa Anti-tPA- Überstand) und die positive Kontrolle ist 1 uM PPACK (d-Phenylalanin-Prolin- Arginin-Chlormethylketon). 25 ul an 90 nM Faktor X und 50 ul des Substrats Spectrozym Xa wurden jedem Well zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird der OD-405 bestimmt. Die maximale Aktivierung (negative Kontrolle) wurde mit Proben erhalten, die mit Puffer oder irrelevantem Hybridom- Kulturüberstand behandelt wurden. Die vollständige Hemmung (positive Kontrolle), wie mit dem PPACK aus diesem Assay ausgewertet, ist in unten stehender Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Ergebnisse des Faktor X-Aktivierungs-Assays

Probenbehandlung OD-405
Puffer 1,101
Anti-tPA-Hybridom
Kulturüberstand 1,151
(1 : 10)
PPACK (1 uM) 0,023
Die Eigenschaften eines aus einem bevorzugten Hybridom, bezeichnet als 12D10, isolierten monoklonalen Antikörpers im Faktor VII/VIIa-Bindungs-Assay und im Faktor X-Aktivierungs-Assay sind in unten stehenden Tabellen 2 und 3 gezeigt. Tabelle 2: Identifizierung von Hybridom-Antikörper 12D10 in Faktor VII/VIIa-Antigen-Bindungs-Assay
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, dass der 12D10-monoklonale Antikörper sowohl mit Faktor VII- als auch Faktor VIIa-Antigen spezifisch reagiert.

Tabelle 3: Identifizierung der neutralisierenden Aktivität von Hybridom-Antikörper 12D1 0

Inhibitor Prozentuale Inhibition der F. X-Aktivierung
Puffer 0
Anti-tPA-monoklonaler Antikörper 3
PPACK (1 uM) 100
12D10 (1 : 10-Verdünnung) 100
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass der 12D10-monoklonale Antikörper die Aktivität des Gewebefaktor: Faktor VIIa-Komplexes hemmt.

Beispiel 2

Der Faktor X-Aktivierungs-Assay wurde zur Bestimmung des Mechanismus der Inhibition mittels des 12D10-monoklonalen Antikörpers eingesetzt. Die 1 : 50 verdünnten Hybridom-Kulturüberstände wurden entweder mit rF.7VIIa oder rF. VIIa (rF.7Vl 1a und rF. VIIa steht für eine rekombinante Quelle eines spezifischen Moleküls) vorinkubiert, das an zellulären Gewebefaktor, welcher an der Oberfläche der J-82-Zellen exprimiert wurde, vorkomplexiert wurde. Die Antikörper-Inkubationen erfolgten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Wirksamkeit der Antikörper- Blockierung wurde im Faktor X-Aktivierungs-Assay ausgewertet. Die Kontrollen enthielten irrelevanten Hybridom-Antikörper (Anti-tPA) und einen monoklonalen Antikörper zu Faktor VIIa, der für seine verhütende Wirkung auf die Anlagerung von Gewebefaktor an Faktor VIIa bekannt ist, doch die Aktivität nach der Komplexbildung nicht hemmt (Mab 1296). Die optimale Spezifität für einen antithrombotischen monoklonalen Antikörper ist eine solche, die den zellulären Komplex aus Gewebefaktor und Faktor VIIa hemmt. Die Ergebnisse aus diesem Experiment sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: Mechanismus der Inhibition von F. VIIa durch den Hybridom-Antikörper 12D10
Diese Ergebnisse demonstrieren die Fähigkeit des monoklonalen Antikörpers 12D10 zur Hemmung der Aktivität sowohl des freien Faktors VIIa als auch der zellulären Komplexe von Gewebefaktor und Faktor VIIa, eine wichtige Eigenschaft des beschriebenen therapeutischen Antikoagulans.

Beispiel 3

Die detailierte Spezifität des 12D10-monoklonalen Antikörpers wurde wie folgt ausgewertet. Eine Reihe synthetischer Peptide, die die linearen Sequenzen aus den beiden gla-Domänen, EGF-Domänen, der leichten Kette und der katalytischen Stelle des Faktors VIIa darstellen, wurde auf ihre Reaktivität mit dem 12D10-monoklonalen Antikörper getestet. Das Experiment wurde durch Beschichten von Mikrotiter-Wells mit 12D10-monoklonalen Antikörper und Umsetzen des Einfang-Antikörpers mit 25 ul einer 100 uM Lösung des angegebenen Peptids über 30 Min. hinweg bei 37ºC durchgeführt. Im Anschluss an diese Inkubation wurden 25 ul an 1 nM ¹²&sup5;I-Faktor VIIa jedem Well 1 Std. lang bei Raumtemperatur zugegeben. Die Wells wurden gewaschen und der gebundene ¹²&sup5;I-Faktor Vlia bestimmt. Das Faktor VIIa-Peptid, enthaltend Aminosäure-Reste 195-208, verhinderte die Bindung des 12D10- monoklonalen Antikörpers an ¹²&sup5;I-Faktor VIIa.
Dieses Ergebnis wurde durch die direkte Bindung des 12D10-monoklonalen Antikörpers an das Faktor VIIa-Peptid 195-208 bestätigt. Die Peptide wurden an Mikrotiter-Wells bei einer Konzentration von 1 mg pro ml bei 37ºC über 2 Std. hinweg adsorbiert. Die Wells wurden mit Albumin blockiert und mit 12D10-monoklonalem Antikörper (10 ug pro ml) über 2 Std. hinweg bei 37ºC umgesetzt. Ziege-Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat wurde zum Nachweis des gebundenen monoklonalen Antikörpers verwendet, gefolgt von einer Substrat-Entwicklung und Bestimmung von OD-450. Die Peptide, die gla- (2 Peptide), EGF- (8 Peptide), leichte Ketten- (2 Peptide) und katalytische (11 Peptide) Domänen darstellten, wurden getestet. Die Peptide der katalytischen Domäne 195-208 banden den 12D10-monoklonalen Antikörper (OD-450 = 0,450), während alle anderen negativ waren (OD-450 < 0,042). Die Spezifität des 12D10-monoklonalen Antikörpers für die katalytische Domäne von Faktor VIIa stimmt mit unserer Entdeckung überein, dass der Antikörper an VIIA vor und nach Reaktion mit dem Gewebefaktor: VII-Komplex bindet.

Beispiel 4

Die Charakterisierung der Aktivität von F(ab)-Fragmenten des 12D10-Antikörpers wurde wie folgt durchgeführt. Die Erzeugung von F(ab)-Fragmenten des 12D10- monoklonalen Antikörpers wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Bioprobe International Tustin, CA) erreicht. Die F(ab)-Fragmente wurden durch Papain-Spaltung von IgG präpariert. Das Papain wird gehemmt und durch Zugabe eines Anti-Papain-polyklonalen Antikörpers entfernt. Eine Protein-A-Chromatographie wird zum Auftrennen von Fc-Fragmenten, intaktem IgG und Papainenthaltenden Immunkomplexen eingesetzt. Die F(ab)-Fragmente wurden weiter gereinigt durch Größenausschluss-Chromatographie unter Verwendung einer Superose 12-Säule. Der monoklonale Antikörper 12D10 wurde, gereinigt wie oben beschrieben, vor und nach der Papain-Verdauung analysiert. Die resultierende Reinheit des 12D10-IgG und F(ab)-Fragmente betrug etwa 95%. Die Aktivität dieser F(ab)-Fragmente wurde zu intaktem 12D10-IgG sowohl im Faktor X-Aktivierungs- Assay als auch im Gerinnungs-Inhibitions-Assay verglichen. Die Analyse von 12D10- IgG und F(ab)-Fragmenten im Faktor X-Aktivierungs-Assay wurde wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass wahlweise relipidierter rekombinanter Humangewebefaktor für J-82-Zellen als Quelle des Gewebefaktors substituiert wurde. Diese Modifikation erhöht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Assays und erleichtert die erforderliche Durchführung von Zellkulturen zum Erhalt von J-82-Zellen. Bei diesen Experimenten wurde Faktor VII über 30 Min. hinweg bei Raumtemperatur mit dem 12D10-IgG oder F(ab)-Fragment vor Einführung der Immunkomplexe in die Faktor X-Aktivierungs- oder Gerinnungs-Assays vorinkubiert. Tabelle 5: Inhibition der F. X-Aktivierung mit 12D10-lciG und F(ab)
Diese in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zeigen auf, dass die Fragmentierung des 12D10-Antikörpers nicht zu einem Verlust der biologischen Aktivität führte. Die Aktivität von IgG und F(ab)-Fragmenten waren unter diesen experimentellen Bedingungen im wesentlichen identisch. Die Wirksamkeit des 12D10-Antikörpers ist aus diesem Ergebnis offensichtlich, da eine Hemmung bei einem 1 : 1-molaren Verhältnis von Antikörper-Stelle zu Enzym beobachtbar ist. Die Hemmung des Faktor X-Aktivierüngs-Assays bei Verhältnissen von Faktor VIIa zu monoklonalem Antikörper von weniger als 1 lässt sich durch die Tatsache erklären, dass die Assay- Auslesung eine extreme Amplifikation der in der Probe vorliegenden restlichen (ungehemmten) Menge der Faktor-VIIa-Aktivität ist.

Beispiel 5

Der 12D10-monoklonale Antikörper hemmt die Gerinnung des recalcifizierten Humanplasmas in einem zweistufigen Prothrombin-Zeittest. Die Wirkung des F(ab)- Fragmentierungs-Prozesses auf diese Eigenschaft wurde wie folgt analysiert. Das Plasma wurde 1 : 2 mit 2 mM Natriumcitrat verdünnt. IgG oder F(ab) wurde bei den angegebenen Konzentrationen (50 ul) zu 100 ul verdünntem Plasma zugegeben und eine Inkubation bei Raumtemperatur über 20 Min. hinweg vorgenommen. Humanes Thromboplastin (Thromborel S. Behring Diagnostics) wurde 1 : 1000 in 30 mM CaCl&sub2; verdünnt und 200 ul der Plasma/Antikörper-Lösung zugegeben.
Die Gerinnungszeiten wurden in einem optischen Coagamat-Koagulometer (Organon Technica) bestimmt. Die Gerinnungszeiten wurden zur prozentualen Gewebefaktor-Aktivität mittels eines zuvor beschriebenen Algorithmus umgerechnet, Hvatum, M. und Prydz, H. Studies on Tissue Thromboplastin. Solubilization with Sodium Dioxycholate. Biochem. Biophys. Acta. 130 : 92-101 (1966). Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass das 12D10 F(ab)- Fragment ein wirksamer Inhibitor der Gerinnung von Humanplasma ist.

Beispiel 6

Der 12D10-monoklonale Antikörper senkt die Menge an freiem Faktor VII/VIIa- Antigen auf die in vivo- Verabreichung an einen Schimpansen hin. Solche eine verminderte Menge an diesen Antigenen wird über Zeiträume von mehr als 1 Std., und in einigen Fällen von über 5 oder sogar 10 Stunden hinweg aufrechterhalten. Das F(ab)-Fragment des 12D10-monoklonalen Antikörpers wurde an Schimpansen zur Auswertung der Pharmakokinetik, systemischen Antikoagulans-Wirkung und beschränkten Toxizität verabreicht. Drei normale erwachsene Schimpansen (45-55 kg) wurden für die Studie ausgewählt. Alle Tiere wurden einer physischen Untersuchung durch einen Veterinär unterzogen, einschließlich von großem Blutbild (CBC), Serumchemie-Screening, Fäzes-Untersuchung (Ovozyten und Parasiten) und Hepatitis-serologischen Screenings. Die Parameter der Hämatologie, Koagulation und klinischen Chemie wurden getestet und als im Normalbereich befindlich nachgewiesen. Es wurden Tiere ausgewählt, die zuvor keine murinen Proteine erhalten hatten und die Schimpansen-Anti-Maus-Antikörper (CHAMA)- negativ waren.
Die Tiere wurden vor den Manipulationen intermittierend mit Ketamin anästhesiert. Zu Anfang wurden fünf Dosen zur Verabreichung ausgewählt. Die Dosen, die die Prothrombin-Zeit verlängerten, wurden bei zwei weiteren Schimpansen wiederholt. Plasmaproben wurden bei -15, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1440 und 2880 Minuten nach Verabreichung zur Auswertung der hämatologischen, physiologischen und Koagulations-Parameter genommen. Die Studie erstreckte sich über fünf Wochen bei insgesamt 16 Injektionen des 12D10-Fab-Fragments. Es wurden keine sofort beobachtbaren Nebenwirkungen festgestellt; allerdings waren einige Hämatom- Bildungen und Rückblutungen an der Stelle der Ketamin-Injektion bei den höheren Dosen beobachtbar.
Die Verabreichung von geringen Mengen (0,0023-0,0058 mg pro kg) zeigte keine offensichtliche Wirkungen auf die PZ oder die Faktor-VII-Aktivität (beide unter Anwendung standardmäßiger Assays gemessen). In Abb. 3 ist veranschaulicht, dass die PZ-Werte und Faktor-VII-koagulierende Aktivität nach Injektion einer Dosis von 0,0035 mg/kg des 12D10-F(ab)-Fragments im wesentlichen konstant blieben.
Der Grenzwert für die Beobachtung der systemischen Wirkung lag bei einer Dosis von 0,04 mg pro kg. Bei dieser Dosierungsmenge war die Prothrombinzeit auf mehr als 30 Sek. verlängert, bei gleichzeitiger Verminderung der Faktor-VIIkoagulierenden Aktivität und des freien Faktor VII/VIIa-Antigens auf weniger als 10% bzw. weniger als 10 ng pro ml.
Die systemische Wirkung des 12D10-F(ab)-Fragments auf die Koagulations- Parameter wurde an einem Schimpansen beobachtet, dem 0,0547 mg/kg an 12D10- F(ab)-Fragment intravenös infundiert worden waren. In Abb. 4 ist der schnelle Anstieg der Plasma-PZ-Werte in der gleichzeitigen Abnahme der Faktor-VIIa koagulierenden Aktivität wiedergespiegelt. Die Abnahme der freier Faktor-VIINIIa- Antigen-Menge ist in Abb. 5 gezeigt.
Mit abnehmenden Mengen des Faktor VII/VIIa-Antigens und Faktor VII-Koagulans stiegen die Plasmamengen an 12D10-F(ab)-Fragment, parallel zu den PZ-Werten, über den Verlauf der Studie enorm an. Die Plasma-F(ab)-Fragment-Mengen schienen direkt mit den Plasma-PZ-Werten und umgekehrt mit den Faktor VIINIIa- Antigen-Mengen zu korrelieren. Das Plasma-F(ab)-Fragment erreichte eine Spitzenkonzentration innerhalb der ersten 15 Minuten nach Injektion. Die Veränderung bei den Plasmamengen von 12D10-F(ab)-Fragment ist in Abb. 6 gezeigt.
In Abb. 7 wird ein Bereich an Dosierungen verglichen, die einem einzelnen Schimpansen verabreicht wurden. Die Reaktionsdauer stieg mit zunehmender Dosierungsmenge. Die Reaktionsdauer bei der Menge 0,1 mg pro kg war annähernd doppelt so lange wie bei der Dosierungsmenge 0,0547 mg pro kg. Eine Dosis- Eskalations-Wirkung ist auch aus diesen Daten ersichtlich. Der Grenzwert bei diesem Tier scheint etwa 0,04 mg/kg an 12D10-F(ab)-Fragment zu sein.
Weitere Ausführungsformen finden sich in den nachfolgenden Ansprüchen.

Claims

1. Zusammensetzung, die zur Verhütung oder Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustandes nützlich ist, welche eine wirksame Menge eines Antikörpers oder Antikörper-Derivats umfaßt, der gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit zum Binden von freiem Humanfaktor VII, freiem Humanfaktor VIIA und des Humanfaktor VIIa: Gewebefaktor-Komplex' und außerdem gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit, ein Antagonist des freien Humanfaktors VIIa und des Humanfaktors VIIa: Gewebefaktor-Komplex' zu sein.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper die antagonistische Aktivität gegenüber Humanfaktor VIIa: Gewebefaktor-Komplex aufweist, die charakteristisch für den monoklonalen Antikörper 12D10 ist (gewinnbar aus ATCC HB 10558).

3. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Antikörper-Derivat ein monoklonales Antikörper-Fragment ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das monoklonale Antikörper- Fragment ein F(ab) oder ein Fv-Fragment ist.

5. Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die außerdem einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfaßt.

6. Wesentlich gereinigte Präparation eines monoklonalen Antikörpers oder Antikörper-Fragments, der gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit zum Binden von freiem HumanfaktorVII, freiem Humanfaktor VIIa und des Humanfaktor VIIa: Gewebefaktor-Komplex' und außerdem gekennzeichnet ist durch die Fähigkeit, ein Antagonist des freien Humanfaktors VIIa und des Humanfaktors VIIa: Gewebefaktor-Komplex' zu sein.

7. Präparation nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper eine antagonistische Aktivität gegenüber Humanfaktor VIIa: Gewebefaktor-Komplex aufweist, die charakteristisch für den monoklonalen Antikörper 12D10 ist (gewinnbar aus ATCC HB 10558).

8. Präparation nach Anspruch 6 oder 7, wobei das monoklonale Antikörper- Fragment ein F(ab)-Fragment des monoklonalen Antikörpers 12D10 ist (gewinnbar aus ATCC HB 10558).

9. Monoklonaler Antikörper 12D10 (gewinnbar aus ATCC HB 10558).

10. Pharmazeutische Präparation, umfassend eine wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers oder Fragments davon, wie in einem der Ansprüche 6 bis 9 definiert, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger.

11. Hybridomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie Antikörper produziert, wie in Anspruch 7 definiert.

12. Hybridomzellinie ATCC HB 10558.

13. Verfahren zum Produzieren einer Hybridomzellinie, die Antikörper sekretiert, welche gekennzeichnet sind durch die Fähigkeit zum Binden von freiem Humanfaktor VII, freiem Humanfaktor VIIa und des Humanfaktor VIIa: Gewebefaktor-Komplex' und außerdem gekennzeichnet sind durch die Fähigkeit, Antagonisten des freien Humanfaktors VIIa und des Humanfaktors VIla: Gewebefaktor-Komplex' zu sein, welches Verfahren außerdem die Immunisierung einer Tierspezies mit einem Immunogen beinhaltet, umfassend ein oder mehrere Faktor VII oder Faktor VIIa-Schleifenregion-Polypeptide.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Schleifenregion aus Aminosäuren 165- 177, 195-208, 209-218, 234-248, 263-278, 285-295, 313-321, 330-339, 348-360 oder 367-390 des Faktor-VII/VIIa-Moleküls besteht.

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, oder eine Präparation nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder ein Antikörper, gewinnbar durch die Methode nach Anspruch 13 oder 14, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des Säugerkörpers.

16. Zusammensetzung, Präparation oder Antikörper zur Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Säugerkörper auf akute disseminierte intravasale Koagulation, septischen Schock, Koronarthrombose, Organtransplantatabstoßung oder tiefe Venenthrombose hin behandelt wird.