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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Inhibition intimaler
Hyperplasie, einschließlich
Restenose bei einem Säugetier
infolge von Gefäßverletzung,
und Zusammensetzungen, die bei diesen Verfahren nützlich sind.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
Proliferation glatter Muskelzellen (SMCs) in der Gefäßwand ist
ein wichtiges Ereignis bei der Bildung vaskulärer Läsionen bei der Atherosklerose,
nach Gefäßwiederherstellung
oder in Antwort auf eine andere Gefäßverletzung. Zum Beispiel beinhaltet
die Behandlung von Atherosklerose häufig das Ausräumen verstopfter
Gefäße durch
Angioplastie, Endarteriektomie oder Reduktionsarteriektomie oder
durch Bypasstransplantierung, chirurgische Eingriffe, bei denen
atherosklerotische Plaques komprimiert oder durch Katheterisierung
(Angioplastie) entfernt, durch eine Inzision von der arteriellen
Wand abgestreift (Endarteriektomie) oder durch natürliche oder
synthetische Transplantate umgangen werden. Diese Eingriffe entfernen
das vaskuläre Endothel,
beeinträchtigen
die darunter liegende intimale Schicht und resultieren in dem Absterben
medialer SMCs. Diese Verletzung wird durch mediale SMC-Proliferation
und Migration in die Intima gefolgt, begleitet durch eine übermäßige Ablagerung
extrazellulärer
Matrix. Diese Läsionentwicklung
tritt charakteristischerweise innerhalb der ersten paar Wochen und
bis zu sechs Monate nach der Verletzung auf und endet, wenn die darüber liegende
endotheliale Schicht wieder hergestellt ist. Bei Menschen bestehen
diese Läsionen
aus ungefähr
20% Zellen und 80% extrazellulärer
Matrix.
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Bei
ungefähr
30% oder mehr Patienten, die durch Angioplastie, Endarteriektomie
oder Bypasstransplantate behandelt wurden, verursacht Thrombose
und/oder SMC-Proliferation
in der Intima einen Wiederverschluss des Gefäßes und daraus folgend Versagen
der Wiederherstellungsoperation. Dieser Verschluss des Gefäßes infolge
einer Operation ist als Restenose bekannt.
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Ein ähnlicher
Vorgang der SMC-Proliferation wurde auch bei Organtransplantaten
beobachtet und kann zu Transplantatatherosklerose und Organversagen
beitragen. Die intimale Verdickung bei diesem Vorgang betrifft nur
das transplantierte Organ.
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Es
wurde postuliert, dass Thrombozytenmitogene wie der Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), eine
Rolle bei der Entwicklung atherosklerotischer Plaques spielt (siehe
Ross et al., Cell 46: 155–169,
1986; Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987). Ein vorgeschlagener
Mechanismus für
die Plaquebildung ist die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die
SMC-Wachstum stimulieren, durch Thrombozyten an Stellen endothelialer
Abtragung (Ross and Glomset, N. Eng. J. Med. 295: 369–377, 420–425, 1976;
Ross, Arteriosclerosis 1: 293–311,
1981). Moore et al. (Thrombos. Haemostas. Stuttg.) 35: 70, 1976)
und Friedman et al. (J. Clin. Invest. 60: 1191–1201, 1977) berichteten unter
Verwendung eines in situ-Katheterverletzungsmodells über eine
Inhibition experimentell induzierter intimaler Läsionsbildung in Kaninchenarterien
durch anhaltende Thrombozytopenie, die durch Verabreichung eines
Antithrombozytenserums induziert wurde. Es wurde auch postuliert,
dass SMCs selber PDGF, das die Läsionentwicklung
durch einen autokrinen Mechanismus stimuliert, herstellen könnten (Ross
et al., ebenda; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7311–7315, 1986). Fingerle
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8412–8416, 1989) untersuchte intimate
Läsionsbildung
bei thrombozytopenischen Ratten und schloss, dass Thrombozyten keine
Rolle bei der initialen SMC-Proliferation nach Ballonverletzung
spielen, aber die SMC-Migration
in die Intima regulieren könnten.
Thrombozyten sind nun dafür
bekannt, eine Anzahl von Wachstumsfaktoren einschließlich PDGF,
epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), transformierende Wachstumsfaktoren
alpha und beta (TGFα und
TGFβ), insulinähnlichen
Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und Thrombozyten-Wachstumsfaktor der Endothelialzelle
wie auch verschiedene chemische Attraktanzmoleküle freizusetzen. Obwohl bestimmte
Studien PDGF mit Vorgängen,
die an der Läsionentwicklung
beteiligt sind, in Verbindung bringen, haben keine Studien die Beteiligung
von PDGF bei diesen Vorgängen
bei Primaten gezeigt.
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Die
Entfernung atherosklerotischer Plaques durch Angioplastie oder Endarteriektomie
weist eine begrenzte Effizienz auf und es ist keine effektive Behandlung
der Restenose von behandelten Gefäßen oder der Stenose von Bypasstransplantaten
entwickelt worden. In dem Fachgebiet besteht daher ein Bedarf an
Verfahren zur Reduktion oder Verhinderung der Entwicklung SMC-reicher
Läsionen
in vaskulären
Wänden,
einschließlich
der Stenose von Blutgefäßen nach
Gefäßverletzung,
wie einer Verletzung aufgrund einer Ballonkatheterisierung, Endarteriektomie
oder Reduktionsarteriektomie, wie auch bei Gefäßtransplanten, Organtransplantaten
und Kathetereinbringungen.
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Die
internationale Patentanmeldung WO 94/19016 offenbart Verfahren zur
Inhibition intimaler Hyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugetieres,
umfassend die Verabreichung eines anti-PDGF-Rezeptorantikörpers an
das Säugetier.
Die Beispiele 1 bis 13 und 1 bis 9 haben
WO 94/19016 und die vorliegende Anmeldung gemeinsam.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Thrombozyten-Wachstumsfaktor
(PDGF)-Antagonisten und Heparin bei der Herstellung eines Medikamentes
zur Inhibition intimaler Hyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugetieres
bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines
PDGF-Antagonisten bei der Herstellung eines Medikamentes, das gleichzeitig
mit Heparin für
die Behandlung vaskulärer hyperproliferativer
Erkrankungen verabreicht werden soll, bereit. Beispiele intimaler
Hyperplasie schließen Restenose
nach Angioplastie, Endarteriektomie und anderen Eingriffen, bei
denen atherosklerotische Plaques aus Blutgefäßen entfernt werden, mit ein.
Medikamente gemäß der Erfindung
können
eine effektive Menge eines PDGF-Rezeptorantikörpers zur
Inhibition intimaler Hyperplasie umfassen.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird es vorgezogen, einen Antithrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptorantikörper in
einer Menge zu verwenden, die ausreicht, um Mitogenese und/oder
Migration glatter Muskelzellen zu inhibieren. Ein anti-PDGF-Rezeptorantikörper kann
gleichzeitig oder alternativ sequentiell mit einem Heparin verabreicht
werden.
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Gemäß der Erfindung
können
Medikamente eine effektive Menge an anti-PDGF-Rezeptorantikörper wie einen anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper, einen
anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper oder
eine Gruppe von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern umfassen. Bei einer Ausführungsart
ist die Antikörpergruppe
in der Lage, die Bindung der AA-, AB- und BB-Isoformen von PDGF
an PDGF-Rezeptoren zu inhibieren.
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Medikamente
gemäß der Erfindung
können
einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper
umfassen, der einem Säugetier
gleichzeitig mit oder innerhalb eines antihyperplastisch effektiven
Zeitraumes vor dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung bei dem Säugetier
verabreicht werden kann. Beispiele akuter Gefäßverletzungen schließen vaskuläre Wiederherstellungseingriffe
wie Angioplastie, Endarteriektomie, Reduktionsarteriektomie und
Anastomose eines Gefäßtransplantates
mit ein. Bei einem verwandten Aspekt wird der Antikörper gleichzeitig
mit oder innerhalb eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes
vor dem Einbringen eines Gefäßtransplantats
oder transplantierten Organs verabreicht. Bei anderen Ausführungsarten
wird der Antikörper innerhalb
eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes nach dem Auftreten
einer akuten Gefäßverletzung oder
dem Einbringen eines Gefäßtransplantates
oder transplantierten Organes verabreicht.
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Medikamente
gemäß der Erfindung,
die die Antikörper
umfassen, können
verwendet werden, um intimale Hyperplasie, die innerhalb eines Gefäßtransplantates
oder eines transplantierten Organs auftritt, zu inhibieren.
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Medikamente
gemäß der Erfindung,
die einen PDGF-Antagonisten und Heparin umfassen, können koordiniert
in den jeweiligen Mengen an Antikörper und Heparin, die ausreichen,
um kombiniert die Hyperplasie zu inhibieren, verabreicht werden.
Der Antagonist und Heparin können
gleichzeitig oder alternativ sequentiell verabreicht werden, wobei
entweder der Antagonist oder Heparin zuerst verabreicht wird, und
der nicht verabreichte Rest an Antagonist und Heparin innerhalb
eines effektiven Zeitraumes danach verabreicht wird. Bei einer Ausführungsart
ist der PDGF-Antagonist ein nicht-peptidischer PDGF-Antagonist. Bei einer
anderen Ausführungsart
ist der PDGF-Antagonist
ein anti-Wachstumsfaktor-Rezeptorantikörper wie ein anti-PDGF-Rezeptorantikörper.
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Bei
verwandten Ausführungsarten
inhibiert der koordiniert verabreichte Antikörper oder andere PDGF-Antagonist
und Heparin kombiniert ein oder mehrere der intimalen hyperplastischen
Vorgänge
der glatten Gefäßmuskelzellproliferation,
glatten Gefäßmuskelzellmigration
und/oder neointimalen Ablagerung extrazellulärer Matrix. Bei weiteren Ausführungsarten
ist der Antikörper
entweder ein anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper, ein anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper oder
eine Gruppe von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern. Bei zusätzlichen
Ausführungsarten
inhibiert der Antikörper
oder andere PDGF-Antagonist eine Rezeptorfunktion des Wachstumsfaktorrezeptors,
wie die Bindung des Rezeptors an einen Rezeptorliganden, oder die
Dimerisation des Wachstumsfaktorrezeptors. Bei anderen Ausführungsarten
wird ein anti-PDGF-Antikörper
oder anderer PDGF-Antagonist verabreicht, der die Bindung eines
oder mehrerer der AA-, AB- und BB-Isoformen von PDGF an PDGF-Rezeptoren
inhibiert. Bei anderen Ausführungsarten
umfasst das Heparin ein Heparansulfat oder ein niedermolekulares
Heparin, das durch den Besitz einer reduzierten antithrombotischen
Aktivität
charakterisiert wird.
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Medikamente
gemäß der Erfindung,
die einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder anderen PDGF-Antagonisten
und Heparin umfassen, können
koordiniert an ein Säugetier
gleichzeitig mit oder innerhalb eines effektiven Zeitraumes vor
dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung
bei dem Säugetier
verabreicht werden. Akute Gefäßverletzungen
schließen
Gefäßverletzungen,
die durch Gefäßwiederherstellung, einschließlich Verletzungen
aufgrund von Angioplastie, endovaskulärer Stentsetzung, Endarteriektomie, endovaskulärer Laserablation,
Reduktionsarteriektomie und Anastomose eines Gefäßtransplantates entstehen,
mit ein. Bei verwandten Aspekten kann ein PDGF-Antagonist und Heparin
gleichzeitig mit oder innerhalb eines therapeutisch effektiven Zeitraumes
vor dem Einbringen eines Gefäßtransplantates
oder transplantierten Organs verabreicht werden. Bei anderen Ausführungsarten
werden ein PDGF-Antagonist und Heparin innerhalb eines antihyperplastisch
effektiven Zeitraumes nach dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung
oder dem Einbringen eines Transplantates oder eines transplantierten
Organs verabreicht.
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Die
Erfindung stellt auch Produkte, die Heparin und einen PDGF-Antagonisten
als ein kombiniertes Präparat
für simultane,
getrennte oder sequentielle Verwendung für die Behandlung vaskulärer hyperproliferativer
Erkrankungen enthalten, bereit.
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Vorzuziehende
Produkte der Erfindung beinhalten Antikörper und Heparin in einem Antikörper : Heparin-Gewichtsverhältnis zwischen
ungefähr
0,01 : 1 und 100 : 1, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05
: 1 und 20 : 1. In einer Ausführungsform
umfasst das Heparin ein niedermolekulares Heparin mit reduzierter
antithrombotischer Aktivität
oder es umfasst ein Heparansulfat.
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Bei
wieder einem anderen Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische
Kits zur Behandlung intimaler Hyperplasie bei einem Säugetier
bereitgestellt, wobei die Kits einen PDGF-Antagonisten wie einen
anti-PDGF-Rezeptorantikörper
oder einen nicht-peptidischen
PDGF-Antagonisten und Heparin in einem pharmakologisch geeigneten
Trägerstoff
beinhalten. Bei einer Ausführungsart
werden der Antagonist und Heparin in einem einzigen Trägerstoff
vorher kombiniert. Bei einer anderen Ausführungsart werden der Antagonist
und Heparin durch simultane, getrennte oder sequentielle Abgabe
verabreicht.
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Antikörper, die
für die
vorliegende Erfindung nützlich
sind, schließen
monoklonale Antikörper
und gentechnisch hergestellte Antikörper mit ein, wobei die letzteren
Einzelstrangantikörper,
chimäre
Antikörper,
bifunktionelle Antikörper
und Immunkonjugate beinhalten.
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Heparinpräparate,
die für
die vorliegende Erfindung nützlich
sind, schließen
unfraktionierte oder fraktionierte Heparine und heparinähnliche
Glykosaminoglykane einschließlich
Heparansulfaten mit ein: Ebenfalls nützlich sind niedermolekulare
Heparine einschließlich
antikoagulierender und nicht-antikoagulierender Fragmente und Derivate
von Heparin und heparinähliche
Glykosaminoglykanen.
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Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden im Zusammenhang mit der
folgenden ausführlichen Beschreibung
und den anhängenden
Zeichnungen offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 veranschaulicht
die Bindung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper an Zellen, die rekombinanten
PDGF-beta-Rezeptor exprimieren. Die Ergebnisse werden als mittlere
cpm, gebunden von 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG
für dreifache
Bestimmungen ausgedrückt.
Die Balken zeigen die Standardabweichung an.
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2 veranschaulicht
die Bindung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper an Zellen, die rekombinanten
PDGF-alpha-Rezeptor exprimieren. Die Ergebnisse werden als mittlere
cpm, gebunden von 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG
für dreifache
Bestimmungen ausgedrückt.
Die Balken zeigen die Standardabweichung an.
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Die 3A–3C veranschaulichen
die Inhibition der mitogenen PDGF-Aktivität auf humanen dermalen Fibroblasten
durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Die Ergebnisse werden
als der durchschnittliche Level des [3H]Thymidin-Einschlusses
für jede
der PDGF-Ligandentestbedingungen dargestellt. Die Standardabweichung
wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt. Jedes Feld zeigt
auch die Standardkurve für
den PDGF-Liganden alleine. A) PDGF-AA-Stimulation, B) PDGF-AB-Stimulation,
C) PDGF-BB-Stimulation.
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4 veranschaulicht
die Inhibition von mitogener PDGF-AA-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden
allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche
Level des [3H]-Thymidin-Einschlusses dargestellt. Die
Standardabweichung wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt.
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5 veranschaulicht
die Inhibition von mitogener PDGF-AB-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden
allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden wie in 4 dargestellt.
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6 veranschaulicht
die Inhibition von mitogener PDGF-BB-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden
allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden wie in 4 dargestellt.
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7A und B veranschaulichen die Titrierung von repräsentativen
monoklonalen Antikörpern,
um die mitogene Aktivität
von PDGF-AA auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren. Die Ergebnisse
werden als der durchschnittliche Level des [3H]-Thymidin-Einschlusses
für jede
der PDGF-AA-Testbedingungen dargestellt. Die Standardabweichung
wird durch das T für
die PDGF-AA-Standardkurvenproben gezeigt. (A) Standardkurve der
mitogenen PDGF-AA-Aktivität.
(B) Inhibitorische Wirksamkeit der MAks 169.14 und 169.31 für die mitogene
PDGF-AA-Aktivität
wie durch eine Abnahme das Levels des [3H)-Thymidin-Einschlusses
gezeigt wird.
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8 veranschaulicht
die Inhibition der mitogenen Pavianserum-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für das Serum
allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche
Level des [3H]-Thymidin-Einschlusses dargestellt. Die
Standardabweichung wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt.
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9 veranschaulicht
die mitogene Aktivität
von Pavianserum in der Gegenwart von monoklonalem anti-PDGF-alpha-Rezeptor-Antikörper 169.31
auf glatten Pavianmuskelzellen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Wie
oben bemerkt, ist die Restenose von Blutgefäßen ein häufiges Problem bei Patienten,
bei denen eine Angioplastie, Endarteriektomie oder eine Bypasstransplantation
durchgeführt
wurde. Die Restenose ist ein Beispiel intimaler Hyperplasie, von
der man glaubt, dass sie über
einen Vorgang voranschreitet, der sowohl Proliferation (Mitose)
und Migration glatter Gefäßmuskelzellen
in den Bereich, der durch den operativen Eingriff geschädigt wurde,
wie auch die Produktion (Ablagerung) extrazellulärer Matrix mit einschließt. Siehe
im Allgemeinen (Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987; DeFeudis, Drug
News and Perspectives 5: 49–51, 1992).
Dieser proliferative Vorgang manifestiert sich auch in dem Verschluss
von Gefäßtransplantaten
(sowohl natürlicher,
einschließlich
autologer und allogener wie auch synthetischer) und bei transplantierten
Organen. Dieser proliferative Vorgang resultiert in der Entwicklung
von Läsionen,
die reich an glatten Muskelzellen sind, und wird hier als intimale
Hyperplasie bezeichnet.
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Medikamente
gemäß der Erfindung
können
verwendet werden, um die Entwicklung SMC-reicher Läsionen durch
die Verwendung von Antikörpern
gegen PDGF-Rezeptoren
und durch die Verwendung anderer PDGF-Antagonisten, insbesondere
nicht-peptidischer PDGF-Antagonisten zu inhibieren. Die Bezeichnung "nicht-peptidisch" bezieht sich auf
andere Verbindungen als Proteine oder andere peptidge bundene Multimere. Solche
Läsionen
resultieren in der partiellen oder vollständigen Blockierung eines Blutgefäßes durch
intimate Verdickung (Hyperplasie). Es wird verstanden werden, dass
die Inhibition der intimalen Hyperplasie die Beeinträchtigung
des proliferativen Prozesses durch Reduktion oder Verhinderung eines
oder mehrere hyperplastischer Prozesse einschließlich Zellmigration, Zellproliferation
und der Bildung extrazellulärer
Matrix mit einschließt.
Durch die Blockierung der Proliferation und/oder Migration durch
Störung
der Wechselwirkung von PDGF und seinen Rezeptoren, kann die SMC-Proliferation
und darauf folgende Matrixablagerung vermindert werden. Eine Reduktion
der intimalen Hyperplasie manifestiert sich klinisch als eine signifikante
Abnahme des Verlustes an Lumenvolumen nach akuter Gefäßverletzung.
Solch eine Reduktion wird im Allgemeinen in einem verminderten Bedarf
an Revaskularisierungseingriffen (z. B. wiederholten Angioplastien)
an dem Ort der anfänglichen
Verletzung resultieren.
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Medikamente
der vorliegenden Erfindung können
besonders nützlich
bei der Behandlung intimaler Hyperplasie aufgrund akuter Gefäßverletzung
sein. Akute Gefäßverletzungen
sind solche, die schnell auftreten (sprich über Tage bis Monate), im Gegensatz
zu chronischen Gefäßverletzungen
(z. B. Atherosklerose), die sich im Verlauf eines Lebens entwickeln.
Akute Gefäßverletzungen
resultieren häufig
aus operativen Eingriffen wie Gefäßwiederherstellung, wobei die
Techniken der Angioplastie, Endarteriektomie, Arteriektomie, Einbringen
von Gefäßtransplantaten
oder dergleichen angewendet werden. Hyperplasie kann auch als verzögerte Antwort
in Antwort auf z. B. Einbringen eines Transplantates oder Organtransplantation
auftreten.
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Die
vorliegende Erfindung verwendet PDGF-Antagonisten, um intimate Hyperplasie
in dem Gefäßsystem
eines Säugetieres
zu inhibieren. PDGF-Antagonisten werden vorteilhaft in Kombination
mit Heparin verwendet. PDGF-Antagonisten, die für die vorliegende Erfindung
nützlich
sind, schließen
nicht-peptidische PDGF-Antagonisten und peptidische PDGF-Antagonisten
wie anti-PDGF-Rezeptorantikörper
mit ein.
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Eine
besonders vorzuziehende Gruppe nicht-peptidischer PDGF-Antagonisten
beinhaltet Brefeldin A (1,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a-Decahydro-1,13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-on)
und Derivate davon. Brefeldin A besitzt die Struktur:
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Es
wurde herausgefunden, dass Brefeldin A die mitogene PDGF-Aktivität auf glatten
Pavianmuskelzellen inhibiert, wobei diese Aktivität in der
Gegenwart von Heparin verstärkt
wird.
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Antikörper, die
für die
vorliegende Erfindung nützlich
sind, können
durch konventionelle Verfahren der Immunisierung und Reinigung hergestellt
werden. Kurz gefasst wird ein PDGF-Rezeptor, Rezeptorfragment oder
Fusionsprotein, das ein Rezeptorpolypeptid umfasst, vorzugsweise
gereinigt, einem Tier wie einer Maus, Ratte, einem Kaninchen oder
einer Ziege in einer Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort
hervorzurufen, verabreicht. Es wird vorgezogen, den Wachstumsfaktorrezeptor
kombiniert mit einem Adjuvans, wie dem Freund-Adjuvans, zu verabreichen,
um die Immunantwort zu verstärken.
Obwohl eine einzige Injektion des Antigens ausreichen kann, um die
Antikörperproduktion
bei dem Tier zu induzieren, wird es im Allgemeinen vorgezogen, eine
große
anfängliche
Injektion, gefolgt von ein oder mehreren Auffrischungsinjektionen über einen Zeitraum
von mehreren Wochen bis mehreren Monaten zu verabreichen. Siehe
z. B. Hurrell, J. G. R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques
and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1982, welches hier
durch Verweis eingeschlossen ist. Es wird dann Blut von dem Tier
abgenommen und man lässt
es gerinnen, und Antikörper
werden unter Verwendung konventioneller Techniken wie Salzpräzipitation,
Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie
aus dem Serum isoliert.
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Bei
einer Ausführungsart
der Erfindung werden monoklonale Antikörper verwendet. Monoklonale
Antikörper
liefern die Vorteile der Leichtigkeit der Herstellung und geringerer
therapeutischer Dosen im Vergleich zu polyklonalen Antiseren, da
nur Antikörper
der gewünschten
Spezifität
verwendet werden. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind
auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden zum Beispiel durch Kohler
und Milstein Nature 256: 495, 1975; Eur. J. Immunol. 6: 511–519, 1976)
offenbart. Siehe auch Hurrell, J. G. R., ed., Monoclonal Hybridoma
Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL,
1982 und Hart, US-Patent Nr. 5,094,941. Von Fachleuten auf dem Gebiet
wird erkannt werden, dass auch Antikörperfragmente, wie Fab-Fragmente,
verwendet werden können.
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Es
wird im Allgemeinen vorgezogen, Antikörper zu verwenden, die mit
dem Patienten syngenetisch sind, oder die syngenetische konstante
Regionen enthalten. Aus diesem Grund werden im Allgemeinen genetisch
hergestellte Antikörper,
die menschliche Gerüststrukturen
enthalten, bei der Behandlung von Menschen verwendet werden. Verfahren
zur Herstellung rekombinanter menschlicher Antikörper oder humanisierter nicht-menschlicher (sprich
chimärer)
Antikörper
werden durch Cabilly et al. (US-Patent Nr. 4,816,567), Robinson
et al. (WO 87/02671) und Neumaier (WO 90/00616) offenbart. Kurzgefasst
werden menschliche konstante Regiongene mit geeigneten menschlichen
oder nicht-menschlichen variablen Regiongenen vereinigt. Zum Beispiel
werden die Aminosäuresequenzen,
die die Antigen-Bindungsstellen (CDRs oder komplimentaritätsbestimmende
Regionen) des monoklonalen Maus-Eltern-Antikörpers darstellen, auf dem DNA-Level
auf menschliche variable Regiongerüstsequenzen transplantiert.
Dieses Verfahren ist als "Humanisierung" bekannt. Verfahren
für diese
Technik sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel
durch Jones et al. (Nature 326: 522–525, 1986), Riechmann et al.
(Nature 322: 323–327,
1988) und Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033,
1989) offenbart.
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Die
vereinigten Gene werden dann in Wirtszellen, die gemäß konventionellen
Verfahren kultiviert werden, transfiziert. Alternativ werden monoklonalen
Antikörper
produzierende Zellen mit geklonten menschlichen konstanten Regiongenen
transfiziert und chimäre
Antikörpergene
werden durch homologe Rekombination hergestellt. So ist es möglich, monoklonale
Antikörper,
bei denen ein wesentlicher Anteil der Struktur menschlich ist, zusammenzubauen,
wodurch Antikörper
bereitgestellt werden, die für
vielfache Anwendungen bei menschlichen Patienten besser geeignet
sind.
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Alternativ
kann ein einkettiger Antikörper
durch die Expression eines rekombinanten Polypeptids, das im Allgemeinen
aus einer variablen leichten Ketten-Sequenz, die typischerweise über ein
Linkerpolypeptid mit einer variablen schweren Ketten-Sequenz verbunden
ist, besteht, entwickelt werden. Verfahren zur Herstellung von einkettigen
Antikörpern
sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel durch Davis
et al. (BioTechnology 9: 165–169,
1991) offenbart.
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Es
wurden zwei PDGF-Rezeptorpolypeptide beschrieben. Diese werden als "alpha-Rezeptor" (Kelly et al., WO
90/14425; Kelly et al., US-Patent Nr. 5,371,205; Claesson-Welsh et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917–4921,
1989) und "beta-Rezeptor" (Claesson-Welsh
et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3476–3486, 1988; Gronwald et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988) bezeichnet. In
der Gegenwart des PDGF-Liganden
dimerisieren die Rezeptorpolypeptide. So sind drei Rezeptorsubtypen
möglich: αα, αβ und ββ. Der β-Rezeptor
ist spezifisch für
die B-Kette von PDGF, während
der α-Rezeptor
die A-Kette und die B-Kette bindet. Daraus folgt, dass die wachstumsregulierende
Reaktionsbereitschaft von Zellen gegenüber PDGF nicht nur von der
Verfügbarkeit
von PDGF-AA, -AB und -BB-Ligandisoformen abhängt, sondern auch von der Expression
und Verfügbarkeit
verschiedener PDGF-Rezeptorsubtypen (Heldin et al., Cell. Regul.
1: 555–566,
1990). Menschliche glatte Muskelzellen exprimieren sowohl α- wie auch β-Rezeptorsubtypen
(Heldin et al., Cell Regul. 1: 555–566, 1990), aber es sind andere
Zelltypen bekannt, die nur einen einzelnen Rezeptorsubtyp exprimieren
(Gronwald et al., J. Biol. Chem. 264: 8120–8125, 1989).
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Die
anti-PDGF-Rezeptorantikörper,
die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise
eine Gruppe von Antikörpern,
die in der Lage sind, alle drei PDGF-Rezeptorisoformen (αα, ββ und αβ) zu inhibieren.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Gruppe" eine Kombination aus zwei oder mehr
Antikörpern
mit verschiedenen Spezifitäten.
Die Antikörper
können
spezifisch für
verschiedene Antigene oder für
verschiedene Epitope auf einem einzelnen Antigen sein. Monoklonale
Antikörper
(MAks) werden vorgezogen.
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Wie
oben bemerkt, beeinträchtigen
die Antikörper,
die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Wechselwirkung
von PDGF und seinen Rezeptoren. In vorzuziehenden Ausführungsarten
der Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper verwendet, die die Bindung
eines PDGF-Liganden an einen PDGF-Rezeptor inhibieren, obwohl Fachleute
auf dem Gebiet erkennen werden, dass die Vorteile der Erfindung
auch verwirklicht werden können,
wenn Antikörper
verwendet werden, die andere Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, wie
Rezeptordimerisation inhibieren.
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Monoklonale
anti-Rezeptorantikörper
können
auch als Zielstoffe für
die Abgabe von Verbindungen von therapeutischem Interesse verwendet
werden. Solche Verbindungen beinhalten, sind aber nicht begrenzt
auf Toxine, zytostatische Verbindungen oder Proenzyme, deren mögliche Funktion
es sein kann, endogene Proenzyme zu aktivieren, Proenzyme die von
exogenen Quellen zugegeben werden zu aktivieren oder Enzymspaltungsorte
auf Prodrugs zu aktivieren. Anti-Rezeptorantikörper können auch mit Radionukleotiden,
Färbungen,
fluoreszierenden Verbindungen oder dergleichen zur Verwendung als
bildgebende Wirkstoffe markiert werden. Beispiele dafür beinhalten
die Darstellung von Thromboseorten oder Orten von Gefäßverletzung,
bei denen eine Freilegung, zum Beispiel von vaskulären. glatten
Muskelzellen, die Zelloberflächenrezeptoren
exprimieren, vorliegt.
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Monoklonale
Antikörper
können
auch verwendet werden, um bifunktionelle Antikörper zu entwickeln, bei denen
es zwei unabhängige
antigene Bindungsstellen auf jedem Immunglobulinmolekül gibt.
Diese Technologie ist auf dem Fachgebiet bekannt und wurde in der
Literatur offenbart (Thromb. Res. Suppl. X: 83, 1990). Zusätzlich können bispezifische
Antikörper
aus einkettigen Antikörpern
aufgebaut werden. Diese Technologie ist auf dem Fachgebiet bekannt
und wurde zum Beispiel durch A. George (The Second Annual IBC International
Conference on Antibody Engineering, Dez. 16–18, 1991, San Diego CA) offenbart.
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Antikörper, die
bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in der Lage,
eine signifikante Menge der biologischen Aktivität eines Antigens in einem in
vitro-Testsystem
zu blockieren, zum Beispiel die Fähigkeit, die Wechselwirkung
eines oder mehrerer PDGF-Liganden mit PDGF-Rezeptoren) zu blockieren. Geeignete
in vitro-Testsysteme
beinhalten unter anderem Mitogenese-Assays und Rezeptorbindungs-Assays. Zum Beispiel
sind 25 μg/ml
eines monoklonalen anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk, der hier beschrieben wird, in der
Lage, die mitogene Aktivität
von 10 ng/ml PDGF-AA
zu blockieren. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden
werden, dass die Menge des Antikörpers,
die notwendig ist, um die Aktivität einer gegebenen Menge eines
Antigens zu inhibieren, von solchen Faktoren wie Antikörper-Spezifität und -Affinität abhängt. Es
wird vorgezogen, nicht 100% der mitogenen Serumaktivität zu blockieren,
so dass nicht die gesamte Wundheilungsantwort unterdrückt wird.
Antikörperdosierungen
werden wie unten beschrieben berechnet, wobei Affinität und spezifische
Aktivität
beachtet werden.
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Eine "antihyperplastisch
effektive Menge" eines
anti-PDGF-Rezeptorantikörpers
oder anderen PDGF-Antagonisten wird als eine Menge, die ausreicht,
um messbar die intimale Hyperplasie in einem Blutgefäß, einem
Gefäßtransplantat
oder einem vaskulären
Bestandteil eines transplantierten Organs zu reduzieren oder zu
verhindern, definiert. Konkreter wird die "Inhibition intimaler Hyperplasie" hier so definiert,
dass sie jede messbare Inhibition von einem oder mehreren der intimalen
hyperplastischen Prozesse, die in dem Fachgebiet als glatte Gefäßmuskelzellen
(VSMC)-Migration, VSMC-Proliferation
und neointimale Ablagerung von extrazellulärer Matrix beschrieben werden,
einschließt.
In diesem Zusammenhang kann die Reduktion oder Verhinderung intimaler
Hyperplasie oder eines hyperplastischen Prozesses, der an der intimalen
Hyperplasie beteiligt ist, einfach unter Verwendung von in vitro-,
in vivo- und ex vivo-Assaysystemen,
die auf dem Fachgebiet bekannt sind, insbesondere auf Primaten basierende
Assaysysteme (z. B. nicht-menschliche oder menschliche Primaten-VSMC-Kulturen oder vaskuläre Gewebeexplantate
oder nicht-menschliche Primaten-in vivo-Tests) bewertet werden. Bei der Interpretation
von in vitro-Dosierungsdaten wird man anerkennen, dass verschiedene
Testzellen und -gewebe verschiedene Level und/oder Typen von PDGF-Rezeptoren
exprimieren können.
Zusätzlich
wird man erkennen, dass die Zellkulturpassagezahl (sprich die Anzahl
von Zellgenerationen, die nach der Dissoziation oder dem Herauswachsen
von VSMCs von oder aus einer vaskulären Gewebequelle vergeht) möglicherweise
einen wichtigen Einfluss auf die mitogenen und anderen wachstumsbezogenen
Aktivitäten,
die in experimentellen Systemen beobachtet werden, besitzt. Ähnlich muss
eine Anzahl von Variablen bei der Extrapolation von in vivo-Daten
aus nicht-menschlichen Systemen beachtet werden, um die antihyperplastische
Effekti vität
von Antikörpern
bei Menschen zu schätzen.
Insbesondere ist es wichtig, alle Unterschiede in der Natur und
Schwere von Blutgefäßverletzungen
zwischen experimentellen und klinischen Systemen in Betracht zu
ziehen, um bei der Bestimmung tatsächlicher Behandlungsprotokolle
für Menschen die
Modelldaten am besten zu verwerten. Ebenso müssen Unterschiede zwischen
den Arten bei der vaskulären
Anatomie und Histologie und intrinsische Unterschiede bei den hyperplastischen
Prozessen, die durch verschiedene Arten von Gefäßverletzungen hervorgerufen
werden, abgewogen werden, wenn man zwischen Modell und klinischen
Anwendungen extrapoliert. Nichtsdestoweniger liefern die Assays
und Verfahren, die hier beschrieben werden, einschließlich der
in vitro- und in vivo-Studien unter Verwendung nicht-menschlicher
und menschlicher Primatenmodellsysteme, die gesamte notwendige Anleitung,
gekoppelt mit bekannten Techniken einschließlich standardisiertem klinischem
Versuchsvorgehen, um erfolgreich Behandlungsprotokolle für intimale
Hyperplasie bei Säugetierpatienten
einschließlich
Menschen zu bestimmen.
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Es
wird vorgezogen, dass die antihyperplastisch effektive Menge eines
Antikörpers
oder eines anderen Antagonisten signifikant die Proliferation (z.
B. wie in einem in vitro-Mitogenese-Assay
bestimmt) und/oder die Migration glatter Gefäßmuskelzellen inhibiert. Eine "signifikante" Reduktion ist eine
Reduktion der Mitogenese oder Migration von 50% oder mehr in einem
in vitro-Assay. Während
die tatsächliche
Menge teilweise von solchen Faktoren wie der Spezifität und der
Bindungsaffinität
eines bestimmten Antikörpers
abhängt,
kann eine effektive Menge empirisch durch in vitro- und ex vivo-Verfahren, die auf
dem Fachgebiet bekannt sind und hier offenbart werden, bestimmt
werden. Im Allgemeinen werden Mengen von PDGF-Antagonist zur therapeutischen
Verwendung ausreichend sein, um eine Konzentration in der Blutbahn
oder am Wirkort bereitzustellen, die mindestens derjenigen gleich
ist, die gezeigt hat, dass sie in vitro oder ex vivo effektiv ist.
Es wird jedoch vorgezogen, in vivo höhere Mengen bis zu oder über die
Zunahme um eine Größenordnung
hinaus zu verwenden. So wird in Modellsystemen die anti-PDGF-Rezeptorantikörperdosierung
mit dem Ziel temporär
oder anhaltend, lokale oder systemische Level des Antikörpers in
dem behandelten Säugetier
bereitzustellen, die zu Antikörperkonzentrationen,
die gezeigt haben, dass sie in geeigneten in vitro-Tests antihyperplastisch
effektiv sind, korrespondieren, ausgewählt.
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Von
besonderem Interesse für
die in vivo-Testung ist ein Pavian-Gefäßverletzungmodell,
das hier detailliert offenbart wird. Dieses Modell wurde entwickelt,
um die Verletzungsantwort, die bei Menschen nach verschiedenen Typen
von Akutbehandlungen, um verschlossene Arterien zu öffnen, auftritt,
zu imitieren. Die Verwendung von Ballonangioplastie für das Hervorrufen
einer vaskulären
Läsion
imitiert einen Eingriff, der häufig verwendet
wird, um den Blutfluss in stenosierten Koronararte rien wiederherzustellen
und die zur Restenose bei 30–40%
der behandelten Personen führt.
Dieses Modell ist daher zur Testung der Verwendung von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern oder
anderen PDGF-Antagonisten allein oder in Verbindung mit Heparin
besonders gut geeignet.
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Ein
anderes geeignetes Modell zur Testung der Effizienz der PDGF-Antagonistentherapie
ist ein Pavianmodell der Carotisendarteriektomie. Bei diesem Modell
wird eine akute Verletzung im medialen Bereich der Arterie verursacht,
was im Folgenden zur Entwicklung einer intimalen Läsion führt (Hanson
et al., Hypertension 18: I170–I176,
1991). Dieses Modell imitiert die Verwendung der Carotisendarteriektomie,
um Carotisarterien bei Menschen zu öffnen, die aufgrund einer fortgeschrittenen
Atherosklerose einen verminderten Blutfluss aufweisen. Ein drittes
Modell zur Testung der Verwendung der PDGF-Antagonistentherapie
ist ein Gefäßtransplantat-Einbringungsmodell
beim Pavian. Es wurde gezeigt, dass die Platzierung von Gefäßtransplantaten
zu der Bildung hyperplastischer Läsionen an dem Ort des Transplantates
führt (Kraiss
et al., J. Clin. Invest. 92: 338–348, 1993). Diese Läsionen weisen
Charakteristiken auf, die denjenigen hyperplastischer Läsionen bei Menschen
an Orten von Gefäßverletzungen
gleichen.
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Um
die Effizienz der PDGF-Antagonistentherapie bei Menschen zu testen,
können
verschiedene Typen der Analyse verwendet werden. Diese beinhalten
die Überwachung
auf eine Abnahme des mittleren Lumendurchmessers (MLD) durch Angiographie
in dem 3–6
Monatszeitraum, der einer vaskulären
Behandlung folgt. Alternative Verfahren zur Überwachung der Effizienz beinhalten
intravaskulären
Ultraschall, B-Mode-Ultraschall
und Magnetresonanztomographie. Es können auch klinische Korrelate
verwendet werden, um die Effizienz der anti-PDGF-Rezeptorantikörperbehandlung
zu überwachen.
Diese beinhalten eine Abnahme an Myokardinfarkten und wiederkehrender
Angina und der Notwendigkeit wiederholter Revaskularisierungen.
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Antikörperdosierungsspiegel
werden aus den Inhibitionsdaten nach Bestimmung der Clearance von Antikörper aus
dem Blut berechnet. Im Allgemeinen wird die Dosierung mit dem Ziel
der Erhaltung zirkulierender Spiegel von Antikörper, die ausreichen, um mehr
als 10%, vorzugsweise wenigstens 20–50% der zirkulierenden PDGF-Aktivität zu inhibieren
(z. B. Rezeptorligandbindung, PDGF- oder serumstimulierte Mitogenese und/oder
Migration von VSMCs oder eine andere biologische Aktivität, die mit
der PDGF-Rezeptorfunktion und/oder Regulation eines intimalen hyperplastischen
Prozesses korreliert) ausgewählt.
Im Allgemeinen liegen die Dosierungen in dem Bereich von ungefähr 0,1 μg bis 500
mg oder mehr Antikörper
pro kg des Körpergewichts
des Patienten pro Tag, vorzugsweise bei ungefähr 20 μg bis 20 mg/kg/Tag, mehr vorzuziehen bei
ungefähr
1 mg bis 10 mg/kg/Tag. Wie oben bemerkt, wird die tatsächliche
Dosierung teilweise von der Antikörperaffinität und -aktivität abhängen. Etwas
höhere
Dosierungen können
erforderlich sein, wenn zwei oder mehr Antikörper kombiniert verabreicht
werden, als wenn ein einzelner Antikörper verwendet wird. Um die
Antikörperherstellungskosten
zu minimieren und die Immunintoleranz der verabreichten Antikörper durch
den Patienten zu begrenzen, wird es vorgezogen, Antikörper hoher
Affinität
mit einer hohen spezifischen inhibitorischen Aktivität zu verwenden,
wodurch die Verwendung von Dosierungen von ungefähr 1 mg/kg/Tag oder weniger ermöglicht wird.
Dosierungen von nicht-Antikörper-PDGF-Antagonisten
können
unter Verwendung ähnlicher Kriterien
bestimmt werden.
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Bei
mit anti-PDGF-Rezeptor-Antikörpertherapie
kombiniert mit Heparin behandelten Menschen kann der Antikörper innerhalb
eines großen
Bereiches von Bedingungen gegeben werden. Der Antikörper kann
per Bolusinjektionen sowohl vor dem Revaskularisierungseingriff
wie auch viele Male nach dem Eingriff gegeben werden. Der Antikörper kann
als eine Bolusinjektion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal
oder subkutan) vor dem Eingriff (im Allgemeinen innerhalb von 24
Stunden vor der Operation) und als eine konstante Infusion nach
dem Eingriff (einschließlich
der Infusion über
implantierte Pumpen) gegeben werden. In vielen Fällen wird es vorzuziehen sein,
während
eines Krankenhausaufenthaltes tägliche
Dosen zu verabreichen (einschließlich Verabreichung per Infusion)
gefolgt von weniger häufigen
Bolusinjektionen während
eines Zeitraumes der ambulanten Behandlung von einer bis zwei Wochen
oder mehr. Die Behandlung kann bis zu sechs Monate nach der anfänglichen
Verletzung fortgeführt
werden. Der Antikörper
kann auf vielen verschiedenen Wegen einschließlich intravenösen, intramuskulären oder
subkutanen Injektionen gegeben werden. Zusätzlich kann der Antikörper lokal
an die Stelle der Gefäßverletzung
unter Verwendung von Perfusionsballonkathetern, Beschichtung auf
Stents oder Platzierung auf Gel-beschichtete Ballons, abgegeben
werden. In den letzteren Fällen
würde erwartet
werden, dass die Dosen des Antikörpers
wesentlich geringer sind als diejenigen, die erforderlich sind,
wenn er systemisch gegeben wird. Die Antikörper können auch durch Abgabesysteme
mit verzögerter
Freisetzung abgegeben werden, einschließlich solcher Systeme, die
in Gefäßtransplantaten
oder Stents eingeschlossen sind, oder auf dem Weg von Perfusions-
oder Doppelballonkathetern. Zur Inhibition der Stenose in Gefäßtransplantaten
können
anti-PDGF-Rezeptorantikörper kovalent
an das Transplantat durch ihre konstanten Regionen angeheftet oder
in das Transplantat in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen
werden. Pumpen und andere bekannte Abgabesysteme können auch
verwendet werden. In jedem Fall ist die Verabreichung so angelegt,
dass sie die gewünschte
tägliche
Dosierung bereitstellt (z. B. einen fünftägigen Bolus von 25 mg/kg, um
5 mg/kg/Tag bereitzustellen). Die Art und der Zeitplan der Verabreichung anderer PDGF-Antagonisten
kann aus den chemischen und physikalischen Eigenschaften des spezifischen Antagonisten
und den pharmakokinetischen Daten gemäß den akzeptierten Prinzipien
bestimmt werden.
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Zur
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper zu
injizierbaren Zusammensetzungen gemäß konventionellen Vorgehensweisen
formuliert und in sterile Behälter
verpackt. Die Antikörper
können
mit einem geeigneten Verdünnungsmittel
wie steriler Kochsalzlösung
oder sterilem Wasser verbunden werden. Die Antikörperzusammensetzungen können weiter
Trägerstoffe,
Stabilisatoren und Arzneiträger
wie Zucker (z. B. Mannitol) oder Albumin enthalten. Alternativ können die
Antikörper
in lyophilisierter Form bereitgestellt und vor der Verwendung in
einem geeigneten Lösungsmittel
aufgelöst
werden. Diese Zusammensetzungen können in einzelnen oder vielfachen
Dosierungsformen verpackt werden, zum Beispiel in versiegelten Ampullen
oder Phiolen. Nicht-peptidische PDGF-Antagonisten können parenteral
oder enteral (z. B. oral) verabreicht werden.
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Medikamente
der Erfindung, die einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder einen nicht-Antikörper-PDGF-Antagonisten
umfassen, können
einem Säugetier
koordiniert mit Heparin jeweils in Einheitsdosierungen von Antikörper/Antagonist
und Heparin, die ausreichen, um kombiniert die intimate Hyperplasie
in dem Gefäßsystem
des Säugetieres
zu inhibieren, verabreicht werden. In diesem Zusammenhang soll "koordinierte Verabreichung" gleichzeitige, getrennte
oder sequentielle Verabreichung des Antikörper/Antagonisten und Heparin
einschließen,
wobei sowohl der Antikörper/Antagonist
wie auch Heparin innerhalb eines begrenzten, kombiniert effektiven
Zeitraumes in Abhängigkeit
voneinander verabreicht werden. Ein "kombiniert effektiver Zeitraum" wird als der maximale
dazwischenliegende Zeitraum zwischen der Verabreichung des Antikörper/Antagonisten
und der Verabreichung des Heparins, in dem die beiden Wirkstoffe
kombiniert effektiv bei der Inhibition der Hyperplasie sind, definiert.
Die Bezeichnung „kombiniert
effektiv" wird wiederum
als das Hervorrufen einer messbaren Inhibition der intimalen Verdickung
oder der Bildung einer Läsion
oder eines hyperplastischen Prozesses definiert, die einen maximalen
Level der Inhibition übersteigt,
der unabhängig
entweder von dem Antikörper/Antagonisten
oder Heparin bereitgestellt wird, wenn diese unter ansonsten vergleichbaren
Bedingungen und Dosierung alleine verabreicht werden.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Heparin" auf jedes Mitglied einer Familie von
strukturell komplexen, sulfierten Glycosaminoglycanen, die im Allgemeinen
durch eine Struktur wiederholter Glucosamine und Glucuronsäurezuckerresten
charakterisiert werden (Casu, Adv. Carbohyd. Chem. and Biochem. 47:
578–583,
1985). Das am weitesten bekannte Heparin ist "unfraktioniertes" oder "kommerzielles" Heparin, das aus Rinderlunge oder Schweinedarm
hergestellt wird, das eine heterogene Mischung aus Heparinmolekülen umfasst,
die in einem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 8000 bis 20000 Dalton liegen
(Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Die Bezeichnung
Heparin umfasst jedoch auch einen weiten Bereich homogenerer Heparinpräparate,
wie auch heparinähnliche
Moleküle
einschließlich
Heparansulfaten. Unter diesen besonderen Heparinbeispielen sind
auch spezifischere Heparinsubtypen bekannt. Zum Beispiel wurden
Heparansulfatanteile, die durch endotheliale Zellen (Castellot et
al., J. Cell. Biol. 90: 372–379,
1981) und glatte Muskelzellen (Fritze et al., J. Cell. Biol. 100:
1041–1049,
1985) hergestellt werden, isoliert, die Berichten zufolge bei der
Inhibition der Proliferation glatter Muskelzellen bis zu 40 mal
stärker
aktiv sind als unfraktioniertes Heparin. Zusätzlich wurden unter den natürlich auftretenden
Heparingrößenvarianten
fraktionierte Heparinarten isoliert, die hauptsächlich entweder antikoagulatorische
oder antiproliferative Aktivität
aufweisen (Wolinsky et al., J. am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990).
Die letztere Aktivität
tendiert dazu, bei den niedermolekularen Heparinarten vorzuliegen,
wie in Heparin in dem Bereich von Penta- oder Decasacchariden, über die
berichtet wurde, dass sie auch eine größere Bioverfügbarkeit
und eine längere
Halbwertszeit bereitstellen (Id., Bacher et al., Thrombosis Res.
70: 295–306,
1993) und die daher besonders nützlich
bei spezifischen Ausführungsarten
der Erfindung sein können.
Ebenfalls eingeschlossen in die Definition von Heparin für die Zwecke
der Beschreibung der Erfindung werden synthetische Heparine und
Heparinderivate, von denen eine Vielzahl unter Verwendung konventioneller
chemisch synthetischer, modifizierender und degradativer Techniken
hergestellt wurden (siehe zum Beispiel Roden, L. The biochemistry
of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.) Seiten
267–371,
Plenum Publishing Corp., New York, 1980, durch Hinweis hier eingeschlossen).
Die Bezeichnung "niedermolekulares
Heparin mit reduzierter antithrombotischer Aktivität" wird verwendet,
um niedermolekulare Formen mit reduzierter antithrombotischer Aktivität (wie durch
Standard-Assays bestimmt) im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin
anzuzeigen.
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Um
kombiniert effektive Dosen von Antikörper/Antagonist und Heparin
zu bestimmen und/oder um kombiniert effektive Zeiträume für die getrennte
oder sequentielle Verabreichung eines PDGF-Antagonisten und Heparin
zu bewerten, werden die gleichen allgemeinen Verfahren, die oben
für die
Analyse antihyperplastischer Aktivität der anti-PDGF-Rezeptorantikörper und für die Extrapolation zwischen
experimentellen und klinischen Anwendungen beschrieben wurden, verwendet.
Diese Verfahren beinhalten unter anderen Mitogenese- und Migrations-Assays,
die VSMC-Zellkulturen oder Gefäßgewebeexplantate
verwenden, wie auch eine Vielzahl von in vivo-Assays, die das Auftreten
oder den Grad der intimalen Hyperplasie in einem lebenden Subjekt
messen.
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Von
diesen Verfahren wird entweder gezeigt oder erwartet, dass der Level
der kombinierten Inhibition, der durch die koordinierte Verabreichung
von Antikörper
oder anderem Antagonisten und Heparin erreicht wird, abhängig von
den jeweiligen Typen und Dosierungen des verwendeten Antagonisten
und Heparins, von dem Zeitplan und der Art der Verabreichung des
Antagonisten und Heparins, und von anderen experimentell und klinisch
relevanten Variablen wie dem behandelten Typ der Zellen oder der
Gewebe oder der Natur und der Schwere einer Blutgefäßverletzung
variiert. Durch Einstellung des koordinierten Verabreichungsregimes (z.
B. Heparin- und Antagonisttypen, Dosierungen und Art oder Zeitplan
der Verabreichung) innerhalb der Verfahren der Erfindung, kann die
kombinierte Inhibition intimaler Hyperplasie optimiert werden, um
einen großen Bereich
spezifischer Anwendungen der Erfindung zu erleichtern. Zum Beispiel
können
für verschiedene
klinische Anwendungen verschiedene Antikörper- und Heparintypen und
Dosierungen erwünscht
sein. Für
Patienten mit einem hohen Risiko für mit Thrombose zusammen hängenden
Komplikationen, können
antikoagulatorische Formen von Heparin klinisch erwünscht sein.
Andere Patienten können
besonders anfällig
für Blutungskomplikationen,
die mit der Verwendung antikoagulatorischer Formen von Heparin zusammenhängen, sein,
in welchem Fall ein niedermolekulares Heparin mit reduzierter antithrombotischer
Aktivität
indiziert sein kann. Diese und andere klinische Überlegungen werden Fachleuten
auf dem Gebiet offensichtlich sein.
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Um
die Wahl eines bestimmten Heparintyps oder Dosierung zu erleichtern,
erlauben die Verfahren der Erfindung eine Mitveränderung der Form des Zeitplanes
oder der Dosierung des Antikörpers
oder des anderen Antagonisten, der koordiniert verabreicht werden
soll, so dass das Verabreichungsregime für den Antikörper oder anderen Antagonisten
koordiniert eingestellt werden kann, um einen hohen Level kombinierter
Inhibition zu erhalten. Unter anderen Umständen kann die Form oder Dosierung
des Antagonisten oder der Zeitplan oder die Art der Verabreichung
des Antagonisten durch äußere Umstände festgelegt
werden, in welchem Fall es nötig
sein kann, das Heparinverabreichungsregime koordiniert einzustellen.
Zum Beispiel können
unter Umständen,
bei denen ein anhaltendes Antikörperbehandlungsregime
erwünscht
ist, niedrigere Antikörperdosierungen
oder weniger immunogene Antikörperformen
(z. B. Maus/Mensch-chimäre Antikörper) verwendet
werden, um die Ergebnisse zu optimieren. In solchen Fällen kann
eine koordinierte Einstellung hinsichtlich des Typs der Dosierung
oder des Zeitplanes des verabreichten Heparins durchgeführt werden,
um einen starken kombinierten antihyperplastischen Effekt zu erreichen.
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Gemäß der Erfindung
können
insbesondere Dosierungen des Antikörpers oder des anderen Antagonisten
und Heparins koordiniert über
einen weiten Bereich variiert werden, während ein hoher Level an kombinierter
Inhibition der intimalen Hyperplasie erhalten bleibt. Diese Eigenschaft
der Erfindung ist besonders nützlich
bei der Anpassung an klinische Anwendungen, bei denen eine niedrige
Dosis von dem einen oder dem anderen antihyperplastischen Wirkstoff
(sprich des Antagonisten oder Heparin) erwünscht ist, wie in Fällen, bei denen
Dosis-limitierende Toxizitäten,
Allergien oder andere Komplikationen vorliegen. Bei den Verfahren
der Erfindung wurde gefunden, dass koordiniert verabreichte anti-PDGF-Rezeptorantikörper und
Heparin kombiniert effektiv in einem Antikörper : Heparin-Dosierungsverhältnis (sprich
Verhältnis
der Antikörpereinheitsdosis zur
Heparineinheitsdosis, bezogen auf das Gewicht), das zwischen 0,001
: 1 bis 1000 : 1 und weiter liegt, sind. In anderen Worten ergibt
eine Einheitsdosis von Antikörper,
die so niedrig wie 1/1000 einer Dosis eines koordiniert verabreichten
Heparins liegt, einen kombinierten inhibitorischen Effekt, während Antikörperdosen,
die 1000-fach größer sind
als die Dosis eines koordiniert verabreichten Heparins, ebenfalls
einen kombinierten Effekt ergeben. Diese im Allgemeinen umgekehrt
proportionale Kovariabilität
von Antikörper-
und Heparindosierungen stellte eine extreme Flexibilität für die Umsetzung
alternativer koordinierter Verabreichungsregime unter Verwendung
der zwei antihyperplastischen Wirkstoffe bereit. Gleichzeitig wurde
gezeigt, dass weniger extreme Mitveränderung von Antikörper und
Heparindosierungen, verkörpert
in Antikörper
: Heparin-Dosierungsverhältnissen
zwischen 0,01 : 1 und 100 : 1 und zwischen 0,05 : 1 und 20 : 1,
auch kombiniert effektiv sind und sie werden vorzugsweise unter
Umständen
ausgewählt,
bei denen gemäßigte bis
extrem niedrige Dosierungen von sowohl dem Antikörper wie auch Heparin klinisch
erwünscht
sind.
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Im
Allgemeinen liegen Dosierungen von Antikörper, der koordiniert mit Heparin
zur Behandlung intimaler Hyperplasie bei Säugetieren verabreicht werden
soll, innerhalb des Bereiches von ungefähr 0,1 μg bis 100 mg an Antikörper pro
Kilogramm Körpergewicht
des Säugetieres
pro Tag. Vorzugsweise liegen die Dosierungen zwischen ungefähr 50 μg bis 20
mg Antikörper
pro Kilogramm pro Tag, und mehr vorzuziehen bei weniger als 1 mg/kg/Tag,
um teure Antikörpervorräte zu erhalten
und Nebenwirkungen zu begrenzen, während sie befriedigende Inhibitionslevel
ergeben. Im Allgemeinen liegen die Dosierungen von Heparin zwischen
ungefähr
1 μg bis
100 mg/kg/Tag. Vorzugsweise liegen die Neparindosierungen zwischen
20 μg bis
10 mg/kg/Tag, und mehr vorzuziehen bei weniger als ungefähr 1 mg/kg/Tag.
Konkreter ergeben koordiniert verabreichte Dosierungen von Antikörper und
Heparin zwischen ungefähr
0,5 μg bis
10 mg/kg/Tag bzw. zwischen ungefähr
1 μg bis
10 mg/kg/Tag starke kombiniert effektive Ergebnisse bei relativ
geringen Dosierungen beider antihyperplastischer Wirkstoffe. Wo
noch niedrigere Dosierungen von Antikörper und Heparin erwünscht sind, werden
koordiniert verabreichte Mengen an Antikörper und Heparin zwischen ungefähr 5 μg bis 2 mg/kg/Tag bzw.
zwischen ungefähr
50 μg bis
1 mg/kg/Tag vorgezogen. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen,
dass tatsächliche
Dosierungen unter Berücksichtigung
spezifischer Umstände
einschließlich
Patientenparametern und den Eigenschaften des verabreichten Antikörpers (der
Antikörper)
(z. B. Spezifität,
spezifische Aktivität, Halbwertszeit
in der Zirkulation) und des Heparins (z. B. antithrombotische Aktivität) bestimmt
werden.
-
Anti-PDGF-Rezeptorantikörper und
Heparin werden vorzugsweise parenteral verabreicht, wie z. B. durch
Bolusinjektion oder Infusion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal
oder subkutan) vor der Operation (im Allgemeinen innerhalb von 24
Stunden vor der Operation) und wahlweise nach der Operation in Intervallen von
mehreren Stunden bis mehreren Tagen über den Verlauf von ein bis
zwei Wochen oder mehr fortgesetzt. Bei einer Ausführungsart
wird der Antikörper
als eine Bolusinjektion oder Infusion am ersten Tag der Behandlung
in einer Menge, die ausreicht, um einen minimalen Zirkulationsspiegel
des Antikörpers
durch die anfängliche
dreitägige
Behandlungsdauer von zwischen ungefähr 20 μg und 1 mg/kg Körpergewicht
bereitzustellen, verabreicht. In dieser Hinsicht wird es vorgezogen,
Antikörper
zu verwenden, die eine Halbwertszeit in der Zirkulation von wenigstens
12 Stunden, vorzugsweise von wenigstens 4 Tagen, mehr vorzuziehen
bis zu 14–21 Tagen
besitzen. Von chimären
und humanisierten Antikörpern
wird erwartet, dass sie Halbwertszeiten in der Zirkulation von bis
zu 4 bzw. bis zu 14–21
Tagen besitzen. In vielen Fällen
wird es vorgezogen, tägliche
Dosen während
eines Krankenhausaufenthaltes zu verabreichen, gefolgt von weniger
häufigen
Bolusinjektionen während
eines Zeitraumes der ambulanten Behandlung. Diese Antikörper und
Heparin können
auch durch Abgabesysteme mit verzögerter Freisetzung abgegeben
werden, einschließlich
solcher Systeme, die in Gefäßtransplantate
oder Stents eingeschlossen sind, oder auf dem Wege von Perfusions-
oder Doppelballonkathetern. Auch Pumpen oder andere bekannte Abgabesysteme
können
für die
kontinuierliche Infusion verwendet werden. Dosierungsregime können variiert
werden, um die erwünschten
Zirkulationsspiegel des Antikörpers
und des Heparins, basierend auf den pharmakokinetischen Eigenschaften
dieser Wirkstoffe, bereitzustellen. So werden Dosierungen berechnet,
so dass die erwünschten
Zirkulationsspiegel der therapeutischen Wirkstoffe erhalten werden.
Tägliche
Dosen, auf die oben Bezug genommen wird, können als größere, weniger häufige Bolusverabreichungen
verabreicht werden, um die aufgezählten Dosierungen gemittelt über den
Zeitraum der Verabreichung bereitzustellen. Nicht-peptidische PDGF-Antagonisten
können
enteral verabreicht werden.
-
Für die Verwendung
bei der vorliegenden Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper, andere PDGF-Antagonisten
und Heparin kombiniert oder getrennt zu Zusammensetzungen, die für die parenterale
(z. B. intravaskuläre,
perivaskuläre
oder transdermale), orale oder rektale Verabreichung geeignet sind,
gemäß konventionellen
Verfahren formuliert und in sterile Behälter verpackt. Die Antagonisten
und Heparin können zusammen
oder getrennt mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie steriler Kochsalzlösung oder
sterilem Wasser verbunden werden. Die Antagonist-, Heparin- und Antagonist/Heparin-Zusammensetzungen
können weiter
Trägerstoffe,
Stabilisatoren und Arzneiträger
wie Zucker (z. B. Mannitol) oder Albumin enthalten. Alternativ können die
Antagonisten und Heparin in lyophilisierter oder einer anderen stabilen
trockenen Form bereitgestellt werden und in einem geeigneten Lösungsmittel
(das mit dem Antagonisten und Heparin eingeschlossen sein kann)
vor der Verwendung aufgelöst
werden. Diese Zusammensetzungen können in einzelner oder mehrfacher
Dosierungsform, zum Beispiel in versiegelten Ampullen oder Phiolen,
verpackt sein. Für
alternative Arten der Verabreichung, wie für die endovaskuläre Verabreichung,
um Stenose in Gefäßtransplantaten
zu inhibieren, können
PDGF-Antagonisten und/oder Heparin in das Transplantat in Formulierungen
mit verzögerter
Freisetzung eingeschlossen werden. Anti-PDGF-Rezeptorantikörper können über ihre
konstanten Regionen kovalent an das Transplantat gebunden werden.
-
Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung
angeboten.
-
Beispiele
-
Beispiel
1 offenbart die Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper gegen
den PDGF-Rezeptor-alpha- und -beta-Polypeptide herstellen. Die Beispiele
2, 3 und 4 offenbaren die Identifizierung und Charakterisierung
von monoklonalen anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörpern. Beispiel
5 offenbart die Identifizierung und Charakterisierung von monoklonalen
anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörpern.
Beispiel 6 offenbart die Bestimmung der Bindungsspezifitäten bestimmter
repräsentativer
monoklonaler Antikörper.
Beispiel 7 zeigt die Inhibition von mitogener PDGF-Aktivität auf menschlichen
dermalen Fibroblasten unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Beispiel
8 zeigt die Inhibition von mitogener PDGF-Aktivität auf glatten
Pavianmuskelzellen unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Die Beispiele
9 und 10 offenbaren die Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper, um
mitogene Aktivität
von Pavianserum zu inhibieren. Beispiel 11 zeigt die Inhibition
von aortaler glatter Pavianmuskelzellenmigration durch monoklonale
anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Beispiel
12 zeigt die Fähigkeit
von anti-PDGF-Rezeptor-MAks PDGF-Aktivität bis zu acht Stunden, nachdem
der Ligand an die Rezeptoren gebunden hat, zu inhibieren. Beispiel
13 offenbart die Verdrängung
von Rezeptor-gebundenen PDGF von menschlichen Osteosarkomzellen
durch anti-PDGF-Rezeptor-MAks. Beispiel 14 zeigt die Inhibition
von PDGF und mitogener Pavianserum-Aktivität auf glatten Gefäßmuskelzellen
unter Verwendung von monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, die
allein oder koordiniert mit Heparin verabreicht werden. Beispiel
15 offenbart die Verwendung von Heparin, allein oder koordiniert
verabreicht mit monoklonalen anti- PDGF-Rezeptorantikörpern, um mitogene Serumaktivität auf glatten
Paviangefäßmuskelzellen
zu inhibieren. Beispiel 16 offenbart weitere Studien, die die Inhibition
von mitogener Serumaktivität
auf glatten Pavianmuskelzellen unter Verwendung von monoklonalen
anti-PDGF-Rezeptorantikörpern,
die koordiniert mit Heparin verabreicht werden, zeigen. Beispiele
17 und 18 offenbaren Studien, die die antimitotischen Aktivitäten von
ElternMaus- und Maus/Mensch-chimären-anti-PDGF-alpha-
und -beta-Rezeptorantikörpern, die
koordiniert mit Heparin verabreicht werden, vergleichen. Beispiel
19 beschreibt weiter die inhibitorische Aktivität von koordiniert verabreichtem
Heparin und anti-PDGF-Rezeptorantikörpern gegen mitogene Serumaktivität. Beispiel
20 zeigt die Inhibition von glatter Muskelzell-Migration aus aortalen
Pavianexplantaten durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper, die
koordiniert mit Heparin verabreicht werden. Die Beispiele 21–23 offenbaren
Bindungsstudien von PDGF- und anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, kombiniert mit und in
der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin, um mögliche Bindungs- oder Aktivitätswechselwirkungen
zwischen PDGF und Heparin und den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern und
Heparin zu bestimmen. Beispiel 24 beschreibt Studien zur Überwachung der
zirkulierenden Spiegel von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern nach kontinuierlicher
Infusion der Antikörper
in einen Pavian und zur Messung der Pavianantikörper, die gegen die anti-PDGF-Rezeptorantikörper hergestellt werden.
Beispiel 25 offenbart Studien, um die in vivo-Halbwertszeit eines
chimären
anti-PDGF-Rezeptorantikörpers
in einem Primatenmodell zu bestimmen. Beispiel 26 beschreibt ein
sequentielles arterielles Verletzungsmodell in Pavianen zur Testung
antihyperplastischer Wirkstoffe und Behandlungen nach Gefäßverletzung.
Beispiel 27 beschreibt ein Pavianmodell, das nützlich bei der Charakterisierung
der Rolle von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern und
Heparin bei der Inhibition intimaler Hyperplasie in Primaten nach
akuter Gefäßverletzung
ist.
-
Rekombinante
PDGF-AA und -BB wurden in Hefe im Wesentlichen wie in den US-Patenten Nrn. 4,889,919;
4,845,075 und 5,037,743 offenbart wird, hergestellt und bis zur
Homogenität
aus konzentrierten Zellkulturmedien durch eine Kombination von Kationenaustauschchromatographie,
Umkehrphasenchromatographie, Gelfiltration und (NH4)2SO4-Fraktionierung
gereinigt. PDGF-AB wurde aus überalterten
menschlichen Thrombozyten hergestellt, wie durch Hart et al. offenbart
wird (Biochemistry 29: 166–172,
1991). PDGF-AA, -AB und -BB wurden mit 125I
unter Verwendung von IodobeadsTM (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL) wie zuvor beschrieben (Hart et al.,
ebenda) markiert. Es wurde eine mutierte Form der B-Kette, genannt
BBtyr, die einen Tyrosinrest an Position
23 der reifen Codierungssequenz anstelle von Phenylalanin aufweist,
für die
Iodierung von PDGF-BB verwendet. Kaninchen-anti-Maus-IgG und MAk
163.31 wurden ähnlich
mit 125I unter Verwendung von IodobeadsTM radiomarkiert.
-
Es
wurden Fusionsproteine, die eine menschliche schwere oder leichte
IgG-Kette, die mit der extrazellulären Domäne von entweder dem PDGF-alpha-Rezeptor
oder PDGF-beta-Rezeptor
verbunden war, umfassten, im Wesentlichen wie im US-Patent Nr. 5,155,027
und
EP 325,224 offenbart,
hergestellt. In einem Fall wurden Mausmyelomzellen mit cDNAs für sowohl
schwere Ketten wie auch leichte Ketten/PDGF-Rezeptor-extrazelluläre-Domäne-Fusionsproteinen
transfiziert. Diese Zellen sezernieren in ihr Kulturmedium ein Molekül, das analog
zu menschlichem IgG dadurch ist, dass es aus Fusionsproteinen mit
zwei leichten Ketten und zwei schweren Ketten besteht. Diese Verbindung
wird als tetrameres IgG/PDGFr bezeichnet. In einem anderen Fall wurde
eine cDNA für
leichte Kette/PDGF-Rezeptor-extrazelluläre-Domäne-Fusionsprotein in die Zellen
allein transfiziert. Diese Zellen sezernieren monomere leichte Kette-Fusionsproteine in
ihr Kulturmedium, bezeichnet als monomere IgG/PDGFr. Die alpha- und beta-Rezeptorfusionsproteine
wurden als IgG/PDGFr-alpha (tetramer) bzw. IgG/PDGFr-beta (monomer
und tetramer) bezeichnet. Die Fusionsproteine wurden entweder durch Immunaffinitätsreinigung
unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder durch Protein-A-Sepharose
TM-Chromatographie gereinigt.
-
Beispiel 1 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Herstellung von monoklonalen
PDGF-Rezeptorantikörpern
-
Es
wurden Fusionsproteine, die eine konstante IgG-Region, die mit der
extrazellulären
Domäne
von entweder dem PDGF-alpha-Rezeptor (PDGFr-alpha) oder dem PDGF-beta-Rezeptor (PDGFr-beta)
verbunden ist, umfassen, im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,155,027
offenbart, hergestellt. Die alpha- und beta-Rezeptorfusionen wurden
als IgG/PDGFr-alpha bzw. IgG/PDGFr-beta bezeichnet. Das monomere IgG/PDGFr-beta
wurde als eine Fusion einer menschlichen konstanten leichten Kappa-Kettenregion und
der PDGF-beta-Rezeptor-extrazellulären Domäne ausgedrückt. Das tetramere IgG/PDGFr-beta
wurde durch Koexpression des monomeren Konstruktes mit einer menschlichen
konstanten schweren Ig-Kettenregion plus Hinge-Sequenz, fusioniert
an die extrazelluläre
Domäne,
hergestellt. Alpha-Rezeptorfusionen wurden mit ähnlichen Mitteln hergestellt.
-
Acht
Wochen alte Balb/c-Mäuse
wurden mit entweder gereinigten monomeren oder tetrameren IgG/PDGFr-beta
oder gereinigten tetrameren IgG/PDGFr-alpha immunisiert. Den Mäusen wurden
intraperitoneale (ip) Injektionen von ungefähr 10 μg gereinigtem IgG/PDGFr, gemischt
mit vollständigem
Freund-Adjuvans gegeben. In ungefähr zweiwöchigen Intervallen erhielten
die Mäuse
zusätzliche
ip-Injektionen von IgG/PDGFr-beta
oder IgG/PDGFr-alpha, gemischt mit inkomplettem Freund-Adjuvans.
-
Hybridome
wurden aus den immunisierten Mäusen,
im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,094,941 offenbart wird, hergestellt.
Kurz gefasst wurden Milzzellen aus den Mäusen isoliert und gewaschen.
Kontaminierende rote Blutzellen wurden durch Lyse mit destilliertem
Wasser entfernt und die Milzzellen wurden gewaschen. Irgendwelches
verbleibende kontaminierende Gewebematerial wurde durch Zentrifugation
entfernt.
-
Die
NS-1-Maus-Myelomzelllinie (ATCC TIB 18) wurde für die Fusionen verwendet. Um
die Fusionseffizienz zu optimieren, wurden die Zellen auf Fusionseffizienz
geprüft
und ein Klon mit einer hohen Fusionseffizienz wurde ausgewählt. Die
NS-1-Zellen ließ man
in NS-1-Medien (Tabelle 1) bei 37°C,
7% CO2 wachsen.
-
Von
Babymäusen
erhaltene Thymocyten wurden als Feeder-Schicht verwendet, um das
Kulturmedium in den für
die Zellfusion gewünschten
Zustand zu bringen. Man erhielt Thymusdrüsen von drei bis vier Wochen
alten Balb/c-Mäusen
und Thymocyten wurden, wie in US-Patent Nr. 5,094,941 offenbart,
isoliert.
-
NS-1-Zellen
wurden zu den vorbereiteten immunisierten Maus-Milzzellen zugegeben
und die Fusion wurde im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,094,941
offenbart, durchgeführt.
Die Zellen wurden in NS-1-Medium, das 1 × HAT (Tabelle 1) und 2,5 × 10
6 Thymocyten pro ml enthielt, kultiviert.
Die Hybridome wurden zwischen den Tagen 9 und 14 auf die Produktion
spezifischer Antikörper
getestet. Zellfusionen wurden durch Nummer gekennzeichnet (z. B.
162, 163). Tabelle
1
NS-1-Medium
Für
eine 500 ml Lösung
5 ml | 10
mMol MEM nicht-essentielle Aminosäuren (GIBCO BRL, Gaithersburg,
MD) |
5 ml | 100
mMol Natriumpyruvat (Irvine, Santa Ana, CA) |
5 ml | 200
mMol L-Glutamin (GIBCO BRL) |
5 ml | 100 × Penicillin/Streptomycin/Neomycin
(GIBCO BRL) |
75
ml | inaktiviertes
fötales
Kälberserum
(BioCell, Carson, CA) |
1 g | NaNCO3 |
| Man
gebe RPMI 1640 (GIBCO BRL) zu einem Gesamtvolumen von 500 ml zu.
Man sterilisiere durch Filtration durch einen 0,22 Im-Filter. |
100 × HT-Vorrat
38,5
mg | Thymidin |
136,10
mg | Hypoxanthin |
| |
| Man
löse das
Thymidin und Hypoxanthin in destilliertem H2O
und bringe das Volumen auf 100 ml. Man wärme die Lösung auf 60–70°C, um die Feststoffe zu lösen. Nachdem
sich die Feststoffe aufgelöst
haben, stelle man das Volumen wieder auf 100 ml ein. Man sterilisiere
durch Filtration durch ein 0,22 μm-Filter.
Man bewahre gefroren bei –20°C auf. |
1000 × A-Vorrat
17,6
ng | Aminopterin |
| Man
füge steriles
destilliertes Wasser zu dem Aminopterin hinzu und bringe das Volumen
auf 50 ml. Man füge
1 N NaOH tröpfchenweise
zu, bis sich das Aminopterin auflöst. Man bringe das endgültige Volumen
mit destilliertem H2O auf 100 ml. Man sterilisiere
durch Filtration durch ein 0,22 Im-Filter. Man bewahre gefroren bei –20°C auf. |
50 × HT
50
ml | 100 × HT |
5 ml | 1000 × A-Vorrat |
45
ml | destilliertes
H2O |
| Man
sterilisiere die Lösung
durch Filtration durch ein 0,22 Im-Filter. Man bewahre gefroren
bei –20°C auf. |
ELISA-A-Puffer
0,1
M | Na2HCO3, pH 9,6 |
0,02% | NaN3 |
-
ELISA-B-Puffer
-
Dieser
Puffer kann mit 1%igem oder 2%igem Rinderserumalbumin hergestellt
werden (BSA, erhältlich von
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
5 oder 10 μg BSA (für 1%iges
bzw. 2%iges BSA)
250 μl | Tween
20 (Sigma) |
100
mg | NaN3 |
| Man
füge Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung
pH 7,2 (PBS, Sigma) bis zu einem endgültigen Volumen von 500 ml zu.
Alternativ
kann der Puffer als 1%iges oder 2%iges BSA in ELISA C-Puffer hergestellt
werden. |
ELISA-C-Puffer
500 μl | Tween
20® (Sigma) |
200
mg | NaN3 |
| Man
füge PBS
bis zu einem endgültigen
Volumen von 1 Liter zu. |
Reaktionspuffer
10
ml | 0,1
M Natriumcitrat, pH 5,0 |
5 mg | o-Phenylendiamindihydrochlorid
(Sigma) |
5 μl | N2O2 (Sigma) |
Extraktionspuffer
100
ml | PBS |
1,0
ml | Nonidet
P-40 (NP-40) Detergens (Sigma) (1% endgültige Konzentration) |
Bindungsmedien
500
ml | Ham's F-12 (GIBCO BRL) |
12
ml | 1
M Hepes pH 7,4 |
5 ml | 100 × Penicillin/Strepomycin/Neomycin
(GIBCO BRL) |
1 g | Kaninchenserumalbumin
(Sigma) |
Mito-Medien
Für eine 500
ml-Lösung
250
ml | DMEM
(GIBCO BRL) |
250
ml | Ham's F-12 (GIBCO BRL) |
0,25
ml | 10
mg/ml Vorrat an Insulin (GIBCO BRL), um eine endgültige Konzentration
von 5 μg/ml
zu ergeben. |
1 ml | 10
mg/ml Vorrat an Transferrin (Collaborative Research, Bedford, MA), um
eine endgültige
Konzentration von 20 μg/ml
zu ergeben |
2 ml | 4 μg/ml Vorrat
an Selen (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI), um eine endgültige Konzentration
von 5 nMol zu ergeben |
5 ml | 10%ige
Vorratslösung
an Rinderserumalbumin (GIBCO BRL), um eine endgültige Konzentration von 0,1%
zu ergeben. |
-
Beispiel 2 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Identifizierung und Charakterisierung
von Hybridomen, die Antikörper
gegen den PDGF-beta-Rezeptor produzieren
-
Hybridome
aus der Zellfusion 162 wurden auf die Produktion von Antikörpern gegen
den PDGF-beta-Rezeptor getestet. Assays, die zur Identifizierung
positiver Hybridome verwendet wurden, schlossen Enzyme-linked immunosorbent
assays (ELISA), Inhibition von 125I-PDGF-BB-Bindung
an IgG/PDGFr-beta und Inhibition von 125I-PDGF-BB-Bindung an menschliche
dermale Fibroblasten mit ein.
-
Die
ELISA-Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die
mit monomerem IgG/PDGFr-beta beschichtet worden waren, durchgeführt. Um
die Vertiefungen zu beschichten, wurde IgG/PDGFr-beta auf 200 ng/ml
in ELISA A-Puffer (Tabelle 1) verdünnt, und 100 μg der Lösung wurde
zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C für 2 Stunden
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten mit ELISA C-Puffer
(Tabelle 1) gewaschen. Die Platten wurden dann mit 150 μl/Vertiefung
von ELISA B-Puffer (Tabelle 1) bei 37°C inkubiert, um unspezifische
Bindungsstellen zu blockieren. Der Puffer wurde entfernt und die
Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen.
-
Die
Testhybridomüberstände wurden
in Zweiergruppen gepoolt, und 100 μl der gepoolten Proben wurden
zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Platten wurden
für 1 Stunde
bei 37°C
inkubiert. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann
für 1,5
Stunden bei 37°C
mit Biotin-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (Vector Labs, Burlingame,
CA) inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen,
dann für
30 Minuten bei 37°C
mit 100 μl/Vertiefung
von Strepavidin-Meerrettichperoxidase (Amersham
International, Amersham, U. K.) inkubiert. Die Vertiefungen wurden
wieder mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit Reaktionspuffer (Tabelle
1) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H2SO4 beendet und
die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät (Dynatech
Laboratories, Inc. Alexandria, VA) unter Verwendung eines Filters,
um die Absorption bei 490 nm zu überwachen,
gelesen. Diejenigen Vertiefungen mit Aaso-Ablesungen, die größer als
0,2 waren, wurden als Positive genommen. Die positiven Kandidaten
wurden erneut einem ELISA-Assay wie oben beschrieben unterworfen,
um die einzelnen Kulturvertiefungen, die die Hybridomzellen, die
Antikörper
gegen IgG/PDGFr-beta herstellten, enthielten, zu bestimmen.
-
Hybridome
aus der Zellfusion 162 wurden auch auf die Inhibition der 125I-PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta untersucht.
Ziegen-anti-Mensch-IgG (Cappel Labs, Malvern, PA) wurde mit ELISA
A-Puffer bis zu einer endgültigen
Konzentration von 2 μg/ml
verdünnt.
Diese Mischung wurde dann zu Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
zugegeben, 100 μl/Vertiefung,
und die Platten wurden für
1,5 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen,
dann mit 200 μl/Vertiefung
an ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann
für 1,5
Stunden mit tetramerem IgG/PDGFr-beta inkubiert und in ELISA B-Puffer
bis zu einer endgültigen Konzentration
von 25 ng/ml verdünnt.
Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, um ungebundenes
IgG/PDGFr-beta zu entfernen.
-
Die
Hybridomüberstände wurden
in Zweiergruppen gepoolt und 100 μl
der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen
zugegeben. Die Vertiefungen wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
Zu jeder Vertiefung wurden dann 50 μl 125I-PDGF-BB
(ungefähr
50000 cpm pro Vertiefung) zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei
37°C wurden
die Vertiefungen dreimal mit Bindungsmedien (Tabelle 1) gewaschen.
100 μl 0,1 M
Natriumcitrat, pH 2,5, wurde zu den Vertiefungen für 5 Minuten
bei Raumtemperatur zugegeben, die Lösung wurde geerntet und auf
12 × 75
mm Röhrchen übertragen
und die Röhrchen
wurden in einem Gammazähler gezählt, um
den Level der 125I-PDGF-BB-Bindung zu bestimmen. Antikörper, die
an IgG/PDGFr-beta banden und die 125I-PDGF-BB-Bindung blockierten,
wurden durch eine Abnahme des Levels des gebundenen 125I-PDGF-BB
im Vergleich zu den Kulturmedien alleine nachgewiesen.
-
Die
Medienpools, bei denen bestimmt wurde, dass sie positiv für IgG/PDGFr-beta-neutralisierenden Antikörper waren,
wurden unter Verwendung eines Assayformats, das ähnlich dem oben beschriebenen
war, erneut untersucht, um die einzelnen Vertiefungen, die Hybridome,
die neutralisierenden Antikörper
herstellten, enthielten, zu identifizieren.
-
Die
Medienproben aus Kulturvertiefungen, die entweder durch ELISA oder
durch Inhibition von 125I-PDGF-BB-Bindung
positiv waren, wurden im Anschluss daran in einem Down-Regulations-Assayformat (Hart
et al., J. Biol. Chem. 262: 10780–10785, 1987) auf die Fähigkeit,
PDGF-beta-Rezeptor auf menschlichen dermalen Fibroblasten zu erkennen,
einem Assay unterzogen. Die Bindung von PDGF-BB an den PDGF-beta-Rezeptor
bei 37°C
führt zu
der Internalisierung der Rezeptoren von der Zelloberfläche und
einer darauffolgenden Abnahme in der Anzahl der Zelloberflächenrezeptoren,
ein Phänomen,
das als Down-Regulation bezeichnet wird. Die Fibroblasten wurden
auf Kulturschalen mit 96 Vertiefungen mit 10000 Zellen pro Vertiefung plattiert
und vor der Verwendung in Kulturmedien für 1–2 Tage erhalten. Zu einem
Satz von Vertiefungen wurde PDGF-BB
in einer endgültigen
Konzentration von 100 ng/ml auf den Zellen zugegeben. Die Zellen
wurden für 1,5
Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Kulturmedien wurden von den Zellen entfernt und die
Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Test-Kulturmedien
von den Hybridomzellen wurden dann zu doppelten Vertiefungen von
Zellen, die entweder die PDGF-BB-Behandlung erhalten hatten oder von
Zellen, die man unbehandelt gelassen hatte, zugegeben. Die Zellen
wurden anschließend
für 2 Stunden bei
4°C inkubiert,
dann mit PBS gewaschen. 100 μl/Vertiefung 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG (100000 cpm/Vertiefung)
wurden zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden für zusätzliche
1,5 Stunden bei 4°C
inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann für 5 Minuten
bei Raumtemperatur mit 100 μl/Vertiefung
Extraktionspuffer (Tabelle 1) inkubiert. Die Extrakte wurden geerntet,
auf 12 × 75
mm Röhrchen übertragen
und in einem Gammazähler
gezählt,
um den Level an 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung
zu bestimmen. Wenn es einen Antikörper in den Hybridomkulturüberständen gibt,
der fähig
ist, PDGF-beta-Rezeptor der Zelloberfläche zu erkennen, dann würde es eine
Abnahme des Levels der 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung an diejenigen
Zellen, die mit PDGF-BB für
die Down-Regulation der Rezeptoren behandelt wurden, geben.
-
Verschiedene
Hybridome von Fusion 162 wurden als Antikörper gegen den PDGF-beta-Rezeptor herstellend
identifiziert. Die identifizierten Hybridome wurden zweimal durch
Grenzwertverdünnung
geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper herstellen,
zu erhalten. Die Klone wurden auf Antikörperproduktion durch die oben
beschriebenen Assays untersucht. Ein Hybridom, genannt 162.62, wurde
für die
weitere Charakterisierung ausgewählt.
-
Beispiel 3 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Identifizierung und Charakterisierung
von Hybridomen, die anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper herstellen
-
Hybridome
aus Zellfusion 163 wurden auf die Herstellung von Antikörpern gegen
den PDGF-beta-Rezeptor durch ein kombiniertes ELISA/PDGF-Bindungskonkurrenzassay
getestet. Diese Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
durchgeführt.
Die Platten wurden anfangs mit Ziegen-anti-Mensch-IgG, 2 μg/ml in ELISA
A-Puffer, für
2 Stunden bei 37°C
beschichtet. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann
für 1 1/2
Stunden bei 37°C
mit ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann entweder sofort
verwendet oder für
1–4 Tage
bei 4°C
bis zur Verwendung stehen gelassen. Zum Zeitpunkt des Assays wurden
die Platten einmal mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 1 1/2
Stunden bei 37°C
mit tetramerem IgG/PDGFr-beta, das auf 25 ng/ml in Bindungsmedium
verdünnt
worden war, inkubiert. Die Platten wurden dann mit ELISA C-Puffer
gewaschen, um ungebundenes IgG/PDGFr-beta zu entfernen.
-
Die
Hybridomüberstände wurden
in Gruppen von zwei Vertiefungen gepoolt, und 100 μl der gepoolten Proben
wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Platten
wurden für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert, dann mit Bindungsmedium gewaschen. Es wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes
Ziegen-anti-Maus-IgG (Tago, Burlingame, CA), verdünnt 1 :
1000 mit Bindungsmedium, zugegeben. Die Vertiefungen wurden für 1 Stunde
bei 37°C
inkubiert, dann mit Bindungsmedium gewaschen, um ungebundenes MRP-konjugiertes
Ziegen-anti-Maus-IgG zu entfernen. Es wurde dann 125I-PDGF-BB, ungefähr 26000
cpm/Vertiefung, zu den Vertiefungen für eine zusätzliche Stunde bei 37°C zugegeben.
Die Vertiefungen wurden mit Bindungsmedium gewaschen, dann mit Reaktionspuffer
für die
Entwicklung des ELISA inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
von 100 μl/Vertiefung
1 N H2SO4 beendet,
und die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät unter
Verwendung eines Filters zur Überwachung
der Absorption bei 490 nm gelesen.
-
Der
Inhalt der Vertiefungen wurde dann auf 12 × 75 mm TestRöhrchen übertragen,
und die Proben wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level an 125I-PDGF-BB-Bindung zu messen.
-
Das
oben beschriebene Assay identifizierte durch ELISA Hybridomkulturen,
die Antikörper
gegen IgG/PDGFr-beta herstellen, wie auch durch die Fähigkeit,
die Bindung von 125I-PDGF-BB an tetrameres IgG/PDGFr-beta
zu blockieren. Diejenigen gepoolten Proben, die positiv waren, wurden
anschließend
unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben beschrieben erneut
einem Assay unterworfen, um die einzelnen Kulturvertiefungen, die
die Hybridomzellen, die Antikörper
gegen IgG/PDGFr-beta herstellten, enthielten, zu bestimmen.
-
Einzelne
Vertiefungen, bei denen man herausfand, dass sie positiv für die Bindung
an IgG/PDGFr-beta waren, wurden anschließend auf die Fähigkeit, 125I-PDGF-BB-Bindung an menschliche dermale
Fibroblasten zu inhibieren, einem Assay unterworfen. Menschliche
dermale Fibroblasten wurden auf Kulturschalen mit 24 Vertiefungen
mit ungefähr
20000 Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Kulturmedien wurden von
den Zellen entfernt und die Hybridomtestkulturmedien, 0,5 ml pro
Vertiefung, wurde zu den doppelten Vertiefungen zugegeben. Als eine
negative Kontrolle wurde NS-1-Medium zu einem Satz von Vertiefungen
allein zugegeben. Zu einem zweiten Satz von Vertiefungen wurde PDGF-BB
in einer endgültigen
Konzentration von 20 ng/ml in NS-1-Medium zugegeben, um unspezifische
Bindung von 125I-PDGF-BB zu bestimmen. Die
Zellen wurde für 1
Stunde bei 4°C
inkubiert, dann wurde 125I-PDGF-BB, 100 μl/Vertiefung
(ungefähr
26000 cpm), zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden für 1 zusätzliche
Stunde bei 4°C
inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Extraktionspuffer inkubiert.
Die Extrakte wurden in 12 × 75
mm Röhrchen
geerntet und in einem Gammazähler
gezählt.
Die Testproben, die eine Abnahme der 125I-PDGF-BB-Bindung
im Vergleich zu der NS-1-Mediumprobe
hervorriefen, wurden als positiv für die Fähigkeit, PDGF-BB-Bindung an
nativen PDGF-beta-Rezeptor auf Monolayern menschlicher dermaler
Fibroblasten zu inhibieren, einem Assay unterworfen.
-
Verschiedene
Hybridome von Fusion 163 wurden als Antikörper gegen den PDGF-beta-Rezeptor herstellend
identifiziert. Die identifizierten Hybridome wurden zweimal durch
Grenzwertverdünnung
geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper herstellen,
zu erhalten. Die Klone wurden durch die oben beschriebenen Assays
auf Antikörperproduktion
untersucht. Ein Hybridom, genannt 163.31, wurde für die weitere Charakterisierung
ausgewählt.
-
Beispiel 4 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Charakterisierung von
anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAks 162.62 und 163.31
-
Die
MAks 162.62 und 163.31 (hergestellt von Hybridomklonen 162.62 bzw.
163.31) wurden in Hinsicht auf ihre Fähigkeit, die Bindung von 125I-PDGF-BB an entweder tetrameres IgG/PDGFr-beta
oder den PDGF-beta-Rezeptor auf menschlichen dermalen Fibroblasten
zu blockieren, verglichen. Die Inhibition von 125I-PDGF-BB-Bindung
an IgG/PDGFr-beta wurde im Wesentlichen wie oben für das initiale
Screening der Fusion 163 beschrieben getestet. Anstelle der Zugabe
von konditioniertem Kulturmedium, wurden bekannte Mengen an Antikörper, der
in NS-1-Medium verdünnt
wurde, gleichzeitig mit 125I-PDGF-BB zu
den mit IgG/PDGFr-beta beschichteten Vertiefungen zugegeben. NS-1-Medium
allein wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Die Zugabe von
PDGF-BB, 500 ng/ml, zu dem NS-1-Medium wurde verwendet, um den Level
unspezifischer Bindung durch 125I-PDGF-BB
zu bestimmen. Die Vertiefungen wurden bei 4°C für 2 1/2 Stunden inkubiert,
dann mit PBS gewaschen. 100 μl
0,1 M Citrat pH 2,5 wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um das
gebundene 125I-PDGF-BB zu entfernen, die
Proben wurden auf 12 × 75
mm Röhrchen übertragen
und dann wurden die Röhrchen
in einem Gammazähler
gezählt.
-
Um
die Bindung an menschliche dermale Fibroblasten einem Assay zu unterwerfen,
wurden die Fibroblasten mit ungefähr 20000 Zellen/Vertiefung
in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Die Zellen wurden
2–7 Tage
nach der Plattierung für
das Assay verwendet. Die Antikörper
wurden in Bindungsmedien auf die Konzentrationen, die in Tabelle
2 gezeigt werden, verdünnt,
dann mit 125I-PDGF-BB vermischt und 0,5
ml Aliquots wurden zu den doppelten Vertiefungen von Fibroblasten
zugegeben. Die Bindungsmedien alleine wurde als die negative Kontrolle
verwendet und die Zugabe von 500 ng/ml PDGF-BB wurde verwendet,
um unspezifische Bindung für 125I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Zellen wurden
für 2 1/2
Stunden bei 4°C
inkubiert, dann mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden
zu entfernen. Die Zellen wurden dann mit Extraktionspuffer inkubiert
und die Extrakte wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt.
-
Die
Ergebnisse der Bindungsstudien werden in Tabelle 2 gezeigt. Die
Daten werden als spezifische cpm gebunden für 125I-PDGF-BB
dargestellt. Unspezifische Bindung, bestimmt durch die Zugabe von
500 mg/ml unmarkiertem PDGF-BB, betrug 260 cpm für die IgG/PDGFr-beta-Vertiefungen
und 105 cpm für
die menschlichen dermalen Fibroblasten und wurde von den dargestellten
Daten abgezogen. %CB = Prozent Kontrollbindung.
-
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass beide MAks 162.62 und 163.31 wirksame Inhibitoren
der PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta sind. Im Gegensatz dazu ist
MAk 162.62 ein stärker
wirksamer Inhibitor als MAk 163.31 für die PDGF-BB-Bindung an menschliche
dermale Fibroblasten.
-
MAk
162.62 wurde auch in Hinblick auf die Fähigkeit an Rezeptoren auf Monolayern
von menschlichen dermalen Fibroblasten gebundenes 125I-PDGF
zu verdrängen
analysiert. Zuerst wurde 125I-PDGF-BB mit
Monolayern menschlicher dermaler Fibroblasten auf Kulturplatten
mit 24 Vertiefungen inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen,
dann anschließend
für 1 Stunde
bei 4°C
mit entweder MAk 162.62, 5 μg/ml,
oder Bindungsmedium alleine inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen,
mit Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden in einem
Gammazähler
gezählt,
um den Level der 125I-PDGF-BB-Bindung zu
bestimmen. Um unspezifische Bindung zu bestimmen, wurden 500 ng/ml
unmarkiertes PDGF-BB während
des ersten Inkubationsschrittes zugegeben. Die Ergebnisse, dargestellt
in Tabelle 3, zeigen, dass die Zugabe von MAk 162.62 zu einer 47%igen
Verdrängung
des zuvor gebundenen 125I-PDGF-BB führten. So
war MAk 162.62 in der Lage, Rezeptor-gebundenes PDGF-BB von der
Oberfläche
menschlicher dermaler Fibroblasten zu verdrängen.
-
-
Die
Unterklasse für
die MAks 162.62 und 163.31 wurde durch ELISA unter Verwendung IgG/PDGFr-beta-beschichteter
Vertiefungen und subklassenspezifischer sekundärer Antikörper bestimmt. Es wurde herausgefunden,
dass MAk 162.62 ein IgG2b-Isotyp ist, während herausgefunden wurde,
dass MAk 163.31 ein IgG1-Isotyp ist.
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Beispiel 5 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Identifizierung und Charakterisierung
von Hybridomen, die anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper herstellen
-
Hybridome
von der Zellfusion 169 wurden auf die Herstellung von Antikörpern gegen
den PDGF-alpha-Rezeptor durch ein kombiniertes ELISA/PDGF-Bindungskonkurrenz-Assay getestet. Diese
Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die
Platten wurden anfänglich
mit Ziegen-anti-Mensch-IgG, 2 μg/ml
in ELISA A-Puffer, über Nacht
bei 4°C
beschichtet. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann
mit ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann über Nacht
bei 4°C
mit tetramerem IgG/PDGFr-alpha, verdünnt auf 25 ng/ml in Bindungsmedium,
inkubiert. Die Platten wurden dann mit ELISA C-Puffern gewaschen,
um ungebundenes IgG/PDGFr zu entfernen.
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Die
Hybridomüberstände wurden
in Zweiergruppen gepoolt und 25 μl
der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen
zugegeben. Die Platten wurden für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert, dann mit ELISA C-Puffer gewaschen. Zu den Vertiefungen
wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Tago),
verdünnt
1 : 1000 mit Bindungsmedium, zugegeben. Die Vertiefungen wurden
für 1 Stunde bei
37°C inkubiert,
dann mit ELISA C-Puffer gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu
entfernen. Es wurde dann 125I-PDGF-AA, ungefähr 25000
cpm/Vertiefung, zu den Ver tiefungen für eine zusätzliche Stunde bei 37°C zugegeben.
Die Vertiefungen wurden mit Bindungsmedium gewaschen, dann mit Reaktionspuffer
für die
Entwicklung des ELISA inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe
von 100 μl/Vertiefung
1 N H2SO4 beendet und
die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät unter
Verwendung eines Filters, um die Absorption bei 490 nm zu überwachen,
gelesen.
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Der
Inhalt der Vertiefungen wurde dann auf 12 × 75 mm TestRöhrchen übertragen
und die Proben wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level der 125I-PDGF-AA-Bindung zu messen.
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Dieses
Assay identifizierte durch ELISA Hybridomkulturen, die Antikörper gegen
IgG/PDGFr-alpha herstellten, und überwachte hinsichtlich eines
Antikörpers,
der in der Lage war, die Bindung von 125I-PDGF-AA an
das tetramere IgG/PDGFr-alpha zu blockieren. Diejenigen gepoolten
Proben, die in dem anfänglichen
Assay positiv waren, wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls
wie oben beschrieben erneut einem Assay unterworfen, um die einzelnen
Kulturvertiefungen, die die Hybridomzellen, die Antikörper gegen
IgG/PDGFr-alpha herstellten, enthielten, zu bestimmen. Es wurden
verschiedene Vertiefungen identifiziert, bei denen Antikörper, der
gegen IgG/PDGFr-alpha
gerichtet war, vorlag. Von diesen wurden zwei, 169.14 und 169.31,
für die
weitere Analyse ausgewählt.
Hybridome aus diesen Vertiefungen wurden durch Grenzwertverdünnung zweimal
geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper gegen
den PDGF-alpha-Rezeptor herstellten, zu erhalten. Die Klone wurden
unter Verwendung des kombinierten ELISA/125I-PDGF-AA-Bindungskonkurrenz-Assays
im Wesentlichen wie oben beschrieben untersucht.
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Um
zu bestätigen,
dass MAks 169.14 und 169.31 nativen PDGF-alpha-Rezeptor auf Monolayern
von Säugetierzellen
erkennen, wurden die zwei Antikörper
auf ihre Fähigkeit
hin, 125I-PDGF-AA-Bindung an alpha T-7-Zellen
zu blockieren, analysiert. Diese Zellen sind epitheliale Hundenierenzellen,
die normalerweise PDGF-alpha-Rezeptor nicht exprimieren, die aber
mit einer cDNA, die die gesamte Länge des PDGF-alpha-Rezeptors codiert,
transfiziert wurden (US-Patent Nr. 5,371,2050. 5,371,205; PCT-Veröffentlichung
WO 90/14425). Diese Zellen exprimieren ungefähr 100000 rekombinante Rezeptoren
pro Zelle. Die alpha T-7-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen
bis zu ungefähr
95%iger Konfluität
kultiviert. Das Kulturmedium wurde entfernt und Verdünnungen
der MAks 169.14 und 169.31 wurden zu den Zellen zugegeben. Die Kontrollen waren
NS-1-Medium und NS-1-Medium, das 500 ng/ml PDGF-BB enthielt, um
den unspezifischen Bindungsanteil für 125I-PDGF-AA
zu bestimmen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl der Testprobe plus 10 μl 125I-PDGF-AA (ungefähr 22000 cpm pro Vertiefung)
zugegeben. Die Zellen wurden mit den Proben für 2 Stunden bei 4°C inkubiert, mit
PBS gewaschen, dann mit 100 μl
pro Vertiefung Extraktionspuffer extrahiert. Die Extrakte wurden
geerntet und in einem Gammazähler
gezählt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen,
dass diese zwei MAks membrangebundenen PDGF-alpha-Rezeptor bei Säugetierzellen zusätzlich zu
IgG/PDGFr-alpha erkennen.
-
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Die
Subklasse für
die MAks 169.14 und 169.31 wurde durch ELISA unter Verwendung IgG/PDGFr-alpha-beschichteter
Vertiefungen und subklassenspezifischem sekundären Antikörper bestimmt. Beide MAks, 169.14
und 169.31, waren im Assay positiv für IgG2a-Isotyp.
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Beispiel 6 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Bindungsspezifität von anti-PDGF-Rezeptor-MAks
-
Um
PDGF-Rezeptorunterheinheits-Bindungsspezifität zu zeigen, wurden die MAks
162.62, 163.31, 169.14 und 169.31 hinsichtlich ihrer Bindung an
Klon 8-Zellen und Alpha 1-10-Zellen analysiert. Klon 8-Zellen sind
BHK 570 (ATCC CRL 10314)-Zellen, die mit einem Gen, das die gesamte
Länge menschlichen
PDGF-beta-Rezeptors codiert, transfiziert wurden (Gronwald et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988). Diese Zellen
exprimieren ungefähr
500000 menschliche PDGF-beta-Rezeptoren pro Zelle. Die Alpha 1-10-Zellen
sind BHK 570-Zellen, die mit einer cDNA, die die gesamte Länge menschlichen
PDGF-alpha-Rezeptors codiert, transfiziert wurden (US-Patent Nr.
5,371,205; PCT-Veröffentlichung
WO 90/14425). Diese Zellen exprimieren ungefähr 1000000 menschlicher PDGF-alpha-Rezeptoren
pro Zelle. Um die Bindungsspezifität für entweder den PDGF-alpha-
oder -beta-Rezeptor zu zeigen, wurden Zelloberflächenbindungsstudien unter Verwendung
der anti-PDGF-Rezeptor-MAks mit diesen zwei Zelllinien durchgeführt.
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Sowohl
die Klon 8- wie auch die Alpha 1-10-Zellen wurden in Platten mit
24 Vertiefungen bis zur Konfluität
kultiviert. PDGF-BB (200 ng/ml) wurde zu einer Hälfte der Zellen zugegeben,
um PDGF-Rezeptor-Down-Regulation zu stimulieren und Trägerstoffkontrolle
(10 mm Essigsäure,
0,25%iges Kaninchenserumalbumin) wurde zu der anderen Hälfte zugegeben.
Die Zellen wurden für
1–2 Stunden
bei 37°C
inkubiert, dann mit auf 4°C
gekühltem
PBS gewaschen. Es wurden die gereinigten MAks 162.62, 163.31, 169.14
und 169.31, verdünnt
auf 5 μg/ml
in Bindungsmedium, zu dreifachen Vertiefungen der mit PDGF-BB behandelten
und nicht behandelten Kontrollzellen zugegeben. Die Zellen wurden
für ungefähr 2 Stunden
auf Eis inkubiert und dann mit gekühltem PBF gewaschen, um ungebundenen
Antikörper
zu entfernen. Die Testvertiefungen wurden dann auf Eis für 30 Minuten
mit 125I-markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG
inkubiert und in Bindungsmedium auf ungefähr 400000 cpm/Vertiefung verdünnt. Die
Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen, dann mit Extraktionspuffer
inkubiert. Die Extrakte wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die
Ergebnisse, gezeigt in 1, zeigen, dass nur MAks 162.62
und 163.31 spezifisch an den PDGF-beta-Rezeptor banden, wie durch die signifikante
Abnahme der Bindung an die PDGF-BB-behandelten Klon 8-Zellen im Vergleich
zu den unbehandelten Kontrollen gezeigt wird. Der hohe Bindungslevel
durch MAk 169.14 lag an dem erhöhten Level
unspezifischer Bindung durch diesen Antikörper, da es keine signifikante
Abnahme der 125I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung
an die mit PDGF-BB behandelten Zellen gab. Im Gegensatz dazu zeigten
nur die MAks 169.14 und 169.31 Bindung an den PDGF-alpha-Rezeptor,
wie durch die spezifische Bindung an die Alpha 1-10-Zellen gezeigt
wird (2). Aufgrund der Fähigkeit der Antikörper an
Zelloberflächen-PDGF-Rezeptor
zu binden, bestätigen
diese Ergebnisse, dass diese Antikörper extrazelluläre Epitope
auf den PDGF-Rezeptoren erkennen.
-
Beispiel 7 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Neutralisierung mitogener
PDGF-Aktivität
auf menschlichen dermalen Fibroblasten
-
Menschliche
dermale Fibroblasten wurden mit ungefähr 20000 Zellen pro Vertiefung
auf Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert und bis zum Ruhezustand
in DMEM (GIBCO BRL), das 2%iges fötales Kälberserum enthielt, wachsen
gelassen. Die Zellen wurden entweder mit PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert.
Es wurden Standardkurven mit Konzentrationen von 5, 1,25, 0,31 und
0 ng/ml endgültiger
Konzentration auf den Zellen durchgeführt. Vorrats-PDGF-Verdünnungen
wurden mit 10 mMol Essigsäure,
die 0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, hergestellt, und 50 μl der Vorratsproben
oder Trägerstoff
allein wurde zu den Kulturvertiefungen hinzugegeben, um die erwünschten
endgültigen
Konzentrationen zu ergeben. Um die Fähigkeit der MAks 162.62 und
169.14, die mitogene Aktivität
von jedem der drei PDGF-Liganden zu neutralisieren, zu analysieren,
wurden 5 ng/ml PDGF zu den Vertiefungen zusammen mit 20 μg/ml (endgültige Konzentration
auf den Zellen) der MAks 162.62 und 169.14 allein, oder 20 μg/ml eines
Pools aus den beiden Antikörpern
zugegeben. Die Zellen wurden mit den Testproben für ungefähr 20 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Die Medien wurden aspiriert, dann mit 1 ml DMEM, das
5% fötales
Kälberserum
enthielt, ersetzt, und mit 37 kBq/ml (1 μCi/ml) [3H]Thymidin
ergänzt.
Die Zellen wurden für
4 Stunden bei 37°C
inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der
[3H]Thymidin-Einschluss in einem Wallac
(Turku, Finnland) BetaplateTM-Flüssigszintillationszähler gezählt. Die
Ergebnisse, dargestellt in 3A, zeigen,
dass die mitogene PDGF-AA-Aktivität durch MAk 169.14 wie auch
durch den Antikörperpool,
aber nicht durch MAk 162.62 inhibiert wurde. Die mitogene Aktivität von PDGF-AB
wurde zu ungefähr
80% durch MAk 162.62, und zu über
92% durch MAk 169.14 oder den Antikörperpool inhibiert (3B).
Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität von PDGF-BB nur minimal durch
MAk 169.14, aber zu ungefähr
80% durch MAk 162.62 und zu über
92% durch den Antikörperpool
inhibiert (3C).
-
Diese
Ergebnisse stimmen mit dem Modell der PDGF-Ligandenbindung überein,
das beschreibt, dass PDGF-AA an PDGF-alphalalpha-Rezeptordimere
bindet, PDGF-AB an PDGF-alpha/alpha und -alpha/beta-Rezeptordimere
bindet, und PDGF-BB an alle drei PDGF-Rezeptordimere bindet; -alpha/alpha,
-alpha/beta und -beta/beta (geprüft
in Hart et al., J. Invest. Derm. 94: 535–575, 1990). Somit, wenn MAk
169.14 an den alpha-Rezeptor
bindet und die PDGF-Bindung daran inhibiert, würde man dann erwarten, dass
er im Grunde 100% der mitogenen PDGF-AA- und -AB-Aktivität inhibiert,
da alpha-Rezeptorbindung für
diese beiden Liganden erforderlich ist. Dieses Modell stimmt mit
den Ergebnissen, die oben beschrieben werden, überein. Von der Bindung an
den und der Inhibition des PDGF-beta-Rezeptors durch MAk 162.62
würde man
dann erwarten, dass die Menge der mitogenen PDGF-AB- und -BB-Aktivität auf einen
Level begrenzt wird, der mit PDGF-AA übereinstimmt, da AB und BB
nur in der Lage wären,
an alpha/alpha-Dimere zu binden. Dies stimmt wiederum mit den Ergebnissen
der oben beschriebenen Studie überein.
-
Zusammenfassend
sind die anti-PDGF-Rezeptor-MAks 162.62 und 169.14 in der Lage,
die mitogene Aktivität
der drei Formen von PDGF auf eine Weise zu inhibieren, die mit der
gegenwärtigen
Hypothese der PDGF-Rezeptorbindung durch die drei PDGF-Liganden übereinstimmt.
Zusätzlich
ist die gemeinsame Verwendung der zwei Antikörper in der Lage, im Grunde
100% der mitogener PDGF-Aktivität
auf menschlichen dermalen Fibroblasten zu inhibieren.
-
Beispiel 8 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Inhibition
der mitogenen PDGF-Aktivität
auf glatten Pavianmuskelzellen
-
Anti-PDGF-Rezeptor-MAks
wurden auf ihre Fähigkeit
hin, die mitogene Aktivität
von PDGF auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren, analysiert.
Alle Mitogenese-Assays,
die an glatten Paviangefäßmuskelzellen
(BVSMCs) durchgeführt
wurden, wurden an primären
Kulturen von Zellen zwischen den Passagen 3 und 7 in der Kultur
gemacht. Die anfänglichen
Kulturen wurden aus dem Auswuchs aortaler Gewebeexplantate etabliert.
Glatte Pavianmuskelzellen wurden mit ungefähr 30000 Zellen pro Vertiefung
in DMEM, das mit 10%igem fötalem
Kälberserum
ergänzt
wurde, in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Zwei Tage
vor der Verwendung wurden die Kulturmedien entfernt und 1 ml Mito-Medien
(Tabelle 1) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Zellen zur
Ruhe kommen zu lassen. Zum Zeitpunkt des Experimentes wurden die
Zellen mit entweder PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert. Es wurden
Standardkurven für
jeden der drei Liganden unter Verwendung von endgültigen Konzentrationen,
die in den 4–6 gezeigt
werden, durchgeführt.
Es wurden 20 × Vorratslösungen für jede der
PDGF-Konzentrationen durch Verdünnung
in 10 mMol Essigsäure,
die 0,25% Albumin enthielt, hergestellt und 50 μl PDGF oder Verdünnungsträgerstoff
allein wurden zu den Kulturvertiefungen zugegeben.
-
Für die Mitogenese-Assays
wurden endgültige
PDGF-Konzentrationen von 10, 2 und 1,25 ng/ml für PDGF-AA, -AB bzw. -BB verwendet.
MAks 163.31 und 169.31 wurden zu den PDGF-enthaltenden Vertiefungen
in einer endgültigen
Konzentration von 25 μg/ml
zugegeben. Für
die Pools der zwei Antikörper
lag die endgültige
Konzentration des Antikörpers
auf den Zellen bei 25 μg/ml
gesamt oder 12,5 μg/ml
für jeden
der MAks. Die Zellen wurden zwischen 20–24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Für die
PDGF-AA- und -AB- Studien
wurden 50 μl
einer 1,48 MBq/ml (40 μCi/ml)-Lösung von
[3H]Thymidin zu jeder Vertiefung zugegeben.
Für die PDGF-BB-Studie
wurden die Medien aspiriert, dann mit 0,5 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum
enthielt, ersetzt und mit 74 kBq/ml (2 μCi/ml) [3H]Thymidin
ergänzt.
Die Zellen wurden zwischen 2–4
Stunden bei 37°C inkubiert,
mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der [3H]Thymidin-Einschluss
in einem BetaplateTM-Flüssigszintillationszähler (Wallac)
gezählt.
Wie in 4 gezeigt, wird die mitogene PDGF-AA-Aktivität zu 100%
durch MAk 169.31 wie auch durch den Antikörperpool inhibiert, aber nicht
durch MAk 163.31. Die mitogene PDGF-AB-Aktivität wurde vollständig durch
beide einzelne MAks wie auch durch den Antikörperpool inhibiert (5).
Es ist interessant zu bemerken, dass der Level des [3H]Thymidin-Einschlusses
in der Gegenwart der MAks unter dem Level lag, den man durch die
Zugabe der Trägerstoff-Kontrolle
alleine erhielt. Dieses sah man ähnlich
bei MAk 169.31 auf der PDGF-AA-Platte (4). Für die PDGF-BB-stimulierten
Zellen ergaben MAk 169.31 und MAk 163.31 einzeln weniger als 50%
Inhibition, während
ein Pool der zwei Antikörper in
der Lage war, ungefähr
75% der mitogenen PDGF-Aktivität zu inhibieren
(6).
-
Um
weiter die inhibitorische Wirksamkeit dieser Antikörper, die
mitogene Aktivität
von PDGF auf glatten Pavianmuskelzellen zu neutralisieren, darzustellen,
wurden zwei anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAks, 169.14
und 169.31 auf ihre Fähigkeit
hin, die mitogene PDGF-AA-Aktivität zu inhibieren, analysiert.
BVSMCs wurden plattiert und im Grunde wie oben beschrieben behandelt.
Zu einem Satz an Vertiefungen wurden zunehmende Konzentrationen
von PDGF-AA zugegeben, um eine Standardkurve der mitogenen PDGF-AA-Aktivität zu erzeugen
(7A). Die PDGF-AA-Proben reichten von 10 ng/ml
bis hinunter zu 0,31 ng/ml. Zu einem zweiten Satz an Vertiefungen
wurde eine Standardverdünnung
von PDGF-AA zugegeben, um eine endgültige Konzentration von 10
ng/ml zu ergeben. Es wurden dann abnehmende Konzentrationen der
MAks 169.14 und 169.13 zu den Vertiefungen zugegeben, um die inhibitorische
Wirksamkeit für
jeden der MAks, wie durch eine Abnahme des Levels des [3H]Thymidin-Einschlusses
bestimmt wird, zu überwachen
(7B). Die Ergebnisse zeigen, dass sogar bei 8 ng/ml
Antikörper
eine mehr als 90%ige Inhibition einer 10 ng/ml-Lösung PDGF-AA auftrat.
-
Beispiel 9 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Inhibition
von mitogener Pavianserum-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
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Es
wurden anti-PDGF-Rezeptor-MAks hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
die mitogene Aktivität
von Pavianserum auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren, analysiert.
BVSMCs wurden mit ungefähr
30000 Zellen pro Vertiefung in DMEM, das mit 10% fötalem Käl berserum
ergänzt
worden war, in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Drei
Tage vor der Verwendung wurden die Kulturmedien entfernt und 1 ml
Mito-Medien (Tabelle 1) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um
die Zellen zur Ruhe kommen zu lassen. Zum Zeitpunkt des Experimentes
wurden die Zellen mit verschiedenen Mengen Pavianserum stimuliert.
-
Es
wurde eine Standardkurve für
die Serumprobe erzeugt. Es wurden 20 × Vorratslösungen für jede der Serumkonzentrationen
hergestellt und 50 μl
der Serumverdünnung
oder des Verdünnungsträgers PBS wurde
zu den Kulturvertiefungen zugegeben, um endgültige Serumkonzentrationen,
die von 2,5% bis hinunter zu 0,15% reichten, auf den Zellen zu ergeben.
Die MAks 169.31 und 163.31 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mitogener
Pavianserum-Aktivität
zu inhibieren, analysiert. Eine endgültige Serumkonzentration von
2,5% wurde für
die Antikörperinhibitionsstudie
verwendet. Die MAks 169.31 und 163.31 wurden zu den Serum enthaltenden
Vertiefungen in einer endgültigen
Konzentration von 25 μg/ml
zugegeben. Für
Pools der zwei Antikörper
betrug die endgültige
Konzentration an Antikörper
auf den Zellen 25 μg/ml
gesamt oder 12,5 μg/ml
für jeden
der MAks. Die Zellen wurden mit den Serumproben für ungefähr 20 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Medien von den Zellen
aspiriert, dann mit 0,5 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, ersetzt,
und mit 74 kBq/ml (2 μCi/ml)
[3H]Thymidin ergänzt. Die Zellen wurden für ungefähr 3 Stunden bei
37°C inkubiert,
mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der [3H]Thymidin-Einschluss in einem BetaplateTM-Flüssigszintillationszähler (Wallac)
gezählt.
Die Ergebnisse, dargestellt in 8, zeigen,
dass die mitogene Pavianserum-Aktivität durch MAk 169.31 minimal
inhibiert, aber durch MAk 163.31 zu über 50% inhibiert wird. Der
Pool der zwei Antikörper
inhibierte mehr als 75% der mitogenen Serumaktivität.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Großteil
der mitogenen Aktivität
in Pavianserum gegenüber
glatten Pavianmuskelzellen durch die Verwendung von monoklonalen
anti-PDGF-Rezeptorantikörpern inhibiert
werden kann. Von den Erfindern durchgeführte Studien haben gezeigt,
dass die vorherrschende Form von PDGF in Pavian-Thrombozyten PDGF-BB ist. Aufgrund des
großen
Prozentsatzes an PDGF-beta-Rezeptoren
auf glatten Pavianmuskelzellen, stimmt es damit überein, dass der anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAk
die größte inhibitorische
Aktivität
gegenüber
Pavianserum aufweist.
-
Beispiel 10 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Der Effekt von zirkulierendem
MAk 169.31 auf mitogene Pavianserumaktivität
-
Es
wurde eine Studie durchgeführt,
um die zirkulierenden Spiegel von MAk 169.31 nach der Verabreichung
einer intravenösen
(i. v.) Bolusinjektion von 25 mg an einen Pavian zu beobachten.
Man verschaffte sich Serum in verschiedenen Intervallen nach der
Antikörperinjektion
und der Spiegel des zirkulierenden Antikörpers wurde durch ELISA bestimmt.
Es wurde Schaf-anti-Maus-IgG zu Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
in ELISA-Puffer A in einer Konzentration von 2 μg/ml zugegeben. Die Platten
wurden über
Nacht bei 4°C
inkubiert, mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit ELISA B-Puffer
inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten
wurden mit ELISA C-Puffer
gewaschen, dann mit 100 μl
pro Vertiefung Testprobe inkubiert. Pavianplasma oder -serum, das
monoklonalen Antikörper
169.31 enthielt, wurde 1 : 1000 mit ELISA B-Puffer verdünnt und zu den Testvertiefungen
zugegeben. Es wurden Standards, die aus gereinigtem MAk 169.31,
das in Kontrollpavianplasma oder -serum hineingegeben wurde, bestanden, ähnlich den
Testplasma/Serumproben 1 : 1000 verdünnt und dann zu den Testvertiefungen
zugegeben. Die Standards reichten von einer endgültigen Konzentration von 100
ng/ml bis 1,56 ng/ml in den Testvertiefungen. Die Plasma/Serumproben
wurden in den Vertiefungen für
1–2 Stunden
bei 37°C
inkubiert, die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen,
dann wurde Ziegen-anti-Maus-IgG,
konjugiert mit Meerrettichperoxidase, zugegeben. Die Vertiefungen
wurden für
1 Stunde bei 37°C
inkubiert, mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit Reaktionspuffer inkubiert.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H2SO4 beendet, und die Platten wurden in einem
ELISA-Plattenlesegerät
bei 490 nm gelesen. Die ELISA-Analyse der Pavianserumproben für zirkulierende
Spiegel von MAk 169.31 zeigten an, dass die in vivo-Halbwertszeit
dieses Maus-Antikörpers
bei ungefähr
15 Stunden lag.
-
Zusätzlich wurde
die relative mitogene Wirksamkeit der Serumproben, die man sich
nach 1 Stunde und 18 Stunden nach der Injektion verschaffte, bestimmt.
Zu diesen Zeitpunkten wurden die zirkulierenden Spiegel an Antikörper in
dem Pavian als bei 46 μg/ml
bzw. 21 μg/ml
liegend bestimmt. Die 1-Stunden- und 18-Stunden-Serumproben wurden
dann mit einer Kontrollserumprobe hinsichtlich ihrer relativen mitogenen Aktivität verglichen.
Verdünnungen
der Serumproben wurden zu den glatten Pavianmuskelzellen, die im
Grunde wie in der oben dargestellten Pavian-Serumstudie beschrieben
kultiviert worden waren, zugegeben. Die endgültigen Serumkonzentrationen
auf den glatten Muskelzellen reichten von 1,25% bis hinab zu 0,15%.
Die glatten Pavianmuskelzellen wurden auf den Level des [3H]Thymidin-Einschlusses hin überwacht,
als ein Mittel, um die mitogene Aktivität im Grunde wie oben beschrieben
zu bestimmen.
-
Die
Ergebnisse, dargestellt in 9, zeigen,
dass es eine signifikante Abnahme in der relativen mitogenen Wirksamkeit
für sowohl
die 1-Stunden- wie auch die 18-Stunden-Serumproben
im Vergleich zu der Kontrollprobe gab, wobei die 18-Stunden-Probe bei der mitogenen
Aktivität
in der Mitte zwischen den Kontroll- und 1-Stunden-Proben lag. Der Neutralisierungslevel
durch MAk 169.31, der in der 18-Stunden-Serumprobe vorlag, stimmt mit dem Neutralisierungslevel,
den man erhält,
wenn man diesen Antikörper
ex vivo zu Kontrollpavianserum zugibt, überein (8). So zeigen
diese Ergebnisse, dass für
mindestens 18 Stunden in Pavianblut zirkulierender MAk 169.31 im
Grunde seine gesamte biologische Aktivität hinsichtlich der Inhibition
mitogener Pavianserum-Aktivität
auf glatten Pavianmuskelzellen behält.
-
Beispiel 11 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
-
Inhibition von Zellauswuchs
aus aortalen Pavianexplantaten
-
Monoklonale
anti-PDGF-Rezeptorantikörper
wurden auf ihre Fähigkeit,
die Rate glatter Muskellzell-Migration aus Explantaten von aortalem
Paviangewebe zu verringern, getestet. Die innere Media der thorakalen Aorta
vom Pavian wurde in DMEM-Kulturmedium,
das 10 mMol Hepes enthielt, präpariert.
Das aortale Gewebe wurde in 1 mm im Quadrat große Abschnitte eingeteilt und
die Explantate wurden in Gewebekulturflaschen platziert. Nach einer
10-minütigen
Inkubation, um genügend
Zeit für
die Anheftung der Explantate an die Flaschen zu lassen, wurde Kulturmedium
DMEM plus 6 μg/ml
Insulin und 5 μg/ml
Transferrin zu den Explantaten zugegeben und die Proben wurden bei
37°C mit
5% CO2 inkubiert. Insgesamt wurden 15 Explantate
in jeder Kulturflasche vorbereitet. Zu verschiedenen Zeiten nach
der Etablierung der Explantate wurden sie unter einem Hochleistungsmikroskop
untersucht, um die Anzahl der Explantate, die sichtbaren Zellauswuchs
auf die Kulturschale aufwiesen, zu zählen. Explantate wurden als
positiv gezählt,
wenn mindestens eine Zelle aus dem Explantatgewebe hinaus auf die
Kulturschalenoberfläche
migrierte. Die Explantate wurden mindestens für sieben Tage verfolgt. In
Experiment #1 wurden die Explantate in den DMEM-Kulturmedien, die
mit Insulin und Transferrin ergänzt
worden war, und die die folgenden Testproben enthielten, kultiviert:
1) anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk (169.31) mit 50 μg/ml; 2) anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAk
(163.31) mit 50 μg/ml
oder 3) DMEM-Medien allein (Kontrolle). Bei Experiment #2 wurden
die Explantate in DMEM plus Insulin und Transferrin und entweder
1) einem Pool von anti-PDGF-alpha- und -beta-Rezeptor-MAks (169.31
und 163.31) mit jeweils 25 μg/ml,
oder 2) DMEM allein (Kontrolle) kultiviert.
-
Die
Ergebnisse, dargestellt als der mittlere Prozentsatz der Explantate,
die positiv für
Zellauswuchs +/– SEM
für jede
Testbedingung waren (Tabelle 5), zeigen, dass die monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörper, einzeln
wie auch in Pools, in der Lage sind, den Level des Auswuchses glatter
Muskelzellen aus den aortalen Pavianexplantaten zu verringern, wenn
er entweder nach vier oder sieben Tagen gemessen wird. Diese Ergebnisse
zeigen, dass diese Antikörper
in der Lage sind, Prozesse, die für die Zellmigration durch eine feste
Matrix erforderlich sind, wie es zum Beispiel für Zellen erforderlich sein
könnte,
durch bestehendes Gefäßgewebe
zu den Orten intimaler Hyperplasie zu migrieren, zu inhibieren.
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-
Beispiel 12 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Inhibition
der mitogenen PDGF-Aktivität
auf menschlichen dermalen Fibroblasten durch verzögerte Zugabe von
monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern
-
Menschliche
dermale Fibroblasten wurden mit ungefähr 20000 Zellen pro Vertiefung
in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie bis
zum Ruhezustand in DMEM, das 2% fötales Kälberserum enthielt, wachsen.
Die Zellen wurden entweder mit PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert.
Es wurden zunehmende Konzentrationen von jedem der PDGF-Liganden
zu den Zellen zugegeben, um Standardkurven der mitogenen Wirksamkeit
für die
drei PDGF-Isoformen zu erzeugen. Die endgültigen PDGF-Konzentrationen, die für die Standards
verwendet wurden, betrugen 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31, 0,15 und 0,0
ng/ml. 50 × Vorratslösungen von PDGF
wurden in 10 mMol Essigsäure,
die 0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, hergestellt. 25 μl jeder der Vorratslösungen wurden
zu dreifachen Testvertiefungen zugefügt. Um nach der inhibitorischen
Aktivität
durch die MAks 162.62 und 169.14 Ausschau zu halten, wurden die
Fibroblasten enthaltenden Vertiefungen mit 5 ng/ml PDGF, endgültige Konzentration, inkubiert.
In verschiedenen Zeitintervallen nach der Zugabe der PDGF-Proben
(1, 2, 4, 6 und 8 Stunden) wurde eine gepoolte Probe von MAk 162.62
und MAk 169.14, 25 μg/ml
endgültige
Konzentration für
jeden MAk, zu dreifachen Vertiefungen der Zellen, die mit 5 ng/ml
PDGF behandelt worden waren, zugegeben. Neun Stunden nach der Zugabe
der PDGF-Proben, wurden 50 μl [3H]Thymidin, 20 μCi/ml in DMEM, das 1 fötales Kälberserum
enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Proben wurden für weitere
13–15
Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin
geerntet und in einem BetaplateTM-Flüssigszintillationszähler (Wallac)
gezählt.
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Die
Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 6, werden als mittlere cpm von
eingeschlossenem [3H]Thymidin +/– Standardabweichung
für dreifache
Bestimmungen angegeben. Die Daten werden sowohl für die PDGF-Standardkurven
wie auch für
den Zeitverlauf der Antikörperzugabe
angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass es eine 75%ige Abnahme bei
der mitogenen Aktivität
für PDGF-AA
gab, wenn die anti-PDGF-Rezeptorantikörper so spät wie 8 Stunden nach der Zugabe
von PDGF-Ligand zu den Zellen zugegeben wurden. Sowohl für PDGF-AB
wie auch -BB rief die Zugabe der anti-PDGF-Rezeptorantikörper 8 Stunden nach der Zugabe
des PDGF-Liganden eine größer als
90%ige Abnahme bei der mitogenen PDGF-Aktivität hervor. Diese Studien zeigen,
dass die monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörper nach einem längeren Zeitraum
nach der Gegenwart von PDGF-Ligand zu den Zellen zugegeben werden
können
und dennoch wirksame neutralisierende Effekte gegenüber mitogener
PDGF-Aktivität
aufweisen.
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Beispiel 13 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
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Verdrängung von Rezeptor-gebundenem 125I-PDGF von menschlichen Osteosarkomzellen
durch anti-PDGF-Rezeptor-MAks
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Die
vier MAks 162.62, 163.31, 169.14 und 169.31 wurden hinsichtlich
ihrer Fähigkeit, 125I-PDGF-AA und 125I-PDGF-BB,
das an PDGF-Rezeptoren auf Monolayern von menschlichen Osteosarkomzellen
(ATCC CRL 1427), die ungefähr
gleiche Mengen an PDGFr-alpha und PDGFr-beta exprimieren, gebunden
war, zu verdrängen,
untersucht. Monolayer menschlicher Osteosarkomzellen, die auf Kulturplatten
mit 24 Vertiefungen gewachsen waren, wurden für 1 Stunde bei 4°C mit 125I-PDGF-AA oder 125I-PDGF-BB,
verdünnt
in Bindungsmedium, inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen,
dann wurde 1 ml von entweder Bindungsmedium allein, MAk 169.14,
169.31, 162.62, 163.31 oder ein Pool aus 169.31 und 162.62 zu jeder
Vertiefung zugegeben. Die Antikörper
wurden in Bindungsmedien verdünnt
und zu den Zellen in einer Konzentration von 5 μg/ml, 1 ml/Vertiefung, zugegeben.
Die Zellen wurden für
1 Stunde bei 4°C
gewaschen, dann mit PBS, mit Extraktionspuffer inkubiert, dann geerntet
und in einem Gammazähler
gezählt,
um den Level der 125I-PDGF-Bindung zu überwachen.
100 ng/ml PDGF-BB wurde zu dreifachen Vertiefungen mit 125I-PDGF-AA
und 125I-PDGF-BB zugegeben, um die Level
der unspezifischen Bindung zu bestimmen. Die Ergebnisse, dargestellt
in Tabelle 7, werden als spezifische gebundene cpm (Standardabweichung)
für 125I-PDGF-AA
und 125I-PDGF-BB nach der zweiten Inkubation
mit den aufgeführten
Testverbindungen gezeigt. Der %-Verdrängungswert wurde durch Vergleich
der gebundenen cpm für
die Testproben im Vergleich zu den gebundenen cpm in den Vertiefungen mit
dem Bindungsmedium allein bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass
die anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAks, 169.14
und 169.31 in der Lage waren, ungefähr 63% des zuvor gebundenen 125I-PDGF-AA zu verdrängen. Im Gegensatz dazu wiesen
die anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAks
162.62 und 163.31 im Grunde keinen Effekt auf, sie verdrängten weniger
als 10% der Zählungen.
Bei der 125I-PDGF-BB-Bindung waren die MAks
169.14 und 169.31 in der Lage, zwischen 22–25% der zuvor gebundenen Zählungen
zu verdrängen,
während
MAk 162.62 in der Lage war, 34% der Zählungen zu verdrängen. Der
Pool aus 169.31 und 162.62 verdrängte
44% des zuvor gebundenen 125I-PDGF-BB. Diese
Ergebnisse zeigen, dass zusätzlich
zu der Fähigkeit,
PDGF-Bindung zu blockieren, die anti-PDGF-Rezeptor-MAks auch in
der Lage sind, vorgebundenes PDGF-AA und -BB von Zelloberflächenrezeptoren
zu verdrängen.
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Beispiel 14
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Inhibition von Pavianserum
und PDGF-BB-stimulierter glatter Muskelzellmitogenese durch anti-PDGFr-MAks, die
unabhängig
oder koordiniert mit Heparin angewendet werden
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Anti-PDGFr-alpha-MAk
169.31 und anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 wurden unabhängig und
in koordinierten Verabreichungs-Assays mit Heparin analysiert, um
die Fähigkeit
der Antikörper,
PDGF-BB und mitogene Pavianserumaktivität auf BVSMCs zu inhibieren,
zu bestimmen.
-
Um
die Aktivität
der beiden Antikörper
allein zu bestimmen und um die kombinierten inhibitorischen Aktivitäten der
koordiniert mit Heparin verabreichten Antikörper zu bestimmen, wurden glatte
venöse
Pavianmuskelzellen bei Passage 7 nach dem Herauswachsen, in Gewebskulturschalen
mit 24 Vertiefungen mit 3,0 × 104 Zellen pro Vertiefung in DMEM (GIBCO BRL),
ergänzt
mit 10% fötalem
Rinderserum, plattiert. Die Zellen wurden in diesem Medium für 3 Tage
bei 37°C
unter einer 5%igen CO2-Athmosphäre erhalten. Das Medium wurde
dann durch 1 ml/Vertiefung Mito-Medien ersetzt und die Zellen wurden
für zusätzliche
24 Stunden kultiviert.
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Bei
einem ersten Satz an Experimenten wurde PDGF-BB mit 10 mMol Essigsäure, die
0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, auf eine Konzentration von
40 ng/ml verdünnt.
50 μl dieser
Vorratsverdünnung wurde
dann zu jeder Vertiefung zugegeben, um eine endgültige Konzentration von 2 ng/ml
auf den Zellen zu ergeben. Zu bestimmten Testvertiefungen wurde
unfraktioniertes Heparin (UH) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
allein zugegeben oder koordiniert mit einem oder mehreren der anti-PDGFr-Antikörper verabreicht. Das
für diese
Studien verwendete UH war eine Mischung aus Heparinarten vielfacher
Größen mit
einer spezifischen Aktivität
von annähernd
150 Einheiten/mg in einem standardisierten Aktivierte Partielle
Thromboplastin-Zeit (APTT)-Assay. Die Zugabe von Heparin zu den
Zellen wurde durch Verdünnung
des Heparins auf eine Vorratskonzentration von 400 μg/ml in PBS
und Zugabe von 25 μl
der Heparinlösung
zu den geeigneten Vertiefungen, um eine endgültige Heparinkonzentration
von 10 μg/ml
auf den Zellen zu ergeben, durchgeführt. Die anti-PDGFr-Antikörper wurden
mit PBS verdünnt,
um 40 × Vorratskonzentrate
zu ergeben, dann wurden 25 μl der
Antikörperverdünnung zu
den geeigneten Testvertiefungen zugegeben. Diejenigen Vertiefungen,
die nur Antikörper
oder Heparin erhielten, erhielten unabhängig voneinander 25 μl PBS als
eine Pufferkontrolle.
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Es
wurde ein Dosis-Antwort-Profil für
die PDGF-BB-Stimulierung durch Herstellung zweifacher Verdünnungen
des PDGF mit 10 mMol Essigsäure,
die Kaninchenserumalbumin enthielt, und Zugabe von 50 μl der Vorratslösungen zu
den entsprechenden Vertiefungen erzeugt, um endgültige PDGF-BB-Konzentrationen auf
den Zellen von 2, 1 und 0,5 ng/ml zu ergeben.
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Nach
Zugabe der Behandlungen, wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die mitogene Stimulierung von BVSMCs wurde durch Messung der Aufnahme
von [3H]Thymidin bestimmt. 50 μl einer 740 KBq/ml
(20 μCi/ml)
[3H]Thymidin-Vorratslösung, hergestellt in DMEM,
wurde direkt zu den Zellen für
eine endgültige
Konzentration von 37 KBq/Vertiefung (1 μCi/Vertiefung) zugegeben. Diese
Zellen wurden für
4 Stunden bei 37°C
inkubiert, einmal mit PBS gewaschen, mit 0,25 ml Trypsin behandelt,
bis sich Zellen abtrennten und auf einen Filter unter Verwendung
eines Zellernters (LKB Wallac) geerntet. Die Filter wurden unter
Verwendung eines BetaplateTM-Flüssigszintillationszählers (Wallac)
gezählt.
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Die
Daten der Antikörper
und Antikörper/Heparin-Inhibition
der PDGF-BB-Stimulierung werden in Tabelle 8 gezeigt. Die Daten
in Tabelle 8 werden als mittlere Zählungen pro Minute (counts
per minute, cpm) von mit PDGF-BB-stimulierten glatten Pavianmuskelzellen
eingeschlossenem [3H]Thymidin dargestellt.
Die Werte prozentualer Inhibition wurden direkt aus der gemessenen
Abnahme des Einschlusses von [3H]Thymidin
bestimmt. In Tabelle 8 ist eine Dosis-Antwort-Tabelle der mitogenen
PDGF-BB-Aktivität
eingeschlossen. Bei Experiment #1 rief die Zugabe von Antikörper 169.31
zu Zellen, die mit PDGF-BB stimuliert worden waren, eine deutliche
Inhibition des [3H]Thymidin-Einschlusses bei
Antikörperdosierungen
von 1 und 0,1 μg/ml
hervor. Die Verabreichung von Heparin an die Zellen koordiniert
mit Antikörper
169.31 resultierte in einem kombiniert effektivem antimitogenem
Ergebnis, sprich der [3H]Thymidin-Einschluss
wurde in einem größeren Ausmaß inhibiert,
als entweder für
den Antikörper
oder Heparin bei alleiniger Verabreichung gemessen wurde. Die Analyse von
Antikörper
163.31, Experiment #1, zeigte, dass eine Dosis von 25 μg/ml auch
in der Lage war, den [3H]Thymidin-Einschluss zu inhibieren,
aber in einem viel geringerem Maße, als für Antikörper 169.31 beobachtet wurde.
Wenn Heparin zusammen mit Antikörper
163.31 zugegeben wurde, wurde auch eine kombiniert effektive Inhibition
beobachtet, aber dieser Effekt wurde nur bei höheren Antikörperkonzentrationen gesehen.
Die koordinierte Anwendung von den Antikörpern 169.31 (1 μg/ml) und
163.31 (25 μg/ml)
resultierte auch in einem kombiniert antimitotischen Ergebnis, wobei
die Inhibition des PDGF-BB-stimulierten [3H]Thymidin-Einschlusses durch
die BVSMCs größer war
als diejenige, die man nach der Verabreichung von jedem Antikörper allein beobachtete.
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Bei
Experiment #2 wurden die Antikörper
169.31 und 163.31 weiter analysiert, beide unabhängig voneinander und in koordinierten
Verabreichungs-Assays miteinander oder mit Heparin (UH, 10 μg/ml), um
die antimitotischen Aktivitäten
dieser verschiedenen Behandlungen auf PDGF-BB-stimulierten [3H]Thymidin-Einschluss durch BVSMCs zu bestimmen. Ähnlich zu
den Ergebnissen aus Experiment #1 stellte die koordinierte Verabreichung
der beiden Antikörper
eine effektivere Inhibition der mitogenen Aktivität auf BVSMCs
bereit, als die Verabreichung von jedem der Antikörper allein.
Zusätzlich
führte
die koordinierte Verabreichung von Heparin mit einem Pool der zwei
Antikörper
zu einer kombiniert effektiven Inhibition über die inhibitorischen Aktivität hinaus,
die durch das Heparin oder den Antikörper-Pool allein bereitgestellt
wurde.
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Insgesamt
zeigen diese Daten, dass die koordinierte Verabreichung von Heparin
mit jedem der anti-PDGFr-alpha- oder anti-PDGFr-beta-Antikörper oder
mit einem Pool aus diesen zwei Antikörpern wie auch die koordinierte
Verabreichung der Antikörper
miteinander eine kombiniert effektive Behandlung gegen mitogene
PDGF-BB-Aktivität
auf BVSMCs bereitstellen kann.
-
-
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Die
Inhibition der mitogenen Aktivität
von Pavianserum wurde in einem parallelen Satz an Experimenten getestet.
Die Experimente wurden im Grunde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei
Pavianserum zu den Testvertiefungen in einer endgültigen Konzentration
von 1,25% durch Verdünnung
des Serums 1 : 4 mit PBS und Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums zu jeder Vertiefung
zugegeben wurde. Es wurde ein Dosis-Antwort-Profil für die Pavianserum-Stimulierung
durch Herstellung zweifacher Verdünnungen des Pavianserums in
PBS und Zugabe von 50 μl
der geeigneten Verdünnungen,
um endgültige
Serumkonzentrationen auf den Zellen von 1,25, 0,62, 0,31 und 0,15%
zu ergeben, erzeugt.
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Die
Daten für
die Antikörper
und Antikörper/Heparin-Inhibition
der mitogenen Serumaktivität
auf BVSMCs werden in Tabelle 9 dargestellt. Diese Daten zeigen,
dass der monoklonale Antikörper
169.31 einen minimalen inhibitorischen Effekt auf den [3H]Thymidin-Einschluss,
stimuliert durch die Zugabe von 1,25% Pavianserum, bei Dosierungen
des Antikörpers
bis zu 1 μg/ml
aufwies. Wenn Heparin koordiniert zusammen mit dem Antikörper 169.31
den Zellen verabreicht wurde, war der beobachtete Level der Inhibition
nicht größer als die
inhibitorische Aktivität,
die von Heparin alleine gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu zeigten
die Assays, die monoklonalen Antikörper 163.31 beinhalteten, eine
signifikante Inhibition des [3H]Thymidin-Einschlusses
bei einer Antikörperkonzentration
von 25 μg/ml.
Darüber
hinaus, wenn Heparin koordiniert mit Antikörper 163.31 verabreicht wurde,
gab es eine deutliche kombiniert effektive Inhibition der mitogenen
Aktivität,
wie durch [3H]Thymidin-Einschluss gemessen
wurde, sprich deutlich oberhalb der antimitogenen Effekte, die man
entweder für
den Antikörper
oder Heparin allein beobachtete. Diese kombiniert effektive Inhibition
war bei MAk 163.31-Konzentrationen
zwischen 0,2 μg/ml
und 5 μg/ml
besonders ausgeprägt.
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Die
koordinierte Verabreichung von 1 μg/ml
Antikörper
169.31 mit zunehmenden Dosierungen von Antikörper 163.31 zeigte eine dosisabhängige Inhibition
des [3H]Thymidin-Einschlusses. Die koordinierte Verabreichung
von Antikörper
169.31 mit Antikörper
163.31 resultierte auch in einer ausgeprägten kombiniert effektiven
Inhibition der mitogenen Serumaktivität, wie in Tabelle 9 gezeigt
wird.
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Die
Daten in Tabelle 9 werden als mittlere Zählungen pro Minute (cpm) des
durch glatte Pavianmuskelzellen, die mit 1,25%igem Pavianserum stimuliert
wurden, eingeschlossenen [3H]Thymidins dargestellt.
Die Werte der prozentualen Inhibition wurden aus einer Standardkurve,
die unter Verwendung der dargestellten Serum-Dosis-Antwort-Daten erzeugt wurde,
berechnet.
-
-
Beispiel 15
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Inhibition der mitogenen
Serumaktivität
auf glatten Paviangefäßmuskelzellen
durch allein verabreichtes Heparin oder koordiniert mit anti-PDGFr-MAks
verabreichtes Heparin
-
Sowohl
unfraktioniertes Heparin (UH) (Sigma, St. Louis, MO) wie auch niedermolekulares
Heparin (NMH) (Logiparin®, Novo Nordisk, Bagsvaerd,
Dänemark)
wurden auf ihre Fähigkeit,
die mitogene Aktivität
von Pavianserum auf glatten Paviangefäßmuskelzellen zu inhibieren,
untersucht. Jede Form des Heparins wurde den Zellen unabhängig von
oder koordiniert mit anti-PDGFr-MAks verabreicht. Das für diese
Studien verwendete NMH wurde durch Heparinasebehandlung eines unfraktionierten
Heparins erzeugt und besteht aus Heparinarten mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 5 500 Dalton. Das NMH hat eine verringerte
antithrombotische Aktivität,
geschätzt
auf ungefähr
50 Einheiten/mg, im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin in einem
APTT-Assay.
-
Um
die antimitogene Aktivität
der zwei Heparinpräparate,
mit und ohne koordiniert verabreichte anti-PDGFr-Antikörper, zu
bestimmen, wurden BVSMCs aus aortalen Ex plantaten (bezeichnet als
BO54-Zellen) auf Gewebekulturschalen mit 24 Vertiefungen mit 2,5 × 104 Zellen pro Vertiefung in DMEM (GIBCO BRL),
das mit 10% fötalem
Rinderserum ergänzt
wurde, plattiert. Die Zellen wurden in diesem Medium für 3 Tage
bei 37°C
unter einer 5%igen CO2-Atmosphäre erhalten.
Die Medien wurden dann durch 1 ml/Vertiefung Mito-Medien ersetzt
und die Zellen wurden in diesen Medien für zusätzliche 24 Stunden kultiviert.
-
Es
wurde Pavianserum zu den Testvertiefungen in einer endgültigen Konzentration
von 2,5% zugegeben. Dies erreichte man durch Verdünnung des
Serums 1 : 1 mit PBS und Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums zu jeder Vertiefung.
Um die Heparinpräparate
auf ihre Inhibition der Pavianserum-stimulierten DNA-Synthese in
glatten Pavianmuskelzellen zu untersuchen, wurde Heparin zu den
Zellen entweder unabhängig
oder koordiniert mit den zwei monoklonalen anti-PDGFr-Antikörpern zugegeben.
Die Heparinproben wurden mit PBS verdünnt, um ein 400 μg/ml-Konzentrat
zu ergeben, dann wurden 25 μl
des Konzentrats zu jeder Testvertiefung zugegeben, um eine endgültige Heparinkonzentration
von 10 μg/ml
zu ergeben. Kontrollvertiefungen erhielten nur Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung.
Anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 und anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 wurden mit PBS auf 40 μg/ml bzw.
1 mg/ml verdünnt,
und 25 μl
der verdünnten
Antikörper
wurden zu den entsprechenden Testvertiefungen zugegeben, um endgültige Antikörperkonzentrationen
von 1 μg/ml
für MAk
169.31 und 25 μg/ml
für MAk
163.31 zu ergeben.
-
Nach
der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die mitogene Stimulierung der glatten Muskelzellen wurde durch Messung
des zellulären
Einschlusses von [3H]Thymidin beurteilt,
wie in Beispiel 14 offenbart wird.
-
Die
Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 10 dargestellt. Diejenigen
Zellen, die nur mit Serum in der Abwesenheit von entweder Heparin
oder anti-PDGFr-MAks behandelt wurden, hatten einen Kontrollwert für den [3H]Thymidin-Einschluss von 36032 cpm/Vertiefung.
Die Behandlung der Zellen mit koordiniert verabreichten monoklonalen
anti-PDGFr-alpha- und anti-PDGFr-beta-Antikörpern rief eine Abnahme des
[3H]Thymidin-Einschlusses auf 27000 cpm
hervor (sprich eine 25%ige Inhibition der serumstimulierten DNA-Synthese). Es
gab keine signifikante Reduktion des [3H]Thymidin-Einschlusses,
wenn die Zellen entweder mit UH oder NMH allein behandelt wurden.
Es wurde jedoch eine signifikante Abnahme des [3H]Thymidin-Einschlusses beobachtet,
wenn entweder das UH oder das NMH koordiniert mit dem Pool der anti-PDGFr-Antikörper zu
den Zellen zugegeben wurde. Die Daten zeigen, dass sowohl UH wie
auch NMH, wenn sie koordiniert mit einem Pool von anti-PDGFr-alpha- und anti-PDGFr-beta-Antikörpern verabreicht
werden, die mitogene Aktivität
von autologem Serum auf BVSMCs auf eine kombiniert effektive Weise
inhibieren. Hier zeigt der Grad der kombiniert effektiven Inhibition,
der erreicht wurde, wieder einen synergistischen oder potenzierenden
Zusammenhang zwischen dem Antikörper
und Heparin bei dem besonderen Regime der koordinierten Verabreichung, das
getestet wurde.
-
-
Beispiel 16
-
Dosis-Antwort der Inhibition
der mitogenen Serumaktivität
auf glatten Paviangefäßmuskelzellen
durch anti-PDGFr-MAks, die koordiniert mit unfraktioniertem Heparin
oder niedermolekularem Heparin angewendet werden
-
Es
wurde ein Dosis-Antwort-Assay des monoklonalen anti-PDGFr-beta-Antikörpers 163.31
in der Gegenwart einer konstanten Menge an anti-PDGFr-alpha-Antikörper 169.31
(1 μg/ml)
durchgeführt,
um die Konzentrationsabhängigkeit
der anti-PDGFr-MAk-Inhibition
der DNA-Synthese in BVSMCs, die durch Pavianserum stimuliert wurden,
zu beurteilen. Diese Dosis-Antwort wurde in der Abwesenheit von
irgendwelchem zugegebenem Heparin wie auch in der Anwesenheit von
10 μg/ml
von entweder einem unfraktionierten Heparin (UH) mit einer antithrombotischen
Aktivität
von ungefähr
150 Einheiten/mg im APPT-Assay (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
oder einem nieder molekularen Heparin (NMH) (Logiparin®, ungefähr 50 Einheiten/mg
im APPT-Assay) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark), beurteilt.
-
Für diese
Dosis-Antwortstudien, wurden BVSMCs aus aortalen Explantaten (BO54-Zellen) auf Gewebskulturschalen
mit 24 Vertiefungen mit 2,5 × 104 Zellen pro Vertiefung in DMEM, das mit
10% fötalem
Rinderserum ergänzt
worden war, plattiert. Nach 3 Tagen wurden die Medien durch Mito-Medien
ersetzt und die Zellen wurden für
zusätzliche
24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 50 μl/Vertiefung Pavianserum,
das 1 : 1 mit PBS verdünnt
worden war, was eine endgültige
Serumkonzentration von 2,5% auf den Zellen ergab, stimuliert, um
Mitose durchzumachen. MAk 163.31 wurde mit PBS verdünnt, um
40 × Konzentrate
herzustellen, und 25 μl
des verdünnten
Antikörpers
wurden zu den Testvertiefungen zugegeben, um endgültige Antikörperkonzentrationen
auf den Zellen, die von 25 μg/ml
bis 1,25 μg/ml
reichten, zu ergeben. 25 μl
einer 40 μg/ml-Lösung von
MAk 169.31 wurde gleichzeitig zu den Vertiefungen zugegeben, um
eine endgültige
Antikörperkonzentration
von 1 μg/ml
in allen der mit 163.31 behandelten Vertiefungen zu ergeben. Die Kombination
der monoklonalen Antikörper
163.31 und 169.31 wurde in der Abwesenheit von irgendwelchem zugegebenen
Heparin und alternativ in einem koordinierten Verabreichungs-Assay
mit entweder UH oder NMH getestet. Die beiden Heparinpräparate wurden
mit PBS auf eine endgültige
Konzentration von 400 μg/ml verdünnt, und
25 μl des
Konzentrates wurde zu den entsprechenden Vertiefungen zugegeben,
um eine endgültige
Heparinkonzentration auf den Zellen von 10 μg/ml zu ergeben. Zu denjenigen
Testvertiefungen, die nicht Heparin erhielten, wurde PBS allein
zugegeben.
-
Nach
der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die mitogene Aktivität
wurde durch Messung der Aufnahme von [3H]Thymidin
beurteilt, wie in Beispiel 14 offenbart wird.
-
Die
Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 11 dargestellt. In der
Abwesenheit von Heparin wurde eine signifikante Abnahme der mitotischen
Aktivität
der BVSMCs nur bei denjenigen Vertiefungen beobachtet, die die 25
und 10 μg/ml
Dosen des monoklonalen Antikörpers
163.31 erhalten hatten. In der Gegenwart von entweder UH oder NMH
stellten jedoch alle getesteten Konzentrationen des monoklonalen
Antikörpers
163.31 (in der Gegenwart einer konstanten Menge MAk 169.31) eine
signifikante kombiniert effektive Inhibition mit im wesentlichen
identischen Ergebnissen, wie man sie für die zwei Heparinpräparate erhielt,
bereit. In der Gegenwart von Heparin war die 1,25 μg/ml Dosis
von 163.31 bei der Inhibition der DNA-Synthese effektiver als die 25 μg/ml Dosierung
von 163.31 in der Abwesenheit von Heparin. Die Gegenwart von entweder
UH o der NMH, die unabhängig
von irgendeinem Antikörper
verabreicht wurden, wies nur einen minimalen Effekt auf die mitogene
Aktivität
des Serums auf.
-
-
Beispiel 17
-
Vergleich der antimitogenen
Aktivitäten
von anti-PDGFr-alpha- Maus-MAk 169.31 mit Maus/Mensch-chimärem anti-PDGFr-alpha-Antikörper
-
Ein
Maus/Mensch-chimärer
Antikörper
wurde unter Verwendung des monoklonalen anti-PDGFr-alpha-Antikörpers 169.31
als dem Elternantikörper
für das
Ausklonieren der variablen leichte und schwere Ketten-Domänen erzeugt.
Dieser Maus/Mensch-chimärer
Antikörper
umfasst die variablen Domänen
des monoklonalen Maus-Eltern-Antikörpers und die konstanten Domänen für die menschliche
schwere IgG4-Kette und menschliche leichte Kappa-Kette. Beim Aufbau
dieses Antikörpers
verwendete man Standardtechni ken wie in Mountain und Adair beschrieben
(Biotech. and Genet. Eng. Rev. 10: 1–142, 1992; und Adair et al,
Immunol. Rev. 130: 5–40,
1992). Der Maus-Eltern-Antikörper
und der Maus/Mensch-chimäre
Antikörper
wurden direkt hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die DNA-Synthese von
BVSMCs (BO54), die mit 2% Pavianserum stimuliert wurden, zu inhibieren,
verglichen.
-
Die
Eltern-Maus- und die chimären
anti-PDGFr-alpha-Antikörper
wurden beide mit 1,0 und 0,1 μg/ml in
der Gegenwart von 10 μg/ml
anti-PDGFr-beta-Maus-Antikörper
163.31 und 10 μg/ml
unfraktionierten Heparins (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N. J.;
spezifische Aktivität ≅ 150 Einheiten/mg)
analysiert. Zusätzliche
wurden beide anti-PDGFr-alpha-Antikörper (1 μg/ml) zu
den Zellen in der Gegenwart von 10 μg/ml des chimären anti-PDGFr-beta-Antikörpers (siehe
Beispiel 18) und 10 μg/ml
Heparin zugegeben. Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 12, zeigen,
dass sowohl der Eltern-Maus-MAk 169.31 wie auch der Maus/Mensch-chimäre anti-PDGFr-alpha-Antikörper eine ähnliche
inhibitorische Wirksamkeit in der Gegenwart von entweder dem anti-PDGFr-beta-Eltern-Maus-MAk 163.31 oder
dem Maus/Mensch-chimärem
anti-PDGFr-beta-Antikörper
besitzt.
-
Tabelle
12
Antimitogene Aktivitäten
von Eltern-Maus- und Maus/Mensch-chimären anti-PDGFr-alpha-Antikörpern, die
koordiniert mit Heparin verabreicht werden
-
Beispiel 18
-
Vergleich der antimitogenen
Aktivitäten
von anti-PDGFr-beta-Maus-MAk 163.31 mit Maus/Mensch-chimärem anti-PDGFr-beta-Antikörper
-
Ein
Maus/Mensch-chimärer
anti-PDGFr-beta-Antikörper
wurde unter Verwendung des monoklonalen anti-PDGFr-beta-Maus-Antikörpers 163.31
als dem Eltern-Antikörper
für das
Ausklonieren der variablen leichten und schweren Kettendomänen erzeugt.
Dieser Maus/Mensch-chimäre
Antikörper
umfasst die variablen Domänen
des monoklonalen Eltern-Maus-Antikörpers und die konstanten Domänen für die menschliche schwere
IgG4-Kette und die menschliche leichte Kappa-Kette. Beim Aufbau
dieses Antikörpers
verwendete man die gleichen Standardtechniken für den chimären Antikörperaufbau wie oben für den chimären anti-PDGFr-alpha-Antikörper beschrieben
(Beispiel 17). Der Eltern-Maus-Antikörper und der Maus/Mensch-chimäre Antikörper wurden
direkt hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
die DNA-Synthese in mit 2% Pavianserum stimulierten, glatten Pavianmuskelzellen
zu inhibieren, verglichen.
-
BVSMCs
(BO54) wurden in einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Vertiefung
auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden
in DMEM, das 10% fötales
Kälberserum
enthielt, bei 37°C
wachsen. Die Zellen wurden dann für 24 Stunden in Mito-Medien
inkubiert, um sie zum Ruhezustand kommen zu lassen.
-
Eine
Kontrollplatte von Zellen wurde mit einer zweifachen Verdünnungsserie
von normalem Pavianserum (2% bis 0,125%) stimuliert, um eine Standardkurve
herzustellen. Das Serum wurde in PBS verdünnt, und 50 μl eines 20×-Vorrats
wurde direkt zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung zugegeben.
-
Es
wurde eine Verdünnungsserie
des anti-PDGFr-beta-MAks 163.31 oder des chimären anti-PDGFr-beta-Antikörpers koordiniert
den entsprechenden Testvertiefungen mit dem anti-PDGFr-alpha-MAk
169.31 (1 μg/ml)
und unfraktioniertem Heparin (2 Einheiten/ml) (Elkins-Sinn, Inc.,
Cherry Hill, N. J.) verabreicht, um die inhibitorischen Effekte
dieser Behandlungen auf BVSMCs, die mit 2% Pavianserum stimuliert
wurden, zu beurteilen. Zusätzlich
wurden die anti-PDGFr-beta-Eltern- und himären Antikörper in unabhängigen Verabreichungs-Assays
und in koordinierten Verabreichungs-Assays unter Verwendung des
Antikörpers
und Heparins analysiert. Die Antikörper und Heparin wurden zu
den entsprechenden Testvertiefungen mit 25 μl/Vertiefung eines 40×-Vorrats,
verdünnt
in PBS, zugegeben. Die Antikörperkonzentrationen,
die verwendet wurden, werden in Tabelle 13 angezeigt.
-
Nach
der Verabreichung der Testproben wurden die Zellen für 18 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Die mitogene Aktivität
wurde durch die Aufnahme von [3H]Thymidin
beurteilt.
-
Die
Ergebnisse des anti-PDGFr-beta-MAk-Dosis-Antwort-Experimentes, dargestellt
in Tabelle 13, zeigen, dass die Pavianserum-induzierte mitogene
Aktivität
zu ungefähr
80% durch eine Kombination von 25 μg/ml 163.31, 1 μg/ml 169.31
und 2 Einheiten/ml Heparin inhibiert wurde. Ähnliche Ergebnisse erhielt
man unter Verwendung des chimären
anti-PDGFr-beta-MAks. Die koordinierte Verabreichung von jedem der
Maus- und chimären
anti-PDGFr-beta-MAks mit 25 μg/ml
mit dem anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31, resultierte in einer annähernd 30%igen
Inhibition der mitogenen Aktivität
von Pavianserum. Die anti-PDGFr-beta-MAks, die koordiniert mit Heparin
verabreicht wurden, wiesen eine ungefähr 40%ige Inhibition auf. Jeder
der antimitogenen Wirkstoffe resultierte, wenn er unabhängig verabreicht
wurde, in einer geringeren als 30%igen Inhibition der mitogenen
Aktivität
von Pavianserum.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass der Maus/Mensch-chimäre anti-PDGFr-beta-Antikörper eine ähnlich inhibitorische
Aktivität
besitzt wie diejenige des anti-PDGFr-beta-Eltern-Maus-Antikörpers MAk 163.31. Diese Aktivität stellt
eine kombiniert effektive Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf BVSMCs
bereit, wenn der chimäre
anti-PDGFr-beta-Antikörper koordiniert
mit entweder dem anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31, Heparin oder einer
Kombination von anti-PDGFr-alpha-MAk und Heparin verabreicht wird.
-
-
-
Beispiel 19
-
Dosis-abhängige Inhibition
der mitogenen Serumaktivität
auf glatten Paviangefäßmuskelzellen
durch Heparin, das entweder unabhängig oder koordiniert mit anti-PDGFr-Antikörpern verabreicht
wird
-
Glatte
Pavianmuskelzellen (BO54) wurden in einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit
24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 72 Stunden in DMEM, das
10% fötales
Kälberserum
enthielt, bei 37°C
wachsen. Die Zellen wurden dann in den Ruhezustand überführt, indem
man sie für 24
Stunden in Mito-Medien inkubierte. Es wurde die Fähigkeit
von Heparin allein, die mitogene Stimulation durch 2%iges Pavianserum
zu inhibieren, durch Zugabe einer Verdünnungsserie von entweder einem
unfraktionierten Heparin (UH; ungefähr 150 Einheiten/mg) (Elkins-Sinn,
Inc.) oder niedermolekularem Heparin (NMH; Logiparin®, ungefähr 50 Einheiten/mg)
(Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark)
zu den Zellen in Dosierungen, die von 15 Einheiten/ml bis 0,06 Einheiten/ml
(endgültige
Konzentration auf den Zellen) reichten, getestet. Die gleiche Verdünnungsserie
für die
beiden Heparintypen wurde auch in der Gegenwart von anti-PDGFr-beta-MAk
163.31 (10 μg/ml)
und anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 (1 μg/ml) getestet.
-
Nach
der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 18 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die mitogene Serumaktivität
wurde durch Messung der Aufnahme von [3H]Thymidin
beurteilt. Die Ergebnisse der Heparin-Dosis-Antwort-Experimente
werden in Tabelle 14 dargestellt. Heparin alleine besaß bei den
höchsten
getesteten Dosierungen nur einen bescheidenen inhibitorischen Effekt
auf den [3H]Thymidin-Einschluss durch BVSMCs,
während
die gleichen Dosierungen, koordiniert verabreicht mit den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, in
Kombination bis zu 90% der mitogenen Serumaktivität inhibierten.
Unter Annahme einer spezifischen Aktivität von 150 Einheiten/mg für das Elkins-Sinn
unfraktionierte Heparin und 50 Einheiten/mg für das niedermolekulare Heparin,
lagen die höchsten
verwendeten Dosierungen für
die zwei Heparinpräparate
bei ungefähr 100
bzw. 300 μg/ml.
Bei diesen Konzentrationen gab es in den unabhängigen Verabreichungs-Assays
nur eine minimale Inhibition der mitogenen Aktivität. Im Gegensatz
dazu gab es bei 100-fach niedrigeren Heparindosierungen eine signifikante
kombiniert effektive Zunahme der inhibitorischen Aktivität, wenn
das Heparin koordiniert mit den anti-PDGFr-Antikörpern verabreicht wurde. Diese
Ergebnisse zeigen, dass signifikant niedrigere Dosierungen von Heparin
verwendet werden können,
um auf eine kombiniert effektive Weise mit den anti-PDGFr-Antikörpern zu
wirken, um den [3H]Thymidin-Einschluss zu inhibieren
und das weit über
den Inhibitionsleveln, die man mit den Antikörpern oder Heparin alleine
erreicht.
-
-
Beispiel 20
-
Inhibition
der glatten Muskelzell-Migration aus aortalen Pavianexplantaten
durch koordinierte Verabreichung von anti-PDGFr-MAks und Heparin
-
Monoklonale
anti-PDGFr-Antikörper
wurden weiter in der Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin auf
ihre Fähigkeit,
die Raten der glatten Paviangefäßmuskelzellen-Migration aus Explantaten
von aortalem Paviangewebe zu verringern, getestet. Die aortalen
Pavianexplantate wurden im Grunde wie in Beispiel 11 beschrieben
vorbereitet. Die Explantate wurden in DMEM kultiviert, das mit Insulin
und Transferrin ergänzt
worden war und die folgenden Testproben enthielt: 1) anti-PDGFr-alpha-MAk
(169.31) und anti-PDGFr-beta-MAk (163.31), jeder Antikörper mit
25 μg/ml,
2) unfraktioniertes Heparin (Sigma Chemical Co.) (100 μg/ml), 3)
anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk (169.31) und anti-PDGF-Rezeptor-MAk
(163.31) (jeweils 25 μg/ml)
und unfraktioniertes Heparin (100 μg/ml), und 4) DMEM (Kontrolle).
-
Die
Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 15, zeigen, dass, wenn er 7 Tage
nach der Etablierung der Explantate gemessen wurde, Heparin alleine
den Level der glatten Muskelzell-Ausmigration auf 82% der Kontrolle
verringerte, während
die anti-PDGF-Rezeptorantikörper-Kombination
das Herauswachsen auf 64% der Kontrolle verringerte. Die koordinierte
Verabreichung von sowohl den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern wie auch
Heparin verringerte den Level der Ausmigration weiter auf 42% der
Kontrolle. So inhibierten Heparin und die anti-PDGF-Rezeptorantikörper in
Kombination die glatte Muskelzell-Ausmigration bei den getesteten
koordinierten Verabreichungsregimen.
-
-
Beispiel 21
-
Sättigungs-Bindungsanalyse von
MAk 163.31 auf BO54-Zellen in der Gegenwart und Abwesenheit von
Heparin
-
Es
wurde die Bindungsfähigkeit
von anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 auf glatten Pavianmuskelzellen (BO54)
in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin getestet. Es wurden
glatte Pavianmuskelzellen (BO54) in einer Dichte von 20000 Zellen/Vertiefung
auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden
bei 37°C
in DMEM, das 10% fötales
Kälberserum
enthielt, wachsen. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Mito-Medien
bis sie den Ruhezustand erreichten inkubiert, dann einmal mit 4°C Bindungsmedien
(DMEM/Hams F-12, 25 mMol Hepes, 0,1% BSA) gewaschen. Es wurde die
Bindungsaktivität von
MAk 163.31 auf PDGF-beta-Rezeptoren in der Gegenwart von Heparin
durch Zugabe vierfacher Verdünnungen
von 125I-markiertem MAk 163.31 (125I-163.31) in 4°C Bindungsmedien (in einem Bereich
von 2,1 × 106 bis 1 × 103 cpm/ml) und 10 μg/ml Heparin (Elkins-Sinn, Inc.)
zu den entsprechenden Vertiefungen in dreifacher Ausführung in
1 ml Aliquots analysiert. Auf einer separaten Platte wurde die gleiche
Verdünnungsserie
von 125I-163.31 ohne Heparin zugegeben.
Um den Level der unspezifischen Bindung durch 125I-163.31
zu bestimmen, wurde ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder Platte,
die 5,5 × 105 cpm/Vertiefung des 125I-163.31
plus 25 μg/ml
unmarkiertes 163.31 enthielt, vorbereitet. Die Platten wurden auf
Eis gehalten, während
die Proben zugegeben wurden, dann für 1,5 Stunden bei 4°C auf einem
Rundschüttler
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit
einem Extraktionspuffer (PBS, 1% NP-40) inkubiert, und die Extrakte wurden
in 12 × 75
mm Röhrchen
geerntet und in einem Gammazähler
gezählt.
Die Ergebnisse der Bindungsstudien, dargestellt in Tabelle 16, zeigen,
dass die koordinierte Zugabe von Heparin und Antikörper keinen
signifikanten Effekt auf die Antikörperbindung ausübte. So
scheint die kombinierte Effektivität von mit den anti-PDGFr-beta-Antikörpern koordiniert
verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen, nicht auf
irgendeine Stimulation der Bindung der Antikörper an Zelloberflächen-PDGFr-beta-Rezeptoren
durch Heparin zurückzuführen zu
sein.
-
-
Beispiel 22
-
Sättigungs-Bindungsanalyse
von PDGF-BB auf glatten Paviangefäßmuskelzellen in der Gegenwart
und Abwesenheit von Heparin
-
Die
Fähigkeit
von PDGF-BB an seinen Rezeptor auf glatten Paviangefäßmuskelzellen
zu binden, wurde in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin getestet.
Es wurden glatte Pavianmuskelzellen (BO54) in einer Dichte von 20000
Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert
und man ließ sie
für ungefähr 48 Stunden
bei 37°C
in DMEM, das 10% fötales
Kälberserum
enthielt, wachsen. Man überführte die Zellen
dann durch ihre Inkubation für
24 Stunden in Mito-Medien in den Ruhezustand, dann wurden sie einmal mit
4°C Bindungsmedien
gewaschen. Es wurde die Bindungs aktivität von PDGF-BB an seinen Rezeptoren
in der Gegenwart von Heparin durch Zugabe zweifacher Verdünnungen
von 125I-PDGF-BB in 4°C Bindungsmedien (in einem Bereich
von 2 × 105 bis 2,5 × 104 cpm/ml),
die 10 μg/ml
Heparin (Elkins-Sinn, Inc.) enthielten, zu den entsprechenden Vertiefungen
in dreifacher Ausführung
in 1 ml Aliquots analysiert. Auf einer separaten Platte wurde die
gleiche Verdünnungsserie
von 125I-PDGF-BB
ohne Heparin zugegeben. Ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder
Platte enthielt auch 2,0 × 105 cpm/Vertiefung 125I-PDGF-BB
zusätzlich
zu 1 μg/ml
unmarkiertem PDGF-BB, um den Level unspezifischer Bindung durch 125I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Platten wurden
auf Eis gehalten, während
die Proben zugegeben wurden, und dann für 1,5 Stunden bei 4°C auf einem Rundschüttler inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit Extraktionspuffer
inkubiert und die Extrakte wurden in 12 × 75 mm Röhrchen geerntet und in einem
Gammazähler
gezählt.
-
Die
Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 17, zeigen, dass die Gegenwart
von Heparin keinen signifikanten Effekt auf die 125I-PDGF-BB-Bindung
ausübte.
So scheint die kombinierte Effektivität von mit den anti-PDGFr-Antikörpern koordiniert
verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen, nicht auf
irgendeine Inhibition der Bindung von PDGF-BB an Zelloberflächen-PDGF-Rezeptoren
durch Heparin zurückzuführen zu sein.
-
-
Beispiel 23
-
Inhibition der PDGF-BB-Bindung
an glatte Muskelzellen durch MAk 163.31 in der Gegenwart und Abwesenheit von
Heparin
-
Es
wurde ein Experiment durchgeführt,
um die Fähigkeit
von MAk 163.31, die 125I-PDGF-BB-Bindung an den PDGF-beta-Rezeptor
auf glatten Paviangefäßmuskelzellen
in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin zu inhibieren, zu bestimmen.
-
Glatte
Pavianmuskelzellen (BO54) wurden in einer Dichte von 20000 Zellen/Vertiefung
auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert, und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden
bei 37°C
in DMEM, das 10% fötales Rinderserum
enthielt, wachsen. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Mito-Medien
inkubiert, um sie in den Ruhezustand zu überführen, dann wurden sie einmal
mit 4°C-Bindungsmedien
gewaschen. MAk 163.31 wurde in Bindungsmedien auf die Konzentrationen,
die in Tabelle 18 gezeigt werden, verdünnt, dann mit 125I-PDGF-BB
und 10 μg/ml
Heparin (Elkins-Sinn, Inc.) gemischt, und 1 ml Aliquots der Mischung
wurden in dreifacher Ausführung
zu den Vertiefungen von BO54-Zellen
zugegeben. Auf einer separaten Platte wurde die gleiche Verdünnungsserie
von 163.31 zu 125I-PDGF-BB ohne Heparin
zugegeben. Ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder Platte enthielt 125I-PDGF-BB plus 1 μg/ml unmarkiertes PDGF-BB, um
den Level der unspezifischen Bindung durch 125I-PDGF-BB
zu bestimmen. Die Platten wurden auf Eis gehalten, während die
Proben zugegeben wurden, dann für
1,5 Stunden bei 4°C
auf einem Rundschüttler
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit
einem Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden auf 12 × 75 mm
Röhrchen übertragen
und in einem Gammazähler
gezählt.
-
Die
Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 18, zeigen, dass die Gegenwart
von Heparin keinen signifikanten Effekt auf die dosisabhängige inhibitorische
Aktivität
von MAk 163.31 auf 125I-PDGF-BB-Bindung
an BVSMCs hatte. So scheint die kombinierte Effektivität von mit
den anti-PDGFr-Antikörpern
koordiniert verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen,
nicht auf irgendeine direkte Modulierung der PDGF-BB-inhibitorischen Bindungsaktivität des anti-PDGFr-beta-Antikörpers durch
Heparin zurückzuführen zu
sein.
-
-
Beispiel 24
-
Kontinuierliche intravenöse Infusion
der MAks 169.31 und 163.31 in Paviane und Analyse der Pavian-anti-Maus-IgG-Antwort
-
Diese
Studie wurde entworfen, um die zirkulierenden Spiegel der anti-PDGFr-Maus-Antikörper nach kontinuierlicher
Infusion auf entweder intravenösen
oder intraperitonealen Wegen zu überwachen.
Ein Pool von anti-PDGFr-MAks 163.31 und 169.31 wurde mit den zwei
Antikörpern
in ungefähren
Konzentrationen von 36 bzw. 22 mg/ml erstellt. Die Antikörper wurden
in einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff aus 1,5% Glycin, 0,2
Mol NaCl und 0,01% Tween-20® formuliert. Der Antikörperpool
wurde in osmotische 14 Tage-Alzet-Pumpen, die 2,1 ml Probe enthalten
und in einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 μl/h abgeben, gefüllt. Zwei
Pumpen wurden in jedes der drei Versuchstiere eingepflanzt. Zweien
der Tiere wurden die Pumpen intraperitoneal (IP) in die Perito nealhöhle eingepflanzt
und einem Tier wurden die Pumpen in den subkutanen Raum eingepflanzt
und der Antikörper
intravenös
(IV) durch die Verwendung eines Silastic-Katheters, der in das Venensystem eingepflanzt
wurde, abgegeben.
-
Es
wurden Plasmaproben von den Versuchstieren an den Tagen 1, 7, 14,
21 und 28 nach der Pumpeneinpflanzung abgenommen. Die Plasmaproben
wurden hinsichtlich der zirkulierenden Spiegel der anti-PDGFr-Antikörper durch
ELISA analysiert. Zusätzlich
wurden die Plasmaproben hinsichtlich der Gegenwart von Pavian-Antikörpern, die
gegen die Maus-Antikörper
gerichtet waren, analysiert.
-
Um
auf die Gegenwart der Maus-Antikörper
zu untersuchen, wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit
entweder Ziegen-anti-Maus-IgG1 (Sigma Chemical Co.) oder Ziegen-anti-Maus-IgG2a
(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) mit 1 μg/ml in ELISA A-Puffer beschichtet.
Die Platten wurden über
Nacht bei 4°C
inkubiert, dann zweimal mit ELISA C-Puffer gewaschen. Die Platten
wurden die Zugabe von ELISA B-Puffer für 2 Stunden bei 37°C blockiert,
dann zweimal mit ELISA C-Puffer gewaschen. Die Pavian-Plasmaproben wurden
mit ELISA B-Puffer verdünnt,
dann zu den entsprechenden Testvertiefungen zugegeben. Es wurden Verdünnungen
der gereinigten monoklonalen Antikörper 163.31 und 169.31, verdünnt in Kontroll-Pavianplasma,
zu einem Satz von Testvertiefungen zugegeben, um eine Standardkurve
zur Verwendung bei der Quantifizierung der Antikörperspiegel in den Pavian-Plasmaproben
zu erzeugen. Die Testantikörperproben
wurden für
2 Stunden bei 37°C
inkubiert, dann wurden die Vertiefungen 3 × mit ELISA C-Puffer gewaschen.
Es wurde dann Ziegen-anti-Maus-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase
(Tago, Burlingame, Ca), zu den Vertiefungen zugegeben, und die Platten
wurden für
zusätzliche
2 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen,
dann mit Reaktionspuffer für
ungefähr
1 Minute inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N
H2SO4 beendet und
die Platten in einem ELISA-Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 492 nm
gelesen. Unter Verwendung der Werte, die man aus den gereinigten
Antikörperproben
erhielt, wurde eine Standardkurve für jeden Antikörper erzeugt,
und die Konzentrationen der Antikörper in den Pavian-Plasmaproben wurden
aus diesen Kurven bestimmt.
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Die
Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 19, zeigen, dass es bei den zirkulierenden
Antikörperspiegeln eine
Spitze 1 Tag nach der Pumpeneinpflanzung bei dem i. v.-infundierten Tier
gab, während
die Spitzenantikörperspiegel
bei den intraperitoneal infundierten Tieren am Tag 7 gefunden wurden.
An den Tagen 14, 21 und 28 betrugen die zirkulierenden Antikörperspiegel
weniger als 1% der Spitzenspiegel, die zu früheren Zeitpunkten gemessen
wurden.
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-
Es
wurden Studien unter Verwendung von ELISA durchgeführt, um
mögliche,
gegen die infundierten Mäuse-Antikörper erzeugte
Pavian-Antikörper
zu messen. Die Ergebnisse legten nahe, dass die niedrigen Spiegel
zirkulierenden Antikörpers,
die man nach 14 Tagen maß,
von einer Immunantwort, die bei den Pavianen gegen die Maus-Antikörper erzeugt
wurde, verursacht wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nützlich ist,
um einen anhaltenden Spiegel zirkulierenden anti-PDGFr-Antikörpers in
einem Primatensystem bereitzustellen, Antikörper so auszuwählen, dass
ihr immunogenes Potential minimiert ist. Dies kann durch eine Vielzahl
konventioneller Mittel erreicht werden, einschließlich durch
Herstellung von Fab- oder F(ab')2-Fragmenten
oder durch Aufbau Maus/Mensch-chimärer Antikörper oder andere Antikörperfragmente
oder durch Konstruktionen mit verringerter Immunogenität.
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Beispiel 25
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Bestimmung
der Zirkulationshalbwertszeit chimärer anti-PDGFr-beta-Antikörper bei
Cynomolgus-Affen
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Der
Metabolismus des chimären
anti-PDGFr-beta-Antikörpers
wurde bei Cynomolgus-Affen
bestimmt. Dies erreichte man durch Verwendung von 125I-markiertem
Antikörper.
Gereinigter Antikörper
wurde mit 125Iod durch das Chloramin-T-Verfahren
bis zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 370 KBq/μg (10 μCi/μg) des Antikörper markiert. Es wurden drei
männliche
Cynomolgus-Affen bei dieser Studie verwendet, die in ihrem Körpergewicht
von 6,0 bis 6,6 kg reichten. An dem Morgen des Experiments wurde
der radioaktiv markierte Antikörper
in eine 3 ml Spritze aufgezogen und in eine Infusions pumpe gegeben.
Die Affen wurden mit Ketamin anästhesiert,
und die Saphena-Venen wurden mit einem 24 Gauge intravenösen Katheter
(SURFLO, Terumo Medical Corp., Elkton, MD), der an eine Polyethylenleitung
angebracht war, punktiert. Die den Antikörper enthaltende Spritze wurde
an der Leitung angebracht und man begann die Infusion mit einer
Geschwindigkeit von 0,5 ml/min, gefolgt von einer 0,5 ml Spülung mit
Kochsalzlösung.
Jedes Tier erhielt eine Dosis von 3,18 mg Antikörper/kg Körpergewicht.
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Direkt
nach der Infusion begann man mit der Blutprobenabnahme. Um die Halbwertszeit
des Antikörpers
zu bestimmen, zog man die Proben auf EDTA-enthaltende Vakutainer-Röhrchen nach
0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168, 240, 336,
504 und 672 Stunden auf. Das Blut wurde zentrifugiert, das Plasma dekantiert
und die Radioaktivität
in einem Gammazähler
(80% Effizienz) bestimmt. Die Antikörperkonzentrationen in dem
Plasma wurden durch Vergleich der Zählungen in dem Blut mit der
anfänglichen
spezifischen Aktivität
des radioaktiv markierten Antikörpers
bestimmt, wobei die Zerfallsrate von 125I
berücksichtigt
wurde. Die Analyse der Antikörperkonzentrationen
in den Plasmaproben zeigte, dass die Halbwertszeit des Antikörpers ungefähr 50 Stunden
betrug.
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Beispiel 26
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Entwicklung
eines sequentiellen arteriellen Verletzungsmodells bei Pavianen
zur Testung antihyperplastischer Wirkstoffe und Behandlungen nach
Gefäßverletzung
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Es
wurde ein Modell einer sequentiellen arteriellen Verletzung im Pavian
entwickelt, um die Testung der anti-PDGFr-Antikörper auf ihre Fähigkeit,
experimentell induzierte intimale Hyperplasie bei Primaten zu inhibieren,
zu ermöglichen.
Dieses Modell wurde entworfen, um jedes Tier als seine eigene Kontrolle
durch Nutzung beidseitiger arterieller Verletzungen, die in 28-tägigem Intervall
zugefügt
wurden, fungieren zu lassen.
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Bei
dieser Studie wurden Paviane, die jeweils ungefähr 10 kg wogen, verwendet.
Der anfängliche
operative Eingriff ähnelte
sehr dem wiederherstellenden Gefäßeingriff
der Ballonangioplastie, die bei klinischen Anwendungen für die Behandlung
menschlicher Atherosklerose verwendet wird. Bei jedem Tier wurde
eine anfängliche
Ballonrückzugs-Ausschälungsverletzung
in der Arteria saphena hervorgerufen. Am Tag 28 unterzogen sich
die Tiere einem zweiten operativen Eingriff, wobei die anfänglich verletzte
Arterie exzidiert wurde und diese exzidierte Arterie wurde ex vivo
unter 100 mm Hg Druck für
1 Stunde mit einer 10%igen Formalinlösung perfusionsfixiert. Nach
der Exzision der ersten Arterie erhielt die kontralaterale Arteria
saphena eine Ballon-Ausschälungsverletzung.
Nach dem zweiten Zeitraum von 28 Tagen wurde die zweite verletzte
Arterie exzidiert und ex vivo auf eine ähnliche Weise wie die erste
Arterie perfusionsfixiert.
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Beide
exzidierten Arterien wurden in zahlreiche Abschnitte geteilt und
in Paraffin eingebettet. Es wurden Abschnitte aus mehreren Gewebeblöcken geschnitten,
mit Hämatoxylin
und Eosin gefärbt,
dann durch morphometrische Analyse hinsichtlich der intimalen Läsionsbildung
unter Verwendung eines computerisierten Bildgebungsanalysesystems
analysiert (Ferns et al., Science 253: 1129, 1991).
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Die
Ergebnisse der Studie, dargestellt in Tabelle 20, zeigen, dass die
intimalen/medialen Verhältnisse (I/M)
für die
kontralateralen Arterien sehr ähnlich
waren, obwohl die anfänglichen
arteriellen Verletzungen sogar 28 Tage voneinander getrennt durchgeführt wurden.
Dies legt nahe, dass das Vorliegen einer anfänglichen arteriellen Verletzung
und die darauffolgende Entfernung des verletzten arteriellen Segmentes
die Antwort der zweiten verletzten Arterie nicht beeinflusst. Diese
Ergebnisse zeigen auch, dass das Ausmaß der arteriellen Verletzung
wie durch das intimale/mediale Verhältnis gemessen, ähnlicher
innerhalb eines Tieres als zwischen Tieren ist. Diese Ergebnisse
zeigen, dass es möglich
ist, ein sequentielles Verletzungsmodell zur Bewertung der Effizienz
therapeutischer Verbindungen für
die Verhinderung intimaler Läsionsbildung
beim Pavian zu verwenden, wobei jedes Tier als seine eigene Kontrolle
fungiert.
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Beispiel 27
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Bewertung der anti-PDGF-Rezeptorantikörper/Heparintherapie
zur Inhibition intimaler Hyperplasie bei Primaten
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Es
wurden Paviane, die jeweils 6 bis 10 kg wogen, verwendet, um die
Effizienz von anti-PDGFr-MAks und Heparin zu untersuchen. Es wurde
eine anfängliche
Ballonrückzugs-Ausschälungsverletzung
in einer Arteria saphena von jedem Tier unter Verwen dung eines 2F-Embolektomiekatheters
(Fogarty) hervorgerufen. Zum Zeitpunkt der Verletzung wurden Femoralvenenkatheter
und subkutane (SQ) osmotische Pumpen (Alzet) eingebracht (28 Tage-Pumpen,
zwei Pumpen pro Tier). Die Pumpen gaben zusammen in einer Geschwindigkeit
von 5 μl/h
an die Femoralvene ab. Während
des ersten 28 Tage-Kontrollzeitraumes wurden die Pumpen mit Placebo-Kochsalzlösung befüllt. Während des
28 Tage-Zeitraumes nach der Ballonverletzung erhielten die Tiere
i. v.-Injektionen
von Placebopuffer an den Untersuchungstagen 1, 4, 8, 15 und 22.
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Am
Untersuchungstag 29 wurde ein zweiter operativer Eingriff durchgeführt, wobei
die zuvor verletzte Arterie exzidiert und unter 100 ml Hg Druck
für 1 Stunde
mit einer 10%igen Formalinlösung
perfusionsfixiert wurde. Die Arterien wurden dann 10 Abschnitte
von ungefähr
0,5 cm Länge
aufgeteilt. Jedes Gewebestück wurde
in Paraffin eingebettet und es wurden Abschnitte von jedem Gewebeblock
zur morphometrischen Analyse geschnitten, wie durch Geary et al.
offenbart (Circulation 91: 2972, 1995). Es wurden fünf μm dicke Abschnitte
von jedem Block geschnitten und mit Verhoeff's-van Gieson's-Färbung
gefärbt.
Querschnitte wurden mit einem Mikroskop und einer Camera lucida
auf einen computerisierten Digitalisiertisch projiziert, und die
intimalen und medialen Bereiche von jedem Querschnitt wurden ausgemessen.
Es wurden die Mittelwerte für jede
verletzte Arterie durch Mittelung der Querschnittsmessungen von
6–8 Gewebeblöcken für jede Arterie
bestimmt. Die distalsten Gewebeblöcke wurden aus der Datenanalyse
entfernt, um zu vermeiden, dass man Abschnitte aus Bereichen erhielt,
die nicht vom Ballon erfasst worden waren.
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Nach
der Exzision der ersten Arterie erhielt die kontralaterale Arteria
saphena eine Ballon-Ausschälungsverletzung.
Es wurden dann Femoralvenenkatheter und SQ-osmotische Pumpen eingebracht. Die Pumpen
wurden mit Schweineheparin, Grad II (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) befüllt,
das mit einer Geschwindigkeit von 0,13 mg/kg/h abgegeben wurde.
Die zirkulierenden Spiegel an Heparin wurden durch APTT-Analyse unter Verwendung
eines kommerziell erhältlichen
Kits (HEPTEST Assay #803, American Diagnostica, Greenwich, CT) in
einem MLA (Pleasantville, NY) Electra 800-Gerinnungsgerät überwacht. Die bei der Studie verwendete
Dosis von Heparin rief eine ungefähr 2-fache Zunahme bei der
APTT hervor.
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Die
Tiere erhielten i. v.-Injektionen von Maus/Mensch-chimärem anti-PDGF-Rezeptorantikörper (10 mg/ml
in 50 mMol Natriumacetat, 125 mMol NaCl, pH 5,0) an den Untersuchungstagen
1, 4, 8, 15 und 22. Es wurde eine Dosis von 10 mg/kg des anti-PDGF-Rezeptorantikörpers verwendet,
um zirkulierende Antikörperspiegel
von ungefähr
50 μg/ml
bereitzustellen.
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Blutabnahmen
wurden kurz vor dem Zeitpunkt jeder Antikörperinjektion durchgeführt, um
die zirkulierenden Spiegel des anti-PDGF-Rezeptorantikörpers und
zirkulierenden Spiegel von Heparin zu bestimmen. Die zirkulierenden
Antikörperspiegel
wurden unter Verwendung eines ELISA bestimmt. Lösliches PDGF-beta-Rezeptor/IgG-Fusionsprotein
wurde auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen geschichtet. Die
Platten wurden mit PBS, das 0,1% BSA und 0,05% Tween-20® enthielt,
blockiert, um unspezifische Bindung zu eliminieren. Verdünnungen
von Pavianserum, hergestellt in dem gleichen Puffer, wurden zu den
Vertiefungen zusammen mit einer Verdünnungsserie von gereinigtem
chimären
Antikörper,
verdünnt
in Kontroll-Pavianserum, zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert,
dann gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Es wurde
dann mit Meerrettichperoxidase (Zymed, So. San Francisco, CA) konjugierter
Ziegen-anti-Mensch-IgG4-Antikörper zu
den Vertiefungen für
eine Stunde bei 37°C
zugegeben. Die Vertiefungen wurden mit PBS, das 0,05% Tween-20 enthielt,
gewaschen, dann mit OPD-Substratlösung inkubiert. Die Reaktion
wurde durch die Zugabe von 1 N H2SO4 beendet und die Platten wurden in einem
Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 490
nm gelesen. Die zirkulierenden Antikörperspiegel wurden durch Vergleich
der Datenpunkte mit einer Standardkurve bestimmt. Die Heparinspiegel
wurden wie oben beschrieben bestimmt. Zusätzlich wurden die Tiere durch
ELISA unter Verwendung eines Ziegen-anti-Affen-IgG, konjugiert mit
Meerrettichperoxidase (Cappel, Durham, NC) hinsichtlich des Auftretens
irgendeiner Pavian-Antikörperantwort,
die gegen den chimären
Antikörper
gerichtet war, überwacht.
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Nach
dem zweiten 28-Tage-Zeitraum wurde die zweite verletzte Arterie
exzidiert und ex vivo auf eine ähnliche
Weise wie die erste Arterie perfusionsfixiert.
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Insgesamt
15 Tiere wurden in die Studie aufgenommen. Vorangehende Studien,
die oben offenbart wurden, zeigten unter Verwendung des sequentiellen
Verletzungsmodells, dass eine geringe Variabilität zwischen den Arterien, die
in 28-tägigem
Abstand verletzt wurden, bestand. Die Analyse der vorangehenden
Studien legt nahe, dass ein n = 15 erforderlich sein würde, um
eine 50%ige Abnahme bei der Läsionsentwicklung mit
einer 95% Konfidenzgrenze zu beobachten. Zur Vereinfachung der operativen
Behandlung wurden die Tiere in drei Gruppen von fünf eingeteilt.
Die Seite des ersten Eingriffes wurde für jedes Tier randomisiert,
um jede Seit-zu-Seit-Variation zu eliminieren.
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Man
erhielt Gewebeabschnitte von mehreren Blöcken für jede Testarterie wie oben
beschrieben und die absoluten intimalen und medialen Bereiche für jeden
Gewebeabschnitt wurden bestimmt. Die Daten für die zahlreichen Abschnitte
für jede
Arterie wurden dann gemittelt, um Mittelwerte für den intimalen Bereich, den medialen
Bereich und das intimale/mediale Verhältnis zu ergeben. Drei Tiere
wurden aufgrund der Gegenwart von Verschlussthromben an dem Ort
der Angioplastie aus der Studie entfernt. Photomikrographien der
arteriellen Querschnitte zeigten eine verdickte Intima in Kontrollarterien
im Vergleich zu den Antikörper-behandelten Arterien.
Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den linken und
rechten Beinen für
den Level der intimalen Hyperplasie bei den Antikörper-behandelten
Tieren festgestellt. Die Daten werden in Tabelle 21 zusammengefasst.
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Der
Spiegel an zirkulierendem Antikörper
wurde für
jedes der Tiere vor der Behandlung und an den Untersuchungstagen
4, 8, 15, 22 und 29 bestimmt. Im Allgemeinen lagen die Antikörperspiegel über 50 μg/ml an den
Untersuchungstagen 4 und B. An Tag 15 wiesen drei der Tiere Antikörperspiegel
auf, die auf unter 5 μg/ml
gefallen waren, während
die übrigen
Spiegel aufwiesen, die in dem Bereich von 14–70 μg/ml lagen. An Tag 22 wiesen
nur fünf
der Tiere Antikörperspiegel über 17 μg/kg auf.
Daten zur Immunantwort (nicht gezeigt) legen nahe, dass der Abfall
der zirkulierenden chimären
Antikörperspiegel
ein direktes Ergebnis der Clearance des Antikörpers durch das Immunsystem
der Tiere war. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Spiegel an zirkulierendem
Antikörper
und dem Ausmaß der
intimalen Läsionsbildung
beobachtet, was nahe legt, dass die anfänglich vorliegenden Spiegel
an Antikörper
ausreichend waren, um die Bildung ausgedehnter intimaler Läsionen zu
inhibieren und was weiter nahe legt, dass ein kürzerer Zeitraum der Antikörperverabreichung
günstige
Ergebnisse bereitstellen sollte.
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Das
oben beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die anti-PDGF-Rezeptorantikörper einzeln,
in Kombination oder in der Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen
Dosierungen von Heparin zu beurteilen. Zum Beispiel kann ein ähnliches
Protokoll zur Beurteilung eines gepoolten anti-PDGF-alpha-Rezeptor-
(MAk 169.3.1) und anti-PDGF-beta-Rezeptor- (MAk 163.3.1) Antikörperpräparates
wie auch für
die zwei chimären
Antikörper
einzeln verwendet werden. Zusätzlich
zur Verwendung morphometrischer Analyse, um nach Änderungen
in der intimalen Hyperplasie Ausschau zu halten, schliessen zusätzliche
Analysetypen, die verwendet werden können, um die Läsionsbildung
zu überwachen,
Angiographie, intravaskulären
Ultraschall und Magnetresonanz-Tomographie mit ein. Zusätzlich kann
man Gewebeproben von dem Ort der Verletzung zu zahlreichen Zeitpunkten
nach der Induktion der Verletzung durch Reduktionsarteriektomie
erhalten.