DE68919361T2

DE68919361T2 - Therapeutische zusammensetzungen für die behandlung von myocard-infarkten.

Info

Publication number: DE68919361T2
Application number: DE68919361T
Authority: DE
Inventors: Donogh O'brien; Gordon Vehar; Josiah Wilcox
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-06-21
Filing date: 1989-06-14
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2009-06-15
Also published as: WO1989012463A1; EP0420937B1; JPH03505329A; DE68919361D1; ATE113846T1; JP2749167B2; CA1340633C; EP0420937A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Myokardinfarkt und spezieller Zusammensetzungen zur Verwendung bei einer Therapie, die zur Verhinderung der Reokklusion einer Koronararterie tauglich ist, die oft die Verwendung von thrombolytischen Wirkstoffen bei der Behandlung von Myokardinfarkt begleitet. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von Gewebefaktorproteinantagonisten und thromobolytischer Wirkstoffe bei der Herstellung therapeutischer Zusammensetzungen.
Das initiierende Ereignis von vielen Myokardinfarkten (Herzattacken) ist die Blutung zu einer atherosklerotischen Plaque. Solche Blutung führt oftmals zur Bildung eines Thrombus (oder Blutgerinnsels) in der Koronararterie, welche die Infarktzone (d.h. ein Nekrosegebiet, das von einer Behinderung des Blutflusses herrührt) beliefert. Dieser Thrombus ist zusammengesetzt aus einer Kombination von Fibrin und Blutplättchen. Die Bildung eines Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsels hat ernsthafte klinische Folgen. Das Ausmaß und die Dauer der Okklusion bzw. Verstopfung, die durch das Fibrin- Blutplättchen-Gerinnsel verursacht wird, bestimmt die Masse der Infarktzone und das Ausmaß der Schädigung.
Das primäre Ziel der gegenwärtigen Behandlung von Myokardinfarkt schließt die rasche Auflösung des verstopfenden Thrombus und die Wiederherstellung des Blutflusses ("Reperfusion") ein. Eine erfolgreiche Therapie muß tauglich sein, das Fibrin- Blutplättchen-Gerinnsel auf eine Weise zu beseitigen, die seine Neubildung nach Aufhören der Therapie verhindert. Wenn das Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel imstande ist, sich erneut zu bilden, dann wird die betroffene Arterie erneut verstopft.
Die Bildung von Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel in anderen Teilen des Kreislaufsystems kann durch die Verwendung von Antikoagulantien (wie zum Beispiel Heparin) teilweise verhindert werden. Leider wurde Heparin als nicht universell wirksam bei der Verhinderung von Reokklusion bei Myokardinfarkt-Patienten erkannt, bei denen das Ausmaß der Blutgefäßokklusion (der "Stenose"grad) größer oder gleich 70% ist, insbesondere bei jenen Patienten mit ernstnafter bleibender Koronarstenose.
Wenn ein Individuum ein Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel gebildet hat, kann das Gerinnsel durch die Anwendung von thrombolytischen Wirkstoffen aufgelöst werden. Ein thrombolytischer Wirkstoff ist ein Arzneimittel, das zur Lyse des Fibrin- Blutplättchen-Thrombus tauglich ist und dadurch ermöglicht, daß das Blut wieder durch das betroffene Blutgefäß fließt. Solche Wirkstoffe umfassen Streptokinase, Prourokinase, Urokinase und Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (Ganz,W. et al.,J.Amer.Coll.Cardiol.1:1247-1253 [1983];Rentrop,K.P. et al., Amer.J:Gardiol.54:29E- 31E [1984]; Gold,H.K. et al., Amer.J.Cardiol. 53:122C-125G [1984]).
Die Behandlung mit thrombolytischen Wirkstoffen kann oftmals erfolgreich den Koronarblutfluß rasch genug wiederherstellen, um den Myokardinfarkt zu unterbrechen. Es wurde entdeckt, daß das aufgelöste Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel bei mehreren Patienten sich nach dem Aufhören einer solchen thrombolytischen Therapie unglücklicherweise erneut bildet. Diese Neubildung kann zur Reokklusion bzw. erneuten Verstopfung der betroffenen Blutgefäße führen und ist daher von wesentlicher Bedeutung (Gold,H.K.et.al.,oben; Gold, H.K.et.al., Circulation, 68:150-154 [1983]. Obwohl die Streptokinase-Behandlung als erfolgreich beim Auflösen von Fibrin- Gerinnseln ermittelt wurde,ist daher eine Reokklusion der betroffenen Gefäße als bei ungefähr 25% der untersuchten Patienten auftretend festgestellt worden (Gold,H.K.,et al.,Circulation 68:150-154 [1983]).
Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) ist ein wünschenswerterer thrombolytischer Wirkstoff sowohl als Streptokinase als auch Urokinase, weil er mehr (obgleich nicht absolute) Spezifität für Fibrin zeigt als jeder dieser beiden Wirkstoffe. (Verstrate, M., et al., Lancet 1:142 [1985]). Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) ist ein Gerinnsel-spezifischer thrombolytischer Wirkstoff mit einer schnellen Dispositionsrate aus Plasma. Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA) wurde als ein effektiver thrombolytischer Wirkstoff bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt ermiuelt, der erneuten Koronarfluß bewirkt (d.h. Stenose verringert) in 45-75 Minuten bei ungefähr 70% der untersuchten Patienten (Gold, H.K. et al., Circulation 73:347-352 [1986]).
Plasminogenaktivator vom Gewebetyp wird als Infusion mit einer Dosis von ungefähr 1- 2 mg/kg Patientengewicht verabreicht. Der Nutzen der Verwendung von t-PA wird deutlich aufgehoben durch die spontane Rate akuter Reokklusion, die der Einstellung der t-PA-Therapie folgt. Es wurde beobachtet, daß die Einstellung der t-PA-Therapie zu einer Reokklusion der betroffenen Blutgefäße bei etwa 45% der untersuchten Patienten führt (Circulation 73: 347-352 [1986]). Es wurde nicht festgestellt, daß erhöhte t-PA- Dosierungen die Neigung zur Herzkranzarterienreokklusion verringern. Es ist von Bedeutung, daß die Möglichkeit der Neubildung von Thrombingerinnseln in engem Zusammenhang mit dem Ausmaß der Rest-Koronarstenose steht (d.h. dem Ausmaß der Blutgefäßverengung). Somit ist die Reokklusion bei jenen Personen wahrscheinlicher, bei denen hochgradige Stenose (d.h. mehr als 70% quantitative Stenose oder mehr als 80% nicht-quantitative Stenose) auftrat. Es wurde festgestellt, daß die Reokklusion von Blutgefäßen durch fortgesetzte Infusion von t-PA gehemmt wird (Gold, H.K. et al., Circulation 73: 347-352 [1986]). Es handelt sich dabei um eine nicht gerade optimale Behandlung, da es zu einer Blutgefäß-Reokklusion kommt, sobald die Infusion eingestellt wird.
Der allgemeine Mechanismus der Bildung von Blutgerinnseln wird durch Ganong, W.F (in: Review of Medical Physiology, 9.Ausg., Lange, Los Altos, CA, S. 411-414 [1979]) besprochen. Die Blutkoagulation erfüllt zwei Funktionen: die Herstellung von Thrombin, das die Blutplättchenaggregation induziert und die Bildung von Fibrin, das den Blutplättchenpfropfen stabiler macht. Eine Anzahl von diskreten Proenzymen und Pro-Cofaktoren, die als "Koagulationsfaktoren" bezeichnet werden, sind im Koagulationsvorgang beteiligt. Der Vorgang besteht aus mehreren Stufen und endet mit der Fibrinbildung. Fibrinogen wird durch die Wirkung von Thrombin zu Fibrin umgewandelt. Thrombin bildet sich durch proteolytische Spaltung eines Proenzyms, Prothrombin. Diese Proteolyse wird durch einen aktivierten Faktor X (als Faktor X&sub3; bezeichnet) bewirkt, der sich an die Oberfläche der aktivierten Blutplättchen bindet und in Gegenwart von Va und ionischem Kalzium Prothrombin spaltet.
Die Aktivierung von Faktor X kann in einer von zwei voneinander getrennten Weisen erfolgen - auf extrinsischem oder auf intrinsischem Wege. Die intrinsische Kaskade besteht aus einer Reihe von Reaktionen, worin ein Proteinvorläufer gespalten wird, um eine aktive Protease zu bilden. Bei jedem Schritt katalysiert die neu gebildete Protease die Aktivierung einer weiteren Protease im nachfolgenden Schritt der Kaskade. Ein Mangel an irgendeinem der Proteine in diesem Weg blockiert den Aktivierungsprozeß in diesem Schritt, wodurch die Bildung von Blutgerinnseln verhindert wird und eine Blutungsneigung entsteht. Ein Mangel an Faktor VIII oder Faktor X bewirkt z.B. die schweren Blutungssyndrome Hämophilie A bzw. B. Im extrinsischen Weg der Blutkoagulation wird Gewebefaktor, der auch als Gewebe-Thromboplastin bezeichnet wird, aus beschädigten Zellen freigesetzt und fördert Faktor X in Gegenwart von Faktor VII und Kalzium. Obwohl man ursprünglich annahm, daß die Aktivierung von Faktor X die einzige durch Gewebefaktor und Faktor VII katalysierte Reaktion ist, weiß man heute, daß eine Verstärkungsschleife zwischen Faktor X, Faktor VII und Faktor IX besteht (Osterud, B., und S.I. Rapaport, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74:5260-5264, 1977; Zur, M. et al, Blood 52: 198, 1978). Jede der Serinproteasen in diesem Schema kann durch Proteolyse die anderen zwei in die aktivierte Form umwandeln, wodurch das Signal in diesem Stadium des Koagulationsprozesses verstärkt wird (Fig.2). Man ist heute der Ansicht, daß der extrinsische Weg tatsächlich der physiologische Hauptweg der normalen Blutkoagulation sein kann (Haemostasis 13: 150-155 1983). Da Gewebefaktor normalerweise nicht im Blut vorhanden ist, gerinnt das System nicht kontinuierlich. Der Koagulationsauslöser wäre daher die Freisetzung oder das Aussetzen von Gewebefaktor aus beschädigtem Gewebe, z.B. atherosklerotische Plaque.
Gewebefaktor ist ein integrales Membranglykoproten, das, wie vorstehend diskutiert, die Blutkoagulation über den extrinsischen Weg auslösen kann. Bach, R. et al., J.Biol.Chem. 256 (16), 8324-8331 (1981). Gewebefaktor besteht aus einer Proteinkomponente (früher als Gewebefaktorapoprotein-III bezeichnet) und einem Phospholipid. Osterud, B und Rapaport, S.I., PNAS 74, 5260-5264 (1977). Es wurde festgestellt, daß der Komplex auf den Membranen von Monozyten und verschiedenen Zellen der Blutgefäßwand vorhanden ist. Osterud, B., Scand.J.Haematol. 32, 337-345 1984). Gewebefaktor aus verschiedenen Organen und Spezien weist, wie berichtet wurde, eine relative Molekularmasse von 42.000 bis 53.000 auf. Menschliches Gewebethromboplastin besteht gemäß Beschreibungen aus Gewebefaktorprotein, das in eine Phospholipidbischicht in einem optimalen Verhältnis von Gewebefaktorprotein Phospholipid von etwa 1:80 eingefügt ist. Lyberg, T. und Prydz, H. Nouv.Rev.Fr.Hematol. 25 (5), 291-293 (1983). Über die Reinigung von Gewebefaktor aus verschiedenen Geweben wurde berichtet: aus dem menschlichen Gehirn (Guha, A. et al., PNAS 83, 299-302 [1986] und Broze, G.H. et al., J.Biol.Chem. 260 (20), 10917- 10920 [1985]); aus Rinderhirn (Bach, R. et al., J.Biol.Chem. 256, 8324-8331 [1981]); aus menschlicher Plazenta (Bom, V.J.J. et al., Thrombosis Res. 42: 635-643 [1986]); und Andoh, K. et al., Thrombosis Res. 43: 275-286 [1986]); aus Schafhirn (Carlsen, E. et al., Thromb.Haemostas. 48 (3), 315-319 [1982]); und aus der Lunge (Glas, P. und Astrup, T., Am.J.Physiol. 219, 1140-1146 [1970]). Es wurde gezeigt, daß Rinder- und Humangewebethromboplastin hinsichtlich der Größe und Funktion identisch sind. Siehe z.B. Broze, G.H. et al., J.Biol.Chem. 260 (20), 10917-10920 (1985). Es herrscht weitgehend Übereinstimmung, daß es zwar bezüglich der Struktur von Gewebefaktorprotein unter den Spezien Unterschiede gibt, daß aber keine durch in vitro-Koagulationsassays gemessene Unterschiede festzustellen sind. Cuha et al, oben. Weiters war Gewebefaktor, der aus verschiedenen Geweben eines Tieres, z.B. aus einem Hundegehirn, der Lunge, Arterien und Venen isoliert wurde, in gewisser Hinsicht ähnlich, z.B. bezüglich des Extinktionskoeffizienten, des Stickstoff- und Phosphorgehaltes und des optimalen Phospholipid zu Lipid-Verhältnisses, doch wies er bezüglich der Molekulargröße, des Aminosäuregehalts, der Reaktivität mit Antikörpern und der Plasma-Halbwertszeit geringe Unterschiede auf. Gonmori, H. und Takeda. Y., J.Physiol. 229 (3), 618-626 (1975). Alle Gewebefaktoren aüs den verschiedenen Hundeorganen zeigten eine Gerinnungsaktivität in Gegenwart von Lipid. Ebda. Es herrscht weitgehend Einigkeit darüber, daß zum Zeigen biologischer Aktivität der Gewebefaktor mit Phospholipiden assoziiert sein muß. Pitlick, F.A. und Nemerson, Y., Biochemistry 9, 5105-5111 (1970) und Bach, R. et al. oben, S.8324). Es wurde gezeigt, daß die Entfernung der Phospholipidkomponente des Gewebefaktors, z.B. durch Verwendung einer Phospholipase. zu einem Verlust seiner biologischen Aktivität führt. Nemerson, Y., J.C.I. 47, 72-80 (1968). Die Relipidation kann die Gewebefaktoraktivität in vitro wiederherstellen. Pitlick, F.A. und Nemerson, Y., Biochemistry 9, 5105-5113 (1970) und Freyssinet, J.M. et al., Thrombosis and Haemostasis 55, 112-118 [1986].
Man war lange der Ansicht, daß die Infusion von Gewebefaktor die normale Hämostase beeinträchtigt. Im Jahre 1834 stellte der französische Physiologe de Blainville erstmals fest, daß Gewebefaktor direkt zur Blutkoagulation beiträgt. de Blainville, H.Gazette Medicale Paris, Series 2, 524 (1834). de Blainville beobachtete auch, daß die intravenöse Infusion einer Gehirngewebesuspension den sofortigen Tod bewirkte, was seinen Beobachtungen zufolge mit einem hyperkoagulativen Zustand korrelierte, der die bei der Autopsie festgestellte weitläufige Verteilung von Blutgerinnseln bewirkte. Heute herrscht gute Übereinstimmung, daß die intravenöse Infusion von Gewebethromboplastin intravaskuläre Koagulation induziert und bei verschiedenen Tieren zum Tod führen kann. (Hunde: Lewis, J. und Szeto I.F., J.Lab.Clin.Med. 60, 261- 273 (1962); Hasen: Fedder, G. et al., Thromb.Diath.Haemorrh. 27, 365-376 (1972); Ratten: Giercksky, K.E. et al., Scand.J.Haematol. 17, 305-311 (1976); und Schafe: Carlsen, E. et al., Thromb.Haemostas. 48, 315-319 [1982]).
Zusätzlich zur intravaskulären Koagulation oder einem hyperkoagulativen Zustand, der sich aus der exogenen Verabreichung von Gewebefaktor ergibt, wurde angenommen, daß die intravaskuläre Freisetzung oder das intravaskuläre Aussetzen von Gewebethromboplastin die disseminierte intravaskuläre Koagulation (DIC) einleiten könnte. Prentice, C.R., Clin.Haematol. 14(2), 413-442 (1985). DIC oder die lokalisierte intravaskuläre Koagulätion kann in verschiedenen Zuständen entstehen, die z.B. Schock, Septikämie, Herzstillstand, postoperative Tiefvenenthrombose, Lungenembolie, instabile Angina, post-Angioplastie-Thrombose, extensives Trauma, Bisse von Giftschlangen, akute Lebererkrankung, große operative Eingriffe, Verbrennungen, septischer Abortus, Hitzschlag, disseminierte Malignität, Bauchspeicheldrüsen und Eierstockkrebs, promyelocytische Leukämie, Myokardinfarkt, Neoplasmen, systemischer Lupus erythematosus, Nierenerkrankung und Eklampsie. Die derzeitige Behandlung von DIC umfaßt die Transfusion von Blut und frischem gefrorenem Plasma; die Infusion von Heparin sowie die Entfernung von gebildeten Thromben. Die oben angeführten klinischen Syndrome legen nahe, daß die endogene Freisetzung bzw. das Aussetzen von Gewebefaktor zu schweren klinischen Komplikationen führen kann. Andoh, K. et al., Thromb.Res. 43, 275-286 (1986). Es wurden Anstrengungen unternommen, die thrombotische Wirkung von Gewebethromboplastin unter Verwendung von Enzymthromboplastinase zu überwinden. Gollub, S. et al., Thromb.Diath.Haemorh. 7, 470-479 (1962). Die Thromboplastinase ist eine Phospholipase und würde vermutlich den Phospholipidanteil von Gewebefaktor spalten. Ebda.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung zur Verwendung bei einer wirksamen Myokardinfarkt-Therapie bereitzustellen, die durch das Ermöglichen einer frühen Reperfusion und durch das Verhindern von Reokklusion Nekrose einschränkt.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, eine therapeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Myokardinfarkt und zur Verhinderung der neuerlichen Bildung von Fibrin-Bluttplättchen-Gerinnseln, d.h. der Reokklusion, bereitzustellen.
Ausführungsformen der Erfindung können ein koagulationshemmendes Therapeutikum bereitstellen, das ein Antagonist zum Gewebefaktorprotein ist, um die thrombotischen Wirkungen der endogenen Freisetzung von Gewebethromboplastin zu neutralisieren. die zu einem hyperkoagulativen Zustand führen können. Insbesondere würde ein solches Antikoagulans das ein Antagonist zum Gewebefaktorprotein ist, die hyperkoagulativen Wirkungen des endogen freigesetzten oder ausgesetzten Gewebethromboplastin durch das Inaktivieren von Gewebefaktorprotein neutralisieren. Ein solcher Gewebefaktorprotein-Antagonist kann ein Antikörper oder ein anderes Protein oder ein kleines organisches Molekül sein, das die Gewebefaktoraktivität spezifisch hemmt.
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der neuen und unerwarteten Beobachtung, daß sich herausstellte, daß Gewebefaktor in atherosklerotischen Plaques vorhanden ist. Man beobachtete, daß Gewebefaktor in größeren Mengen in der Plaque vorhanden war als in normalen Gefäßen. Man beobachtete auch, daß Gewebefaktor mRNA sowohl in mesenchymal-artigen Intimalzellen als auch in Makrophagen und Zellen angrenzend an die Cholesterinspalten innerhalb der atherosklerotischen Plaque vorhanden ist.
Demzufolge betrifft die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffes zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Myokardinfakt, umfassend die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Gewebefaktorprotein-Antagonisten, um Reokklusion zu verhindern, und eines thrombolytischen Wirkstoffs in einer therapeutisch wirksamen Menge, um ein Fibrin- Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffes zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Angioplastie, umfassend die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Gewebefaktorprotein-Antagonisten, um Reokklusion zu verhindern, und eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten, um Reokklusion zu verhindern, und eines thrombolytischen Wirkstoffs in einer therapeutisch wirksamen Menge, um ein Fibrin- Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Myokardinfarkt, umfassend therapeutisch wirksame Mengen eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffes zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verabreichung.
Die Erfindung steilt ein Verfahren zur Behandlung von Myokardinfarkt bereit, umfassend die Verabreichung an einen Patienten, der eine solche Behandlung benötigt:
a) eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten, der fähig ist die mögliche Blutgerinnselneubildung zu verhindern, in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Verhinderung einer solchen Neubildung;
b) eines thrombolytischen Wirkstoffes in einer therapeutisch wirksamen Menge, um ein Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen; und gegebenenfalls
c) eines koagulations- oder blutplättchenhemmenden Wirkstoffes, wie z.B. Aspirin, oder eines Antagonisten zum Blutplättchen-Glykoprotein IIb/IIIa -Aggregatbildungsfaktor, in einer therapeutisch wirksamen Menge zur Verhinderung der Blutgerinnsel- bzw. Blutplättchenaggregation.
Es folgt eine ausführliche und beispielhafte Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die unten zusammengefaßten Zeichnungen.
Figuren 1a-c (nachstehend als Fig.1 bezeichnet). Die Lokalisierung von Gewebefaktor in der normalen menschlichen Vena saphena. Zellen, welche Gewebefaktorprotein enthalten, wurden durch Immunocytochemie unter Verwendung des Vectastain- Alkalische Phosphataseverfahrens nachgewiesen positive Zellen färben sich rot). Die in der Tunica media verteilten Zellen wurden durch den RD010 Antikörper leicht verfärbt, während Endothelialzellen, die das normale Gefäß auskleiden, immer negativ waren (Feld A 500-fache Vergrößerung). Man konnte in den anhaftenden Adventitialfibroblasten eine starke immunohistochemische Verfärbung beobachten (Feld B 500-fache Vergrößerung). In situ-Hybridisierung unter Verwendung einer spezifischen ³&sup5;S-markierten Gewebefaktor mRNA-Sonde bestätigte, daß es in den Medien verteilte Gewebefaktor-produzierende Zellen (Feld C 310-fache Vergrößerung, und der Adventitia (nicht dargestellt) gab.
Figuren 2a-2c (hierin als Fig.2 bezeichnet). Die Lokalisierung von Gewebefaktor in der menschlichen atherosklerotischen Plaque durch in situ-Hybridisierung und Immunohistochemie. Karotis-Endarterektomie-Probenkörper wurden mit einer ³&sup5;S- markierten Gewebefaktor mRNA-Sonde hybridisiert (Feld A 125-fache Vergrößerung); sie wiesen viele Zellen auf, die in der atherosklerotischen Plaque Gewebefaktor produzieren. Die Immunohistochemie mit Gewebefaktor-Antikörper RDO010 zeigte eine starke Verfärbung des nekrotischen Kernbereichs der Plaque, insbesondere in Bereichen angrenzend zu den Cholesterinspalten, der nicht völlig zellassoziiert war (Feld B 125- fache Vergrößerung). In situ-Hybridisierung serieller Abschnitte zeigte, daß es Gewebefaktor mRNA-hältige Zellen angrenzend zu den Cholesterinspalten gab (Feld C 310-fache Vergrößerung), was auf eine lokale Synthese des in diesem Bereich nachgewiesenen Gewebefaktorproteins schließen läßt.
Figuren 3a-b (hierin als Fig.3 bezeichnet). Die Lokalisierung von Gewebefaktorprotein in Makrophageschaumzellbereichen der atherosklerotischen Plaque durch Immunohistochemie (Feld A 125-fache Vergrößerung; Feld B 500-fache Vergrößerung).
Fig.4. Prokoagulantenaktivität eines Karotis-Endarterektomie-Probenkörpers, der mittels eines modifizierten, einstufigen Prothrombin-Zeitassays in Plasma mit einem Faktor XII- Mangel gemessen wurde. Die Prokoagulantenaktivität des Gewebes wurde durch Präinkubation mit einem neutralisierenden polyklonalen Antikörper RD010 bedeutend verringert.
Der hierin verwendete Ausdruck "Gewebefaktorprntein-Antagonist" bezieht sich auf eine Substanz, die die Procoagulantenaktivität des Gewebefaktors hemmt oder neutralisiert. Solche Antagonisten erzielen diese Wirkung auf verschiedene Weise. Erstens bindet sich eine Klasse von Gewebefaktorprotein-Antagonisten an Gewebefaktorprotein mit ausreichender Affinität und Spezifität, um Gewebefaktorprotein zu neutralisieren, sodaß es sich nicht an Faktor VII oder VIIa binden kann oder die Proteolyse von Faktoren IX oder X im Komplex mit Faktor VII oder VIIa bewirken kann. In dieser Gruppe von Molekülen sind Antikörper und Antikörperfragmente enthalten (wie z.B. F(ab) oder F(ab')&sub2;-Moleküle). Eine weitere Klasse von Gewebefaktorantagonisten neutralisiert die Gewebefaktoraktivität durch das Schaffen von Molekülkomplexen, z.B. der in der Natur vorkommende Gewebefaktorinhibitor "LACI", der den Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitor umfaßt, der einen inaktiven Komplex von Gewebefaktor, Faktor VII, Faktor X und Phospholipid bildet (Broze, G.J. et al., PNAS 84: 1886-1890 [1987]). Eine weitere Klasse von Gewebefaktorprotein-Antagonisten sind Fragmente von Gewebefaktorprotein, Fragmente von Faktor VII oder kleine organische Moleküle, d.h. Peptidomimetika, die an Gewebefaktor binden, wodurch die Bildung des Gewebe-Faktor-Faktor VII- Komplexes oder die Aktivierung von Faktoren IX und X durch Gewebefaktor gehemmt wird. Eine weitere Klasse von Gewebefaktorprotein-Antagonisten inaktiviert Gewebefaktorprotein oder den Gewebefaktor/Faktor VIIa-Komplex durch Spaltung, z.B. eine spezifische Protease. Eine fünfte Klasse von Gewebefaktorproteinantagonisten blockiert die Bindung von Gewebefaktorprotein an Faktor VII, z.B. ein Faktor VII- Antikörper, der gegen eine Domäne von Faktor VII gerichtet ist, der an der Aktivierung von Faktor VII durch Gewebefaktor beteiligt ist.
Gewebefaktorprotein-Antagonisten eignen sich zur Behandlung von Myokardinfarkt zur Verhinderung von Reokklusion oder zur Therapie verschiedener oben beschriebener Koagulationsstörungen, z.B. DIC, die während schwerer Infektionen und Septikämien auftritt, verschiedener bösartiger Geschwüre, z.B. Kleinzellen-Lungenkrebs, Eklampsie, Tiefvenenthrombose, nach Operation oder einem Trauma, anstelle von oder in Kombination mit anderen Antikoagulantien, wie z.B. Heparin.
Ein Beispiel eines Antagonisten der das Gewebefaktorprotein neutralisiert, ist ein Antikörper zu Gewebefaktorprotein. Gewebefaktorprotein-neutralisierende Antikörper werden in Tieren wie z.B. Kaninchen oder Mäusen durch Immunisierung mit Gewebefaktorprotein in Freund'schem Adjuvans und bei Bedarf durch nachfolgende Auffrischungsimpfungen problemlos gezüchtet. Immunisierte Mäuse eignen sich besonders für das Bereitstellen von Quellen von B-Zellen zur Herstellung von Hybridomas, die ihrerseits kultiviert werden, um große Mengen an billigen monoklonalen Antigewebefaktorprotein-Antikörpern herzustellen. Solche monoklonalen Gewebefaktorprotein-Antikörper wurden durch Carson, S.D. et al., Blood 66(1), 152- 156 (1985) hergestellt.
Der hierin verwendete Ausdruck "Gewebefaktorprotein" bezieht sich auf ein Protein, das verschiedene Blutungsstörungen beheben kann, insbesondere jene die mit einem Mangel an Koagulationsfaktoren in Zusammenhang stehen. Gewebefaktorprotein unterscheidet sich insoferne von Gewebefaktor oder Gewebethromboplastin, als es den natürlich vorkommenden Lipidanteil des Moleküls nicht aufweist. Gewebefaktorprotein enthält auch Gewebefaktorprotein, das mit dem Phospholipid assoziiert ist, welches Lipid sich vom mit Gewebethromboplastin assoziierten, natürlich vorkommenden Lipid unterscheidet und das eine koagulationsinduzierende Fähigkeit ohne die begleitende Toxizität aufweist, die man beim lipidierten Protein beobachtet.
Der Gewebefaktor wird durch Zellschädigung freigesetzt oder ausgesetzt und aktiviert Faktoren IX und X in Gegenwart von Faktor VII oder VIIa und Kalzium. Für die Aktvierung von Faktor X durch den extrinsischen Koagulationsweg ist Gewebefaktor absolut erforderlich. Silverberg, S.A. et al., J.Biol.Chem. 252, 8481-8488 (1977). Bis zur Entdeckung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, war die Zellverteilung des Gewebefaktorproteins unbekannt, der Zeilen innerhalb von Geweben produzierte, von denen Gewebefaktor isoliert worden war. Es war auch nicht bekannt, daß Gewebefaktorprotein in atherosklerotischen Plaques in größeren Mengen als in normalen Geweben vorhanden ist. Es war auch nicht bekannt, daß der Bruch einer atherosklerotischen Plaque die Bildung von Blutgerinnseln durch das Aussetzen des Gewebefaktors heraufbeschwören kann.
Der Ausdruck "thrombolytischer Wirkstoff" bezieht sich hierin auf jeden beliebigen Wirkstoff, der entweder ein Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel auflösen oder die Bildung eines solchen Gerinnsels hemmen kann. Zu Beispielen solcher thrombolytischer Wirkstoffe gehören Streptokinase, Prourokinase, Urokinase und Plasminogenaktivator des Gewebetyps ("t-PA"). Obwohl natürlicher t-PA (Collen et al., EP-A Veröffentlichungs-Nr. 041.766, eingereicht am 6/10/1981) verwendet werden kann, ist es vorzuziehen, rekombinanten t-PA zu verwenden (Goeddel et al., EP-A Veröffentlichungs-Nr. 093.619, eingereicht am 5/4/1983). Die Erfindung kann zusätzlich die Verwendung von Hybriden, physiologisch aktiven Fragmenten oder Mutantenformen der obigen thrombolytischen Wirkstoffe vorsehen. Der hierin verwendete Ausdruck "Plasminogenaktivator des Gewebetyps" soll solche Hybride, Fragmente und Mutanten sowie sowohl natürlich abgeleitete als auch rekombinant abgeleitete Plasminogenaktivatoren des Gewebetyps umfassen.
Der Ausdruck "Antikoagulans" bezieht sich auf jeden beliebigen Wirkstoff, der fähig ist. die Prothrombin- und Teilthromboplastin-Zeittests zu verlängern und die Werte von Prothrombin und Faktoren VII, IX und X verringert. Antikoagulantien umfassen typischerweise Kumarinderivate und Heparin sowie Aspirin, das auch als Antiblutplättchen-Wirkstoff bezeichnet werden kann.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Gewebefaktorprotein-Antagonist wird mit dem Ziel bereitgestellt, die potentielle Neubildung von Fibrin-Blutplättchen- Gerinnseln zu verhindern. Solche Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel können sich als Folge des Einstellens der Behandlung mit einem thrombolytischen Wirkstoff bilden. Die fortgeschrittene menschliche Atherosklerose ist durch die Wucherung von intimalen glatten Muskelzellen und gleichzeitiger Ansammlung von Fetten und entzündeten Zellen, darunter Makrophage und T-Zellen innerhalb der atherosklerotischen Plaque, gekennzeichnet (Ross, R., N.Engl.J.Med. 314: 488-500 [1986]; Gown et al., Am.J.Pathol. 125:191-207 [1986]; Jonasson et al., Arteriosclerosis 6: 131-138 [1986]). Die Thrombose ist üblicherweise ein kritisches Ereignis, das eine asymptomatische atherosklerotische Plaque in eine symptomatische umwandelt (Falk, E. Br. Heart.J. 50: 127-134 [1983]); Sherman et al., N.Engl.J.Med. 315:913-919 [1986]; Impesato, A.M. et al., Ann.Surg. 197:195-203 [1983]), während gesunde Arterien kaum jemals Thrombose aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, daß der Plaquebruch das wesentliche Ereignis ist, das die Bildung von Blutgerinnseln heraufbeschwört (Forrester et al., Circulation 75: 505-513 [1987]). Ein okklusiver muraler Thrombus kann in den meisten Fällen von akuten Myokardinfarkten beobachtet werden (Buja, L.M. et al., Am.J.Cardiol. 47: 343- 356 [1981]; Horie, T. et al., Brit.Heart.J. 40: 153-161 [1978]). Plaquebruch oder -risse liegen solchen Thromben normalerweise zugrunde, und in vielen Fällen kann man beobachten, daß sich der Thrombus in den Bereich des nekrotischen Kerns der durch solche Risse verlaufenden Plaque erstreckt. Dies gilt sowohl für die Koronararterie (Falk, Br.Heart J. 50: 127-134 [1983]; Chapman, I., Arch.Path. 30: 256-261 [1965]; Drury, J.Path.Bact. 67: 207-215 [1954]) und die Hirnarterien (Constantinides, J.Arch.Pathol. 83: 422-428 [1967]). Bis zu dieser Erfindung wurde die Quelle der Thrombogenität der Plaque nicht zuvor bestimmt; man nahm aber früher an, daß sie eintritt, wenn Blutkomponenten mit Fetten oder der Kollagenmatrix innerhalb der Plaque in Kontakt kommen. Aktuelle Untersuchungen zeigen, daß a) eine signifikante Synthese von Gewebefaktorprotein in atherosklerotischen Plaques zu beobachten ist; b) daß sich Gewebefaktorprotein im nekrotischen Kern ansammelt und sich in schaumzellenreichen Bereichen der Plaque befindet; und c) daß in der Plaque Prokoagulantenaktivität aufgrund des Gewebefaktors festzustellen ist (durch in vitro-Koagulationsassays bestimmt), die durch Gewebefaktorprotein-Antikörper deutlich verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überproduktion und/oder der Einschluß von Gewebefaktorprotein in der atherosklerotischen Plaque bei der Thrombose im Zusammenhang mit menschlichen atherosklerotischen Gefäßen und der Blutgerinnsel- Neubildung im Anschluß an eine thrombolytische Therapie bei der Behandlung von Myokardinfarkten eine wesentliche Rolle spielen kann.
Der Gewebefaktorprotein-Antagonist und der thrombolytische Wirkstoff der vorliegenden Erfindung sollen an den Empfänger in Kombination verabreicht werden. Medikamente gelten als "in Kombination" miteinander verabreicht, wenn sie dem Patienten gleichzeitig verabreicht werden, oder wenn die Zeit zwischen der Verabreichung jedes Medikaments so ist, daß eine Überschneidung biologischer Aktivität ermöglicht wird. Es ist vorzuziehen, den Gewebefaktorprotein-Antagonisten vor der Verabreichung des thrombolytischen Wirkstoffes an den Patienten zu verabreichen.
Eine Menge Gewebefaktorprotein-Antagonist, der fähig ist, die teilweise Neubildung eines Blutgerinnsels zu verhindern, wenn er an einen Patienten verabreicht wird, ist eine "therapeutisch wirksame" Menge. Um die potentielle Blutgerinnsel-Neubildung zu verhindern, wird der Gewebefaktorprotein-Antagonist mittels einer Menge pro Kilogramm des Patientengewichts verabreicht, die durch den herkömmlich ausgebildeten Arzt bestimmt wird. Diese Dosierung kann über einen Zeitraum von 75- 180 Minuten durch kontinuierliche intravenöse Infusion verabreicht werden. Der Gewebefaktorprotein-Antagonist kann durch Herzkatheterisierung oder durch einen intravenös injizierbaren Bolus mit einer Dosis im Bereich von etwa 0,01-25,0 mg pro kg Patientengewicht verabreicht werden. Wenn der Gewebefaktorprotein-Antagon ist durch einen intravenös injizierbaren Bolus verabreicht wird, kann ein einziger Bolus ausreichen, um die potentielle Neubildung von Blutgerinnseln zu verhindern.
Der thrombolytische Wirkstoff wird verabreicht, um die Lyse eines okkludierenden Thrombus zu bewirken. Eine Menge eines thrombolytischen Wirkstoffes, die fähig ist, eine solche Lyse zu bewirken, ist eine "therapeutisch wirksamen" Menge. Der erfindungsgemäße thrombolytische Wirkstoff wird vorzugsweise in einer Dosis von 0,01-2,5 mg pro kg Patientengewicht verabreicht. Der thrombolytische Wirkstoff kann über einen längeren Zeitraum verabreicht werden (d.h. von etwa 60 bis etwa 120 Minuten). Vorzugsweise wird der thrombolytische Wirkstoff als intravenös injizierter Bolus verabreicht, der zwischen 0,01-1,0 mg/kg und am bevorzugtesten zwischen 0,1- 1,0 mg/kg enthält. Der thrombolytische Wirkstoff kann in jeder beliebigen physiologisch tolerierten Flüssigkeit zur Herstellung eines injizierbaren Bolus aufgelöst werden. Es ist jedoch vorzuziehen, einen solchen Bolus durch Auflösen des thrombolytischen Wirkstoffes in einem geeigneten Puffer herzustellen.
Ein nach dem bevorzugten Verfahren behandelter Patient erhält demzufolge einen intravenös injizierten Bolus des Gewebefaktorprotein-Antagonisten in Kombination mit einem intravenös injizierten Bolus des thrombolytischen Wirkstoffes. Es ist bedeutsam, daß die Anwendung der bevorzugten Behandlung zur Auflösung des okkludierenden Thrombus mit einer Rate führt, die viel höher als die Rate der Thrombusauflösung ist, wenn entweder der Gewebefaktorprotein-Antagonist oder der thrombolytische Wirkstoff durch Infusion verabreicht werden. Zusätzlich wird das Reokklusionsrisiko wesentlich verringert. Ein gemäß dem bevorzugten Verfahren behandelter Patient benötigt unter Umständen kein Heparin, das im allgemeinen bei einer Aufrechterhaltungsinfusions-t- PA-Behandlung notwendig ist.
Diese unerwarteten Ergebnisse sind die Grundlage eines Behandlungsverfahrens, bei dem die Verabreichung eines Bolus eines Gewebefaktorprotein-Antagonisten in Kombination mit der Verabreichung eines Bolus eines thrombolytischen Wirkstoffes fähig sind, einen okkludierenden Thrombus aufzulösen und das Risiko der Reokklusion zu minimieren.
Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß die erforderliche Dosierung des Gewebefaktorprotein-Antagon isten oder des thrombolytischen Wirkstoffes vom Schweregrad der Erkrankung des Patienten sowie von solchen Kriterien wie Größe, Gewicht, Geschlecht, Alter und Krankengeschichte des Patienten abhängt.
Der Gewebefaktorprotein-Antagonist oder thrombolytische Wirkstoff zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wie z.B. durch Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel. Geeignete Vehikel und ihre Fomulierung sind z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (16.Ausg., Osol, A. (Hrsg.), Mack, Easton, PA [1980]) beschrieben. Um eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zu bilden, die für die wirksame Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Gewebefaktorprotein- Antagonisten oder des thrombolytischen Wirkstoffes, u.z. entweder alleine oder mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels. Obwohl der erfindungsgemäße Gewebefaktorprotein-Antagonist in jeder beliebigen physiologisch tolerierten Flüssigkeit zur Herstellung eines injizierbaren Bolus aufgelöst werden kann, ist es vorzuziehen, einen solchen Bolus zur Auflösung des Gewebefaktorprotein-Antagonisten in Salzlösung herzustellen.
Zusätzliche pharmazeutische Verfahren können zur Steuerung der Wirkungsdauer angewendet werden. Präparate mit gesteuerter Abgabe können durch die Verwendung von Polymeren hergestellt werden, um den erfindungsgemäßen Gewebefaktorprotein- Antagonisten oder thrombolytischen Wirkstoff zu komplexieren oder zu adsorbieren. Die gesteuerte Abgabe kann durch das Auswählen von geeigneten Makromolekülen (beispielsweise von Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Äthylenvinylacetat, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose oder Protaminsulfat) erreicht werden. Die Rate der Arzneimittelfreisetzung kann auch durch Änderung der Konzentration solcher Makromoleküle gesteuert werden. Ein weiteres mögliches Verfahren zur Steuerung der Wirkungsdauer umfaßt das Einbauen von therapeutischen Wirkstoffen in Teilchen einer polymeren Substanz, wie z.B. von Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly(milchsäure), oder Äthylenvinylacetatcopolymeren. Alternativ dazu ist es möglich, den therapeutischen Wirkstoff in Mikrokapseln, z.B. durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, z. B. durch Verwendung von Hydroxymethylzellulose, Gelatin-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln oder in einem kolloidalen Arzneimittelabgabesystem, z.B. in Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen, Nanokapseln, oder in Makroemulsionen einzuschließen. Solche Lehren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) geoffenbart.
Der thrombolytische Wirkstoff oder Gewebefaktorprotein-Antagonist kann durch auf dem Gebiet wohlbekannte Mittel an einen Patienten verabreicht werden. Solche Mittel umfassen orale, intranasale, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle (z.B. Katheterisierung) oder parenterale Mittel. Im bevorzugtesten Behandlungsverfahren des Myokardinfarktes wird an einen Patienten ein intravenös injizierter Bolus in einer durch den herkömmlich ausgebildeten Arzt festgelegten Dosierung verabreicht, wobei er verschiedene Kriterien berücksichtigt, welche den klinischen Zustand dieses Patienten bestimmen.
Man denkt auch daran, den Gewebefaktorprotein-Antagonisten mit einem nachweisbaren Indikator zu markieren, in den Blutstrom des Wirten zu injizieren und ihn anschließend hinsichtlich seiner Präsenz in einer atherosklerotischen Plaque zu prüfen. Der Gewebefaktorprotein-Antagonist kann mit jedem beiliebigen bekannten Indikator markiert werden, der im Blutstrom eines Wirten nachweisbar ist, z.B. mit ¹³¹J, ¹²&sup5;J, Selen, Technetium oder bifunktionalen Chelaten. Der Gewebefaktorprotein- Antagonist kann auch mit einem nichtradioaktiven Indikator markiert werden, den man z.B. durch kernmagnetische Resonanz oder andere Mittel auf dem Gebiet nachweisen kann. Das Markieren des Gewebefaktorprotein-Antagonisten kann unter Verwendung von Verfahren erfolgen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, z.B. im Falle von ¹²&sup5;J unter Verwendung von Lactoperoxidase oder Jodogen-Verfahren.
Nach dieser allgemeinen Beschreibung der Erfindung wird sie nun anhand von bestimmten spezifischen Beispielen besser verstanden werden, die hierin nur zur Veranschaulichung eingeschlossen sind und die Erfindung, soferne nicht anders angegeben, nicht einschränken sollen.

BEISPIEL 1

Allgemeine Materialien und Verfahren

Triton X-100 ist ein Produkt von Calbiochem, San Diego, CA (TRITON ist ein Warenzeichen). Alle Chemikalien und Reagenzien für die präparative und analytische Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) stammten von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA. Faktor IXa/Faktor X-Reagens und S2222/12581 stammten von den Helena Laboratories (Kabi Coatest-Satz, Helena Laboratories, Beaumont, CA, Katalognummer 5293). YM 10-Ultrafiltrationsmembranen stammten von Amicon. Faktor VII wurde von Sigma Chemical käuflich erworben. Roh- Phosphotidylcholin (Lecithingranulat aus Sojabohnen) stammte von Sigma, St.Lous, MO. Alle anderen Chemikalien wiesen eine Reagens- oder eine höhere Qualität auf.

Reinigung von Gewebefaktorprotein

Gewebefaktorprotein wurde mittels Immunoaffinitätsreinigung unter Verwendung eines IgG-monoklonalen Antikörpers gereinigt, der sich an menschliches Gewebefaktorprotein bindet.
Menschliches Gewebefaktorprotein wurde in rekombinanter Kultur synthetisiert, wie dies in EP-A-0278776 (europäische Patentanmeldung Nr. 88301190.0) beschrieben ist.
Die folgenden Immunogene wurden in eine BALB/c Maus (29.1.B) gemäß dem unten beschriebenen Schema injiziert: rekombinantes menschliches Gewebefaktorprotein (rTF) (0.72 mg/ml mit einer spezifischen Aktivität 4687 E/mg) OR (0.07 mg/ml mit einer spezifischen Aktivität 17040 E/mg); rekombinantes Gewebefaktorprotein aus einer durch Thrombin gespaltenen Gewebefaktor-gD Fusion, um die Herpes-gD Sequenzen aus dem Aminoterminalende zu entfernen (rTF: gDThr) (4300 E/ml) und einer rekombinanten Gewebefaktor-Herpes-gD Fusion (rTF-gD) (etwa 740 E/ml) im folgenden Immunisierungsschema: Tag Verabreichungsweg Immunogen subkutan (sk) halb sk und halb intraperitoneal (ip) 0,25 ml r-TF in Freund's vollständigem Adjuvans 0,25 ml r-TF in unvollständigem Freund'schen Adjuvans
Ein durch Radioimmunoausfällung (RIP) und ELISA geprüfter Anti-TF-Titer nahm in allen Immunisierungen bis Tag 85 allmählich zu.
Der RIP-Assay verwendete 0,005 ml Seren aus immunisierten und nichtimmunisierten Mäusen verdünnt mit 0,495 ml PBSAT (PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1% Triton X-100). 50.000 cpm ¹²&sup5;J-rTF wurden hinzugefügt und die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Mit Antikörper komplexiertes ¹²&sup5;J-rTF wurde durch einstündiges Inkubieren bei Raumtemperatur mit 0,05 ml SPA-Perlen ausgefällt. Die SPA-Perlen bestanden aus Staphylokokkenprotein A, das an Sepharose CL-4B Perlen gebunden war, die mit Kaninchen-Antimaus-IgG präinkubiert und in PBS, 0,1% BSA und 0,02%NaN&sub3; gelagert worden waren. Die Perlen wurden pelletiert, dreimal mit PBSAT gewaschen und in einem Gammazähler gezählt.
Der ELISA bestand aus 0,1 ml rTF (o,5 ug/ml) in Karbonatpuffer (pH-Wert 9,6, bei 37ºC 2 Stunden lang an Mikrotiternäpfe adsorbiert). Eine weitere nichtspezifische Adsorption an die Näpfe wurde 1 Stunde lang bei 37ºC mit PBSA (5% BSA enthaltende PBS) blockiert. Die Näpfe wurden dreimal mit PBST (0,1% Tween 20 enthaltende PBS) ausgewaschen, und die mit PBSAT verdünnten Serenproben wurden hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 22ºC inkubiert. Die Näpfe wurden dreimal mit PBSAT gewaschen. 0,1 ml Ziegen-Antimaus-Immunoglobulin, das an Meerrettichperoxidase konjugiert war, wurde jedem Napf hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Näpfe wurden erneut gewaschen und o-Phenylendiamindihydrochlorid als Substrat hinzugefügt und 25 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit 2,5 M H&sub2;SO&sub4; abgebrochen und die dekadische Extinktion jedes Napfes bei 492 nm abgelesen.
An Tag 89 wurde die Milz aus Maus 29.1.B geerntet, zerkleinert, und die Milzzellen wurden mit X-63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580) nichtsekretierenden Mäuse-Myelomazellen unter Verwendung des PEG-Fusionsverfahrens nach S.Fazakas de St. Groth et al., J.Immun.Meth., 35: 1-21(1980) verschmolzen. Die verschmolzene Kultur wurde in 4 Platten mit jeweils 96 Mikrotiternäpfen gesät und in HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medien durch herkömmliche Verfahren (Mishell und Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman & Co., San Francisco, S. 357-363 [1980]) kultiviert. Die anti-TF-Aktivität der Kulturüberstände wurde durch ELISA und RIA bestimmt. 12 stabile Verschmelzungen (Hybridome) sekretierten anti-TF, wie dies durch ELISA oder Antigen-Fassungs RIA (unten beschrieben) bestimmt wurde. Die Hybridome wurden durch Einschränkungsverdünnung mittels veröffentlichter Verfahren entwickelt und geklont (Oi, V.J.T. & Herzenberg. L.A., "Immunoglobulin Producing Hybrid Cell Lines" in Selected Methods in Cellular Immunology, S. 351-372, Mishell, B.B. und Shiigi, S.M (Hrsg.), W.H.Freeman & Co. [1980]). Die Auswahl der Klone beruhte auf der makroskopischen Beobachtung einzelner Klone, ELISA und RIA. Der Antikörper wurde unter Verwendung eines Zymed Isotypierungssatz gemäß der Begleitvorschrift (Zymed Corp.) isotypiert. Große Mengen spezifischer monoklonaler Antikörper wurden durch Injektion von geklonten Hybridomazellen in Pristan-geprimten Mäusen zur Herstellung von aszitischen Tumoren produziert. Asziten wurden dann gesammelt und über einer Protein-A Sepharosesäule gereinigt.
Das Antigen-Fassungs-RIA-Verfahren verwendete ¹²&sup5;J-markiertes Gewebefaktorprotein mit den Lactoperoxidaseenzym-Perlen (BIORAD, Richmond, CA) gemäß der empfohlenen Vorschrift der Lieferfirma. Polystyrol-"Streifennäpfe" wurden mit 100 ul/Napf Ziegen-Antimaus-IgG (H & L kettenspezifisch, Boehringer Mannheim) bei 5 ug/ml in einem Karbonatpuffer (pH-Wert 9,6) 1 Stunde lang bei 37ºC beschichtet. Die Streifen wurden mit PBSAT gewaschen und 2 Stunden lang bei 22ºC mit 50.000 CPM ¹²&sup5;J/TF in 100 ul BPBST inkubiert. Die Streifen wurden gewaschen und einzelne Näpfe auf einem 20/20 Gammazähler gezählt, um den Prozentsatz gebundener Eingabezählungen zu bestimmen.
Das vorangehende Verfahren zur Immunisierung und zum Screenen hinsichtlich Antigewebefaktor-Antikörper ist beispielhaft. Die Immunisierung könnte auch unter Verwendung eines bestimmten Antigens erfolgen, wie z.B. des r-Gewebefaktorproteins, der gD-Gewebefaktorfusion oder der Thrombin-gespaltenen gD-Gewebefaktorfusion. Die Immunisierungsvorschrift könnte durch Ändem des Verabreichungswegs, des Verfahrens der in vitro-Immunisierung, verschiedener Konjugations- oder Hilfsverfahren oder durch Auswahl aus verschiedenen verfügbaren Quellenspezien von B- Zellen modifiziert werden. Der Antikörper könnte z.B. mittels des unten beschriebenen chromogenen Assays hinsichtlich der Neutralisierung der Gewebefaktoraktivität gescreent werden. Das Screenen hinsichtlich neutralisierender Antikörper könnte durch Prüfen des geernteten Überstands im chromogenen Assay anstelle von ELISA oder RIA erfolgen.
Etwa 5 ml Aszitesfluid wurde bei 3000 U/Min. in einem Sorvall 6000 bei 4ºC 10 Minuten lang zentrifugiert. Die klare Pristanschicht und die Lipidschicht wurden mit einer Pasteurpipette entfernt. Das Aszitesfluid wurde in ein 50 ml Zentrifugenrohr übertragen. Das Aszitesfluid wurde durch einen 0,45 u Filter sterilgefiltert. 1,11 g KCl wurden den Asziten hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 3 M KCl zu erhalten.
Die Asziten wurden auf eine 10 ml Säule geladen, die SPA Sepharose (Fermentech) enthielt. Die Säule wurde mit 3 M KCl gewaschen. Das Mäuse-IgG wurde mit 3 bis 4 Säulenvolumina von 0,1 M Essigsäure in 0,15 M NaCl, pH-Wert 2,8, eluiert.
Der Antikörper D3 wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers bei 3 mg IgG pro ml Sepharose mit CNBr Sepharose gekoppelt. (Siehe Pharmacia Co. Anleitungshandbuch). Transfizierte 293S-Zellen wurden in einer 1:1 Mischung aus Ham's F-12 (w/o Glyzin, Hypoxanthin und Thymidin) und DMEM (w/o Glyzin) gezüchtet. Zugaben zum Basismedium umfassen: 10% dialysiertes oder diagefiltertes fötales Kalbsserum, 50 nM Methotrexat, 2,0 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES-Puffer.
Ein gefrorenes Fläschchen 293S (63/2S CISTF) wird in einem Gewebekulturkolben aufgetaut, der das beschriebene Medium enthält. Wenn die Kultur Konfluenz erreicht wird sie mit Trypsin-EDTA-Mischung trypsiniert, und ein kleiner Anteil der Zellpopulation wurde verwendet, um größere Kolben zu beimpfen. Kulturen wurden täglich durch Phasenmikroskopie überwacht, um das Wachstum (Prozentsatz der Konfluenz), die Morphologie und die allgemeine Gesundheit festzustellen. Als die Rollflaschenkulturen konfluent waren (üblicherweise innerhalb von 5-7 Tagen), wurden die Zellen trypsiniert und gezählt. Die Zellen wurden gezählt und ihre Lebensfähigkeit durch das Trypan-Blauexklusionsverfahren ermittelt. Typische Zellanzahlen aus einer konfluenten 850 cm² Rollflasche betrugen zwischen 1 bis 4 x 10&sup8; Zellen. Die Zellen wurden in 0,01 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl suspendiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 5000 E/Min. gesammelt. Die Zellen wurden in 50 ml TBS erneut suspendiert, die 1 % Triton X pro Kolben enthielt. Kulturen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 8000 x g 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde auf die oben beschriebene D3-Sepharosesäule geladen. Die Säule wurde gewaschen und mit 0,1 M Essigsäure, 150 mM NaCl und 0,05% Tween 80 eluiert.

Assay für Gewebefaktorprotein

1. Chromogener Gewebefaktorassay

Alle Gewebefaktorprotein-Proben wurden vor dem Assay erneut lipidiert. Wie oben diskutiert ist für Gewebefaktor Phospholipid absolut erforderlich, um in in vitro Assaysystemen Aktivität zu zeigen (Pitlick und Nemerson, oben). Lezithin-Granulat wurde in Tris 0,05 M, 0,1 M, NaCl, pH-Wert 7,4 (TBS) (enthält 0,25% Natriumdesoxycholat) auf eine Konzentration von 1 mg/ml homogenisiert. Diese Lösung (PC/DOC) wurde zur erneuten, nachstehend beschriebenen Lipidierung von Gewebefaktor verwendet. Gewebefaktorprotein wurde in 0,1 % Rinderserumalbumin (TBSA) enthaltender TBS verdünnt. 50 ul wurden in ein 12 x 75 mm Polystyrolreagenzglas gefüllt, dem 50 ul PC/DOC Lösung hinzugefügt wurden. 350 ul TBSA wurden dann gemeinsam mit 25 ul 100 mM CdCl&sub2; hinzugefügt. Diese Relipidierungsmischung ließ man 30 Minuten lang bei 37ºC inkubieren.
Für den chromogenen Assay wurden relipidierte Gewebefaktorprotein-Proben in TBSA verdünnt. 10 ul wurden mit 50 ul des Faktor IXa/Faktor X-Reagens und 2 ul einer Lösung aus gereinigtem Faktor VII, 30 Einheiten/ml, in ein Reagenzglas gefüllt. Die Reagenzgläser wurden auf 37ºC erwärmt, und 100 ul 25 mM CaCl&sub2; wurden hinzugefügt. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 37ºC vor der Zugabe von 50 ul chromogenem Substrat S2222, das den synthetischen Thrombininhibitor I2581 enthielt. inkubiert. Die Reaktion ließ man 10 Minuten lang ablaufen und wurde durch die Zugabe von 100 ul Eisessiglösung abgebrochen. Die dekadische Extinktion wurde bei 405 nm festgestellt. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von Kaninchengehirnthromboplastin (im Handel erhältlich bei Sigma, St. Louis, MO, Katalognr. T0263) konstruiert, wobei diesem Reagens willkürlich 100 Gewebefaktoreinheiten/ml zugewiesen wurden. Verdünnungen wurden von 1:10 bis 1:100 gemacht. Die dekadische Extinktion wurde auf der Abszisse von Millimeterpapier mit halblogarithm. Teilung aufgetragen, wobei die Verdünnung des Standards auf der Ordinate aufgetragen wurde.

2. Einstufiger Assay hinsichtlich Gewebefaktoraktivität

100 ul hämophiles Plasma wurden 10 ul relipidiertem oder lipidfreiem Gewebefaktor oder TBSA als Kontrolle in einem silizierten Glasrohr hinzugefügt, um die nichtspezifische Aktivierung durch die Kontaktphase der Koagulation zu verhindern. Die Reaktanden wurden auf 37ºC erwärmt und 100 ul 25 mM CaCl&sub2; hinzugefügt, und dann wurde die Zeit der Bildung von Blutgerinnseln gemessen. Hvatum, Y. und Prydz, H., Thromb.Diath. Haemorrh. 21, 217-222(1969).

Gewebeherstellung

Normale menschliche Wadenvenen und innere Brustarterien wurden während einer Koronararterien-Bypassoperation erhalten. Menschliche atherosklerotische Plaques stammten aus Patienten, die sich einer Karotis-Endarterektomie-Operation unterzogen. Eine Endarterektomie-Operation besteht aus der Entfernung einer atherosklerotischen Plaque und eines Teils des darunterliegenden glatten Muskels. Zusätzliches normales Gewebe aus einem geopferten Rhesusaffen, darunter Proben normaler Organe und Gefäße, wurden hergestellt, wie dies beim Screenen der Gewebefaktorexpression beschrieben ist.
Die Gewebeproben wurden bei der Operation entfernt und in frisch hergestelltes 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Natriumphosphat (pH-Wert 7,4) eingetaucht. Das Gewebe wurde 3 Stunden lang bis über Nacht bei 4ºC fixiert und dann in 15% Saccharosephosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) 24 Stunden lang bei 4ºC eingetaucht, um als Cryoprotektant zu wirken. Das Gewebe wurde anschließend in ein Einbettungsmedium für gefrorene Gewebeprobenblöcke ("OCT" Miles Laboratories) eingebettet und bei -70ºC gelagert. Man konnte keinen Verlust der Immunreaktivität oder mRNA feststellen, die während dieser Zeit für die Hybridisierung zur Verfügung stand. Das Gewebe wurde mittels eines Kryostats bei einer Dicke von 10 mm geschnitten, auf Polylysin-beschichtete Mikroskop-Objektträger zum Auftauen befestigt und sofort wiedereingefroren und bei -70ºC mit Trockungsmittel gelagert. Zusätzliches atherosklerotisches Plaquegewebe wurde bei der Operation zur Verwendung in Koagulationsassays rasch bzw. schockgefroren, um die Gewebefaktoraktivität zu beurteilen.

In situ-Hybridisierung

In situ-Hybridisierungen erfolgten wie bereits beschrieben (Rosenthal et al., EMBO J. 6: 3641-3646 [1987]; Wilcox et al., Methods Enzymol. 124: 510-533 [1986]). Vor der Hybridisierung wurden die Abschnitte mit Paraformaldehyd (10 Min.), Proteinase K (1 ug/ml) (10 Min.) vorbehandelt und 1 bis 2 Stunden lang in 50 ul Vorhybridisierungspuffer 0,3 M NaCl, 20 mM Tris pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA, 1 x Denhardt'sche Lösung, 10% Dextransulfat und 10 mM Dithiothreitol) vorhybridisiert. Die Hybridisierungen begannen durch die Zugabe von 600.000 CPM einer Gewebefaktor 33S Ribosonde in einer kleinen Menge eines Vorhybridisierungspuffers. Nach der Hybridisierung wurden die Abschnitte mit 2 x SSC (2 x 10 Min.) gewaschen (1 x SSC = 1 50 mM NaCl, 5 mM Na-Citrat, pH-Wert 7,0), mit RNase behandelt (20 ug/ml, 30 Min., Raumtemperatur), in 2 x SSC (2 x 10 Min.) gewaschen und unter sehr strengen Bedingungen in 0,1 x SSC bei 52ºC 2 Stunden lang gewaschen. Alle SSC- Lösungen enthielten bis zu diesem Punkt des Verfahrens 10 mM β-Mercaptoäthanol und 1 mM EDTA, um die Verhinderung von nichtspezifischem Binden der Sonde zu unterstützen. Das Gewebe wurde dann in 0,5 x SSC ohne β-Mercaptoäthanol (2 x 10 Min.) gewaschen und durch Eintauchen in abgestufte, 0,3 M Ammoniumacetat enthaltende Alkohole dehydratisiert. Die Abschnitte wurden getrocknet und mit NTB2 Kernemulsion (Kodak, Rochester, N.Y.) beschichtet und im Dunkeln 4 bis 8 Wochen lang bei 4ºC ausgesetzt. Nach dem Entwickeln wurden die Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin gegengefärbt. Die Abschnitte wurden bei 15ºC entwickelt, indem die Objektträger 3 Minuten lang in einem 1:1 mit Wasser verdünnten D19-Entwickler (Kodak), 20 Sekunden lang in Wasser und 3 Minuten lang in einem Fixiermittel behandelt wurden. Die Objektträger wurden ausgewaschen und gegengefärbt.
Eine für den menschlichen Gewebefaktor spezifische Sonde (Fisher et al., Thrombosis Res. 48: 89-99 [1987]) wurde durch Transkription (Melton et al., Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056 [1984]) unter Verwendung von (³&sup5;S)-markiertem UTP (spezifische Aktivität 1200 Ci/mmol, Amersham) markiert. Dies war eine Sonde von 1,2 Kb und enthielt die gesamte Kodierungssequenz für den menschlichen Gewebefaktor, die sich von Nukleotid 1 im 5'-Flankierungsbereich bis zu einer Ncol-Stelle bei Nukleotid 1224 im 3'-untranslatierten Bereich (Fisher et al., oben) erstreckte. Die endgültige spezifische Aktivität dieser Sonde betrug 300 Ci/mmol.

Immuncytochemie

Die Immunocytochemie erfolgte gemäß den Richtlinien des Herstellers unter Verwendung des Vectastain ABC alkalische Phosphatasesystems (Vector, Inc., Burlingame, CA). Das Endreaktionsprodukt wurde mit dem alkalische Phosphatasesubstrat-Satz I gefärbt, um eine rot erscheinende Endfärbung zu ergeben. Der verwendete Antigewebefaktorprotein-Antikörper war Antikörper RD010, der weiter unten in Beispiel 2 beschrieben ist.
Eine IgG-Fraktion des Präimmunserums wurde als Steuerung für die Gewebefaktorprotein-Immunohistochemie mit der gleichen IgG-Konzentration wie RD010 verwendet. Die Herstellung erfolgte, indem das Präimmunserum über eine Protein A-Sepharosesäule geschickt wurde. Gefrorene Aliquote aller Antikörperpräparate wurden bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert.
Antikörper, die für menschliche Makrophage (HAM56, Gown, A.M. et al., Am.J.Pathol. 125: 191-207 [1986]) oder menschliche Endothelialzellen (anti-Ulex Lectin, im Handel erhältlich bei Vector, Inc.) spezifisch sind, wurden auch zur Unterstützung der Zeilidentifizierung verwendet.

Koagultionsassays

Die Prokoagulantenaktivität von menschlichem Plaquegewebe, das während einer Karotis-Endarterektomieoperation erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines zweistufigen Gerinnungsassays gemessen (Pitlick, F.A. und Nemerson, Y., Methods Enzymol., 45:37-48 [1976]). Ein kleines Stück schockgefrorener, nicht fixierter Plaque wurde aufgetaut und mit 20 ul Faktor VII (Sigma. Mindestaktivität 10 E ml&supmin;¹), 3 ul Faktor X (Sigma, Mindestaktivität 10 E ml&supmin;¹) und 25 ul 50 mM Kalziumchlorid 60 Sekunden lang bei 37ºC inkubiert. Ein 20 ul-Aliquot wurde dann entfernt und gleichzeitig mit 80 ul, 25 mM CaCl&sub2; zu 100 ul Faktor XII-armem Plasma plus 100 ul Kaninchencephalin bei 37ºC hinzugefügt. Die Zeit zur Fibrinbildung wurde visuell bestimmt. Bei der Wiederverwendung wurde Plaque aus der mit Tris-Puffer (50 mM, pH-Wert 7,5) ausgespülten Inkubationsmischung entfernt und die Inkubation wiederholt. Die Neutralisierungseffekte eines affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers, RD010 wurden durch Vorinkubation von Plaquesegmenten in antikörperhältigem Tris-Puffer (50 mM, pH-Wert 7,5) 10 Minuten lang bei 37ºC gemessen, bevor die Zugabe von Faktor VII, X und Kalziumchlorid erfolgte. Alle Werte sind als Mittelwerte ± S.E.M. ausgedrückt.

BEISPIEL 2

Herstellung von Gewebefaktorprotein-Antagonisten

Der Gewebefaktorprotein-Antagonist, Antikörper RD010, war ein in Kaninchen gezüchteter affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper. RD010 wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit Gewebefaktorprotein in Freund'schem Adjuvans und im Bedarfsfall durch anschließende Auffrischungsimpfungen hergestellt. Die Kaninchen wurden mit rekombinantem menschlichen Gewebefaktorprotein immunisiert, das in 293S-Zellen als Fusionsprotein hergestellt wurde (siehe EP-A- 0278776). Das Immunserum wurde durch Affinitätschromatographie auf einer rekombinanten menschlichen Gewebefaktor-Sepharosesäule gereinigt. Es zeigte sich, daß dieser Antikörper auf einem Western Blot monospezifisch ist, die Gewebefaktoraktivität neutralisiert und das Gewebefaktorprotein immunausfällt. Dieser Antikörper wurde in einer Verdünnung von 4,4 ug/ml für die Immunocytochemie verwendet, während man 1,0-100 ug/ml für in vitro-Gewebefaktorinhibitions-Untersuchungen verwendete.
Für Gewebefaktorprotein spezifische menschliche monoklonale Antikörper werden unter Verwendung eines menschliches B Lymphozyten sekretierenden, für Gewebefaktorprotein spezifischen Antikörpers erzeugt (siehe Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies [Hrsg. Engelmann, E.G., Plenum Press, 1985]). Diese B Lymphozyten könnten durch in vitro-Immunisierungen erzeugt werden. Gewebefaktorspezifische Lymphozyten werden durch das Epstein-Barr Virus in mmortales menschliches Lymphoblastoid, menschliches Myeloma, menschliche Plasmacytome oder andere immortale Zellinien umgewandelt. Die immortalisierte Linie sekretiert gewebefaktorspezifisches menschliches IgG. Präparation menschlicher Rekombinantenmoleküle kann auch durch die in der EP Veröffentlichung Nr. 0125023 vom 14. November 1984 beanspruchten Verfahren erfolgen, welche das Kombinieren eines variablen Bereichs eines monoklonalen Antikörpers mit dem konstanten Bereich der schweren oder leichten Kette menschlicher Antikörper beschreibt.

BEISPIEL 3

Lokalisierung von Gewebefaktorbiosynthese

Normale Gefäße

Normale menschliche Wadenvenen- und innere Brustarterienproben wurden hinsichtlich Gewebefaktorbiosynthese untersucht. Endothelialzellen waren hinsichtlich Gewebefaktor-mRNA und Protein negativ (Fig. 1a). Gewebefaktor-positive Zellen waren in der Tunica media und der Adventitia angrenzend zum Gefäß verteilt. Die stärkste Markierung konnte man dort auf der Adventitia beobachten, wo die Adventitialfibroblasten eine starke Gewebefaktorverfärbung (Fig.Ib) und mRNA- Hybridisierung zeigten. Verteilte Zellen in der Tunica media enthielten Gewebefaktor- mRNA, wie dies durch in situ-Analyse (Fig.1c) bestimmt wurde. Die immunochemische Verfärbung der Medien war jedoch nicht beeindruckend und recht schwach, schien jedoch zellassoziiert zu sein und korrelierte gut mit den in situ-Ergebnissen (Fig.1a). Im allgemeinen stellte sich heraus, daß mehr Zellen in den Medien durch in situ- Hybridisierung positiv waren als man durch immunochemisches Verfärben nachweisen konnte. Dies könnte auf eine verringerte Gewebefaktortranslation oder Gewebefaktorsekretion durch diese Zellen hindeuten. Gewebefaktorpositive Zellen in den Medien zeigten keine typische Glattmuskelzellmorphologie. Das Cytoplasma dieser Zellen verfärbte sich mit Eosin schlecht, wies kein typisches pfannkuchenförmiges Cytoplasma auf, sondern schien eher würfelförmig und wies kleine, dichte Kerne auf. Die Zellen mit dieser Morphologie verfärben sich typischerweise nicht mit Alpha- Glattmuskel-Actinantikörpern (HHF35) und müssen als undefiniert erachtet werden.
Die Immunocytochemie und in situ-Hybridisierung zeigen an, daß Gewebefaktor durch glatte Muskelzellen in der Tunica media und durch Fibroblasten in der anhaftenden, normale Gefäße umgebenden Adventitia synthetisiert wird. Es gab keinerlei Hinweis auf Gewebefaktor mRNA oder Proteinlokalisierung in Endothelialzellen irgendwelcher untersuchter Gefäße. Frühere Arbeiten zu Zellkulturen hatten nahegelegt, daß die Herbeiführung von Gewebefaktorsynthese durch die Endothelialzellen einen Prokoagulanten-Hauptmechanismus darstellt, durch den Endothelialzellen in der Homeostase beteiligt sind (Bevilacqua, Am.J.Pathol. 121: 393-403 [1985]); es wurde auch gezeigt, daß vaskuläre glatte Muskelzellen Gewebefaktor in viel größeren Mengen erzeugen (Maynard, J.Clin.Invest. 55: 814-824 [1975]). Das Herbeiführen der Endothelialgewebefaktor-Biosynthese kann ein normaler Mechanismus sein, durch den das Endothelium die Homeostase modifiziert oder alternativ eine Reaktion des Endotheliums auf Infektion und Endotoxinstimulation sein.

Atherosklerotische Plaques

Menschliche atherosklerotische Plaques, die aus einer Karotis-Endarterektomieoperation stammten, wurden mittels der obigen Verfahren hinsichtlich Gewebefaktor-mRNA und Protein untersucht. Man konnte in mehreren Bereichen atherosklerotischer Plaque (Fig.2) ausgedehnte mRNA-Hybridisierungen beobachten. Positive Zellen waren in der gesamten fibrösen Kappe, der Basis und dem Schulterbereich der Plaque sowie im nekrotischen Kern angrenzend zu den Cholesterinspalten (Fig.2c) verteilt. Die den Endarterektomie-Proben zugrundeliegenden normalen Medien enthielten keinerlei Gewebefaktor oder mRNA-positive Zellen. Sechs Plaques wurden gescreent, und Zellen, die eine positive Hybridisierung aufwiesen, konnten in allen von ihnen wahrgenommen werden. Die nekrotischen Kerne der Plaques waren durch eine ausgedehnte Gewebefaktorproteinlokalisierung in der extrazellulären Matrix, Insbesondere um die Cholesterinspalten, gekennzeichnet (Fig.2b). Man konnte eine zusätzliche Proteinverfärbung in den Makrophage-reichen Schaumzellbereichen atherosklerotischer Plaques feststellen (Fig.3). Solche schaumzellenreiche Bereiche lagen oft unterhalb der fibrösen Kappe und angrenzend zu den nekrotischen Kernen. Schließlich wurde wie bei den normalen Gefäßen keinerlei Gewebefaktor mRNA oder Protein in der Oberfläche oder dem Kapillarendothelium nachgewiesen. Von den 18 gescreenten Endarterektomieproben war nur eine Probe hinsichtlich TF-Immunfärbung negativ, zehn zeigten eine Lokalisierung zu Schaumzellen, secns zum nekrotischen Kern und acht zu mesenchymal erscheinenden Zellen. Es war möglich zu bestätigen. daß die Proteinfärbung und die in situ-Hybridisierung die gleichen Zellen auf seriellen Abschnitten markierten. Diese Beobachtung diente als Kontrolle sowohl für die Immunhistochemie- als auch die Hybridisierungsanalyse. Zusätzliche Kontrollen wurden in jedem Versuch auf seriellen Abschnitten durchgeführt. Die in situ- Hybridisierungen wurden durch Hybridisierung serieller Abschnitte mit PDGF-A Kette oder PDGF-rezeptorspezifischen cRNA-Sonden gesteuert (Wilcox, et al., J.Clin.Res. 82, 1988). Verschiedene Hybridisierungsmuster konnten im Vergleich zum Gewebefaktor bei diesen Sonden festgestellt werden. Die Gewebefaktor-Immunhistochemie wurde ständig durch die Inkubation serieller Abschnitte mit Präimmunserum gesteuert, das überhaupt keine Zellen markierte.
Atherosklerotische Plaques wiesen, wie sich herausstellte, wesentlich mehr Gewebefaktorprotein im Vergleich zu normalen saphenösen Venen, der inneren Brustarterie oder Bereichen normaler Medien, die der Plaque zugrundeliegen, auf. Gewebefaktorprotein-mRNA war sowohl in mesenchymal-artigen Intimalzellen in der atherosklerotischen Intima als auch in Makrophagen und Zellen angrenzend zu den Cholesterinspalten vorhanden, die ebenfalls Makrophage zu sein scheinen. Die Immuncytochemie zeigte an, daß eine beträchtliche Menge an Gewebefaktorprotein in der extrazellulären Matrix des nekrotischen Kerns der atherosklerotischen Plaque vorhanden ist. Dies ist nicht zellassoziiert, doch lokal synthetisiert, da Zellen angrenzend zu diesen Bereichen Gewebefaktor-mRNA enthalten. Gewebefaktorprotein im nekrotischen Kern kann von der Zelloberfläche der synthetischen Zellen abgestoßen (Bona, R. et al., Thromb.Res., 48: 487-500 [1987]) und anschließend in der umgebenden Lipidmatrix eingeschlossen werden. Alternativ dazu kann das Gewebefaktorprotein in diesem Bereich aus Zellen stammen, die starben und gewebefaktorreiche Membranen hinterließen.
Das Immunfärben von Makrophag-Schaumzellen legt nahe, daß in diesen Zellen Gewebefaktor intrazellulär und möglicherweise zelloberflächenassoziiert ist. Zu welchem Ausmaß solche Gewebefaktorlager Makrophage-abgeleitet sind, oder ob dieses Protein aus der Phagozytose der umgebenden Bruchstücke des nekrotischen Kerns stammt, ist nicht klar. Levy, J.Clin.Invest. 67: 1614-1622 (1981) haben gezeigt, daß bestimmte Lipoproteinfraktionen Prokoagulantenaktivität aus Monozyten/Makrophagen induzieren können. Die Herstellung von Gewebefaktor durch Makrophage wurde durch andere Forscher bewiesen (Tipping, Am.J.Pathol. 131: 206- 212 [1988]; Levy, oben). Zusätzlich haben die Autoren der vorliegenden Erfindung Makrophage mit Gewebefaktor mRNA gezeigt. Gewebefaktor stellt den endgültigen gemeinsamen Weg sowohl für den intrinsischen als auch den extrinsischen Koagulationsweg dar (Nemerson, Y., Blood 71: 1-8 [1988]). Er ist ein äußerst thrombogenes Peptid und erfordert nur Phospholipid und Faktor VII/VIIa, um Faktor X direkt und indirekt über Faktor IX-Aktivierung zu aktivieren, was zur Erzeugung von Thrombin führt. Faktor VII ist normalerweise in Blut vorhanden, benötigt jedoch das Binden an Gewebefaktor zur Aktivierung von Faktor X (Nemerson, Y., oben). Da es keine in vivo-Koagulation ohne vaskulären Schaden gibt, kann man davon ausgehen, daß Gewebefaktor Blut normalerweise nicht ausgesetzt sein würde (Nemerson, oben; Spicer, PNAS (USA) 84: 5148-5152 [1987]). Dies stimmt mit den Ergebnissen der Autoren der vorliegenden Erfindung überein, da Endothelialzellen aus normalen Gefäßen in direktem Kontakt mit Blut Gewebefaktor nicht synthetisieren oder lagern. Da Gewebefaktor in verstreuten glatten Muskelzellen in der Tunica media und in den am Gefäß anhaftenden Adventitialzellen vorhanden ist, wäre ein Bruch der Gefäßwand in diese Bereiche erforderlich, um das Blut signifikanten Lagern der Prokoagulantengewebefaktoraktivität auszusetzen. Zaugg et al.. J.Clin.Chem. und Clin.Biochem. 18: 545 (1980) zeigten als Unterstützung dieser Hypothese. daß eine geschädigte menschliche Aorta Faktor VII-abhängige Prokoagulantenaktivität zeigt.

BEISPIEL 4

Gewebefaktorkoagulations-Assays

Die funktionale Gewebefaktoraktivität wurde in menschlicher atherosklerotischer Plaque durch Inkubieren der Plaquefragmente mit Faktoren X und VII in Gegenwart von Kalzium gezeigt. Die Erzeugung von Xa in diesem System wurde durch seine Fähigkeit gemessen, das Gerinnen in menschlichem Faktor XII-armen Plasma herbeizuführen. In Abwesenheit von Plaque wurde keine meßbare Xa-Aktivität erzeugt (Fig.4, Kontrolle). Die Zugabe steigender Mengen von Plaque verringerte die Gerinnungszeit proportional: 40,3 ± 3 8 mg (n = 3 Plaques) ergab eine Gerinnungszeit von 112 ± 17,2 Sek., während 81,1 mg ± 12,3 mg (n= 3 Plaques) Plaque eine Gerinnungszeit von 73 ± 19 Sek. ergab. Plaques konnten in einem Puffer abgespült und zumindest viermal ohne Verlust der Gewebefaktoraktivität wiederverwendet werden. Diese Prokoagulantenaktivität konnte durch Vorinkubation des Gewebes mit dem oben beschriebenen affinitätsgereinigten Gewebefaktor-neutralisierenden Antikörper RD010 gehemmt werden (4,9 ug in einem Inkubationsvolumen von 75 ul verlängerte die Geringungszeit auf 431 ± 9,1 Sek. mit 40 ± 3,8 mg Plaquegewebe) (Siehe Fig.4). Eine völlige Umkehr der Prokoagulantenaktivität mit zunehmenden Antikörper- Konzentrationen konnte nicht erreicht werden. Diese Ergebnisse zeigen an, daß das in der Plaque durch Immunhistochemie nachgewiesene Gewebefaktorprotein aktiv ist und an der Einleitung der Koagulation beteiligt sein kann, wenn es in vivo freigesetzt oder ausgesetzt wird,
Fortgeschrittene menschliche Atherosklerose ist durch das Wuchern von glatten Intimalmuskelzellen und gleichzeitige Anhäufung von Fetten und entzündeten Zellen, einschließlich Makrophagen und T-Zellen innerhalb der atherosklerotischen Plaque, gekennzeichnet (Ross, N.Eng.J.Med. 314: 488-500 [1986]); Gown et al., Am.J.Pathol. 125: 191-207 [1986]; Jonasson, L., Arteriosclerosis 6: 131-138 [1986]). Thrombose ist üblicherweise das entscheidende Ereignis, das eine asymptomatische atherosklerotische Plaque in eine symptomatische umwandelt (Falk, Br.Heart J. 50: 127-134 [1983]; Sherman, N.Eng.J.Med. 315: 913-919 [1986]), während gesunde Arterien kaum jemals von Thrombose betroffen sind. Der Plaquebruch ist wahrscheinlich ein integrales Ereignis, das die Bildung von Blutgerinnseln heraufbeschwört (Ferrester, Circulation 75: 505-513 [1987]). Ein okklusiver muraler Thrombus begleitet die meisten Fälle akuter Myokardinfarkte (Buja, L.M., Am.J.Cardiol. 47: 343-356 [1981]). Plaquebruch oder -rißbildung liegt normalerweise solchen Thromben zugrunde, und in vielen Fällen sieht man, daß sich der Thrombus in den Bereich des nekrotischen Kerns der durch solche Risse ragenden Plaque erstreckt. Dies gilt sowohl für die Koronararterie (Falk, Br.Heart J. 50: 127-134 [1983]; Chapman, I., Arch.Pathol. 80: 256-261 [1965]; Drury, J.Path.Bact. 67: 207-215 [1954] und die Hirnarterien (Constantinides, Arch.Pathol. 83: 422-428 [1967]). Bis zur vorliegenden Erfindung wurde die Quelle der Thrombogenizität der Plaque nicht bestimmt; aber diese Ergebnisse zeigen, daß ein Thrombus resultiert, wenn die Blutkomponenten mit Gewebefaktorprotein, das innerhalb der Plaque vorhanden ist, in Kontakt kommen. Die Ergebnisse zeigen, daß a) eine signifikante Synthese von Gewebefaktorprotein in atherosklerotischen Plaques zu beobachten ist; b) daß sich Gewebefaktorprotein im nekrotischen Kern ansammelt und sich in schaumzellenreichen Bereichen der Plaque befindet; und c) daß in der Plaque Prokoagulantenaktivität aufgrund des Gewebefaktorproteins festzustellen ist (durch in vitro-Koagulationsassays bestimmt), die durch Gewebefaktorprotein-Antagonisten deutlich verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überproduktion und/oder der Einschluß von Gewebefaktorprotein in der atherosklerotischen Plaque bei der Thrombose und Reokklusion in Zusammenhang mit menschlichen atherosklerotischen Gefäßen Anschluß an eine thrombolytische Therapie eine wesentliche Rolle spielen kann.

BEISPIEL 5

Versuch für Herzkranzarterienthrombose

Nicht reinrassige Hunde oder Kaninchen, die etwa 20-25 kg bzw. 2-4 kg wogen, werden mit einer langsamen intravenösen Natriumpentobarbital-Injektion anästhesiert, inkubiert und auf einen künstlichen Ventilator plaziert. Ein linker Brustwandschnitt wird im Raum zwischen der 5. und 6. Rippe durchgeführt und ein Arterienkatheter zur Überwachung des Blutdrucks in die innere Brustarterie gesetzt. Procainamid (1,5 g intramuskulär an 2-3 Stellen injiziert) wird dann verabreicht, der Herzbeutel geöffnet und eine Perikardialschiene hergestellt. Die linke vordere hinunterführende Koronararterie wird vom Epikard ausgeschnitten, Seitenverzweigungen werden ligiert und ein 2,5 cm langes Segment isoliert. Eine elektromagnetische Flußsonde (Carolina Medical Electronics FM501, King, NC) wird auf den proximalsten Abschnitt des Segments gesetzt und intravenöses Lidocain (15 mg Bolus gefolgt von einer konstanten Infusion bei 1 mg/Min.) wird infundiert. Ein linkes Kontrollkoronarangiogramm wird durch händisches Injizieren von etwa 2 ml Renograffin 76 durch einen aus einer Karotidarterie eingesetzten modifizierten Judkin's 7 French Katheter durchgeführt. 1 ml Blut wird dann abgenommen und in einer Spritze zur späteren Verwendung bei der Bildung des Thrombus gehalten; danach wird Heparin (5000 E intravenöser Bolus) verabreicht. Zusätzliche 1000 E Heparin-Boli werden in stündlichen Intervallen verabreicht. Ein permanenter 2 mm breiter Konstriktor wird in die Nähe des distalen Endes des Segments gesetzt und so eingestellt, um den Koronar- bzw. Herzkranzarterienblutfiuß auf etwa 40 ± 10% der Kontrolle zu verringern.
Hochauflösende postmortale Angiogramme in ausgewählten Tieren zeigen, daß eine so angeordnete Konstriktion den Luminaldurchmesser um mehr als 90% verringert. Der proximal zur Konstruktion gelegenene eine Zentimeter Koronararterie wird von Blut entleert, und das Stück wird zwischen temporären Seidenschlingen isoliert. Durch das Fassen des Segments mit einer Zange wird intimaler Schaden herbeigeführt, und dann wird das Segment durch das Lösen der proximalen Schlinge und Injektion von Salzlösung rückwärts durch eine kanülenförmige Seitenverzweigung ausgespült. Das Segment wird dann erneut isoliert, und 0,2 ml Thrombin Parke-Davis topisches Thrombin, 1000 E/ml, Morris Plans, NJ) wird eingeführt. 0,1 ml des gelagerten Blutes wird in das isolierte Segment injiziert. Nach etwa 5 Minuten werden zunächst die proximalen und dann die distalen Knoten gelöst und der Seitenzweigkatheter entfernt. Während dieser Vorgangsweise blieb der Dauerkonstriktor an seiner Stelle.
Etwa 30 Minuten nach dem Injizieren des Thrombins und des Blutes, und nachdem ein wiederholtes Angiogramm das Vorhandensein einer vollständigen Koronararterienokklusion bestätigt, werden langsame intravenöse Injektionen von Gewebefaktorprotein-Antagonisten, Acetylsalizylsäure (35 mg/kg) oder Dipyridamol (0,6 mg/kg) verabreicht. Etwa 10 Minuten später wird eine 30-minütige Infusion von rt-PA (15 ug/kg/Min. für die zweikettige Form oder 30 ug/kg/Min. für die einkettige Form) begonnen.
Wenn eine partielle Koronararterienreperfusion nicht innerhalb der 30-minütigen Infusionsperiode eintritt, wird die rt-PA-Infusion weitere 30 Minuten lang fortgesetzt. Der Blutfluß im betroffenen Gefäß wird ständig überwacht. Ein Angiogramm wird sofort nach Wiederherstellung des Blutflusses durchgeführt. Die Reperfusionszeit wird als Anzahl der Minuten vom Beginn der rt-PA-Infusion bis zur Aufzeichnung der Reperfusion durch das Flußmeßgerät bestimmt und durch das wiederholte Angiogramm bestätigt, das ein vollständiges vorheriges Füllen der Arterie mit einer raschen Clearance des Farbstoffes (weniger als 4 Herzzyklen) zeigt. Nach Erzielung der Reperfusion wird der Blutfluß auf Hinweise einer Reokklusion überwacht, wobei man die endgültige Bestätigung wieder durch die Angiographie unter Anwendung der gleichen Kriterien wie bei der Einsetzung der Reperfusion erhält. Die Reokklusionszeit wird als Intervall zwischen der aufgezeichneten Reperfusion und der Reokklusion bestimmt. Das oben beschriebene Tiermodell simuliert die Reaktion menschlicher Patienten mit akutem Myokardinfarkt auf die thrombolytische Therapie in genauer Weise.
Die Blutungszeiten erfolgen vor und 30 Minuten nach den Injektionen von Gewebefaktorprotein-Antagonisten mit einem federnbeladenen Klingengerät (Simplate , General Diagnostic Morris Plains, NJ oder Surgicutt Int. Technidyne Corp., Edison, NJ), das an ein rasiertes Vorderbein angelegt wird. Venöse Blutproben zur Bestimmung der Fibrinogenwerte, die aktivierte partielle Thromboplastinzeit und die ADP-induzierte Blutplättchenaggregation werden in einem 150 KIU/ml Aprotinin enthaltenden 0,01 M Citrat gesammelt (Sigma, St. Louis, MO). Die Blutplättchenzählungen erfolgen auf Blut, das unter Verwendung eines automatischen Teilchenzählers (Coulter, Hialeah, FL) in EDTA gezogen wird.

BEISPIEL 6

Vergleich von thrombolytischer Wirksamkeit und der Auswirkung auf die Reokklusion von Bolus-Injektionen von rt-PA und rt-PA plus Gewebefaktorprotein-Antagonisten

Die thrombolytische Wirksamkeit und die Auswirkung auf die Reokklusion von Bolus- Injektionen von rt-PA alleine wird mit jener kombinierter Injektionen von rt-PA und Gewebefaktorprotein-Antagonisten unter Verwendung des Tiermodells von Beispiel 5 verglichen.
Bolus-Injektionen von 450 ug/kg rt-PA in 15-minütigen Intervallen werden verabreicht (mit hochgradiger, d.h. über 90%iger, überlagerter Stenose).
An die Injektion von etwa 0,01 bis 25,0 mg/kg Gewebefaktorprotein-Antagonist schließt sich 10 Minuten später eine einzelne Bolus-Injektion von 450 ug/kg rt-PA in Hunden an, um sie auf Reperfusion innerhalb von 5-10 Minuten ohne Reokklusion während eines Beobachtungszeitraums von 2 Stunden zu testen.

BEISPIEL 7

Umgekehrte arterielle Verpflanzung

Kaninchen wurden mit Pentobarbital anästhesiert. Die Oberschenkelarterie wurde herausgeschnitten und ein 4-7cm langes Segment durch Hämostatklemmen isoliert. Eine elektromagnetische Flußsonde (Carolina Medical Electronics, King, NC) wurde auf den proximalsten Abschnitt des Segments gesetzt. Das Oberschenkelarteriensegment wurde dann entfernt, umgekehrt und wieder an die richtige Stelle genäht. Die Klemmen wurden dann entfernt und der Blutfluß wiederhergestellt. Normalerweise trat innerhalb von Minuten ab dem Freigeben der Hämostatklemmen eine völlige Okklusion (gemessen durch die Einstellung des Blutflusses des umgekehrten Arteriensegments durch einen blutplättchenreichen Thrombus auf. Verschiedene Behandlungen, darunter die Injektion von Gewebefaktorprotein-Antagonisten alleine oder in Kombination mit tPA und/oder Inhibitoren von Blutplättchenaggregation, wurden anhand der Zeit der durch das Flußmeßgerät gemessenen Arterienokklusion bewertetet. Die postmortale Pathologie umfaßte die Untersuchung des umgekehrten Arteriensegments durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um das Ausmaß der Blutplättchenablagerung zu bestimmen.
Die Blutungszeiten wurden vor und 30 Minuten nach den Injektionen von Gewebefaktorprotein-Antagonisten mit einer an das Ohr angelegten federnbeladenen Klingenvorrichtung gemessen. Venöse Blutproben wurden zur Bestimmung der Fibrinogenwerte, der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit und der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation entnommen. Die Plättchenzählungen erfolgten unter Verwendung eines automatischen Teilchenzählers auf Blut, das in EDTA gezogen wurde.
Die Kaninchen wurden wie oben präpariert und mit 150 E/kg Heparin intravenös und mit 3 mg/kg Gewebefaktorprotein-Antagonist D3 (einem in Beispiel 1 beschriebenen monoklonalen Antikörper) intravenös 10 Minuten vor dem Lösen der Hämostatklemmen injiziert. Eine zusätzliche Menge von 9 mg/kg des Gewebefaktorantagonisten wurde im Anschluß an das Lösen der Klemmen über die epigastritische Oberflächenarterie injiziert. Drei von drei Tieren zeigten nach 30 Minuten keine Okklusion, während die mit Heparin alleine behandelten Kontrolltiere innerhalb der ersten zehn Minuten okkludierten.

Claims

1. Verwendung eines Gewebefaktorproteinantagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Myokardinfarkt, umfassend die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Gewebefaktorproteinantagonisten, um Reokklusion zu verhindern, und eines thrombolytischen Wirkstoffs in einer therapeutisch wirksamen Menge, um ein Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen.

2. Verwendung eines Gewebefaktorproteinantagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Angioplastie, umfassend die gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Gewebefaktorproteinantagonisten, um Reokklusion zu verhindern, und eines thrombolytischen Wirkstoffs in einer therapeutisch wirksamen Menge, um ein Fibrin- Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Verabreichung an den Patienten mittels intravenöser Infusion zu erfolgen hat.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Verabreichung an den Patienten mittels Bolus zu erfolgen hat.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin der Bolus intravenös zu injizieren ist.

6. Verwendung nach Anspruch 4, worin dem Patienten ein erster Bolus, der den Gewebefaktorproteinantagonisten enthält, und anschließend ein zweiter Bolus, der thrombolytischen Wirkstoff enthält, zu verabreichen ist.

7. Verwendung nach Anspruch 4, worin dem Patienten ein erster Bolus, der thrombolytischen Wirkstoff enthält, und anschließend ein zweiter Bolus, der den Gewebefaktorproteinantagonisten enthält, zu verabreichen ist.

8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Gewebefaktorproteinantagonist ein Antikörper ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.

10. Verwendung nach Anspruch 8, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der thrombolytische Wirkstoff aus Streptokinase, Urokinase, Prourokinase und Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ausgewählt wird.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin der thrombolytische Wirkstoff ein Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ist.

13. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Gewebefaktorproteinantagonist in einer Dosis im Bereich von ungefähr 0,01-25,0 mg pro Kilo Körpergewicht des Patienten, und der thrombolytische Wirkstoff in einer Dosis im Bereich von ungefähr 0,01-2,5 mg pro Kilo Körpergewicht des Patienten verabreicht wird.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-13, worin diese Zusammensetzung weiters einen Antikoagulanten enthält und zur Verwendung bei einem Verfahren dient, das einen zusätzlichen Schritt der Verabreichung eines Antikoagulanten in einer therapeutisch wirksamen Menge umfaßt.

15. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Myokardinfarkt, die therapeutisch wirksame Mengen eines Gewebefaktorproteinantagonisten und eines thrombolytischen Wirkstoffs zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verabreichung umfaßt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin der Gewebefaktorproteinantagonist ein Antikörper ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, worin der thrombolytische Wirkstoff aus Streptokinase, Urokinase, Prourokinase und Plasminogenaktivator vom Gewebetyp ausgewählt ist.