DE69533069T2

DE69533069T2 - Zusammensetzung zur hemmung von innerer hyperplasie unter verwendung von pdgf antagonisten und heparin

Info

Publication number: DE69533069T2
Application number: DE69533069T
Authority: DE
Inventors: E. Charles HART; D. Richard KENAGY; Alexander Clowes
Original assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Current assignee: University of Washington; Zymogenetics Inc
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2015-12-21
Also published as: AU692996B2; DK0801572T3; WO1996020718A2; EP0801572B1; WO1996020718A3; EP0801572A2; ES2220948T3; GB9713718D0; JP2001523214A; CA2208673A1; DE69533069D1; AU4741596A; GB2311463B; ATE267016T1; US5976534A; CA2208673C; GB2311463A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Inhibition intimaler Hyperplasie, einschließlich Restenose bei einem Säugetier infolge von Gefäßverletzung, und Zusammensetzungen, die bei diesen Verfahren nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Die Proliferation glatter Muskelzellen (SMCs) in der Gefäßwand ist ein wichtiges Ereignis bei der Bildung vaskulärer Läsionen bei der Atherosklerose, nach Gefäßwiederherstellung oder in Antwort auf eine andere Gefäßverletzung. Zum Beispiel beinhaltet die Behandlung von Atherosklerose häufig das Ausräumen verstopfter Gefäße durch Angioplastie, Endarteriektomie oder Reduktionsarteriektomie oder durch Bypasstransplantierung, chirurgische Eingriffe, bei denen atherosklerotische Plaques komprimiert oder durch Katheterisierung (Angioplastie) entfernt, durch eine Inzision von der arteriellen Wand abgestreift (Endarteriektomie) oder durch natürliche oder synthetische Transplantate umgangen werden. Diese Eingriffe entfernen das vaskuläre Endothel, beeinträchtigen die darunter liegende intimale Schicht und resultieren in dem Absterben medialer SMCs. Diese Verletzung wird durch mediale SMC-Proliferation und Migration in die Intima gefolgt, begleitet durch eine übermäßige Ablagerung extrazellulärer Matrix. Diese Läsionentwicklung tritt charakteristischerweise innerhalb der ersten paar Wochen und bis zu sechs Monate nach der Verletzung auf und endet, wenn die darüber liegende endotheliale Schicht wieder hergestellt ist. Bei Menschen bestehen diese Läsionen aus ungefähr 20% Zellen und 80% extrazellulärer Matrix.
Bei ungefähr 30% oder mehr Patienten, die durch Angioplastie, Endarteriektomie oder Bypasstransplantate behandelt wurden, verursacht Thrombose und/oder SMC-Proliferation in der Intima einen Wiederverschluss des Gefäßes und daraus folgend Versagen der Wiederherstellungsoperation. Dieser Verschluss des Gefäßes infolge einer Operation ist als Restenose bekannt.
Ein ähnlicher Vorgang der SMC-Proliferation wurde auch bei Organtransplantaten beobachtet und kann zu Transplantatatherosklerose und Organversagen beitragen. Die intimale Verdickung bei diesem Vorgang betrifft nur das transplantierte Organ.
Es wurde postuliert, dass Thrombozytenmitogene wie der Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), eine Rolle bei der Entwicklung atherosklerotischer Plaques spielt (siehe Ross et al., Cell 46: 155–169, 1986; Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987). Ein vorgeschlagener Mechanismus für die Plaquebildung ist die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die SMC-Wachstum stimulieren, durch Thrombozyten an Stellen endothelialer Abtragung (Ross and Glomset, N. Eng. J. Med. 295: 369–377, 420–425, 1976; Ross, Arteriosclerosis 1: 293–311, 1981). Moore et al. (Thrombos. Haemostas. Stuttg.) 35: 70, 1976) und Friedman et al. (J. Clin. Invest. 60: 1191–1201, 1977) berichteten unter Verwendung eines in situ-Katheterverletzungsmodells über eine Inhibition experimentell induzierter intimaler Läsionsbildung in Kaninchenarterien durch anhaltende Thrombozytopenie, die durch Verabreichung eines Antithrombozytenserums induziert wurde. Es wurde auch postuliert, dass SMCs selber PDGF, das die Läsionentwicklung durch einen autokrinen Mechanismus stimuliert, herstellen könnten (Ross et al., ebenda; Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7311–7315, 1986). Fingerle et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8412–8416, 1989) untersuchte intimate Läsionsbildung bei thrombozytopenischen Ratten und schloss, dass Thrombozyten keine Rolle bei der initialen SMC-Proliferation nach Ballonverletzung spielen, aber die SMC-Migration in die Intima regulieren könnten. Thrombozyten sind nun dafür bekannt, eine Anzahl von Wachstumsfaktoren einschließlich PDGF, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), transformierende Wachstumsfaktoren alpha und beta (TGFα und TGFβ), insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und Thrombozyten-Wachstumsfaktor der Endothelialzelle wie auch verschiedene chemische Attraktanzmoleküle freizusetzen. Obwohl bestimmte Studien PDGF mit Vorgängen, die an der Läsionentwicklung beteiligt sind, in Verbindung bringen, haben keine Studien die Beteiligung von PDGF bei diesen Vorgängen bei Primaten gezeigt.
Die Entfernung atherosklerotischer Plaques durch Angioplastie oder Endarteriektomie weist eine begrenzte Effizienz auf und es ist keine effektive Behandlung der Restenose von behandelten Gefäßen oder der Stenose von Bypasstransplantaten entwickelt worden. In dem Fachgebiet besteht daher ein Bedarf an Verfahren zur Reduktion oder Verhinderung der Entwicklung SMC-reicher Läsionen in vaskulären Wänden, einschließlich der Stenose von Blutgefäßen nach Gefäßverletzung, wie einer Verletzung aufgrund einer Ballonkatheterisierung, Endarteriektomie oder Reduktionsarteriektomie, wie auch bei Gefäßtransplanten, Organtransplantaten und Kathetereinbringungen.
Die internationale Patentanmeldung WO 94/19016 offenbart Verfahren zur Inhibition intimaler Hyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugetieres, umfassend die Verabreichung eines anti-PDGF-Rezeptorantikörpers an das Säugetier. Die Beispiele 1 bis 13 und 1 bis 9 haben WO 94/19016 und die vorliegende Anmeldung gemeinsam.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF)-Antagonisten und Heparin bei der Herstellung eines Medikamentes zur Inhibition intimaler Hyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugetieres bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines PDGF-Antagonisten bei der Herstellung eines Medikamentes, das gleichzeitig mit Heparin für die Behandlung vaskulärer hyperproliferativer Erkrankungen verabreicht werden soll, bereit. Beispiele intimaler Hyperplasie schließen Restenose nach Angioplastie, Endarteriektomie und anderen Eingriffen, bei denen atherosklerotische Plaques aus Blutgefäßen entfernt werden, mit ein. Medikamente gemäß der Erfindung können eine effektive Menge eines PDGF-Rezeptorantikörpers zur Inhibition intimaler Hyperplasie umfassen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird es vorgezogen, einen Antithrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptorantikörper in einer Menge zu verwenden, die ausreicht, um Mitogenese und/oder Migration glatter Muskelzellen zu inhibieren. Ein anti-PDGF-Rezeptorantikörper kann gleichzeitig oder alternativ sequentiell mit einem Heparin verabreicht werden.
Gemäß der Erfindung können Medikamente eine effektive Menge an anti-PDGF-Rezeptorantikörper wie einen anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper, einen anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper oder eine Gruppe von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern umfassen. Bei einer Ausführungsart ist die Antikörpergruppe in der Lage, die Bindung der AA-, AB- und BB-Isoformen von PDGF an PDGF-Rezeptoren zu inhibieren.
Medikamente gemäß der Erfindung können einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper umfassen, der einem Säugetier gleichzeitig mit oder innerhalb eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes vor dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung bei dem Säugetier verabreicht werden kann. Beispiele akuter Gefäßverletzungen schließen vaskuläre Wiederherstellungseingriffe wie Angioplastie, Endarteriektomie, Reduktionsarteriektomie und Anastomose eines Gefäßtransplantates mit ein. Bei einem verwandten Aspekt wird der Antikörper gleichzeitig mit oder innerhalb eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes vor dem Einbringen eines Gefäßtransplantats oder transplantierten Organs verabreicht. Bei anderen Ausführungsarten wird der Antikörper innerhalb eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes nach dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung oder dem Einbringen eines Gefäßtransplantates oder transplantierten Organes verabreicht.
Medikamente gemäß der Erfindung, die die Antikörper umfassen, können verwendet werden, um intimale Hyperplasie, die innerhalb eines Gefäßtransplantates oder eines transplantierten Organs auftritt, zu inhibieren.
Medikamente gemäß der Erfindung, die einen PDGF-Antagonisten und Heparin umfassen, können koordiniert in den jeweiligen Mengen an Antikörper und Heparin, die ausreichen, um kombiniert die Hyperplasie zu inhibieren, verabreicht werden. Der Antagonist und Heparin können gleichzeitig oder alternativ sequentiell verabreicht werden, wobei entweder der Antagonist oder Heparin zuerst verabreicht wird, und der nicht verabreichte Rest an Antagonist und Heparin innerhalb eines effektiven Zeitraumes danach verabreicht wird. Bei einer Ausführungsart ist der PDGF-Antagonist ein nicht-peptidischer PDGF-Antagonist. Bei einer anderen Ausführungsart ist der PDGF-Antagonist ein anti-Wachstumsfaktor-Rezeptorantikörper wie ein anti-PDGF-Rezeptorantikörper.
Bei verwandten Ausführungsarten inhibiert der koordiniert verabreichte Antikörper oder andere PDGF-Antagonist und Heparin kombiniert ein oder mehrere der intimalen hyperplastischen Vorgänge der glatten Gefäßmuskelzellproliferation, glatten Gefäßmuskelzellmigration und/oder neointimalen Ablagerung extrazellulärer Matrix. Bei weiteren Ausführungsarten ist der Antikörper entweder ein anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper, ein anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper oder eine Gruppe von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern. Bei zusätzlichen Ausführungsarten inhibiert der Antikörper oder andere PDGF-Antagonist eine Rezeptorfunktion des Wachstumsfaktorrezeptors, wie die Bindung des Rezeptors an einen Rezeptorliganden, oder die Dimerisation des Wachstumsfaktorrezeptors. Bei anderen Ausführungsarten wird ein anti-PDGF-Antikörper oder anderer PDGF-Antagonist verabreicht, der die Bindung eines oder mehrerer der AA-, AB- und BB-Isoformen von PDGF an PDGF-Rezeptoren inhibiert. Bei anderen Ausführungsarten umfasst das Heparin ein Heparansulfat oder ein niedermolekulares Heparin, das durch den Besitz einer reduzierten antithrombotischen Aktivität charakterisiert wird.
Medikamente gemäß der Erfindung, die einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder anderen PDGF-Antagonisten und Heparin umfassen, können koordiniert an ein Säugetier gleichzeitig mit oder innerhalb eines effektiven Zeitraumes vor dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung bei dem Säugetier verabreicht werden. Akute Gefäßverletzungen schließen Gefäßverletzungen, die durch Gefäßwiederherstellung, einschließlich Verletzungen aufgrund von Angioplastie, endovaskulärer Stentsetzung, Endarteriektomie, endovaskulärer Laserablation, Reduktionsarteriektomie und Anastomose eines Gefäßtransplantates entstehen, mit ein. Bei verwandten Aspekten kann ein PDGF-Antagonist und Heparin gleichzeitig mit oder innerhalb eines therapeutisch effektiven Zeitraumes vor dem Einbringen eines Gefäßtransplantates oder transplantierten Organs verabreicht werden. Bei anderen Ausführungsarten werden ein PDGF-Antagonist und Heparin innerhalb eines antihyperplastisch effektiven Zeitraumes nach dem Auftreten einer akuten Gefäßverletzung oder dem Einbringen eines Transplantates oder eines transplantierten Organs verabreicht.
Die Erfindung stellt auch Produkte, die Heparin und einen PDGF-Antagonisten als ein kombiniertes Präparat für simultane, getrennte oder sequentielle Verwendung für die Behandlung vaskulärer hyperproliferativer Erkrankungen enthalten, bereit.
Vorzuziehende Produkte der Erfindung beinhalten Antikörper und Heparin in einem Antikörper : Heparin-Gewichtsverhältnis zwischen ungefähr 0,01 : 1 und 100 : 1, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,05 : 1 und 20 : 1. In einer Ausführungsform umfasst das Heparin ein niedermolekulares Heparin mit reduzierter antithrombotischer Aktivität oder es umfasst ein Heparansulfat.
Bei wieder einem anderen Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Kits zur Behandlung intimaler Hyperplasie bei einem Säugetier bereitgestellt, wobei die Kits einen PDGF-Antagonisten wie einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder einen nicht-peptidischen PDGF-Antagonisten und Heparin in einem pharmakologisch geeigneten Trägerstoff beinhalten. Bei einer Ausführungsart werden der Antagonist und Heparin in einem einzigen Trägerstoff vorher kombiniert. Bei einer anderen Ausführungsart werden der Antagonist und Heparin durch simultane, getrennte oder sequentielle Abgabe verabreicht.
Antikörper, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen monoklonale Antikörper und gentechnisch hergestellte Antikörper mit ein, wobei die letzteren Einzelstrangantikörper, chimäre Antikörper, bifunktionelle Antikörper und Immunkonjugate beinhalten.
Heparinpräparate, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen unfraktionierte oder fraktionierte Heparine und heparinähnliche Glykosaminoglykane einschließlich Heparansulfaten mit ein: Ebenfalls nützlich sind niedermolekulare Heparine einschließlich antikoagulierender und nicht-antikoagulierender Fragmente und Derivate von Heparin und heparinähliche Glykosaminoglykanen.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden im Zusammenhang mit der folgenden ausführlichen Beschreibung und den anhängenden Zeichnungen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht die Bindung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper an Zellen, die rekombinanten PDGF-beta-Rezeptor exprimieren. Die Ergebnisse werden als mittlere cpm, gebunden von ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG für dreifache Bestimmungen ausgedrückt. Die Balken zeigen die Standardabweichung an.
2 veranschaulicht die Bindung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper an Zellen, die rekombinanten PDGF-alpha-Rezeptor exprimieren. Die Ergebnisse werden als mittlere cpm, gebunden von ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG für dreifache Bestimmungen ausgedrückt. Die Balken zeigen die Standardabweichung an.
Die 3A–3C veranschaulichen die Inhibition der mitogenen PDGF-Aktivität auf humanen dermalen Fibroblasten durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche Level des [³H]Thymidin-Einschlusses für jede der PDGF-Ligandentestbedingungen dargestellt. Die Standardabweichung wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt. Jedes Feld zeigt auch die Standardkurve für den PDGF-Liganden alleine. A) PDGF-AA-Stimulation, B) PDGF-AB-Stimulation, C) PDGF-BB-Stimulation.
4 veranschaulicht die Inhibition von mitogener PDGF-AA-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche Level des [³H]-Thymidin-Einschlusses dargestellt. Die Standardabweichung wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt.
5 veranschaulicht die Inhibition von mitogener PDGF-AB-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden wie in 4 dargestellt.
6 veranschaulicht die Inhibition von mitogener PDGF-BB-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für den Liganden allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden wie in 4 dargestellt.
7A und B veranschaulichen die Titrierung von repräsentativen monoklonalen Antikörpern, um die mitogene Aktivität von PDGF-AA auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche Level des [³H]-Thymidin-Einschlusses für jede der PDGF-AA-Testbedingungen dargestellt. Die Standardabweichung wird durch das T für die PDGF-AA-Standardkurvenproben gezeigt. (A) Standardkurve der mitogenen PDGF-AA-Aktivität. (B) Inhibitorische Wirksamkeit der MAks 169.14 und 169.31 für die mitogene PDGF-AA-Aktivität wie durch eine Abnahme das Levels des [³H)-Thymidin-Einschlusses gezeigt wird.
8 veranschaulicht die Inhibition der mitogenen Pavianserum-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Eine Standardkurve für das Serum allein wird links gezeigt. Die Ergebnisse werden als der durchschnittliche Level des [³H]-Thymidin-Einschlusses dargestellt. Die Standardabweichung wird durch das T oben auf jedem Balken gezeigt.
9 veranschaulicht die mitogene Aktivität von Pavianserum in der Gegenwart von monoklonalem anti-PDGF-alpha-Rezeptor-Antikörper 169.31 auf glatten Pavianmuskelzellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben bemerkt, ist die Restenose von Blutgefäßen ein häufiges Problem bei Patienten, bei denen eine Angioplastie, Endarteriektomie oder eine Bypasstransplantation durchgeführt wurde. Die Restenose ist ein Beispiel intimaler Hyperplasie, von der man glaubt, dass sie über einen Vorgang voranschreitet, der sowohl Proliferation (Mitose) und Migration glatter Gefäßmuskelzellen in den Bereich, der durch den operativen Eingriff geschädigt wurde, wie auch die Produktion (Ablagerung) extrazellulärer Matrix mit einschließt. Siehe im Allgemeinen (Harker, Am. J. Cardiol. 60: 20B–28B, 1987; DeFeudis, Drug News and Perspectives 5: 49–51, 1992). Dieser proliferative Vorgang manifestiert sich auch in dem Verschluss von Gefäßtransplantaten (sowohl natürlicher, einschließlich autologer und allogener wie auch synthetischer) und bei transplantierten Organen. Dieser proliferative Vorgang resultiert in der Entwicklung von Läsionen, die reich an glatten Muskelzellen sind, und wird hier als intimale Hyperplasie bezeichnet.
Medikamente gemäß der Erfindung können verwendet werden, um die Entwicklung SMC-reicher Läsionen durch die Verwendung von Antikörpern gegen PDGF-Rezeptoren und durch die Verwendung anderer PDGF-Antagonisten, insbesondere nicht-peptidischer PDGF-Antagonisten zu inhibieren. Die Bezeichnung "nicht-peptidisch" bezieht sich auf andere Verbindungen als Proteine oder andere peptidge bundene Multimere. Solche Läsionen resultieren in der partiellen oder vollständigen Blockierung eines Blutgefäßes durch intimate Verdickung (Hyperplasie). Es wird verstanden werden, dass die Inhibition der intimalen Hyperplasie die Beeinträchtigung des proliferativen Prozesses durch Reduktion oder Verhinderung eines oder mehrere hyperplastischer Prozesse einschließlich Zellmigration, Zellproliferation und der Bildung extrazellulärer Matrix mit einschließt. Durch die Blockierung der Proliferation und/oder Migration durch Störung der Wechselwirkung von PDGF und seinen Rezeptoren, kann die SMC-Proliferation und darauf folgende Matrixablagerung vermindert werden. Eine Reduktion der intimalen Hyperplasie manifestiert sich klinisch als eine signifikante Abnahme des Verlustes an Lumenvolumen nach akuter Gefäßverletzung. Solch eine Reduktion wird im Allgemeinen in einem verminderten Bedarf an Revaskularisierungseingriffen (z. B. wiederholten Angioplastien) an dem Ort der anfänglichen Verletzung resultieren.
Medikamente der vorliegenden Erfindung können besonders nützlich bei der Behandlung intimaler Hyperplasie aufgrund akuter Gefäßverletzung sein. Akute Gefäßverletzungen sind solche, die schnell auftreten (sprich über Tage bis Monate), im Gegensatz zu chronischen Gefäßverletzungen (z. B. Atherosklerose), die sich im Verlauf eines Lebens entwickeln. Akute Gefäßverletzungen resultieren häufig aus operativen Eingriffen wie Gefäßwiederherstellung, wobei die Techniken der Angioplastie, Endarteriektomie, Arteriektomie, Einbringen von Gefäßtransplantaten oder dergleichen angewendet werden. Hyperplasie kann auch als verzögerte Antwort in Antwort auf z. B. Einbringen eines Transplantates oder Organtransplantation auftreten.
Die vorliegende Erfindung verwendet PDGF-Antagonisten, um intimate Hyperplasie in dem Gefäßsystem eines Säugetieres zu inhibieren. PDGF-Antagonisten werden vorteilhaft in Kombination mit Heparin verwendet. PDGF-Antagonisten, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, schließen nicht-peptidische PDGF-Antagonisten und peptidische PDGF-Antagonisten wie anti-PDGF-Rezeptorantikörper mit ein.
Eine besonders vorzuziehende Gruppe nicht-peptidischer PDGF-Antagonisten beinhaltet Brefeldin A (1,6,7,8,9,11a,12,13,14,14a-Decahydro-1,13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-on) und Derivate davon. Brefeldin A besitzt die Struktur:
Es wurde herausgefunden, dass Brefeldin A die mitogene PDGF-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen inhibiert, wobei diese Aktivität in der Gegenwart von Heparin verstärkt wird.
Antikörper, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, können durch konventionelle Verfahren der Immunisierung und Reinigung hergestellt werden. Kurz gefasst wird ein PDGF-Rezeptor, Rezeptorfragment oder Fusionsprotein, das ein Rezeptorpolypeptid umfasst, vorzugsweise gereinigt, einem Tier wie einer Maus, Ratte, einem Kaninchen oder einer Ziege in einer Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen, verabreicht. Es wird vorgezogen, den Wachstumsfaktorrezeptor kombiniert mit einem Adjuvans, wie dem Freund-Adjuvans, zu verabreichen, um die Immunantwort zu verstärken. Obwohl eine einzige Injektion des Antigens ausreichen kann, um die Antikörperproduktion bei dem Tier zu induzieren, wird es im Allgemeinen vorgezogen, eine große anfängliche Injektion, gefolgt von ein oder mehreren Auffrischungsinjektionen über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis mehreren Monaten zu verabreichen. Siehe z. B. Hurrell, J. G. R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1982, welches hier durch Verweis eingeschlossen ist. Es wird dann Blut von dem Tier abgenommen und man lässt es gerinnen, und Antikörper werden unter Verwendung konventioneller Techniken wie Salzpräzipitation, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Hochleistungsflüssigchromatographie aus dem Serum isoliert.
Bei einer Ausführungsart der Erfindung werden monoklonale Antikörper verwendet. Monoklonale Antikörper liefern die Vorteile der Leichtigkeit der Herstellung und geringerer therapeutischer Dosen im Vergleich zu polyklonalen Antiseren, da nur Antikörper der gewünschten Spezifität verwendet werden. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden zum Beispiel durch Kohler und Milstein Nature 256: 495, 1975; Eur. J. Immunol. 6: 511–519, 1976) offenbart. Siehe auch Hurrell, J. G. R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1982 und Hart, US-Patent Nr. 5,094,941. Von Fachleuten auf dem Gebiet wird erkannt werden, dass auch Antikörperfragmente, wie Fab-Fragmente, verwendet werden können.
Es wird im Allgemeinen vorgezogen, Antikörper zu verwenden, die mit dem Patienten syngenetisch sind, oder die syngenetische konstante Regionen enthalten. Aus diesem Grund werden im Allgemeinen genetisch hergestellte Antikörper, die menschliche Gerüststrukturen enthalten, bei der Behandlung von Menschen verwendet werden. Verfahren zur Herstellung rekombinanter menschlicher Antikörper oder humanisierter nicht-menschlicher (sprich chimärer) Antikörper werden durch Cabilly et al. (US-Patent Nr. 4,816,567), Robinson et al. (WO 87/02671) und Neumaier (WO 90/00616) offenbart. Kurzgefasst werden menschliche konstante Regiongene mit geeigneten menschlichen oder nicht-menschlichen variablen Regiongenen vereinigt. Zum Beispiel werden die Aminosäuresequenzen, die die Antigen-Bindungsstellen (CDRs oder komplimentaritätsbestimmende Regionen) des monoklonalen Maus-Eltern-Antikörpers darstellen, auf dem DNA-Level auf menschliche variable Regiongerüstsequenzen transplantiert. Dieses Verfahren ist als "Humanisierung" bekannt. Verfahren für diese Technik sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel durch Jones et al. (Nature 326: 522–525, 1986), Riechmann et al. (Nature 322: 323–327, 1988) und Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033, 1989) offenbart.
Die vereinigten Gene werden dann in Wirtszellen, die gemäß konventionellen Verfahren kultiviert werden, transfiziert. Alternativ werden monoklonalen Antikörper produzierende Zellen mit geklonten menschlichen konstanten Regiongenen transfiziert und chimäre Antikörpergene werden durch homologe Rekombination hergestellt. So ist es möglich, monoklonale Antikörper, bei denen ein wesentlicher Anteil der Struktur menschlich ist, zusammenzubauen, wodurch Antikörper bereitgestellt werden, die für vielfache Anwendungen bei menschlichen Patienten besser geeignet sind.
Alternativ kann ein einkettiger Antikörper durch die Expression eines rekombinanten Polypeptids, das im Allgemeinen aus einer variablen leichten Ketten-Sequenz, die typischerweise über ein Linkerpolypeptid mit einer variablen schweren Ketten-Sequenz verbunden ist, besteht, entwickelt werden. Verfahren zur Herstellung von einkettigen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel durch Davis et al. (BioTechnology 9: 165–169, 1991) offenbart.
Es wurden zwei PDGF-Rezeptorpolypeptide beschrieben. Diese werden als "alpha-Rezeptor" (Kelly et al., WO 90/14425; Kelly et al., US-Patent Nr. 5,371,205; Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4917–4921, 1989) und "beta-Rezeptor" (Claesson-Welsh et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3476–3486, 1988; Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988) bezeichnet. In der Gegenwart des PDGF-Liganden dimerisieren die Rezeptorpolypeptide. So sind drei Rezeptorsubtypen möglich: αα, αβ und ββ. Der β-Rezeptor ist spezifisch für die B-Kette von PDGF, während der α-Rezeptor die A-Kette und die B-Kette bindet. Daraus folgt, dass die wachstumsregulierende Reaktionsbereitschaft von Zellen gegenüber PDGF nicht nur von der Verfügbarkeit von PDGF-AA, -AB und -BB-Ligandisoformen abhängt, sondern auch von der Expression und Verfügbarkeit verschiedener PDGF-Rezeptorsubtypen (Heldin et al., Cell. Regul. 1: 555–566, 1990). Menschliche glatte Muskelzellen exprimieren sowohl α- wie auch β-Rezeptorsubtypen (Heldin et al., Cell Regul. 1: 555–566, 1990), aber es sind andere Zelltypen bekannt, die nur einen einzelnen Rezeptorsubtyp exprimieren (Gronwald et al., J. Biol. Chem. 264: 8120–8125, 1989).
Die anti-PDGF-Rezeptorantikörper, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise eine Gruppe von Antikörpern, die in der Lage sind, alle drei PDGF-Rezeptorisoformen (αα, ββ und αβ) zu inhibieren. Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Gruppe" eine Kombination aus zwei oder mehr Antikörpern mit verschiedenen Spezifitäten. Die Antikörper können spezifisch für verschiedene Antigene oder für verschiedene Epitope auf einem einzelnen Antigen sein. Monoklonale Antikörper (MAks) werden vorgezogen.
Wie oben bemerkt, beeinträchtigen die Antikörper, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Wechselwirkung von PDGF und seinen Rezeptoren. In vorzuziehenden Ausführungsarten der Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper verwendet, die die Bindung eines PDGF-Liganden an einen PDGF-Rezeptor inhibieren, obwohl Fachleute auf dem Gebiet erkennen werden, dass die Vorteile der Erfindung auch verwirklicht werden können, wenn Antikörper verwendet werden, die andere Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen, wie Rezeptordimerisation inhibieren.
Monoklonale anti-Rezeptorantikörper können auch als Zielstoffe für die Abgabe von Verbindungen von therapeutischem Interesse verwendet werden. Solche Verbindungen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Toxine, zytostatische Verbindungen oder Proenzyme, deren mögliche Funktion es sein kann, endogene Proenzyme zu aktivieren, Proenzyme die von exogenen Quellen zugegeben werden zu aktivieren oder Enzymspaltungsorte auf Prodrugs zu aktivieren. Anti-Rezeptorantikörper können auch mit Radionukleotiden, Färbungen, fluoreszierenden Verbindungen oder dergleichen zur Verwendung als bildgebende Wirkstoffe markiert werden. Beispiele dafür beinhalten die Darstellung von Thromboseorten oder Orten von Gefäßverletzung, bei denen eine Freilegung, zum Beispiel von vaskulären. glatten Muskelzellen, die Zelloberflächenrezeptoren exprimieren, vorliegt.
Monoklonale Antikörper können auch verwendet werden, um bifunktionelle Antikörper zu entwickeln, bei denen es zwei unabhängige antigene Bindungsstellen auf jedem Immunglobulinmolekül gibt. Diese Technologie ist auf dem Fachgebiet bekannt und wurde in der Literatur offenbart (Thromb. Res. Suppl. X: 83, 1990). Zusätzlich können bispezifische Antikörper aus einkettigen Antikörpern aufgebaut werden. Diese Technologie ist auf dem Fachgebiet bekannt und wurde zum Beispiel durch A. George (The Second Annual IBC International Conference on Antibody Engineering, Dez. 16–18, 1991, San Diego CA) offenbart.
Antikörper, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind in der Lage, eine signifikante Menge der biologischen Aktivität eines Antigens in einem in vitro-Testsystem zu blockieren, zum Beispiel die Fähigkeit, die Wechselwirkung eines oder mehrerer PDGF-Liganden mit PDGF-Rezeptoren) zu blockieren. Geeignete in vitro-Testsysteme beinhalten unter anderem Mitogenese-Assays und Rezeptorbindungs-Assays. Zum Beispiel sind 25 μg/ml eines monoklonalen anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk, der hier beschrieben wird, in der Lage, die mitogene Aktivität von 10 ng/ml PDGF-AA zu blockieren. Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass die Menge des Antikörpers, die notwendig ist, um die Aktivität einer gegebenen Menge eines Antigens zu inhibieren, von solchen Faktoren wie Antikörper-Spezifität und -Affinität abhängt. Es wird vorgezogen, nicht 100% der mitogenen Serumaktivität zu blockieren, so dass nicht die gesamte Wundheilungsantwort unterdrückt wird. Antikörperdosierungen werden wie unten beschrieben berechnet, wobei Affinität und spezifische Aktivität beachtet werden.
Eine "antihyperplastisch effektive Menge" eines anti-PDGF-Rezeptorantikörpers oder anderen PDGF-Antagonisten wird als eine Menge, die ausreicht, um messbar die intimale Hyperplasie in einem Blutgefäß, einem Gefäßtransplantat oder einem vaskulären Bestandteil eines transplantierten Organs zu reduzieren oder zu verhindern, definiert. Konkreter wird die "Inhibition intimaler Hyperplasie" hier so definiert, dass sie jede messbare Inhibition von einem oder mehreren der intimalen hyperplastischen Prozesse, die in dem Fachgebiet als glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC)-Migration, VSMC-Proliferation und neointimale Ablagerung von extrazellulärer Matrix beschrieben werden, einschließt. In diesem Zusammenhang kann die Reduktion oder Verhinderung intimaler Hyperplasie oder eines hyperplastischen Prozesses, der an der intimalen Hyperplasie beteiligt ist, einfach unter Verwendung von in vitro-, in vivo- und ex vivo-Assaysystemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, insbesondere auf Primaten basierende Assaysysteme (z. B. nicht-menschliche oder menschliche Primaten-VSMC-Kulturen oder vaskuläre Gewebeexplantate oder nicht-menschliche Primaten-in vivo-Tests) bewertet werden. Bei der Interpretation von in vitro-Dosierungsdaten wird man anerkennen, dass verschiedene Testzellen und -gewebe verschiedene Level und/oder Typen von PDGF-Rezeptoren exprimieren können. Zusätzlich wird man erkennen, dass die Zellkulturpassagezahl (sprich die Anzahl von Zellgenerationen, die nach der Dissoziation oder dem Herauswachsen von VSMCs von oder aus einer vaskulären Gewebequelle vergeht) möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf die mitogenen und anderen wachstumsbezogenen Aktivitäten, die in experimentellen Systemen beobachtet werden, besitzt. Ähnlich muss eine Anzahl von Variablen bei der Extrapolation von in vivo-Daten aus nicht-menschlichen Systemen beachtet werden, um die antihyperplastische Effekti vität von Antikörpern bei Menschen zu schätzen. Insbesondere ist es wichtig, alle Unterschiede in der Natur und Schwere von Blutgefäßverletzungen zwischen experimentellen und klinischen Systemen in Betracht zu ziehen, um bei der Bestimmung tatsächlicher Behandlungsprotokolle für Menschen die Modelldaten am besten zu verwerten. Ebenso müssen Unterschiede zwischen den Arten bei der vaskulären Anatomie und Histologie und intrinsische Unterschiede bei den hyperplastischen Prozessen, die durch verschiedene Arten von Gefäßverletzungen hervorgerufen werden, abgewogen werden, wenn man zwischen Modell und klinischen Anwendungen extrapoliert. Nichtsdestoweniger liefern die Assays und Verfahren, die hier beschrieben werden, einschließlich der in vitro- und in vivo-Studien unter Verwendung nicht-menschlicher und menschlicher Primatenmodellsysteme, die gesamte notwendige Anleitung, gekoppelt mit bekannten Techniken einschließlich standardisiertem klinischem Versuchsvorgehen, um erfolgreich Behandlungsprotokolle für intimale Hyperplasie bei Säugetierpatienten einschließlich Menschen zu bestimmen.
Es wird vorgezogen, dass die antihyperplastisch effektive Menge eines Antikörpers oder eines anderen Antagonisten signifikant die Proliferation (z. B. wie in einem in vitro-Mitogenese-Assay bestimmt) und/oder die Migration glatter Gefäßmuskelzellen inhibiert. Eine "signifikante" Reduktion ist eine Reduktion der Mitogenese oder Migration von 50% oder mehr in einem in vitro-Assay. Während die tatsächliche Menge teilweise von solchen Faktoren wie der Spezifität und der Bindungsaffinität eines bestimmten Antikörpers abhängt, kann eine effektive Menge empirisch durch in vitro- und ex vivo-Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und hier offenbart werden, bestimmt werden. Im Allgemeinen werden Mengen von PDGF-Antagonist zur therapeutischen Verwendung ausreichend sein, um eine Konzentration in der Blutbahn oder am Wirkort bereitzustellen, die mindestens derjenigen gleich ist, die gezeigt hat, dass sie in vitro oder ex vivo effektiv ist. Es wird jedoch vorgezogen, in vivo höhere Mengen bis zu oder über die Zunahme um eine Größenordnung hinaus zu verwenden. So wird in Modellsystemen die anti-PDGF-Rezeptorantikörperdosierung mit dem Ziel temporär oder anhaltend, lokale oder systemische Level des Antikörpers in dem behandelten Säugetier bereitzustellen, die zu Antikörperkonzentrationen, die gezeigt haben, dass sie in geeigneten in vitro-Tests antihyperplastisch effektiv sind, korrespondieren, ausgewählt.
Von besonderem Interesse für die in vivo-Testung ist ein Pavian-Gefäßverletzungmodell, das hier detailliert offenbart wird. Dieses Modell wurde entwickelt, um die Verletzungsantwort, die bei Menschen nach verschiedenen Typen von Akutbehandlungen, um verschlossene Arterien zu öffnen, auftritt, zu imitieren. Die Verwendung von Ballonangioplastie für das Hervorrufen einer vaskulären Läsion imitiert einen Eingriff, der häufig verwendet wird, um den Blutfluss in stenosierten Koronararte rien wiederherzustellen und die zur Restenose bei 30–40% der behandelten Personen führt. Dieses Modell ist daher zur Testung der Verwendung von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern oder anderen PDGF-Antagonisten allein oder in Verbindung mit Heparin besonders gut geeignet.
Ein anderes geeignetes Modell zur Testung der Effizienz der PDGF-Antagonistentherapie ist ein Pavianmodell der Carotisendarteriektomie. Bei diesem Modell wird eine akute Verletzung im medialen Bereich der Arterie verursacht, was im Folgenden zur Entwicklung einer intimalen Läsion führt (Hanson et al., Hypertension 18: I170–I176, 1991). Dieses Modell imitiert die Verwendung der Carotisendarteriektomie, um Carotisarterien bei Menschen zu öffnen, die aufgrund einer fortgeschrittenen Atherosklerose einen verminderten Blutfluss aufweisen. Ein drittes Modell zur Testung der Verwendung der PDGF-Antagonistentherapie ist ein Gefäßtransplantat-Einbringungsmodell beim Pavian. Es wurde gezeigt, dass die Platzierung von Gefäßtransplantaten zu der Bildung hyperplastischer Läsionen an dem Ort des Transplantates führt (Kraiss et al., J. Clin. Invest. 92: 338–348, 1993). Diese Läsionen weisen Charakteristiken auf, die denjenigen hyperplastischer Läsionen bei Menschen an Orten von Gefäßverletzungen gleichen.
Um die Effizienz der PDGF-Antagonistentherapie bei Menschen zu testen, können verschiedene Typen der Analyse verwendet werden. Diese beinhalten die Überwachung auf eine Abnahme des mittleren Lumendurchmessers (MLD) durch Angiographie in dem 3–6 Monatszeitraum, der einer vaskulären Behandlung folgt. Alternative Verfahren zur Überwachung der Effizienz beinhalten intravaskulären Ultraschall, B-Mode-Ultraschall und Magnetresonanztomographie. Es können auch klinische Korrelate verwendet werden, um die Effizienz der anti-PDGF-Rezeptorantikörperbehandlung zu überwachen. Diese beinhalten eine Abnahme an Myokardinfarkten und wiederkehrender Angina und der Notwendigkeit wiederholter Revaskularisierungen.
Antikörperdosierungsspiegel werden aus den Inhibitionsdaten nach Bestimmung der Clearance von Antikörper aus dem Blut berechnet. Im Allgemeinen wird die Dosierung mit dem Ziel der Erhaltung zirkulierender Spiegel von Antikörper, die ausreichen, um mehr als 10%, vorzugsweise wenigstens 20–50% der zirkulierenden PDGF-Aktivität zu inhibieren (z. B. Rezeptorligandbindung, PDGF- oder serumstimulierte Mitogenese und/oder Migration von VSMCs oder eine andere biologische Aktivität, die mit der PDGF-Rezeptorfunktion und/oder Regulation eines intimalen hyperplastischen Prozesses korreliert) ausgewählt. Im Allgemeinen liegen die Dosierungen in dem Bereich von ungefähr 0,1 μg bis 500 mg oder mehr Antikörper pro kg des Körpergewichts des Patienten pro Tag, vorzugsweise bei ungefähr 20 μg bis 20 mg/kg/Tag, mehr vorzuziehen bei ungefähr 1 mg bis 10 mg/kg/Tag. Wie oben bemerkt, wird die tatsächliche Dosierung teilweise von der Antikörperaffinität und -aktivität abhängen. Etwas höhere Dosierungen können erforderlich sein, wenn zwei oder mehr Antikörper kombiniert verabreicht werden, als wenn ein einzelner Antikörper verwendet wird. Um die Antikörperherstellungskosten zu minimieren und die Immunintoleranz der verabreichten Antikörper durch den Patienten zu begrenzen, wird es vorgezogen, Antikörper hoher Affinität mit einer hohen spezifischen inhibitorischen Aktivität zu verwenden, wodurch die Verwendung von Dosierungen von ungefähr 1 mg/kg/Tag oder weniger ermöglicht wird. Dosierungen von nicht-Antikörper-PDGF-Antagonisten können unter Verwendung ähnlicher Kriterien bestimmt werden.
Bei mit anti-PDGF-Rezeptor-Antikörpertherapie kombiniert mit Heparin behandelten Menschen kann der Antikörper innerhalb eines großen Bereiches von Bedingungen gegeben werden. Der Antikörper kann per Bolusinjektionen sowohl vor dem Revaskularisierungseingriff wie auch viele Male nach dem Eingriff gegeben werden. Der Antikörper kann als eine Bolusinjektion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan) vor dem Eingriff (im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden vor der Operation) und als eine konstante Infusion nach dem Eingriff (einschließlich der Infusion über implantierte Pumpen) gegeben werden. In vielen Fällen wird es vorzuziehen sein, während eines Krankenhausaufenthaltes tägliche Dosen zu verabreichen (einschließlich Verabreichung per Infusion) gefolgt von weniger häufigen Bolusinjektionen während eines Zeitraumes der ambulanten Behandlung von einer bis zwei Wochen oder mehr. Die Behandlung kann bis zu sechs Monate nach der anfänglichen Verletzung fortgeführt werden. Der Antikörper kann auf vielen verschiedenen Wegen einschließlich intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Injektionen gegeben werden. Zusätzlich kann der Antikörper lokal an die Stelle der Gefäßverletzung unter Verwendung von Perfusionsballonkathetern, Beschichtung auf Stents oder Platzierung auf Gel-beschichtete Ballons, abgegeben werden. In den letzteren Fällen würde erwartet werden, dass die Dosen des Antikörpers wesentlich geringer sind als diejenigen, die erforderlich sind, wenn er systemisch gegeben wird. Die Antikörper können auch durch Abgabesysteme mit verzögerter Freisetzung abgegeben werden, einschließlich solcher Systeme, die in Gefäßtransplantaten oder Stents eingeschlossen sind, oder auf dem Weg von Perfusions- oder Doppelballonkathetern. Zur Inhibition der Stenose in Gefäßtransplantaten können anti-PDGF-Rezeptorantikörper kovalent an das Transplantat durch ihre konstanten Regionen angeheftet oder in das Transplantat in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen werden. Pumpen und andere bekannte Abgabesysteme können auch verwendet werden. In jedem Fall ist die Verabreichung so angelegt, dass sie die gewünschte tägliche Dosierung bereitstellt (z. B. einen fünftägigen Bolus von 25 mg/kg, um 5 mg/kg/Tag bereitzustellen). Die Art und der Zeitplan der Verabreichung anderer PDGF-Antagonisten kann aus den chemischen und physikalischen Eigenschaften des spezifischen Antagonisten und den pharmakokinetischen Daten gemäß den akzeptierten Prinzipien bestimmt werden.
Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper zu injizierbaren Zusammensetzungen gemäß konventionellen Vorgehensweisen formuliert und in sterile Behälter verpackt. Die Antikörper können mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie steriler Kochsalzlösung oder sterilem Wasser verbunden werden. Die Antikörperzusammensetzungen können weiter Trägerstoffe, Stabilisatoren und Arzneiträger wie Zucker (z. B. Mannitol) oder Albumin enthalten. Alternativ können die Antikörper in lyophilisierter Form bereitgestellt und vor der Verwendung in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden. Diese Zusammensetzungen können in einzelnen oder vielfachen Dosierungsformen verpackt werden, zum Beispiel in versiegelten Ampullen oder Phiolen. Nicht-peptidische PDGF-Antagonisten können parenteral oder enteral (z. B. oral) verabreicht werden.
Medikamente der Erfindung, die einen anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder einen nicht-Antikörper-PDGF-Antagonisten umfassen, können einem Säugetier koordiniert mit Heparin jeweils in Einheitsdosierungen von Antikörper/Antagonist und Heparin, die ausreichen, um kombiniert die intimate Hyperplasie in dem Gefäßsystem des Säugetieres zu inhibieren, verabreicht werden. In diesem Zusammenhang soll "koordinierte Verabreichung" gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verabreichung des Antikörper/Antagonisten und Heparin einschließen, wobei sowohl der Antikörper/Antagonist wie auch Heparin innerhalb eines begrenzten, kombiniert effektiven Zeitraumes in Abhängigkeit voneinander verabreicht werden. Ein "kombiniert effektiver Zeitraum" wird als der maximale dazwischenliegende Zeitraum zwischen der Verabreichung des Antikörper/Antagonisten und der Verabreichung des Heparins, in dem die beiden Wirkstoffe kombiniert effektiv bei der Inhibition der Hyperplasie sind, definiert. Die Bezeichnung „kombiniert effektiv" wird wiederum als das Hervorrufen einer messbaren Inhibition der intimalen Verdickung oder der Bildung einer Läsion oder eines hyperplastischen Prozesses definiert, die einen maximalen Level der Inhibition übersteigt, der unabhängig entweder von dem Antikörper/Antagonisten oder Heparin bereitgestellt wird, wenn diese unter ansonsten vergleichbaren Bedingungen und Dosierung alleine verabreicht werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Heparin" auf jedes Mitglied einer Familie von strukturell komplexen, sulfierten Glycosaminoglycanen, die im Allgemeinen durch eine Struktur wiederholter Glucosamine und Glucuronsäurezuckerresten charakterisiert werden (Casu, Adv. Carbohyd. Chem. and Biochem. 47: 578–583, 1985). Das am weitesten bekannte Heparin ist "unfraktioniertes" oder "kommerzielles" Heparin, das aus Rinderlunge oder Schweinedarm hergestellt wird, das eine heterogene Mischung aus Heparinmolekülen umfasst, die in einem Molekulargewichtsbereich von ungefähr 8000 bis 20000 Dalton liegen (Wolinsky et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Die Bezeichnung Heparin umfasst jedoch auch einen weiten Bereich homogenerer Heparinpräparate, wie auch heparinähnliche Moleküle einschließlich Heparansulfaten. Unter diesen besonderen Heparinbeispielen sind auch spezifischere Heparinsubtypen bekannt. Zum Beispiel wurden Heparansulfatanteile, die durch endotheliale Zellen (Castellot et al., J. Cell. Biol. 90: 372–379, 1981) und glatte Muskelzellen (Fritze et al., J. Cell. Biol. 100: 1041–1049, 1985) hergestellt werden, isoliert, die Berichten zufolge bei der Inhibition der Proliferation glatter Muskelzellen bis zu 40 mal stärker aktiv sind als unfraktioniertes Heparin. Zusätzlich wurden unter den natürlich auftretenden Heparingrößenvarianten fraktionierte Heparinarten isoliert, die hauptsächlich entweder antikoagulatorische oder antiproliferative Aktivität aufweisen (Wolinsky et al., J. am. Coll. Cardiol. 15: 475–481, 1990). Die letztere Aktivität tendiert dazu, bei den niedermolekularen Heparinarten vorzuliegen, wie in Heparin in dem Bereich von Penta- oder Decasacchariden, über die berichtet wurde, dass sie auch eine größere Bioverfügbarkeit und eine längere Halbwertszeit bereitstellen (Id., Bacher et al., Thrombosis Res. 70: 295–306, 1993) und die daher besonders nützlich bei spezifischen Ausführungsarten der Erfindung sein können. Ebenfalls eingeschlossen in die Definition von Heparin für die Zwecke der Beschreibung der Erfindung werden synthetische Heparine und Heparinderivate, von denen eine Vielzahl unter Verwendung konventioneller chemisch synthetischer, modifizierender und degradativer Techniken hergestellt wurden (siehe zum Beispiel Roden, L. The biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.) Seiten 267–371, Plenum Publishing Corp., New York, 1980, durch Hinweis hier eingeschlossen). Die Bezeichnung "niedermolekulares Heparin mit reduzierter antithrombotischer Aktivität" wird verwendet, um niedermolekulare Formen mit reduzierter antithrombotischer Aktivität (wie durch Standard-Assays bestimmt) im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin anzuzeigen.
Um kombiniert effektive Dosen von Antikörper/Antagonist und Heparin zu bestimmen und/oder um kombiniert effektive Zeiträume für die getrennte oder sequentielle Verabreichung eines PDGF-Antagonisten und Heparin zu bewerten, werden die gleichen allgemeinen Verfahren, die oben für die Analyse antihyperplastischer Aktivität der anti-PDGF-Rezeptorantikörper und für die Extrapolation zwischen experimentellen und klinischen Anwendungen beschrieben wurden, verwendet. Diese Verfahren beinhalten unter anderen Mitogenese- und Migrations-Assays, die VSMC-Zellkulturen oder Gefäßgewebeexplantate verwenden, wie auch eine Vielzahl von in vivo-Assays, die das Auftreten oder den Grad der intimalen Hyperplasie in einem lebenden Subjekt messen.
Von diesen Verfahren wird entweder gezeigt oder erwartet, dass der Level der kombinierten Inhibition, der durch die koordinierte Verabreichung von Antikörper oder anderem Antagonisten und Heparin erreicht wird, abhängig von den jeweiligen Typen und Dosierungen des verwendeten Antagonisten und Heparins, von dem Zeitplan und der Art der Verabreichung des Antagonisten und Heparins, und von anderen experimentell und klinisch relevanten Variablen wie dem behandelten Typ der Zellen oder der Gewebe oder der Natur und der Schwere einer Blutgefäßverletzung variiert. Durch Einstellung des koordinierten Verabreichungsregimes (z. B. Heparin- und Antagonisttypen, Dosierungen und Art oder Zeitplan der Verabreichung) innerhalb der Verfahren der Erfindung, kann die kombinierte Inhibition intimaler Hyperplasie optimiert werden, um einen großen Bereich spezifischer Anwendungen der Erfindung zu erleichtern. Zum Beispiel können für verschiedene klinische Anwendungen verschiedene Antikörper- und Heparintypen und Dosierungen erwünscht sein. Für Patienten mit einem hohen Risiko für mit Thrombose zusammen hängenden Komplikationen, können antikoagulatorische Formen von Heparin klinisch erwünscht sein. Andere Patienten können besonders anfällig für Blutungskomplikationen, die mit der Verwendung antikoagulatorischer Formen von Heparin zusammenhängen, sein, in welchem Fall ein niedermolekulares Heparin mit reduzierter antithrombotischer Aktivität indiziert sein kann. Diese und andere klinische Überlegungen werden Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein.
Um die Wahl eines bestimmten Heparintyps oder Dosierung zu erleichtern, erlauben die Verfahren der Erfindung eine Mitveränderung der Form des Zeitplanes oder der Dosierung des Antikörpers oder des anderen Antagonisten, der koordiniert verabreicht werden soll, so dass das Verabreichungsregime für den Antikörper oder anderen Antagonisten koordiniert eingestellt werden kann, um einen hohen Level kombinierter Inhibition zu erhalten. Unter anderen Umständen kann die Form oder Dosierung des Antagonisten oder der Zeitplan oder die Art der Verabreichung des Antagonisten durch äußere Umstände festgelegt werden, in welchem Fall es nötig sein kann, das Heparinverabreichungsregime koordiniert einzustellen. Zum Beispiel können unter Umständen, bei denen ein anhaltendes Antikörperbehandlungsregime erwünscht ist, niedrigere Antikörperdosierungen oder weniger immunogene Antikörperformen (z. B. Maus/Mensch-chimäre Antikörper) verwendet werden, um die Ergebnisse zu optimieren. In solchen Fällen kann eine koordinierte Einstellung hinsichtlich des Typs der Dosierung oder des Zeitplanes des verabreichten Heparins durchgeführt werden, um einen starken kombinierten antihyperplastischen Effekt zu erreichen.
Gemäß der Erfindung können insbesondere Dosierungen des Antikörpers oder des anderen Antagonisten und Heparins koordiniert über einen weiten Bereich variiert werden, während ein hoher Level an kombinierter Inhibition der intimalen Hyperplasie erhalten bleibt. Diese Eigenschaft der Erfindung ist besonders nützlich bei der Anpassung an klinische Anwendungen, bei denen eine niedrige Dosis von dem einen oder dem anderen antihyperplastischen Wirkstoff (sprich des Antagonisten oder Heparin) erwünscht ist, wie in Fällen, bei denen Dosis-limitierende Toxizitäten, Allergien oder andere Komplikationen vorliegen. Bei den Verfahren der Erfindung wurde gefunden, dass koordiniert verabreichte anti-PDGF-Rezeptorantikörper und Heparin kombiniert effektiv in einem Antikörper : Heparin-Dosierungsverhältnis (sprich Verhältnis der Antikörpereinheitsdosis zur Heparineinheitsdosis, bezogen auf das Gewicht), das zwischen 0,001 : 1 bis 1000 : 1 und weiter liegt, sind. In anderen Worten ergibt eine Einheitsdosis von Antikörper, die so niedrig wie 1/1000 einer Dosis eines koordiniert verabreichten Heparins liegt, einen kombinierten inhibitorischen Effekt, während Antikörperdosen, die 1000-fach größer sind als die Dosis eines koordiniert verabreichten Heparins, ebenfalls einen kombinierten Effekt ergeben. Diese im Allgemeinen umgekehrt proportionale Kovariabilität von Antikörper- und Heparindosierungen stellte eine extreme Flexibilität für die Umsetzung alternativer koordinierter Verabreichungsregime unter Verwendung der zwei antihyperplastischen Wirkstoffe bereit. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass weniger extreme Mitveränderung von Antikörper und Heparindosierungen, verkörpert in Antikörper : Heparin-Dosierungsverhältnissen zwischen 0,01 : 1 und 100 : 1 und zwischen 0,05 : 1 und 20 : 1, auch kombiniert effektiv sind und sie werden vorzugsweise unter Umständen ausgewählt, bei denen gemäßigte bis extrem niedrige Dosierungen von sowohl dem Antikörper wie auch Heparin klinisch erwünscht sind.
Im Allgemeinen liegen Dosierungen von Antikörper, der koordiniert mit Heparin zur Behandlung intimaler Hyperplasie bei Säugetieren verabreicht werden soll, innerhalb des Bereiches von ungefähr 0,1 μg bis 100 mg an Antikörper pro Kilogramm Körpergewicht des Säugetieres pro Tag. Vorzugsweise liegen die Dosierungen zwischen ungefähr 50 μg bis 20 mg Antikörper pro Kilogramm pro Tag, und mehr vorzuziehen bei weniger als 1 mg/kg/Tag, um teure Antikörpervorräte zu erhalten und Nebenwirkungen zu begrenzen, während sie befriedigende Inhibitionslevel ergeben. Im Allgemeinen liegen die Dosierungen von Heparin zwischen ungefähr 1 μg bis 100 mg/kg/Tag. Vorzugsweise liegen die Neparindosierungen zwischen 20 μg bis 10 mg/kg/Tag, und mehr vorzuziehen bei weniger als ungefähr 1 mg/kg/Tag. Konkreter ergeben koordiniert verabreichte Dosierungen von Antikörper und Heparin zwischen ungefähr 0,5 μg bis 10 mg/kg/Tag bzw. zwischen ungefähr 1 μg bis 10 mg/kg/Tag starke kombiniert effektive Ergebnisse bei relativ geringen Dosierungen beider antihyperplastischer Wirkstoffe. Wo noch niedrigere Dosierungen von Antikörper und Heparin erwünscht sind, werden koordiniert verabreichte Mengen an Antikörper und Heparin zwischen ungefähr 5 μg bis 2 mg/kg/Tag bzw. zwischen ungefähr 50 μg bis 1 mg/kg/Tag vorgezogen. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass tatsächliche Dosierungen unter Berücksichtigung spezifischer Umstände einschließlich Patientenparametern und den Eigenschaften des verabreichten Antikörpers (der Antikörper) (z. B. Spezifität, spezifische Aktivität, Halbwertszeit in der Zirkulation) und des Heparins (z. B. antithrombotische Aktivität) bestimmt werden.
Anti-PDGF-Rezeptorantikörper und Heparin werden vorzugsweise parenteral verabreicht, wie z. B. durch Bolusinjektion oder Infusion (intravenös, intramuskulär, intraperitoneal oder subkutan) vor der Operation (im Allgemeinen innerhalb von 24 Stunden vor der Operation) und wahlweise nach der Operation in Intervallen von mehreren Stunden bis mehreren Tagen über den Verlauf von ein bis zwei Wochen oder mehr fortgesetzt. Bei einer Ausführungsart wird der Antikörper als eine Bolusinjektion oder Infusion am ersten Tag der Behandlung in einer Menge, die ausreicht, um einen minimalen Zirkulationsspiegel des Antikörpers durch die anfängliche dreitägige Behandlungsdauer von zwischen ungefähr 20 μg und 1 mg/kg Körpergewicht bereitzustellen, verabreicht. In dieser Hinsicht wird es vorgezogen, Antikörper zu verwenden, die eine Halbwertszeit in der Zirkulation von wenigstens 12 Stunden, vorzugsweise von wenigstens 4 Tagen, mehr vorzuziehen bis zu 14–21 Tagen besitzen. Von chimären und humanisierten Antikörpern wird erwartet, dass sie Halbwertszeiten in der Zirkulation von bis zu 4 bzw. bis zu 14–21 Tagen besitzen. In vielen Fällen wird es vorgezogen, tägliche Dosen während eines Krankenhausaufenthaltes zu verabreichen, gefolgt von weniger häufigen Bolusinjektionen während eines Zeitraumes der ambulanten Behandlung. Diese Antikörper und Heparin können auch durch Abgabesysteme mit verzögerter Freisetzung abgegeben werden, einschließlich solcher Systeme, die in Gefäßtransplantate oder Stents eingeschlossen sind, oder auf dem Wege von Perfusions- oder Doppelballonkathetern. Auch Pumpen oder andere bekannte Abgabesysteme können für die kontinuierliche Infusion verwendet werden. Dosierungsregime können variiert werden, um die erwünschten Zirkulationsspiegel des Antikörpers und des Heparins, basierend auf den pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Wirkstoffe, bereitzustellen. So werden Dosierungen berechnet, so dass die erwünschten Zirkulationsspiegel der therapeutischen Wirkstoffe erhalten werden. Tägliche Dosen, auf die oben Bezug genommen wird, können als größere, weniger häufige Bolusverabreichungen verabreicht werden, um die aufgezählten Dosierungen gemittelt über den Zeitraum der Verabreichung bereitzustellen. Nicht-peptidische PDGF-Antagonisten können enteral verabreicht werden.
Für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung werden anti-PDGF-Rezeptorantikörper, andere PDGF-Antagonisten und Heparin kombiniert oder getrennt zu Zusammensetzungen, die für die parenterale (z. B. intravaskuläre, perivaskuläre oder transdermale), orale oder rektale Verabreichung geeignet sind, gemäß konventionellen Verfahren formuliert und in sterile Behälter verpackt. Die Antagonisten und Heparin können zusammen oder getrennt mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie steriler Kochsalzlösung oder sterilem Wasser verbunden werden. Die Antagonist-, Heparin- und Antagonist/Heparin-Zusammensetzungen können weiter Trägerstoffe, Stabilisatoren und Arzneiträger wie Zucker (z. B. Mannitol) oder Albumin enthalten. Alternativ können die Antagonisten und Heparin in lyophilisierter oder einer anderen stabilen trockenen Form bereitgestellt werden und in einem geeigneten Lösungsmittel (das mit dem Antagonisten und Heparin eingeschlossen sein kann) vor der Verwendung aufgelöst werden. Diese Zusammensetzungen können in einzelner oder mehrfacher Dosierungsform, zum Beispiel in versiegelten Ampullen oder Phiolen, verpackt sein. Für alternative Arten der Verabreichung, wie für die endovaskuläre Verabreichung, um Stenose in Gefäßtransplantaten zu inhibieren, können PDGF-Antagonisten und/oder Heparin in das Transplantat in Formulierungen mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen werden. Anti-PDGF-Rezeptorantikörper können über ihre konstanten Regionen kovalent an das Transplantat gebunden werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung angeboten.
Beispiele
Beispiel 1 offenbart die Herstellung von Hybridomen, die monoklonale Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor-alpha- und -beta-Polypeptide herstellen. Die Beispiele 2, 3 und 4 offenbaren die Identifizierung und Charakterisierung von monoklonalen anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörpern. Beispiel 5 offenbart die Identifizierung und Charakterisierung von monoklonalen anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörpern. Beispiel 6 offenbart die Bestimmung der Bindungsspezifitäten bestimmter repräsentativer monoklonaler Antikörper. Beispiel 7 zeigt die Inhibition von mitogener PDGF-Aktivität auf menschlichen dermalen Fibroblasten unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Beispiel 8 zeigt die Inhibition von mitogener PDGF-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Die Beispiele 9 und 10 offenbaren die Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper, um mitogene Aktivität von Pavianserum zu inhibieren. Beispiel 11 zeigt die Inhibition von aortaler glatter Pavianmuskelzellenmigration durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper. Beispiel 12 zeigt die Fähigkeit von anti-PDGF-Rezeptor-MAks PDGF-Aktivität bis zu acht Stunden, nachdem der Ligand an die Rezeptoren gebunden hat, zu inhibieren. Beispiel 13 offenbart die Verdrängung von Rezeptor-gebundenen PDGF von menschlichen Osteosarkomzellen durch anti-PDGF-Rezeptor-MAks. Beispiel 14 zeigt die Inhibition von PDGF und mitogener Pavianserum-Aktivität auf glatten Gefäßmuskelzellen unter Verwendung von monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, die allein oder koordiniert mit Heparin verabreicht werden. Beispiel 15 offenbart die Verwendung von Heparin, allein oder koordiniert verabreicht mit monoklonalen anti- PDGF-Rezeptorantikörpern, um mitogene Serumaktivität auf glatten Paviangefäßmuskelzellen zu inhibieren. Beispiel 16 offenbart weitere Studien, die die Inhibition von mitogener Serumaktivität auf glatten Pavianmuskelzellen unter Verwendung von monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, die koordiniert mit Heparin verabreicht werden, zeigen. Beispiele 17 und 18 offenbaren Studien, die die antimitotischen Aktivitäten von ElternMaus- und Maus/Mensch-chimären-anti-PDGF-alpha- und -beta-Rezeptorantikörpern, die koordiniert mit Heparin verabreicht werden, vergleichen. Beispiel 19 beschreibt weiter die inhibitorische Aktivität von koordiniert verabreichtem Heparin und anti-PDGF-Rezeptorantikörpern gegen mitogene Serumaktivität. Beispiel 20 zeigt die Inhibition von glatter Muskelzell-Migration aus aortalen Pavianexplantaten durch monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper, die koordiniert mit Heparin verabreicht werden. Die Beispiele 21–23 offenbaren Bindungsstudien von PDGF- und anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, kombiniert mit und in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin, um mögliche Bindungs- oder Aktivitätswechselwirkungen zwischen PDGF und Heparin und den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern und Heparin zu bestimmen. Beispiel 24 beschreibt Studien zur Überwachung der zirkulierenden Spiegel von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern nach kontinuierlicher Infusion der Antikörper in einen Pavian und zur Messung der Pavianantikörper, die gegen die anti-PDGF-Rezeptorantikörper hergestellt werden. Beispiel 25 offenbart Studien, um die in vivo-Halbwertszeit eines chimären anti-PDGF-Rezeptorantikörpers in einem Primatenmodell zu bestimmen. Beispiel 26 beschreibt ein sequentielles arterielles Verletzungsmodell in Pavianen zur Testung antihyperplastischer Wirkstoffe und Behandlungen nach Gefäßverletzung. Beispiel 27 beschreibt ein Pavianmodell, das nützlich bei der Charakterisierung der Rolle von anti-PDGF-Rezeptorantikörpern und Heparin bei der Inhibition intimaler Hyperplasie in Primaten nach akuter Gefäßverletzung ist.
Rekombinante PDGF-AA und -BB wurden in Hefe im Wesentlichen wie in den US-Patenten Nrn. 4,889,919; 4,845,075 und 5,037,743 offenbart wird, hergestellt und bis zur Homogenität aus konzentrierten Zellkulturmedien durch eine Kombination von Kationenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Gelfiltration und (NH₄)₂SO₄-Fraktionierung gereinigt. PDGF-AB wurde aus überalterten menschlichen Thrombozyten hergestellt, wie durch Hart et al. offenbart wird (Biochemistry 29: 166–172, 1991). PDGF-AA, -AB und -BB wurden mit ¹²⁵I unter Verwendung von Iodobeads^TM (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wie zuvor beschrieben (Hart et al., ebenda) markiert. Es wurde eine mutierte Form der B-Kette, genannt BB_tyr, die einen Tyrosinrest an Position 23 der reifen Codierungssequenz anstelle von Phenylalanin aufweist, für die Iodierung von PDGF-BB verwendet. Kaninchen-anti-Maus-IgG und MAk 163.31 wurden ähnlich mit ¹²⁵I unter Verwendung von Iodobeads^TM radiomarkiert.
Es wurden Fusionsproteine, die eine menschliche schwere oder leichte IgG-Kette, die mit der extrazellulären Domäne von entweder dem PDGF-alpha-Rezeptor oder PDGF-beta-Rezeptor verbunden war, umfassten, im Wesentlichen wie im US-Patent Nr. 5,155,027 und EP 325,224 offenbart, hergestellt. In einem Fall wurden Mausmyelomzellen mit cDNAs für sowohl schwere Ketten wie auch leichte Ketten/PDGF-Rezeptor-extrazelluläre-Domäne-Fusionsproteinen transfiziert. Diese Zellen sezernieren in ihr Kulturmedium ein Molekül, das analog zu menschlichem IgG dadurch ist, dass es aus Fusionsproteinen mit zwei leichten Ketten und zwei schweren Ketten besteht. Diese Verbindung wird als tetrameres IgG/PDGFr bezeichnet. In einem anderen Fall wurde eine cDNA für leichte Kette/PDGF-Rezeptor-extrazelluläre-Domäne-Fusionsprotein in die Zellen allein transfiziert. Diese Zellen sezernieren monomere leichte Kette-Fusionsproteine in ihr Kulturmedium, bezeichnet als monomere IgG/PDGFr. Die alpha- und beta-Rezeptorfusionsproteine wurden als IgG/PDGFr-alpha (tetramer) bzw. IgG/PDGFr-beta (monomer und tetramer) bezeichnet. Die Fusionsproteine wurden entweder durch Immunaffinitätsreinigung unter Verwendung monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder durch Protein-A-Sepharose^TM-Chromatographie gereinigt.
Beispiel 1 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Herstellung von monoklonalen PDGF-Rezeptorantikörpern
Es wurden Fusionsproteine, die eine konstante IgG-Region, die mit der extrazellulären Domäne von entweder dem PDGF-alpha-Rezeptor (PDGFr-alpha) oder dem PDGF-beta-Rezeptor (PDGFr-beta) verbunden ist, umfassen, im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,155,027 offenbart, hergestellt. Die alpha- und beta-Rezeptorfusionen wurden als IgG/PDGFr-alpha bzw. IgG/PDGFr-beta bezeichnet. Das monomere IgG/PDGFr-beta wurde als eine Fusion einer menschlichen konstanten leichten Kappa-Kettenregion und der PDGF-beta-Rezeptor-extrazellulären Domäne ausgedrückt. Das tetramere IgG/PDGFr-beta wurde durch Koexpression des monomeren Konstruktes mit einer menschlichen konstanten schweren Ig-Kettenregion plus Hinge-Sequenz, fusioniert an die extrazelluläre Domäne, hergestellt. Alpha-Rezeptorfusionen wurden mit ähnlichen Mitteln hergestellt.
Acht Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden mit entweder gereinigten monomeren oder tetrameren IgG/PDGFr-beta oder gereinigten tetrameren IgG/PDGFr-alpha immunisiert. Den Mäusen wurden intraperitoneale (ip) Injektionen von ungefähr 10 μg gereinigtem IgG/PDGFr, gemischt mit vollständigem Freund-Adjuvans gegeben. In ungefähr zweiwöchigen Intervallen erhielten die Mäuse zusätzliche ip-Injektionen von IgG/PDGFr-beta oder IgG/PDGFr-alpha, gemischt mit inkomplettem Freund-Adjuvans.
Hybridome wurden aus den immunisierten Mäusen, im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,094,941 offenbart wird, hergestellt. Kurz gefasst wurden Milzzellen aus den Mäusen isoliert und gewaschen. Kontaminierende rote Blutzellen wurden durch Lyse mit destilliertem Wasser entfernt und die Milzzellen wurden gewaschen. Irgendwelches verbleibende kontaminierende Gewebematerial wurde durch Zentrifugation entfernt.
Die NS-1-Maus-Myelomzelllinie (ATCC TIB 18) wurde für die Fusionen verwendet. Um die Fusionseffizienz zu optimieren, wurden die Zellen auf Fusionseffizienz geprüft und ein Klon mit einer hohen Fusionseffizienz wurde ausgewählt. Die NS-1-Zellen ließ man in NS-1-Medien (Tabelle 1) bei 37°C, 7% CO₂ wachsen.
Von Babymäusen erhaltene Thymocyten wurden als Feeder-Schicht verwendet, um das Kulturmedium in den für die Zellfusion gewünschten Zustand zu bringen. Man erhielt Thymusdrüsen von drei bis vier Wochen alten Balb/c-Mäusen und Thymocyten wurden, wie in US-Patent Nr. 5,094,941 offenbart, isoliert.

NS-1-Zellen wurden zu den vorbereiteten immunisierten Maus-Milzzellen zugegeben und die Fusion wurde im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5,094,941 offenbart, durchgeführt. Die Zellen wurden in NS-1-Medium, das 1 × HAT (Tabelle 1) und 2,5 × 10⁶ Thymocyten pro ml enthielt, kultiviert. Die Hybridome wurden zwischen den Tagen 9 und 14 auf die Produktion spezifischer Antikörper getestet. Zellfusionen wurden durch Nummer gekennzeichnet (z. B. 162, 163). Tabelle 1 NS-1-Medium Für eine 500 ml Lösung

5 ml	10 mMol MEM nicht-essentielle Aminosäuren (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)
5 ml	100 mMol Natriumpyruvat (Irvine, Santa Ana, CA)
5 ml	200 mMol L-Glutamin (GIBCO BRL)
5 ml	100 × Penicillin/Streptomycin/Neomycin (GIBCO BRL)
75 ml	inaktiviertes fötales Kälberserum (BioCell, Carson, CA)
1 g	NaNCO₃
	Man gebe RPMI 1640 (GIBCO BRL) zu einem Gesamtvolumen von 500 ml zu. Man sterilisiere durch Filtration durch einen 0,22 Im-Filter.

100 × HT-Vorrat

38,5 mg	Thymidin
136,10 mg	Hypoxanthin

Man löse das Thymidin und Hypoxanthin in destilliertem H₂O und bringe das Volumen auf 100 ml. Man wärme die Lösung auf 60–70°C, um die Feststoffe zu lösen. Nachdem sich die Feststoffe aufgelöst haben, stelle man das Volumen wieder auf 100 ml ein. Man sterilisiere durch Filtration durch ein 0,22 μm-Filter. Man bewahre gefroren bei –20°C auf.

1000 × A-Vorrat

17,6 ng	Aminopterin
	Man füge steriles destilliertes Wasser zu dem Aminopterin hinzu und bringe das Volumen auf 50 ml. Man füge 1 N NaOH tröpfchenweise zu, bis sich das Aminopterin auflöst. Man bringe das endgültige Volumen mit destilliertem H₂O auf 100 ml. Man sterilisiere durch Filtration durch ein 0,22 Im-Filter. Man bewahre gefroren bei –20°C auf.

50 × HT

50 ml	100 × HT
5 ml	1000 × A-Vorrat
45 ml	destilliertes H₂O
	Man sterilisiere die Lösung durch Filtration durch ein 0,22 Im-Filter. Man bewahre gefroren bei –20°C auf.

ELISA-A-Puffer

0,1 M	Na₂HCO₃, pH 9,6
0,02%	NaN₃

ELISA-B-Puffer

Dieser Puffer kann mit 1%igem oder 2%igem Rinderserumalbumin hergestellt werden (BSA, erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
5 oder 10 μg BSA (für 1%iges bzw. 2%iges BSA)

250 μl	Tween 20 (Sigma)
100 mg	NaN₃
	Man füge Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS, Sigma) bis zu einem endgültigen Volumen von 500 ml zu. Alternativ kann der Puffer als 1%iges oder 2%iges BSA in ELISA C-Puffer hergestellt werden.

ELISA-C-Puffer

500 μl	Tween 20^® (Sigma)
200 mg	NaN₃
	Man füge PBS bis zu einem endgültigen Volumen von 1 Liter zu.

Reaktionspuffer

10 ml	0,1 M Natriumcitrat, pH 5,0
5 mg	o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma)
5 μl	N₂O₂ (Sigma)

Extraktionspuffer

100 ml	PBS
1,0 ml	Nonidet P-40 (NP-40) Detergens (Sigma) (1% endgültige Konzentration)

Bindungsmedien

500 ml	Ham's F-12 (GIBCO BRL)
12 ml	1 M Hepes pH 7,4
5 ml	100 × Penicillin/Strepomycin/Neomycin (GIBCO BRL)
1 g	Kaninchenserumalbumin (Sigma)

Mito-Medien Für eine 500 ml-Lösung

250 ml	DMEM (GIBCO BRL)
250 ml	Ham's F-12 (GIBCO BRL)
0,25 ml	10 mg/ml Vorrat an Insulin (GIBCO BRL), um eine endgültige Konzentration von 5 μg/ml zu ergeben.
1 ml	10 mg/ml Vorrat an Transferrin (Collaborative Research, Bedford, MA), um eine endgültige Konzentration von 20 μg/ml zu ergeben
2 ml	4 μg/ml Vorrat an Selen (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI), um eine endgültige Konzentration von 5 nMol zu ergeben
5 ml	10%ige Vorratslösung an Rinderserumalbumin (GIBCO BRL), um eine endgültige Konzentration von 0,1% zu ergeben.

Beispiel 2 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Identifizierung und Charakterisierung von Hybridomen, die Antikörper gegen den PDGF-beta-Rezeptor produzieren
Hybridome aus der Zellfusion 162 wurden auf die Produktion von Antikörpern gegen den PDGF-beta-Rezeptor getestet. Assays, die zur Identifizierung positiver Hybridome verwendet wurden, schlossen Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), Inhibition von ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta und Inhibition von ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an menschliche dermale Fibroblasten mit ein.
Die ELISA-Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die mit monomerem IgG/PDGFr-beta beschichtet worden waren, durchgeführt. Um die Vertiefungen zu beschichten, wurde IgG/PDGFr-beta auf 200 ng/ml in ELISA A-Puffer (Tabelle 1) verdünnt, und 100 μg der Lösung wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten mit ELISA C-Puffer (Tabelle 1) gewaschen. Die Platten wurden dann mit 150 μl/Vertiefung von ELISA B-Puffer (Tabelle 1) bei 37°C inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Der Puffer wurde entfernt und die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen.
Die Testhybridomüberstände wurden in Zweiergruppen gepoolt, und 100 μl der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 1,5 Stunden bei 37°C mit Biotin-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (Vector Labs, Burlingame, CA) inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 30 Minuten bei 37°C mit 100 μl/Vertiefung von Strepavidin-Meerrettichperoxidase (Amersham International, Amersham, U. K.) inkubiert. Die Vertiefungen wurden wieder mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit Reaktionspuffer (Tabelle 1) inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H₂SO₄ beendet und die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät (Dynatech Laboratories, Inc. Alexandria, VA) unter Verwendung eines Filters, um die Absorption bei 490 nm zu überwachen, gelesen. Diejenigen Vertiefungen mit Aaso-Ablesungen, die größer als 0,2 waren, wurden als Positive genommen. Die positiven Kandidaten wurden erneut einem ELISA-Assay wie oben beschrieben unterworfen, um die einzelnen Kulturvertiefungen, die die Hybridomzellen, die Antikörper gegen IgG/PDGFr-beta herstellten, enthielten, zu bestimmen.
Hybridome aus der Zellfusion 162 wurden auch auf die Inhibition der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta untersucht. Ziegen-anti-Mensch-IgG (Cappel Labs, Malvern, PA) wurde mit ELISA A-Puffer bis zu einer endgültigen Konzentration von 2 μg/ml verdünnt. Diese Mischung wurde dann zu Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zugegeben, 100 μl/Vertiefung, und die Platten wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit 200 μl/Vertiefung an ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 1,5 Stunden mit tetramerem IgG/PDGFr-beta inkubiert und in ELISA B-Puffer bis zu einer endgültigen Konzentration von 25 ng/ml verdünnt. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, um ungebundenes IgG/PDGFr-beta zu entfernen.
Die Hybridomüberstände wurden in Zweiergruppen gepoolt und 100 μl der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Vertiefungen wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Zu jeder Vertiefung wurden dann 50 μl ¹²⁵I-PDGF-BB (ungefähr 50000 cpm pro Vertiefung) zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen dreimal mit Bindungsmedien (Tabelle 1) gewaschen. 100 μl 0,1 M Natriumcitrat, pH 2,5, wurde zu den Vertiefungen für 5 Minuten bei Raumtemperatur zugegeben, die Lösung wurde geerntet und auf 12 × 75 mm Röhrchen übertragen und die Röhrchen wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung zu bestimmen. Antikörper, die an IgG/PDGFr-beta banden und die ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung blockierten, wurden durch eine Abnahme des Levels des gebundenen ¹²⁵I-PDGF-BB im Vergleich zu den Kulturmedien alleine nachgewiesen.
Die Medienpools, bei denen bestimmt wurde, dass sie positiv für IgG/PDGFr-beta-neutralisierenden Antikörper waren, wurden unter Verwendung eines Assayformats, das ähnlich dem oben beschriebenen war, erneut untersucht, um die einzelnen Vertiefungen, die Hybridome, die neutralisierenden Antikörper herstellten, enthielten, zu identifizieren.
Die Medienproben aus Kulturvertiefungen, die entweder durch ELISA oder durch Inhibition von ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung positiv waren, wurden im Anschluss daran in einem Down-Regulations-Assayformat (Hart et al., J. Biol. Chem. 262: 10780–10785, 1987) auf die Fähigkeit, PDGF-beta-Rezeptor auf menschlichen dermalen Fibroblasten zu erkennen, einem Assay unterzogen. Die Bindung von PDGF-BB an den PDGF-beta-Rezeptor bei 37°C führt zu der Internalisierung der Rezeptoren von der Zelloberfläche und einer darauffolgenden Abnahme in der Anzahl der Zelloberflächenrezeptoren, ein Phänomen, das als Down-Regulation bezeichnet wird. Die Fibroblasten wurden auf Kulturschalen mit 96 Vertiefungen mit 10000 Zellen pro Vertiefung plattiert und vor der Verwendung in Kulturmedien für 1–2 Tage erhalten. Zu einem Satz von Vertiefungen wurde PDGF-BB in einer endgültigen Konzentration von 100 ng/ml auf den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Kulturmedien wurden von den Zellen entfernt und die Zellen wurden mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Test-Kulturmedien von den Hybridomzellen wurden dann zu doppelten Vertiefungen von Zellen, die entweder die PDGF-BB-Behandlung erhalten hatten oder von Zellen, die man unbehandelt gelassen hatte, zugegeben. Die Zellen wurden anschließend für 2 Stunden bei 4°C inkubiert, dann mit PBS gewaschen. 100 μl/Vertiefung ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG (100000 cpm/Vertiefung) wurden zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden für zusätzliche 1,5 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 μl/Vertiefung Extraktionspuffer (Tabelle 1) inkubiert. Die Extrakte wurden geerntet, auf 12 × 75 mm Röhrchen übertragen und in einem Gammazähler gezählt, um den Level an ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung zu bestimmen. Wenn es einen Antikörper in den Hybridomkulturüberständen gibt, der fähig ist, PDGF-beta-Rezeptor der Zelloberfläche zu erkennen, dann würde es eine Abnahme des Levels der ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung an diejenigen Zellen, die mit PDGF-BB für die Down-Regulation der Rezeptoren behandelt wurden, geben.
Verschiedene Hybridome von Fusion 162 wurden als Antikörper gegen den PDGF-beta-Rezeptor herstellend identifiziert. Die identifizierten Hybridome wurden zweimal durch Grenzwertverdünnung geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper herstellen, zu erhalten. Die Klone wurden auf Antikörperproduktion durch die oben beschriebenen Assays untersucht. Ein Hybridom, genannt 162.62, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Beispiel 3 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Identifizierung und Charakterisierung von Hybridomen, die anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper herstellen
Hybridome aus Zellfusion 163 wurden auf die Herstellung von Antikörpern gegen den PDGF-beta-Rezeptor durch ein kombiniertes ELISA/PDGF-Bindungskonkurrenzassay getestet. Diese Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Platten wurden anfangs mit Ziegen-anti-Mensch-IgG, 2 μg/ml in ELISA A-Puffer, für 2 Stunden bei 37°C beschichtet. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 1 1/2 Stunden bei 37°C mit ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann entweder sofort verwendet oder für 1–4 Tage bei 4°C bis zur Verwendung stehen gelassen. Zum Zeitpunkt des Assays wurden die Platten einmal mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann für 1 1/2 Stunden bei 37°C mit tetramerem IgG/PDGFr-beta, das auf 25 ng/ml in Bindungsmedium verdünnt worden war, inkubiert. Die Platten wurden dann mit ELISA C-Puffer gewaschen, um ungebundenes IgG/PDGFr-beta zu entfernen.
Die Hybridomüberstände wurden in Gruppen von zwei Vertiefungen gepoolt, und 100 μl der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann mit Bindungsmedium gewaschen. Es wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Tago, Burlingame, CA), verdünnt 1 : 1000 mit Bindungsmedium, zugegeben. Die Vertiefungen wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann mit Bindungsmedium gewaschen, um ungebundenes MRP-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG zu entfernen. Es wurde dann ¹²⁵I-PDGF-BB, ungefähr 26000 cpm/Vertiefung, zu den Vertiefungen für eine zusätzliche Stunde bei 37°C zugegeben. Die Vertiefungen wurden mit Bindungsmedium gewaschen, dann mit Reaktionspuffer für die Entwicklung des ELISA inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl/Vertiefung 1 N H₂SO₄ beendet, und die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät unter Verwendung eines Filters zur Überwachung der Absorption bei 490 nm gelesen.
Der Inhalt der Vertiefungen wurde dann auf 12 × 75 mm TestRöhrchen übertragen, und die Proben wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level an ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung zu messen.
Das oben beschriebene Assay identifizierte durch ELISA Hybridomkulturen, die Antikörper gegen IgG/PDGFr-beta herstellen, wie auch durch die Fähigkeit, die Bindung von ¹²⁵I-PDGF-BB an tetrameres IgG/PDGFr-beta zu blockieren. Diejenigen gepoolten Proben, die positiv waren, wurden anschließend unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben beschrieben erneut einem Assay unterworfen, um die einzelnen Kulturvertiefungen, die die Hybridomzellen, die Antikörper gegen IgG/PDGFr-beta herstellten, enthielten, zu bestimmen.
Einzelne Vertiefungen, bei denen man herausfand, dass sie positiv für die Bindung an IgG/PDGFr-beta waren, wurden anschließend auf die Fähigkeit, ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an menschliche dermale Fibroblasten zu inhibieren, einem Assay unterworfen. Menschliche dermale Fibroblasten wurden auf Kulturschalen mit 24 Vertiefungen mit ungefähr 20000 Zellen pro Vertiefung plattiert. Die Kulturmedien wurden von den Zellen entfernt und die Hybridomtestkulturmedien, 0,5 ml pro Vertiefung, wurde zu den doppelten Vertiefungen zugegeben. Als eine negative Kontrolle wurde NS-1-Medium zu einem Satz von Vertiefungen allein zugegeben. Zu einem zweiten Satz von Vertiefungen wurde PDGF-BB in einer endgültigen Konzentration von 20 ng/ml in NS-1-Medium zugegeben, um unspezifische Bindung von ¹²⁵I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Zellen wurde für 1 Stunde bei 4°C inkubiert, dann wurde ¹²⁵I-PDGF-BB, 100 μl/Vertiefung (ungefähr 26000 cpm), zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden für 1 zusätzliche Stunde bei 4°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Extraktionspuffer inkubiert. Die Extrakte wurden in 12 × 75 mm Röhrchen geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die Testproben, die eine Abnahme der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung im Vergleich zu der NS-1-Mediumprobe hervorriefen, wurden als positiv für die Fähigkeit, PDGF-BB-Bindung an nativen PDGF-beta-Rezeptor auf Monolayern menschlicher dermaler Fibroblasten zu inhibieren, einem Assay unterworfen.
Verschiedene Hybridome von Fusion 163 wurden als Antikörper gegen den PDGF-beta-Rezeptor herstellend identifiziert. Die identifizierten Hybridome wurden zweimal durch Grenzwertverdünnung geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper herstellen, zu erhalten. Die Klone wurden durch die oben beschriebenen Assays auf Antikörperproduktion untersucht. Ein Hybridom, genannt 163.31, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Beispiel 4 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Charakterisierung von anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAks 162.62 und 163.31
Die MAks 162.62 und 163.31 (hergestellt von Hybridomklonen 162.62 bzw. 163.31) wurden in Hinsicht auf ihre Fähigkeit, die Bindung von ¹²⁵I-PDGF-BB an entweder tetrameres IgG/PDGFr-beta oder den PDGF-beta-Rezeptor auf menschlichen dermalen Fibroblasten zu blockieren, verglichen. Die Inhibition von ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta wurde im Wesentlichen wie oben für das initiale Screening der Fusion 163 beschrieben getestet. Anstelle der Zugabe von konditioniertem Kulturmedium, wurden bekannte Mengen an Antikörper, der in NS-1-Medium verdünnt wurde, gleichzeitig mit ¹²⁵I-PDGF-BB zu den mit IgG/PDGFr-beta beschichteten Vertiefungen zugegeben. NS-1-Medium allein wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Die Zugabe von PDGF-BB, 500 ng/ml, zu dem NS-1-Medium wurde verwendet, um den Level unspezifischer Bindung durch ¹²⁵I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Vertiefungen wurden bei 4°C für 2 1/2 Stunden inkubiert, dann mit PBS gewaschen. 100 μl 0,1 M Citrat pH 2,5 wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um das gebundene ¹²⁵I-PDGF-BB zu entfernen, die Proben wurden auf 12 × 75 mm Röhrchen übertragen und dann wurden die Röhrchen in einem Gammazähler gezählt.
Um die Bindung an menschliche dermale Fibroblasten einem Assay zu unterwerfen, wurden die Fibroblasten mit ungefähr 20000 Zellen/Vertiefung in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Die Zellen wurden 2–7 Tage nach der Plattierung für das Assay verwendet. Die Antikörper wurden in Bindungsmedien auf die Konzentrationen, die in Tabelle 2 gezeigt werden, verdünnt, dann mit ¹²⁵I-PDGF-BB vermischt und 0,5 ml Aliquots wurden zu den doppelten Vertiefungen von Fibroblasten zugegeben. Die Bindungsmedien alleine wurde als die negative Kontrolle verwendet und die Zugabe von 500 ng/ml PDGF-BB wurde verwendet, um unspezifische Bindung für ¹²⁵I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Zellen wurden für 2 1/2 Stunden bei 4°C inkubiert, dann mit Bindungsmedien gewaschen, um ungebundenen Liganden zu entfernen. Die Zellen wurden dann mit Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt.
Die Ergebnisse der Bindungsstudien werden in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten werden als spezifische cpm gebunden für ¹²⁵I-PDGF-BB dargestellt. Unspezifische Bindung, bestimmt durch die Zugabe von 500 mg/ml unmarkiertem PDGF-BB, betrug 260 cpm für die IgG/PDGFr-beta-Vertiefungen und 105 cpm für die menschlichen dermalen Fibroblasten und wurde von den dargestellten Daten abgezogen. %CB = Prozent Kontrollbindung.
Diese Ergebnisse zeigen, dass beide MAks 162.62 und 163.31 wirksame Inhibitoren der PDGF-BB-Bindung an IgG/PDGFr-beta sind. Im Gegensatz dazu ist MAk 162.62 ein stärker wirksamer Inhibitor als MAk 163.31 für die PDGF-BB-Bindung an menschliche dermale Fibroblasten.
MAk 162.62 wurde auch in Hinblick auf die Fähigkeit an Rezeptoren auf Monolayern von menschlichen dermalen Fibroblasten gebundenes ¹²⁵I-PDGF zu verdrängen analysiert. Zuerst wurde ¹²⁵I-PDGF-BB mit Monolayern menschlicher dermaler Fibroblasten auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann anschließend für 1 Stunde bei 4°C mit entweder MAk 162.62, 5 μg/ml, oder Bindungsmedium alleine inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, mit Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung zu bestimmen. Um unspezifische Bindung zu bestimmen, wurden 500 ng/ml unmarkiertes PDGF-BB während des ersten Inkubationsschrittes zugegeben. Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 3, zeigen, dass die Zugabe von MAk 162.62 zu einer 47%igen Verdrängung des zuvor gebundenen ¹²⁵I-PDGF-BB führten. So war MAk 162.62 in der Lage, Rezeptor-gebundenes PDGF-BB von der Oberfläche menschlicher dermaler Fibroblasten zu verdrängen.
Die Unterklasse für die MAks 162.62 und 163.31 wurde durch ELISA unter Verwendung IgG/PDGFr-beta-beschichteter Vertiefungen und subklassenspezifischer sekundärer Antikörper bestimmt. Es wurde herausgefunden, dass MAk 162.62 ein IgG2b-Isotyp ist, während herausgefunden wurde, dass MAk 163.31 ein IgG1-Isotyp ist.
Beispiel 5 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Identifizierung und Charakterisierung von Hybridomen, die anti-PDGF-alpha-Rezeptorantikörper herstellen
Hybridome von der Zellfusion 169 wurden auf die Herstellung von Antikörpern gegen den PDGF-alpha-Rezeptor durch ein kombiniertes ELISA/PDGF-Bindungskonkurrenz-Assay getestet. Diese Assays wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Die Platten wurden anfänglich mit Ziegen-anti-Mensch-IgG, 2 μg/ml in ELISA A-Puffer, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann über Nacht bei 4°C mit tetramerem IgG/PDGFr-alpha, verdünnt auf 25 ng/ml in Bindungsmedium, inkubiert. Die Platten wurden dann mit ELISA C-Puffern gewaschen, um ungebundenes IgG/PDGFr zu entfernen.
Die Hybridomüberstände wurden in Zweiergruppen gepoolt und 25 μl der gepoolten Proben wurden zu jeder der Mikrotitervertiefungen zugegeben. Die Platten wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann mit ELISA C-Puffer gewaschen. Zu den Vertiefungen wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG (Tago), verdünnt 1 : 1000 mit Bindungsmedium, zugegeben. Die Vertiefungen wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann mit ELISA C-Puffer gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Es wurde dann ¹²⁵I-PDGF-AA, ungefähr 25000 cpm/Vertiefung, zu den Ver tiefungen für eine zusätzliche Stunde bei 37°C zugegeben. Die Vertiefungen wurden mit Bindungsmedium gewaschen, dann mit Reaktionspuffer für die Entwicklung des ELISA inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl/Vertiefung 1 N H₂SO₄ beendet und die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät unter Verwendung eines Filters, um die Absorption bei 490 nm zu überwachen, gelesen.
Der Inhalt der Vertiefungen wurde dann auf 12 × 75 mm TestRöhrchen übertragen und die Proben wurden in einem Gammazähler gezählt, um den Level der ¹²⁵I-PDGF-AA-Bindung zu messen.
Dieses Assay identifizierte durch ELISA Hybridomkulturen, die Antikörper gegen IgG/PDGFr-alpha herstellten, und überwachte hinsichtlich eines Antikörpers, der in der Lage war, die Bindung von ¹²⁵I-PDGF-AA an das tetramere IgG/PDGFr-alpha zu blockieren. Diejenigen gepoolten Proben, die in dem anfänglichen Assay positiv waren, wurden unter Verwendung des gleichen Protokolls wie oben beschrieben erneut einem Assay unterworfen, um die einzelnen Kulturvertiefungen, die die Hybridomzellen, die Antikörper gegen IgG/PDGFr-alpha herstellten, enthielten, zu bestimmen. Es wurden verschiedene Vertiefungen identifiziert, bei denen Antikörper, der gegen IgG/PDGFr-alpha gerichtet war, vorlag. Von diesen wurden zwei, 169.14 und 169.31, für die weitere Analyse ausgewählt. Hybridome aus diesen Vertiefungen wurden durch Grenzwertverdünnung zweimal geklont, um einzelne Klone, die monoklonalen Antikörper gegen den PDGF-alpha-Rezeptor herstellten, zu erhalten. Die Klone wurden unter Verwendung des kombinierten ELISA/¹²⁵I-PDGF-AA-Bindungskonkurrenz-Assays im Wesentlichen wie oben beschrieben untersucht.
Um zu bestätigen, dass MAks 169.14 und 169.31 nativen PDGF-alpha-Rezeptor auf Monolayern von Säugetierzellen erkennen, wurden die zwei Antikörper auf ihre Fähigkeit hin, ¹²⁵I-PDGF-AA-Bindung an alpha T-7-Zellen zu blockieren, analysiert. Diese Zellen sind epitheliale Hundenierenzellen, die normalerweise PDGF-alpha-Rezeptor nicht exprimieren, die aber mit einer cDNA, die die gesamte Länge des PDGF-alpha-Rezeptors codiert, transfiziert wurden (US-Patent Nr. 5,371,2050. 5,371,205; PCT-Veröffentlichung WO 90/14425). Diese Zellen exprimieren ungefähr 100000 rekombinante Rezeptoren pro Zelle. Die alpha T-7-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen bis zu ungefähr 95%iger Konfluität kultiviert. Das Kulturmedium wurde entfernt und Verdünnungen der MAks 169.14 und 169.31 wurden zu den Zellen zugegeben. Die Kontrollen waren NS-1-Medium und NS-1-Medium, das 500 ng/ml PDGF-BB enthielt, um den unspezifischen Bindungsanteil für ¹²⁵I-PDGF-AA zu bestimmen. Zu jeder Vertiefung wurden 100 μl der Testprobe plus 10 μl ¹²⁵I-PDGF-AA (ungefähr 22000 cpm pro Vertiefung) zugegeben. Die Zellen wurden mit den Proben für 2 Stunden bei 4°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit 100 μl pro Vertiefung Extraktionspuffer extrahiert. Die Extrakte wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese zwei MAks membrangebundenen PDGF-alpha-Rezeptor bei Säugetierzellen zusätzlich zu IgG/PDGFr-alpha erkennen.
Die Subklasse für die MAks 169.14 und 169.31 wurde durch ELISA unter Verwendung IgG/PDGFr-alpha-beschichteter Vertiefungen und subklassenspezifischem sekundären Antikörper bestimmt. Beide MAks, 169.14 und 169.31, waren im Assay positiv für IgG2a-Isotyp.
Beispiel 6 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Bindungsspezifität von anti-PDGF-Rezeptor-MAks
Um PDGF-Rezeptorunterheinheits-Bindungsspezifität zu zeigen, wurden die MAks 162.62, 163.31, 169.14 und 169.31 hinsichtlich ihrer Bindung an Klon 8-Zellen und Alpha 1-10-Zellen analysiert. Klon 8-Zellen sind BHK 570 (ATCC CRL 10314)-Zellen, die mit einem Gen, das die gesamte Länge menschlichen PDGF-beta-Rezeptors codiert, transfiziert wurden (Gronwald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3435–3439, 1988). Diese Zellen exprimieren ungefähr 500000 menschliche PDGF-beta-Rezeptoren pro Zelle. Die Alpha 1-10-Zellen sind BHK 570-Zellen, die mit einer cDNA, die die gesamte Länge menschlichen PDGF-alpha-Rezeptors codiert, transfiziert wurden (US-Patent Nr. 5,371,205; PCT-Veröffentlichung WO 90/14425). Diese Zellen exprimieren ungefähr 1000000 menschlicher PDGF-alpha-Rezeptoren pro Zelle. Um die Bindungsspezifität für entweder den PDGF-alpha- oder -beta-Rezeptor zu zeigen, wurden Zelloberflächenbindungsstudien unter Verwendung der anti-PDGF-Rezeptor-MAks mit diesen zwei Zelllinien durchgeführt.
Sowohl die Klon 8- wie auch die Alpha 1-10-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen bis zur Konfluität kultiviert. PDGF-BB (200 ng/ml) wurde zu einer Hälfte der Zellen zugegeben, um PDGF-Rezeptor-Down-Regulation zu stimulieren und Trägerstoffkontrolle (10 mm Essigsäure, 0,25%iges Kaninchenserumalbumin) wurde zu der anderen Hälfte zugegeben. Die Zellen wurden für 1–2 Stunden bei 37°C inkubiert, dann mit auf 4°C gekühltem PBS gewaschen. Es wurden die gereinigten MAks 162.62, 163.31, 169.14 und 169.31, verdünnt auf 5 μg/ml in Bindungsmedium, zu dreifachen Vertiefungen der mit PDGF-BB behandelten und nicht behandelten Kontrollzellen zugegeben. Die Zellen wurden für ungefähr 2 Stunden auf Eis inkubiert und dann mit gekühltem PBF gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Testvertiefungen wurden dann auf Eis für 30 Minuten mit ¹²⁵I-markiertem Kaninchen-anti-Maus-IgG inkubiert und in Bindungsmedium auf ungefähr 400000 cpm/Vertiefung verdünnt. Die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen, dann mit Extraktionspuffer inkubiert. Die Extrakte wurden geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die Ergebnisse, gezeigt in 1, zeigen, dass nur MAks 162.62 und 163.31 spezifisch an den PDGF-beta-Rezeptor banden, wie durch die signifikante Abnahme der Bindung an die PDGF-BB-behandelten Klon 8-Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen gezeigt wird. Der hohe Bindungslevel durch MAk 169.14 lag an dem erhöhten Level unspezifischer Bindung durch diesen Antikörper, da es keine signifikante Abnahme der ¹²⁵I-Kaninchen-anti-Maus-IgG-Bindung an die mit PDGF-BB behandelten Zellen gab. Im Gegensatz dazu zeigten nur die MAks 169.14 und 169.31 Bindung an den PDGF-alpha-Rezeptor, wie durch die spezifische Bindung an die Alpha 1-10-Zellen gezeigt wird (2). Aufgrund der Fähigkeit der Antikörper an Zelloberflächen-PDGF-Rezeptor zu binden, bestätigen diese Ergebnisse, dass diese Antikörper extrazelluläre Epitope auf den PDGF-Rezeptoren erkennen.
Beispiel 7 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Neutralisierung mitogener PDGF-Aktivität auf menschlichen dermalen Fibroblasten
Menschliche dermale Fibroblasten wurden mit ungefähr 20000 Zellen pro Vertiefung auf Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert und bis zum Ruhezustand in DMEM (GIBCO BRL), das 2%iges fötales Kälberserum enthielt, wachsen gelassen. Die Zellen wurden entweder mit PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert. Es wurden Standardkurven mit Konzentrationen von 5, 1,25, 0,31 und 0 ng/ml endgültiger Konzentration auf den Zellen durchgeführt. Vorrats-PDGF-Verdünnungen wurden mit 10 mMol Essigsäure, die 0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, hergestellt, und 50 μl der Vorratsproben oder Trägerstoff allein wurde zu den Kulturvertiefungen hinzugegeben, um die erwünschten endgültigen Konzentrationen zu ergeben. Um die Fähigkeit der MAks 162.62 und 169.14, die mitogene Aktivität von jedem der drei PDGF-Liganden zu neutralisieren, zu analysieren, wurden 5 ng/ml PDGF zu den Vertiefungen zusammen mit 20 μg/ml (endgültige Konzentration auf den Zellen) der MAks 162.62 und 169.14 allein, oder 20 μg/ml eines Pools aus den beiden Antikörpern zugegeben. Die Zellen wurden mit den Testproben für ungefähr 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Medien wurden aspiriert, dann mit 1 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, ersetzt, und mit 37 kBq/ml (1 μCi/ml) [³H]Thymidin ergänzt. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der [³H]Thymidin-Einschluss in einem Wallac (Turku, Finnland) Betaplate^TM-Flüssigszintillationszähler gezählt. Die Ergebnisse, dargestellt in 3A, zeigen, dass die mitogene PDGF-AA-Aktivität durch MAk 169.14 wie auch durch den Antikörperpool, aber nicht durch MAk 162.62 inhibiert wurde. Die mitogene Aktivität von PDGF-AB wurde zu ungefähr 80% durch MAk 162.62, und zu über 92% durch MAk 169.14 oder den Antikörperpool inhibiert (3B). Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität von PDGF-BB nur minimal durch MAk 169.14, aber zu ungefähr 80% durch MAk 162.62 und zu über 92% durch den Antikörperpool inhibiert (3C).
Diese Ergebnisse stimmen mit dem Modell der PDGF-Ligandenbindung überein, das beschreibt, dass PDGF-AA an PDGF-alphalalpha-Rezeptordimere bindet, PDGF-AB an PDGF-alpha/alpha und -alpha/beta-Rezeptordimere bindet, und PDGF-BB an alle drei PDGF-Rezeptordimere bindet; -alpha/alpha, -alpha/beta und -beta/beta (geprüft in Hart et al., J. Invest. Derm. 94: 535–575, 1990). Somit, wenn MAk 169.14 an den alpha-Rezeptor bindet und die PDGF-Bindung daran inhibiert, würde man dann erwarten, dass er im Grunde 100% der mitogenen PDGF-AA- und -AB-Aktivität inhibiert, da alpha-Rezeptorbindung für diese beiden Liganden erforderlich ist. Dieses Modell stimmt mit den Ergebnissen, die oben beschrieben werden, überein. Von der Bindung an den und der Inhibition des PDGF-beta-Rezeptors durch MAk 162.62 würde man dann erwarten, dass die Menge der mitogenen PDGF-AB- und -BB-Aktivität auf einen Level begrenzt wird, der mit PDGF-AA übereinstimmt, da AB und BB nur in der Lage wären, an alpha/alpha-Dimere zu binden. Dies stimmt wiederum mit den Ergebnissen der oben beschriebenen Studie überein.
Zusammenfassend sind die anti-PDGF-Rezeptor-MAks 162.62 und 169.14 in der Lage, die mitogene Aktivität der drei Formen von PDGF auf eine Weise zu inhibieren, die mit der gegenwärtigen Hypothese der PDGF-Rezeptorbindung durch die drei PDGF-Liganden übereinstimmt. Zusätzlich ist die gemeinsame Verwendung der zwei Antikörper in der Lage, im Grunde 100% der mitogener PDGF-Aktivität auf menschlichen dermalen Fibroblasten zu inhibieren.
Beispiel 8 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Inhibition der mitogenen PDGF-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
Anti-PDGF-Rezeptor-MAks wurden auf ihre Fähigkeit hin, die mitogene Aktivität von PDGF auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren, analysiert. Alle Mitogenese-Assays, die an glatten Paviangefäßmuskelzellen (BVSMCs) durchgeführt wurden, wurden an primären Kulturen von Zellen zwischen den Passagen 3 und 7 in der Kultur gemacht. Die anfänglichen Kulturen wurden aus dem Auswuchs aortaler Gewebeexplantate etabliert. Glatte Pavianmuskelzellen wurden mit ungefähr 30000 Zellen pro Vertiefung in DMEM, das mit 10%igem fötalem Kälberserum ergänzt wurde, in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Zwei Tage vor der Verwendung wurden die Kulturmedien entfernt und 1 ml Mito-Medien (Tabelle 1) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Zellen zur Ruhe kommen zu lassen. Zum Zeitpunkt des Experimentes wurden die Zellen mit entweder PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert. Es wurden Standardkurven für jeden der drei Liganden unter Verwendung von endgültigen Konzentrationen, die in den 4–6 gezeigt werden, durchgeführt. Es wurden 20 × Vorratslösungen für jede der PDGF-Konzentrationen durch Verdünnung in 10 mMol Essigsäure, die 0,25% Albumin enthielt, hergestellt und 50 μl PDGF oder Verdünnungsträgerstoff allein wurden zu den Kulturvertiefungen zugegeben.
Für die Mitogenese-Assays wurden endgültige PDGF-Konzentrationen von 10, 2 und 1,25 ng/ml für PDGF-AA, -AB bzw. -BB verwendet. MAks 163.31 und 169.31 wurden zu den PDGF-enthaltenden Vertiefungen in einer endgültigen Konzentration von 25 μg/ml zugegeben. Für die Pools der zwei Antikörper lag die endgültige Konzentration des Antikörpers auf den Zellen bei 25 μg/ml gesamt oder 12,5 μg/ml für jeden der MAks. Die Zellen wurden zwischen 20–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Für die PDGF-AA- und -AB- Studien wurden 50 μl einer 1,48 MBq/ml (40 μCi/ml)-Lösung von [³H]Thymidin zu jeder Vertiefung zugegeben. Für die PDGF-BB-Studie wurden die Medien aspiriert, dann mit 0,5 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, ersetzt und mit 74 kBq/ml (2 μCi/ml) [³H]Thymidin ergänzt. Die Zellen wurden zwischen 2–4 Stunden bei 37°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der [³H]Thymidin-Einschluss in einem Betaplate^TM-Flüssigszintillationszähler (Wallac) gezählt. Wie in 4 gezeigt, wird die mitogene PDGF-AA-Aktivität zu 100% durch MAk 169.31 wie auch durch den Antikörperpool inhibiert, aber nicht durch MAk 163.31. Die mitogene PDGF-AB-Aktivität wurde vollständig durch beide einzelne MAks wie auch durch den Antikörperpool inhibiert (5). Es ist interessant zu bemerken, dass der Level des [³H]Thymidin-Einschlusses in der Gegenwart der MAks unter dem Level lag, den man durch die Zugabe der Trägerstoff-Kontrolle alleine erhielt. Dieses sah man ähnlich bei MAk 169.31 auf der PDGF-AA-Platte (4). Für die PDGF-BB-stimulierten Zellen ergaben MAk 169.31 und MAk 163.31 einzeln weniger als 50% Inhibition, während ein Pool der zwei Antikörper in der Lage war, ungefähr 75% der mitogenen PDGF-Aktivität zu inhibieren (6).
Um weiter die inhibitorische Wirksamkeit dieser Antikörper, die mitogene Aktivität von PDGF auf glatten Pavianmuskelzellen zu neutralisieren, darzustellen, wurden zwei anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAks, 169.14 und 169.31 auf ihre Fähigkeit hin, die mitogene PDGF-AA-Aktivität zu inhibieren, analysiert. BVSMCs wurden plattiert und im Grunde wie oben beschrieben behandelt. Zu einem Satz an Vertiefungen wurden zunehmende Konzentrationen von PDGF-AA zugegeben, um eine Standardkurve der mitogenen PDGF-AA-Aktivität zu erzeugen (7A). Die PDGF-AA-Proben reichten von 10 ng/ml bis hinunter zu 0,31 ng/ml. Zu einem zweiten Satz an Vertiefungen wurde eine Standardverdünnung von PDGF-AA zugegeben, um eine endgültige Konzentration von 10 ng/ml zu ergeben. Es wurden dann abnehmende Konzentrationen der MAks 169.14 und 169.13 zu den Vertiefungen zugegeben, um die inhibitorische Wirksamkeit für jeden der MAks, wie durch eine Abnahme des Levels des [³H]Thymidin-Einschlusses bestimmt wird, zu überwachen (7B). Die Ergebnisse zeigen, dass sogar bei 8 ng/ml Antikörper eine mehr als 90%ige Inhibition einer 10 ng/ml-Lösung PDGF-AA auftrat.
Beispiel 9 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Inhibition von mitogener Pavianserum-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen
Es wurden anti-PDGF-Rezeptor-MAks hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die mitogene Aktivität von Pavianserum auf glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren, analysiert. BVSMCs wurden mit ungefähr 30000 Zellen pro Vertiefung in DMEM, das mit 10% fötalem Käl berserum ergänzt worden war, in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert. Drei Tage vor der Verwendung wurden die Kulturmedien entfernt und 1 ml Mito-Medien (Tabelle 1) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Zellen zur Ruhe kommen zu lassen. Zum Zeitpunkt des Experimentes wurden die Zellen mit verschiedenen Mengen Pavianserum stimuliert.
Es wurde eine Standardkurve für die Serumprobe erzeugt. Es wurden 20 × Vorratslösungen für jede der Serumkonzentrationen hergestellt und 50 μl der Serumverdünnung oder des Verdünnungsträgers PBS wurde zu den Kulturvertiefungen zugegeben, um endgültige Serumkonzentrationen, die von 2,5% bis hinunter zu 0,15% reichten, auf den Zellen zu ergeben. Die MAks 169.31 und 163.31 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mitogener Pavianserum-Aktivität zu inhibieren, analysiert. Eine endgültige Serumkonzentration von 2,5% wurde für die Antikörperinhibitionsstudie verwendet. Die MAks 169.31 und 163.31 wurden zu den Serum enthaltenden Vertiefungen in einer endgültigen Konzentration von 25 μg/ml zugegeben. Für Pools der zwei Antikörper betrug die endgültige Konzentration an Antikörper auf den Zellen 25 μg/ml gesamt oder 12,5 μg/ml für jeden der MAks. Die Zellen wurden mit den Serumproben für ungefähr 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Medien von den Zellen aspiriert, dann mit 0,5 ml DMEM, das 5% fötales Kälberserum enthielt, ersetzt, und mit 74 kBq/ml (2 μCi/ml) [³H]Thymidin ergänzt. Die Zellen wurden für ungefähr 3 Stunden bei 37°C inkubiert, mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und der [³H]Thymidin-Einschluss in einem Betaplate^TM-Flüssigszintillationszähler (Wallac) gezählt. Die Ergebnisse, dargestellt in 8, zeigen, dass die mitogene Pavianserum-Aktivität durch MAk 169.31 minimal inhibiert, aber durch MAk 163.31 zu über 50% inhibiert wird. Der Pool der zwei Antikörper inhibierte mehr als 75% der mitogenen Serumaktivität.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Großteil der mitogenen Aktivität in Pavianserum gegenüber glatten Pavianmuskelzellen durch die Verwendung von monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern inhibiert werden kann. Von den Erfindern durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die vorherrschende Form von PDGF in Pavian-Thrombozyten PDGF-BB ist. Aufgrund des großen Prozentsatzes an PDGF-beta-Rezeptoren auf glatten Pavianmuskelzellen, stimmt es damit überein, dass der anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAk die größte inhibitorische Aktivität gegenüber Pavianserum aufweist.
Beispiel 10 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Der Effekt von zirkulierendem MAk 169.31 auf mitogene Pavianserumaktivität
Es wurde eine Studie durchgeführt, um die zirkulierenden Spiegel von MAk 169.31 nach der Verabreichung einer intravenösen (i. v.) Bolusinjektion von 25 mg an einen Pavian zu beobachten. Man verschaffte sich Serum in verschiedenen Intervallen nach der Antikörperinjektion und der Spiegel des zirkulierenden Antikörpers wurde durch ELISA bestimmt. Es wurde Schaf-anti-Maus-IgG zu Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in ELISA-Puffer A in einer Konzentration von 2 μg/ml zugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit ELISA B-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die Platten wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit 100 μl pro Vertiefung Testprobe inkubiert. Pavianplasma oder -serum, das monoklonalen Antikörper 169.31 enthielt, wurde 1 : 1000 mit ELISA B-Puffer verdünnt und zu den Testvertiefungen zugegeben. Es wurden Standards, die aus gereinigtem MAk 169.31, das in Kontrollpavianplasma oder -serum hineingegeben wurde, bestanden, ähnlich den Testplasma/Serumproben 1 : 1000 verdünnt und dann zu den Testvertiefungen zugegeben. Die Standards reichten von einer endgültigen Konzentration von 100 ng/ml bis 1,56 ng/ml in den Testvertiefungen. Die Plasma/Serumproben wurden in den Vertiefungen für 1–2 Stunden bei 37°C inkubiert, die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann wurde Ziegen-anti-Maus-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, zugegeben. Die Vertiefungen wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit Reaktionspuffer inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H₂SO₄ beendet, und die Platten wurden in einem ELISA-Plattenlesegerät bei 490 nm gelesen. Die ELISA-Analyse der Pavianserumproben für zirkulierende Spiegel von MAk 169.31 zeigten an, dass die in vivo-Halbwertszeit dieses Maus-Antikörpers bei ungefähr 15 Stunden lag.
Zusätzlich wurde die relative mitogene Wirksamkeit der Serumproben, die man sich nach 1 Stunde und 18 Stunden nach der Injektion verschaffte, bestimmt. Zu diesen Zeitpunkten wurden die zirkulierenden Spiegel an Antikörper in dem Pavian als bei 46 μg/ml bzw. 21 μg/ml liegend bestimmt. Die 1-Stunden- und 18-Stunden-Serumproben wurden dann mit einer Kontrollserumprobe hinsichtlich ihrer relativen mitogenen Aktivität verglichen. Verdünnungen der Serumproben wurden zu den glatten Pavianmuskelzellen, die im Grunde wie in der oben dargestellten Pavian-Serumstudie beschrieben kultiviert worden waren, zugegeben. Die endgültigen Serumkonzentrationen auf den glatten Muskelzellen reichten von 1,25% bis hinab zu 0,15%. Die glatten Pavianmuskelzellen wurden auf den Level des [³H]Thymidin-Einschlusses hin überwacht, als ein Mittel, um die mitogene Aktivität im Grunde wie oben beschrieben zu bestimmen.
Die Ergebnisse, dargestellt in 9, zeigen, dass es eine signifikante Abnahme in der relativen mitogenen Wirksamkeit für sowohl die 1-Stunden- wie auch die 18-Stunden-Serumproben im Vergleich zu der Kontrollprobe gab, wobei die 18-Stunden-Probe bei der mitogenen Aktivität in der Mitte zwischen den Kontroll- und 1-Stunden-Proben lag. Der Neutralisierungslevel durch MAk 169.31, der in der 18-Stunden-Serumprobe vorlag, stimmt mit dem Neutralisierungslevel, den man erhält, wenn man diesen Antikörper ex vivo zu Kontrollpavianserum zugibt, überein (8). So zeigen diese Ergebnisse, dass für mindestens 18 Stunden in Pavianblut zirkulierender MAk 169.31 im Grunde seine gesamte biologische Aktivität hinsichtlich der Inhibition mitogener Pavianserum-Aktivität auf glatten Pavianmuskelzellen behält.
Beispiel 11 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Inhibition von Zellauswuchs aus aortalen Pavianexplantaten
Monoklonale anti-PDGF-Rezeptorantikörper wurden auf ihre Fähigkeit, die Rate glatter Muskellzell-Migration aus Explantaten von aortalem Paviangewebe zu verringern, getestet. Die innere Media der thorakalen Aorta vom Pavian wurde in DMEM-Kulturmedium, das 10 mMol Hepes enthielt, präpariert. Das aortale Gewebe wurde in 1 mm im Quadrat große Abschnitte eingeteilt und die Explantate wurden in Gewebekulturflaschen platziert. Nach einer 10-minütigen Inkubation, um genügend Zeit für die Anheftung der Explantate an die Flaschen zu lassen, wurde Kulturmedium DMEM plus 6 μg/ml Insulin und 5 μg/ml Transferrin zu den Explantaten zugegeben und die Proben wurden bei 37°C mit 5% CO₂ inkubiert. Insgesamt wurden 15 Explantate in jeder Kulturflasche vorbereitet. Zu verschiedenen Zeiten nach der Etablierung der Explantate wurden sie unter einem Hochleistungsmikroskop untersucht, um die Anzahl der Explantate, die sichtbaren Zellauswuchs auf die Kulturschale aufwiesen, zu zählen. Explantate wurden als positiv gezählt, wenn mindestens eine Zelle aus dem Explantatgewebe hinaus auf die Kulturschalenoberfläche migrierte. Die Explantate wurden mindestens für sieben Tage verfolgt. In Experiment #1 wurden die Explantate in den DMEM-Kulturmedien, die mit Insulin und Transferrin ergänzt worden war, und die die folgenden Testproben enthielten, kultiviert: 1) anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk (169.31) mit 50 μg/ml; 2) anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAk (163.31) mit 50 μg/ml oder 3) DMEM-Medien allein (Kontrolle). Bei Experiment #2 wurden die Explantate in DMEM plus Insulin und Transferrin und entweder 1) einem Pool von anti-PDGF-alpha- und -beta-Rezeptor-MAks (169.31 und 163.31) mit jeweils 25 μg/ml, oder 2) DMEM allein (Kontrolle) kultiviert.
Die Ergebnisse, dargestellt als der mittlere Prozentsatz der Explantate, die positiv für Zellauswuchs +/– SEM für jede Testbedingung waren (Tabelle 5), zeigen, dass die monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörper, einzeln wie auch in Pools, in der Lage sind, den Level des Auswuchses glatter Muskelzellen aus den aortalen Pavianexplantaten zu verringern, wenn er entweder nach vier oder sieben Tagen gemessen wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Antikörper in der Lage sind, Prozesse, die für die Zellmigration durch eine feste Matrix erforderlich sind, wie es zum Beispiel für Zellen erforderlich sein könnte, durch bestehendes Gefäßgewebe zu den Orten intimaler Hyperplasie zu migrieren, zu inhibieren.
Beispiel 12 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Inhibition der mitogenen PDGF-Aktivität auf menschlichen dermalen Fibroblasten durch verzögerte Zugabe von monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörpern
Menschliche dermale Fibroblasten wurden mit ungefähr 20000 Zellen pro Vertiefung in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie bis zum Ruhezustand in DMEM, das 2% fötales Kälberserum enthielt, wachsen. Die Zellen wurden entweder mit PDGF-AA, -AB oder -BB stimuliert. Es wurden zunehmende Konzentrationen von jedem der PDGF-Liganden zu den Zellen zugegeben, um Standardkurven der mitogenen Wirksamkeit für die drei PDGF-Isoformen zu erzeugen. Die endgültigen PDGF-Konzentrationen, die für die Standards verwendet wurden, betrugen 5, 2,5, 1,25, 0,62, 0,31, 0,15 und 0,0 ng/ml. 50 × Vorratslösungen von PDGF wurden in 10 mMol Essigsäure, die 0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, hergestellt. 25 μl jeder der Vorratslösungen wurden zu dreifachen Testvertiefungen zugefügt. Um nach der inhibitorischen Aktivität durch die MAks 162.62 und 169.14 Ausschau zu halten, wurden die Fibroblasten enthaltenden Vertiefungen mit 5 ng/ml PDGF, endgültige Konzentration, inkubiert. In verschiedenen Zeitintervallen nach der Zugabe der PDGF-Proben (1, 2, 4, 6 und 8 Stunden) wurde eine gepoolte Probe von MAk 162.62 und MAk 169.14, 25 μg/ml endgültige Konzentration für jeden MAk, zu dreifachen Vertiefungen der Zellen, die mit 5 ng/ml PDGF behandelt worden waren, zugegeben. Neun Stunden nach der Zugabe der PDGF-Proben, wurden 50 μl [³H]Thymidin, 20 μCi/ml in DMEM, das 1 fötales Kälberserum enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Proben wurden für weitere 13–15 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann mit Trypsin geerntet und in einem Betaplate^TM-Flüssigszintillationszähler (Wallac) gezählt.
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 6, werden als mittlere cpm von eingeschlossenem [³H]Thymidin +/– Standardabweichung für dreifache Bestimmungen angegeben. Die Daten werden sowohl für die PDGF-Standardkurven wie auch für den Zeitverlauf der Antikörperzugabe angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass es eine 75%ige Abnahme bei der mitogenen Aktivität für PDGF-AA gab, wenn die anti-PDGF-Rezeptorantikörper so spät wie 8 Stunden nach der Zugabe von PDGF-Ligand zu den Zellen zugegeben wurden. Sowohl für PDGF-AB wie auch -BB rief die Zugabe der anti-PDGF-Rezeptorantikörper 8 Stunden nach der Zugabe des PDGF-Liganden eine größer als 90%ige Abnahme bei der mitogenen PDGF-Aktivität hervor. Diese Studien zeigen, dass die monoklonalen anti-PDGF-Rezeptorantikörper nach einem längeren Zeitraum nach der Gegenwart von PDGF-Ligand zu den Zellen zugegeben werden können und dennoch wirksame neutralisierende Effekte gegenüber mitogener PDGF-Aktivität aufweisen.
Beispiel 13 (NICHT ERFINDUNGSGEMÄß)
Verdrängung von Rezeptor-gebundenem ¹²⁵I-PDGF von menschlichen Osteosarkomzellen durch anti-PDGF-Rezeptor-MAks
Die vier MAks 162.62, 163.31, 169.14 und 169.31 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, ¹²⁵I-PDGF-AA und ¹²⁵I-PDGF-BB, das an PDGF-Rezeptoren auf Monolayern von menschlichen Osteosarkomzellen (ATCC CRL 1427), die ungefähr gleiche Mengen an PDGFr-alpha und PDGFr-beta exprimieren, gebunden war, zu verdrängen, untersucht. Monolayer menschlicher Osteosarkomzellen, die auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen gewachsen waren, wurden für 1 Stunde bei 4°C mit ¹²⁵I-PDGF-AA oder ¹²⁵I-PDGF-BB, verdünnt in Bindungsmedium, inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, dann wurde 1 ml von entweder Bindungsmedium allein, MAk 169.14, 169.31, 162.62, 163.31 oder ein Pool aus 169.31 und 162.62 zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Antikörper wurden in Bindungsmedien verdünnt und zu den Zellen in einer Konzentration von 5 μg/ml, 1 ml/Vertiefung, zugegeben. Die Zellen wurden für 1 Stunde bei 4°C gewaschen, dann mit PBS, mit Extraktionspuffer inkubiert, dann geerntet und in einem Gammazähler gezählt, um den Level der ¹²⁵I-PDGF-Bindung zu überwachen. 100 ng/ml PDGF-BB wurde zu dreifachen Vertiefungen mit ¹²⁵I-PDGF-AA und ¹²⁵I-PDGF-BB zugegeben, um die Level der unspezifischen Bindung zu bestimmen. Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 7, werden als spezifische gebundene cpm (Standardabweichung) für ¹²⁵I-PDGF-AA und ¹²⁵I-PDGF-BB nach der zweiten Inkubation mit den aufgeführten Testverbindungen gezeigt. Der %-Verdrängungswert wurde durch Vergleich der gebundenen cpm für die Testproben im Vergleich zu den gebundenen cpm in den Vertiefungen mit dem Bindungsmedium allein bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAks, 169.14 und 169.31 in der Lage waren, ungefähr 63% des zuvor gebundenen ¹²⁵I-PDGF-AA zu verdrängen. Im Gegensatz dazu wiesen die anti-PDGF-beta-Rezeptor-MAks 162.62 und 163.31 im Grunde keinen Effekt auf, sie verdrängten weniger als 10% der Zählungen. Bei der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung waren die MAks 169.14 und 169.31 in der Lage, zwischen 22–25% der zuvor gebundenen Zählungen zu verdrängen, während MAk 162.62 in der Lage war, 34% der Zählungen zu verdrängen. Der Pool aus 169.31 und 162.62 verdrängte 44% des zuvor gebundenen ¹²⁵I-PDGF-BB. Diese Ergebnisse zeigen, dass zusätzlich zu der Fähigkeit, PDGF-Bindung zu blockieren, die anti-PDGF-Rezeptor-MAks auch in der Lage sind, vorgebundenes PDGF-AA und -BB von Zelloberflächenrezeptoren zu verdrängen.
Beispiel 14
Inhibition von Pavianserum und PDGF-BB-stimulierter glatter Muskelzellmitogenese durch anti-PDGFr-MAks, die unabhängig oder koordiniert mit Heparin angewendet werden
Anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 und anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 wurden unabhängig und in koordinierten Verabreichungs-Assays mit Heparin analysiert, um die Fähigkeit der Antikörper, PDGF-BB und mitogene Pavianserumaktivität auf BVSMCs zu inhibieren, zu bestimmen.
Um die Aktivität der beiden Antikörper allein zu bestimmen und um die kombinierten inhibitorischen Aktivitäten der koordiniert mit Heparin verabreichten Antikörper zu bestimmen, wurden glatte venöse Pavianmuskelzellen bei Passage 7 nach dem Herauswachsen, in Gewebskulturschalen mit 24 Vertiefungen mit 3,0 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in DMEM (GIBCO BRL), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, plattiert. Die Zellen wurden in diesem Medium für 3 Tage bei 37°C unter einer 5%igen CO₂-Athmosphäre erhalten. Das Medium wurde dann durch 1 ml/Vertiefung Mito-Medien ersetzt und die Zellen wurden für zusätzliche 24 Stunden kultiviert.
Bei einem ersten Satz an Experimenten wurde PDGF-BB mit 10 mMol Essigsäure, die 0,25% Kaninchenserumalbumin enthielt, auf eine Konzentration von 40 ng/ml verdünnt. 50 μl dieser Vorratsverdünnung wurde dann zu jeder Vertiefung zugegeben, um eine endgültige Konzentration von 2 ng/ml auf den Zellen zu ergeben. Zu bestimmten Testvertiefungen wurde unfraktioniertes Heparin (UH) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) allein zugegeben oder koordiniert mit einem oder mehreren der anti-PDGFr-Antikörper verabreicht. Das für diese Studien verwendete UH war eine Mischung aus Heparinarten vielfacher Größen mit einer spezifischen Aktivität von annähernd 150 Einheiten/mg in einem standardisierten Aktivierte Partielle Thromboplastin-Zeit (APTT)-Assay. Die Zugabe von Heparin zu den Zellen wurde durch Verdünnung des Heparins auf eine Vorratskonzentration von 400 μg/ml in PBS und Zugabe von 25 μl der Heparinlösung zu den geeigneten Vertiefungen, um eine endgültige Heparinkonzentration von 10 μg/ml auf den Zellen zu ergeben, durchgeführt. Die anti-PDGFr-Antikörper wurden mit PBS verdünnt, um 40 × Vorratskonzentrate zu ergeben, dann wurden 25 μl der Antikörperverdünnung zu den geeigneten Testvertiefungen zugegeben. Diejenigen Vertiefungen, die nur Antikörper oder Heparin erhielten, erhielten unabhängig voneinander 25 μl PBS als eine Pufferkontrolle.
Es wurde ein Dosis-Antwort-Profil für die PDGF-BB-Stimulierung durch Herstellung zweifacher Verdünnungen des PDGF mit 10 mMol Essigsäure, die Kaninchenserumalbumin enthielt, und Zugabe von 50 μl der Vorratslösungen zu den entsprechenden Vertiefungen erzeugt, um endgültige PDGF-BB-Konzentrationen auf den Zellen von 2, 1 und 0,5 ng/ml zu ergeben.
Nach Zugabe der Behandlungen, wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die mitogene Stimulierung von BVSMCs wurde durch Messung der Aufnahme von [³H]Thymidin bestimmt. 50 μl einer 740 KBq/ml (20 μCi/ml) [³H]Thymidin-Vorratslösung, hergestellt in DMEM, wurde direkt zu den Zellen für eine endgültige Konzentration von 37 KBq/Vertiefung (1 μCi/Vertiefung) zugegeben. Diese Zellen wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert, einmal mit PBS gewaschen, mit 0,25 ml Trypsin behandelt, bis sich Zellen abtrennten und auf einen Filter unter Verwendung eines Zellernters (LKB Wallac) geerntet. Die Filter wurden unter Verwendung eines Betaplate^TM-Flüssigszintillationszählers (Wallac) gezählt.
Die Daten der Antikörper und Antikörper/Heparin-Inhibition der PDGF-BB-Stimulierung werden in Tabelle 8 gezeigt. Die Daten in Tabelle 8 werden als mittlere Zählungen pro Minute (counts per minute, cpm) von mit PDGF-BB-stimulierten glatten Pavianmuskelzellen eingeschlossenem [³H]Thymidin dargestellt. Die Werte prozentualer Inhibition wurden direkt aus der gemessenen Abnahme des Einschlusses von [³H]Thymidin bestimmt. In Tabelle 8 ist eine Dosis-Antwort-Tabelle der mitogenen PDGF-BB-Aktivität eingeschlossen. Bei Experiment #1 rief die Zugabe von Antikörper 169.31 zu Zellen, die mit PDGF-BB stimuliert worden waren, eine deutliche Inhibition des [³H]Thymidin-Einschlusses bei Antikörperdosierungen von 1 und 0,1 μg/ml hervor. Die Verabreichung von Heparin an die Zellen koordiniert mit Antikörper 169.31 resultierte in einem kombiniert effektivem antimitogenem Ergebnis, sprich der [³H]Thymidin-Einschluss wurde in einem größeren Ausmaß inhibiert, als entweder für den Antikörper oder Heparin bei alleiniger Verabreichung gemessen wurde. Die Analyse von Antikörper 163.31, Experiment #1, zeigte, dass eine Dosis von 25 μg/ml auch in der Lage war, den [³H]Thymidin-Einschluss zu inhibieren, aber in einem viel geringerem Maße, als für Antikörper 169.31 beobachtet wurde. Wenn Heparin zusammen mit Antikörper 163.31 zugegeben wurde, wurde auch eine kombiniert effektive Inhibition beobachtet, aber dieser Effekt wurde nur bei höheren Antikörperkonzentrationen gesehen. Die koordinierte Anwendung von den Antikörpern 169.31 (1 μg/ml) und 163.31 (25 μg/ml) resultierte auch in einem kombiniert antimitotischen Ergebnis, wobei die Inhibition des PDGF-BB-stimulierten [³H]Thymidin-Einschlusses durch die BVSMCs größer war als diejenige, die man nach der Verabreichung von jedem Antikörper allein beobachtete.
Bei Experiment #2 wurden die Antikörper 169.31 und 163.31 weiter analysiert, beide unabhängig voneinander und in koordinierten Verabreichungs-Assays miteinander oder mit Heparin (UH, 10 μg/ml), um die antimitotischen Aktivitäten dieser verschiedenen Behandlungen auf PDGF-BB-stimulierten [³H]Thymidin-Einschluss durch BVSMCs zu bestimmen. Ähnlich zu den Ergebnissen aus Experiment #1 stellte die koordinierte Verabreichung der beiden Antikörper eine effektivere Inhibition der mitogenen Aktivität auf BVSMCs bereit, als die Verabreichung von jedem der Antikörper allein. Zusätzlich führte die koordinierte Verabreichung von Heparin mit einem Pool der zwei Antikörper zu einer kombiniert effektiven Inhibition über die inhibitorischen Aktivität hinaus, die durch das Heparin oder den Antikörper-Pool allein bereitgestellt wurde.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass die koordinierte Verabreichung von Heparin mit jedem der anti-PDGFr-alpha- oder anti-PDGFr-beta-Antikörper oder mit einem Pool aus diesen zwei Antikörpern wie auch die koordinierte Verabreichung der Antikörper miteinander eine kombiniert effektive Behandlung gegen mitogene PDGF-BB-Aktivität auf BVSMCs bereitstellen kann.
Die Inhibition der mitogenen Aktivität von Pavianserum wurde in einem parallelen Satz an Experimenten getestet. Die Experimente wurden im Grunde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei Pavianserum zu den Testvertiefungen in einer endgültigen Konzentration von 1,25% durch Verdünnung des Serums 1 : 4 mit PBS und Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums zu jeder Vertiefung zugegeben wurde. Es wurde ein Dosis-Antwort-Profil für die Pavianserum-Stimulierung durch Herstellung zweifacher Verdünnungen des Pavianserums in PBS und Zugabe von 50 μl der geeigneten Verdünnungen, um endgültige Serumkonzentrationen auf den Zellen von 1,25, 0,62, 0,31 und 0,15% zu ergeben, erzeugt.
Die Daten für die Antikörper und Antikörper/Heparin-Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf BVSMCs werden in Tabelle 9 dargestellt. Diese Daten zeigen, dass der monoklonale Antikörper 169.31 einen minimalen inhibitorischen Effekt auf den [³H]Thymidin-Einschluss, stimuliert durch die Zugabe von 1,25% Pavianserum, bei Dosierungen des Antikörpers bis zu 1 μg/ml aufwies. Wenn Heparin koordiniert zusammen mit dem Antikörper 169.31 den Zellen verabreicht wurde, war der beobachtete Level der Inhibition nicht größer als die inhibitorische Aktivität, die von Heparin alleine gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu zeigten die Assays, die monoklonalen Antikörper 163.31 beinhalteten, eine signifikante Inhibition des [³H]Thymidin-Einschlusses bei einer Antikörperkonzentration von 25 μg/ml. Darüber hinaus, wenn Heparin koordiniert mit Antikörper 163.31 verabreicht wurde, gab es eine deutliche kombiniert effektive Inhibition der mitogenen Aktivität, wie durch [³H]Thymidin-Einschluss gemessen wurde, sprich deutlich oberhalb der antimitogenen Effekte, die man entweder für den Antikörper oder Heparin allein beobachtete. Diese kombiniert effektive Inhibition war bei MAk 163.31-Konzentrationen zwischen 0,2 μg/ml und 5 μg/ml besonders ausgeprägt.
Die koordinierte Verabreichung von 1 μg/ml Antikörper 169.31 mit zunehmenden Dosierungen von Antikörper 163.31 zeigte eine dosisabhängige Inhibition des [³H]Thymidin-Einschlusses. Die koordinierte Verabreichung von Antikörper 169.31 mit Antikörper 163.31 resultierte auch in einer ausgeprägten kombiniert effektiven Inhibition der mitogenen Serumaktivität, wie in Tabelle 9 gezeigt wird.
Die Daten in Tabelle 9 werden als mittlere Zählungen pro Minute (cpm) des durch glatte Pavianmuskelzellen, die mit 1,25%igem Pavianserum stimuliert wurden, eingeschlossenen [³H]Thymidins dargestellt. Die Werte der prozentualen Inhibition wurden aus einer Standardkurve, die unter Verwendung der dargestellten Serum-Dosis-Antwort-Daten erzeugt wurde, berechnet.
Beispiel 15
Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf glatten Paviangefäßmuskelzellen durch allein verabreichtes Heparin oder koordiniert mit anti-PDGFr-MAks verabreichtes Heparin
Sowohl unfraktioniertes Heparin (UH) (Sigma, St. Louis, MO) wie auch niedermolekulares Heparin (NMH) (Logiparin^®, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark) wurden auf ihre Fähigkeit, die mitogene Aktivität von Pavianserum auf glatten Paviangefäßmuskelzellen zu inhibieren, untersucht. Jede Form des Heparins wurde den Zellen unabhängig von oder koordiniert mit anti-PDGFr-MAks verabreicht. Das für diese Studien verwendete NMH wurde durch Heparinasebehandlung eines unfraktionierten Heparins erzeugt und besteht aus Heparinarten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5 500 Dalton. Das NMH hat eine verringerte antithrombotische Aktivität, geschätzt auf ungefähr 50 Einheiten/mg, im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin in einem APTT-Assay.
Um die antimitogene Aktivität der zwei Heparinpräparate, mit und ohne koordiniert verabreichte anti-PDGFr-Antikörper, zu bestimmen, wurden BVSMCs aus aortalen Ex plantaten (bezeichnet als BO54-Zellen) auf Gewebekulturschalen mit 24 Vertiefungen mit 2,5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in DMEM (GIBCO BRL), das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt wurde, plattiert. Die Zellen wurden in diesem Medium für 3 Tage bei 37°C unter einer 5%igen CO₂-Atmosphäre erhalten. Die Medien wurden dann durch 1 ml/Vertiefung Mito-Medien ersetzt und die Zellen wurden in diesen Medien für zusätzliche 24 Stunden kultiviert.
Es wurde Pavianserum zu den Testvertiefungen in einer endgültigen Konzentration von 2,5% zugegeben. Dies erreichte man durch Verdünnung des Serums 1 : 1 mit PBS und Zugabe von 50 μl des verdünnten Serums zu jeder Vertiefung. Um die Heparinpräparate auf ihre Inhibition der Pavianserum-stimulierten DNA-Synthese in glatten Pavianmuskelzellen zu untersuchen, wurde Heparin zu den Zellen entweder unabhängig oder koordiniert mit den zwei monoklonalen anti-PDGFr-Antikörpern zugegeben. Die Heparinproben wurden mit PBS verdünnt, um ein 400 μg/ml-Konzentrat zu ergeben, dann wurden 25 μl des Konzentrats zu jeder Testvertiefung zugegeben, um eine endgültige Heparinkonzentration von 10 μg/ml zu ergeben. Kontrollvertiefungen erhielten nur Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 und anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 wurden mit PBS auf 40 μg/ml bzw. 1 mg/ml verdünnt, und 25 μl der verdünnten Antikörper wurden zu den entsprechenden Testvertiefungen zugegeben, um endgültige Antikörperkonzentrationen von 1 μg/ml für MAk 169.31 und 25 μg/ml für MAk 163.31 zu ergeben.
Nach der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die mitogene Stimulierung der glatten Muskelzellen wurde durch Messung des zellulären Einschlusses von [³H]Thymidin beurteilt, wie in Beispiel 14 offenbart wird.
Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 10 dargestellt. Diejenigen Zellen, die nur mit Serum in der Abwesenheit von entweder Heparin oder anti-PDGFr-MAks behandelt wurden, hatten einen Kontrollwert für den [³H]Thymidin-Einschluss von 36032 cpm/Vertiefung. Die Behandlung der Zellen mit koordiniert verabreichten monoklonalen anti-PDGFr-alpha- und anti-PDGFr-beta-Antikörpern rief eine Abnahme des [³H]Thymidin-Einschlusses auf 27000 cpm hervor (sprich eine 25%ige Inhibition der serumstimulierten DNA-Synthese). Es gab keine signifikante Reduktion des [³H]Thymidin-Einschlusses, wenn die Zellen entweder mit UH oder NMH allein behandelt wurden. Es wurde jedoch eine signifikante Abnahme des [³H]Thymidin-Einschlusses beobachtet, wenn entweder das UH oder das NMH koordiniert mit dem Pool der anti-PDGFr-Antikörper zu den Zellen zugegeben wurde. Die Daten zeigen, dass sowohl UH wie auch NMH, wenn sie koordiniert mit einem Pool von anti-PDGFr-alpha- und anti-PDGFr-beta-Antikörpern verabreicht werden, die mitogene Aktivität von autologem Serum auf BVSMCs auf eine kombiniert effektive Weise inhibieren. Hier zeigt der Grad der kombiniert effektiven Inhibition, der erreicht wurde, wieder einen synergistischen oder potenzierenden Zusammenhang zwischen dem Antikörper und Heparin bei dem besonderen Regime der koordinierten Verabreichung, das getestet wurde.
Beispiel 16
Dosis-Antwort der Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf glatten Paviangefäßmuskelzellen durch anti-PDGFr-MAks, die koordiniert mit unfraktioniertem Heparin oder niedermolekularem Heparin angewendet werden
Es wurde ein Dosis-Antwort-Assay des monoklonalen anti-PDGFr-beta-Antikörpers 163.31 in der Gegenwart einer konstanten Menge an anti-PDGFr-alpha-Antikörper 169.31 (1 μg/ml) durchgeführt, um die Konzentrationsabhängigkeit der anti-PDGFr-MAk-Inhibition der DNA-Synthese in BVSMCs, die durch Pavianserum stimuliert wurden, zu beurteilen. Diese Dosis-Antwort wurde in der Abwesenheit von irgendwelchem zugegebenem Heparin wie auch in der Anwesenheit von 10 μg/ml von entweder einem unfraktionierten Heparin (UH) mit einer antithrombotischen Aktivität von ungefähr 150 Einheiten/mg im APPT-Assay (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder einem nieder molekularen Heparin (NMH) (Logiparin^®, ungefähr 50 Einheiten/mg im APPT-Assay) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark), beurteilt.
Für diese Dosis-Antwortstudien, wurden BVSMCs aus aortalen Explantaten (BO54-Zellen) auf Gewebskulturschalen mit 24 Vertiefungen mit 2,5 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung in DMEM, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt worden war, plattiert. Nach 3 Tagen wurden die Medien durch Mito-Medien ersetzt und die Zellen wurden für zusätzliche 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch die Zugabe von 50 μl/Vertiefung Pavianserum, das 1 : 1 mit PBS verdünnt worden war, was eine endgültige Serumkonzentration von 2,5% auf den Zellen ergab, stimuliert, um Mitose durchzumachen. MAk 163.31 wurde mit PBS verdünnt, um 40 × Konzentrate herzustellen, und 25 μl des verdünnten Antikörpers wurden zu den Testvertiefungen zugegeben, um endgültige Antikörperkonzentrationen auf den Zellen, die von 25 μg/ml bis 1,25 μg/ml reichten, zu ergeben. 25 μl einer 40 μg/ml-Lösung von MAk 169.31 wurde gleichzeitig zu den Vertiefungen zugegeben, um eine endgültige Antikörperkonzentration von 1 μg/ml in allen der mit 163.31 behandelten Vertiefungen zu ergeben. Die Kombination der monoklonalen Antikörper 163.31 und 169.31 wurde in der Abwesenheit von irgendwelchem zugegebenen Heparin und alternativ in einem koordinierten Verabreichungs-Assay mit entweder UH oder NMH getestet. Die beiden Heparinpräparate wurden mit PBS auf eine endgültige Konzentration von 400 μg/ml verdünnt, und 25 μl des Konzentrates wurde zu den entsprechenden Vertiefungen zugegeben, um eine endgültige Heparinkonzentration auf den Zellen von 10 μg/ml zu ergeben. Zu denjenigen Testvertiefungen, die nicht Heparin erhielten, wurde PBS allein zugegeben.
Nach der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die mitogene Aktivität wurde durch Messung der Aufnahme von [³H]Thymidin beurteilt, wie in Beispiel 14 offenbart wird.
Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 11 dargestellt. In der Abwesenheit von Heparin wurde eine signifikante Abnahme der mitotischen Aktivität der BVSMCs nur bei denjenigen Vertiefungen beobachtet, die die 25 und 10 μg/ml Dosen des monoklonalen Antikörpers 163.31 erhalten hatten. In der Gegenwart von entweder UH oder NMH stellten jedoch alle getesteten Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers 163.31 (in der Gegenwart einer konstanten Menge MAk 169.31) eine signifikante kombiniert effektive Inhibition mit im wesentlichen identischen Ergebnissen, wie man sie für die zwei Heparinpräparate erhielt, bereit. In der Gegenwart von Heparin war die 1,25 μg/ml Dosis von 163.31 bei der Inhibition der DNA-Synthese effektiver als die 25 μg/ml Dosierung von 163.31 in der Abwesenheit von Heparin. Die Gegenwart von entweder UH o der NMH, die unabhängig von irgendeinem Antikörper verabreicht wurden, wies nur einen minimalen Effekt auf die mitogene Aktivität des Serums auf.
Tabelle 11
Beispiel 17
Vergleich der antimitogenen Aktivitäten von anti-PDGFr-alpha- Maus-MAk 169.31 mit Maus/Mensch-chimärem anti-PDGFr-alpha-Antikörper
Ein Maus/Mensch-chimärer Antikörper wurde unter Verwendung des monoklonalen anti-PDGFr-alpha-Antikörpers 169.31 als dem Elternantikörper für das Ausklonieren der variablen leichte und schwere Ketten-Domänen erzeugt. Dieser Maus/Mensch-chimärer Antikörper umfasst die variablen Domänen des monoklonalen Maus-Eltern-Antikörpers und die konstanten Domänen für die menschliche schwere IgG4-Kette und menschliche leichte Kappa-Kette. Beim Aufbau dieses Antikörpers verwendete man Standardtechni ken wie in Mountain und Adair beschrieben (Biotech. and Genet. Eng. Rev. 10: 1–142, 1992; und Adair et al, Immunol. Rev. 130: 5–40, 1992). Der Maus-Eltern-Antikörper und der Maus/Mensch-chimäre Antikörper wurden direkt hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die DNA-Synthese von BVSMCs (BO54), die mit 2% Pavianserum stimuliert wurden, zu inhibieren, verglichen.
Die Eltern-Maus- und die chimären anti-PDGFr-alpha-Antikörper wurden beide mit 1,0 und 0,1 μg/ml in der Gegenwart von 10 μg/ml anti-PDGFr-beta-Maus-Antikörper 163.31 und 10 μg/ml unfraktionierten Heparins (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N. J.; spezifische Aktivität ≅ 150 Einheiten/mg) analysiert. Zusätzliche wurden beide anti-PDGFr-alpha-Antikörper (1 μg/ml) zu den Zellen in der Gegenwart von 10 μg/ml des chimären anti-PDGFr-beta-Antikörpers (siehe Beispiel 18) und 10 μg/ml Heparin zugegeben. Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 12, zeigen, dass sowohl der Eltern-Maus-MAk 169.31 wie auch der Maus/Mensch-chimäre anti-PDGFr-alpha-Antikörper eine ähnliche inhibitorische Wirksamkeit in der Gegenwart von entweder dem anti-PDGFr-beta-Eltern-Maus-MAk 163.31 oder dem Maus/Mensch-chimärem anti-PDGFr-beta-Antikörper besitzt.
Tabelle 12 Antimitogene Aktivitäten von Eltern-Maus- und Maus/Mensch-chimären anti-PDGFr-alpha-Antikörpern, die koordiniert mit Heparin verabreicht werden
Beispiel 18
Vergleich der antimitogenen Aktivitäten von anti-PDGFr-beta-Maus-MAk 163.31 mit Maus/Mensch-chimärem anti-PDGFr-beta-Antikörper
Ein Maus/Mensch-chimärer anti-PDGFr-beta-Antikörper wurde unter Verwendung des monoklonalen anti-PDGFr-beta-Maus-Antikörpers 163.31 als dem Eltern-Antikörper für das Ausklonieren der variablen leichten und schweren Kettendomänen erzeugt. Dieser Maus/Mensch-chimäre Antikörper umfasst die variablen Domänen des monoklonalen Eltern-Maus-Antikörpers und die konstanten Domänen für die menschliche schwere IgG4-Kette und die menschliche leichte Kappa-Kette. Beim Aufbau dieses Antikörpers verwendete man die gleichen Standardtechniken für den chimären Antikörperaufbau wie oben für den chimären anti-PDGFr-alpha-Antikörper beschrieben (Beispiel 17). Der Eltern-Maus-Antikörper und der Maus/Mensch-chimäre Antikörper wurden direkt hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die DNA-Synthese in mit 2% Pavianserum stimulierten, glatten Pavianmuskelzellen zu inhibieren, verglichen.
BVSMCs (BO54) wurden in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden in DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthielt, bei 37°C wachsen. Die Zellen wurden dann für 24 Stunden in Mito-Medien inkubiert, um sie zum Ruhezustand kommen zu lassen.
Eine Kontrollplatte von Zellen wurde mit einer zweifachen Verdünnungsserie von normalem Pavianserum (2% bis 0,125%) stimuliert, um eine Standardkurve herzustellen. Das Serum wurde in PBS verdünnt, und 50 μl eines 20×-Vorrats wurde direkt zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung zugegeben.
Es wurde eine Verdünnungsserie des anti-PDGFr-beta-MAks 163.31 oder des chimären anti-PDGFr-beta-Antikörpers koordiniert den entsprechenden Testvertiefungen mit dem anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 (1 μg/ml) und unfraktioniertem Heparin (2 Einheiten/ml) (Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, N. J.) verabreicht, um die inhibitorischen Effekte dieser Behandlungen auf BVSMCs, die mit 2% Pavianserum stimuliert wurden, zu beurteilen. Zusätzlich wurden die anti-PDGFr-beta-Eltern- und himären Antikörper in unabhängigen Verabreichungs-Assays und in koordinierten Verabreichungs-Assays unter Verwendung des Antikörpers und Heparins analysiert. Die Antikörper und Heparin wurden zu den entsprechenden Testvertiefungen mit 25 μl/Vertiefung eines 40×-Vorrats, verdünnt in PBS, zugegeben. Die Antikörperkonzentrationen, die verwendet wurden, werden in Tabelle 13 angezeigt.
Nach der Verabreichung der Testproben wurden die Zellen für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die mitogene Aktivität wurde durch die Aufnahme von [³H]Thymidin beurteilt.
Die Ergebnisse des anti-PDGFr-beta-MAk-Dosis-Antwort-Experimentes, dargestellt in Tabelle 13, zeigen, dass die Pavianserum-induzierte mitogene Aktivität zu ungefähr 80% durch eine Kombination von 25 μg/ml 163.31, 1 μg/ml 169.31 und 2 Einheiten/ml Heparin inhibiert wurde. Ähnliche Ergebnisse erhielt man unter Verwendung des chimären anti-PDGFr-beta-MAks. Die koordinierte Verabreichung von jedem der Maus- und chimären anti-PDGFr-beta-MAks mit 25 μg/ml mit dem anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31, resultierte in einer annähernd 30%igen Inhibition der mitogenen Aktivität von Pavianserum. Die anti-PDGFr-beta-MAks, die koordiniert mit Heparin verabreicht wurden, wiesen eine ungefähr 40%ige Inhibition auf. Jeder der antimitogenen Wirkstoffe resultierte, wenn er unabhängig verabreicht wurde, in einer geringeren als 30%igen Inhibition der mitogenen Aktivität von Pavianserum.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Maus/Mensch-chimäre anti-PDGFr-beta-Antikörper eine ähnlich inhibitorische Aktivität besitzt wie diejenige des anti-PDGFr-beta-Eltern-Maus-Antikörpers MAk 163.31. Diese Aktivität stellt eine kombiniert effektive Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf BVSMCs bereit, wenn der chimäre anti-PDGFr-beta-Antikörper koordiniert mit entweder dem anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31, Heparin oder einer Kombination von anti-PDGFr-alpha-MAk und Heparin verabreicht wird.
Beispiel 19
Dosis-abhängige Inhibition der mitogenen Serumaktivität auf glatten Paviangefäßmuskelzellen durch Heparin, das entweder unabhängig oder koordiniert mit anti-PDGFr-Antikörpern verabreicht wird
Glatte Pavianmuskelzellen (BO54) wurden in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 72 Stunden in DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthielt, bei 37°C wachsen. Die Zellen wurden dann in den Ruhezustand überführt, indem man sie für 24 Stunden in Mito-Medien inkubierte. Es wurde die Fähigkeit von Heparin allein, die mitogene Stimulation durch 2%iges Pavianserum zu inhibieren, durch Zugabe einer Verdünnungsserie von entweder einem unfraktionierten Heparin (UH; ungefähr 150 Einheiten/mg) (Elkins-Sinn, Inc.) oder niedermolekularem Heparin (NMH; Logiparin^®, ungefähr 50 Einheiten/mg) (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Dänemark) zu den Zellen in Dosierungen, die von 15 Einheiten/ml bis 0,06 Einheiten/ml (endgültige Konzentration auf den Zellen) reichten, getestet. Die gleiche Verdünnungsserie für die beiden Heparintypen wurde auch in der Gegenwart von anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 (10 μg/ml) und anti-PDGFr-alpha-MAk 169.31 (1 μg/ml) getestet.
Nach der Zugabe der Behandlungen wurden die Zellen für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die mitogene Serumaktivität wurde durch Messung der Aufnahme von [³H]Thymidin beurteilt. Die Ergebnisse der Heparin-Dosis-Antwort-Experimente werden in Tabelle 14 dargestellt. Heparin alleine besaß bei den höchsten getesteten Dosierungen nur einen bescheidenen inhibitorischen Effekt auf den [³H]Thymidin-Einschluss durch BVSMCs, während die gleichen Dosierungen, koordiniert verabreicht mit den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern, in Kombination bis zu 90% der mitogenen Serumaktivität inhibierten. Unter Annahme einer spezifischen Aktivität von 150 Einheiten/mg für das Elkins-Sinn unfraktionierte Heparin und 50 Einheiten/mg für das niedermolekulare Heparin, lagen die höchsten verwendeten Dosierungen für die zwei Heparinpräparate bei ungefähr 100 bzw. 300 μg/ml. Bei diesen Konzentrationen gab es in den unabhängigen Verabreichungs-Assays nur eine minimale Inhibition der mitogenen Aktivität. Im Gegensatz dazu gab es bei 100-fach niedrigeren Heparindosierungen eine signifikante kombiniert effektive Zunahme der inhibitorischen Aktivität, wenn das Heparin koordiniert mit den anti-PDGFr-Antikörpern verabreicht wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass signifikant niedrigere Dosierungen von Heparin verwendet werden können, um auf eine kombiniert effektive Weise mit den anti-PDGFr-Antikörpern zu wirken, um den [³H]Thymidin-Einschluss zu inhibieren und das weit über den Inhibitionsleveln, die man mit den Antikörpern oder Heparin alleine erreicht.
Beispiel 20
Inhibition der glatten Muskelzell-Migration aus aortalen Pavianexplantaten durch koordinierte Verabreichung von anti-PDGFr-MAks und Heparin
Monoklonale anti-PDGFr-Antikörper wurden weiter in der Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin auf ihre Fähigkeit, die Raten der glatten Paviangefäßmuskelzellen-Migration aus Explantaten von aortalem Paviangewebe zu verringern, getestet. Die aortalen Pavianexplantate wurden im Grunde wie in Beispiel 11 beschrieben vorbereitet. Die Explantate wurden in DMEM kultiviert, das mit Insulin und Transferrin ergänzt worden war und die folgenden Testproben enthielt: 1) anti-PDGFr-alpha-MAk (169.31) und anti-PDGFr-beta-MAk (163.31), jeder Antikörper mit 25 μg/ml, 2) unfraktioniertes Heparin (Sigma Chemical Co.) (100 μg/ml), 3) anti-PDGF-alpha-Rezeptor-MAk (169.31) und anti-PDGF-Rezeptor-MAk (163.31) (jeweils 25 μg/ml) und unfraktioniertes Heparin (100 μg/ml), und 4) DMEM (Kontrolle).
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 15, zeigen, dass, wenn er 7 Tage nach der Etablierung der Explantate gemessen wurde, Heparin alleine den Level der glatten Muskelzell-Ausmigration auf 82% der Kontrolle verringerte, während die anti-PDGF-Rezeptorantikörper-Kombination das Herauswachsen auf 64% der Kontrolle verringerte. Die koordinierte Verabreichung von sowohl den anti-PDGF-Rezeptorantikörpern wie auch Heparin verringerte den Level der Ausmigration weiter auf 42% der Kontrolle. So inhibierten Heparin und die anti-PDGF-Rezeptorantikörper in Kombination die glatte Muskelzell-Ausmigration bei den getesteten koordinierten Verabreichungsregimen.
Beispiel 21
Sättigungs-Bindungsanalyse von MAk 163.31 auf BO54-Zellen in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin
Es wurde die Bindungsfähigkeit von anti-PDGFr-beta-MAk 163.31 auf glatten Pavianmuskelzellen (BO54) in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin getestet. Es wurden glatte Pavianmuskelzellen (BO54) in einer Dichte von 20000 Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden bei 37°C in DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthielt, wachsen. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Mito-Medien bis sie den Ruhezustand erreichten inkubiert, dann einmal mit 4°C Bindungsmedien (DMEM/Hams F-12, 25 mMol Hepes, 0,1% BSA) gewaschen. Es wurde die Bindungsaktivität von MAk 163.31 auf PDGF-beta-Rezeptoren in der Gegenwart von Heparin durch Zugabe vierfacher Verdünnungen von ¹²⁵I-markiertem MAk 163.31 (¹²⁵I-163.31) in 4°C Bindungsmedien (in einem Bereich von 2,1 × 10⁶ bis 1 × 10³ cpm/ml) und 10 μg/ml Heparin (Elkins-Sinn, Inc.) zu den entsprechenden Vertiefungen in dreifacher Ausführung in 1 ml Aliquots analysiert. Auf einer separaten Platte wurde die gleiche Verdünnungsserie von ¹²⁵I-163.31 ohne Heparin zugegeben. Um den Level der unspezifischen Bindung durch ¹²⁵I-163.31 zu bestimmen, wurde ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder Platte, die 5,5 × 10⁵ cpm/Vertiefung des ¹²⁵I-163.31 plus 25 μg/ml unmarkiertes 163.31 enthielt, vorbereitet. Die Platten wurden auf Eis gehalten, während die Proben zugegeben wurden, dann für 1,5 Stunden bei 4°C auf einem Rundschüttler inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit einem Extraktionspuffer (PBS, 1% NP-40) inkubiert, und die Extrakte wurden in 12 × 75 mm Röhrchen geerntet und in einem Gammazähler gezählt. Die Ergebnisse der Bindungsstudien, dargestellt in Tabelle 16, zeigen, dass die koordinierte Zugabe von Heparin und Antikörper keinen signifikanten Effekt auf die Antikörperbindung ausübte. So scheint die kombinierte Effektivität von mit den anti-PDGFr-beta-Antikörpern koordiniert verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen, nicht auf irgendeine Stimulation der Bindung der Antikörper an Zelloberflächen-PDGFr-beta-Rezeptoren durch Heparin zurückzuführen zu sein.
Beispiel 22
Sättigungs-Bindungsanalyse von PDGF-BB auf glatten Paviangefäßmuskelzellen in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin
Die Fähigkeit von PDGF-BB an seinen Rezeptor auf glatten Paviangefäßmuskelzellen zu binden, wurde in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin getestet. Es wurden glatte Pavianmuskelzellen (BO54) in einer Dichte von 20000 Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden bei 37°C in DMEM, das 10% fötales Kälberserum enthielt, wachsen. Man überführte die Zellen dann durch ihre Inkubation für 24 Stunden in Mito-Medien in den Ruhezustand, dann wurden sie einmal mit 4°C Bindungsmedien gewaschen. Es wurde die Bindungs aktivität von PDGF-BB an seinen Rezeptoren in der Gegenwart von Heparin durch Zugabe zweifacher Verdünnungen von ¹²⁵I-PDGF-BB in 4°C Bindungsmedien (in einem Bereich von 2 × 10⁵ bis 2,5 × 10⁴ cpm/ml), die 10 μg/ml Heparin (Elkins-Sinn, Inc.) enthielten, zu den entsprechenden Vertiefungen in dreifacher Ausführung in 1 ml Aliquots analysiert. Auf einer separaten Platte wurde die gleiche Verdünnungsserie von ¹²⁵I-PDGF-BB ohne Heparin zugegeben. Ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder Platte enthielt auch 2,0 × 10⁵ cpm/Vertiefung ¹²⁵I-PDGF-BB zusätzlich zu 1 μg/ml unmarkiertem PDGF-BB, um den Level unspezifischer Bindung durch ¹²⁵I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Platten wurden auf Eis gehalten, während die Proben zugegeben wurden, und dann für 1,5 Stunden bei 4°C auf einem Rundschüttler inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden in 12 × 75 mm Röhrchen geerntet und in einem Gammazähler gezählt.
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 17, zeigen, dass die Gegenwart von Heparin keinen signifikanten Effekt auf die ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung ausübte. So scheint die kombinierte Effektivität von mit den anti-PDGFr-Antikörpern koordiniert verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen, nicht auf irgendeine Inhibition der Bindung von PDGF-BB an Zelloberflächen-PDGF-Rezeptoren durch Heparin zurückzuführen zu sein.
Beispiel 23
Inhibition der PDGF-BB-Bindung an glatte Muskelzellen durch MAk 163.31 in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin
Es wurde ein Experiment durchgeführt, um die Fähigkeit von MAk 163.31, die ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an den PDGF-beta-Rezeptor auf glatten Paviangefäßmuskelzellen in der Gegenwart und Abwesenheit von Heparin zu inhibieren, zu bestimmen.
Glatte Pavianmuskelzellen (BO54) wurden in einer Dichte von 20000 Zellen/Vertiefung auf Kulturplatten mit 24 Vertiefungen plattiert, und man ließ sie für ungefähr 48 Stunden bei 37°C in DMEM, das 10% fötales Rinderserum enthielt, wachsen. Die Zellen wurden für 24 Stunden in Mito-Medien inkubiert, um sie in den Ruhezustand zu überführen, dann wurden sie einmal mit 4°C-Bindungsmedien gewaschen. MAk 163.31 wurde in Bindungsmedien auf die Konzentrationen, die in Tabelle 18 gezeigt werden, verdünnt, dann mit ¹²⁵I-PDGF-BB und 10 μg/ml Heparin (Elkins-Sinn, Inc.) gemischt, und 1 ml Aliquots der Mischung wurden in dreifacher Ausführung zu den Vertiefungen von BO54-Zellen zugegeben. Auf einer separaten Platte wurde die gleiche Verdünnungsserie von 163.31 zu ¹²⁵I-PDGF-BB ohne Heparin zugegeben. Ein Satz dreifacher Vertiefungen auf jeder Platte enthielt ¹²⁵I-PDGF-BB plus 1 μg/ml unmarkiertes PDGF-BB, um den Level der unspezifischen Bindung durch ¹²⁵I-PDGF-BB zu bestimmen. Die Platten wurden auf Eis gehalten, während die Proben zugegeben wurden, dann für 1,5 Stunden bei 4°C auf einem Rundschüttler inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, wurden die Zellen mit einem Extraktionspuffer inkubiert und die Extrakte wurden auf 12 × 75 mm Röhrchen übertragen und in einem Gammazähler gezählt.
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 18, zeigen, dass die Gegenwart von Heparin keinen signifikanten Effekt auf die dosisabhängige inhibitorische Aktivität von MAk 163.31 auf ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an BVSMCs hatte. So scheint die kombinierte Effektivität von mit den anti-PDGFr-Antikörpern koordiniert verabreichtem Heparin, gezeigt in den obigen Beispielen, nicht auf irgendeine direkte Modulierung der PDGF-BB-inhibitorischen Bindungsaktivität des anti-PDGFr-beta-Antikörpers durch Heparin zurückzuführen zu sein.
Beispiel 24
Kontinuierliche intravenöse Infusion der MAks 169.31 und 163.31 in Paviane und Analyse der Pavian-anti-Maus-IgG-Antwort
Diese Studie wurde entworfen, um die zirkulierenden Spiegel der anti-PDGFr-Maus-Antikörper nach kontinuierlicher Infusion auf entweder intravenösen oder intraperitonealen Wegen zu überwachen. Ein Pool von anti-PDGFr-MAks 163.31 und 169.31 wurde mit den zwei Antikörpern in ungefähren Konzentrationen von 36 bzw. 22 mg/ml erstellt. Die Antikörper wurden in einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff aus 1,5% Glycin, 0,2 Mol NaCl und 0,01% Tween-20^® formuliert. Der Antikörperpool wurde in osmotische 14 Tage-Alzet-Pumpen, die 2,1 ml Probe enthalten und in einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 μl/h abgeben, gefüllt. Zwei Pumpen wurden in jedes der drei Versuchstiere eingepflanzt. Zweien der Tiere wurden die Pumpen intraperitoneal (IP) in die Perito nealhöhle eingepflanzt und einem Tier wurden die Pumpen in den subkutanen Raum eingepflanzt und der Antikörper intravenös (IV) durch die Verwendung eines Silastic-Katheters, der in das Venensystem eingepflanzt wurde, abgegeben.
Es wurden Plasmaproben von den Versuchstieren an den Tagen 1, 7, 14, 21 und 28 nach der Pumpeneinpflanzung abgenommen. Die Plasmaproben wurden hinsichtlich der zirkulierenden Spiegel der anti-PDGFr-Antikörper durch ELISA analysiert. Zusätzlich wurden die Plasmaproben hinsichtlich der Gegenwart von Pavian-Antikörpern, die gegen die Maus-Antikörper gerichtet waren, analysiert.
Um auf die Gegenwart der Maus-Antikörper zu untersuchen, wurden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit entweder Ziegen-anti-Maus-IgG1 (Sigma Chemical Co.) oder Ziegen-anti-Maus-IgG2a (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) mit 1 μg/ml in ELISA A-Puffer beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, dann zweimal mit ELISA C-Puffer gewaschen. Die Platten wurden die Zugabe von ELISA B-Puffer für 2 Stunden bei 37°C blockiert, dann zweimal mit ELISA C-Puffer gewaschen. Die Pavian-Plasmaproben wurden mit ELISA B-Puffer verdünnt, dann zu den entsprechenden Testvertiefungen zugegeben. Es wurden Verdünnungen der gereinigten monoklonalen Antikörper 163.31 und 169.31, verdünnt in Kontroll-Pavianplasma, zu einem Satz von Testvertiefungen zugegeben, um eine Standardkurve zur Verwendung bei der Quantifizierung der Antikörperspiegel in den Pavian-Plasmaproben zu erzeugen. Die Testantikörperproben wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert, dann wurden die Vertiefungen 3 × mit ELISA C-Puffer gewaschen. Es wurde dann Ziegen-anti-Maus-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Tago, Burlingame, Ca), zu den Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden für zusätzliche 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit ELISA C-Puffer gewaschen, dann mit Reaktionspuffer für ungefähr 1 Minute inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H₂SO₄ beendet und die Platten in einem ELISA-Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 492 nm gelesen. Unter Verwendung der Werte, die man aus den gereinigten Antikörperproben erhielt, wurde eine Standardkurve für jeden Antikörper erzeugt, und die Konzentrationen der Antikörper in den Pavian-Plasmaproben wurden aus diesen Kurven bestimmt.
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 19, zeigen, dass es bei den zirkulierenden Antikörperspiegeln eine Spitze 1 Tag nach der Pumpeneinpflanzung bei dem i. v.-infundierten Tier gab, während die Spitzenantikörperspiegel bei den intraperitoneal infundierten Tieren am Tag 7 gefunden wurden. An den Tagen 14, 21 und 28 betrugen die zirkulierenden Antikörperspiegel weniger als 1% der Spitzenspiegel, die zu früheren Zeitpunkten gemessen wurden.
Es wurden Studien unter Verwendung von ELISA durchgeführt, um mögliche, gegen die infundierten Mäuse-Antikörper erzeugte Pavian-Antikörper zu messen. Die Ergebnisse legten nahe, dass die niedrigen Spiegel zirkulierenden Antikörpers, die man nach 14 Tagen maß, von einer Immunantwort, die bei den Pavianen gegen die Maus-Antikörper erzeugt wurde, verursacht wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es nützlich ist, um einen anhaltenden Spiegel zirkulierenden anti-PDGFr-Antikörpers in einem Primatensystem bereitzustellen, Antikörper so auszuwählen, dass ihr immunogenes Potential minimiert ist. Dies kann durch eine Vielzahl konventioneller Mittel erreicht werden, einschließlich durch Herstellung von Fab- oder F(ab')2-Fragmenten oder durch Aufbau Maus/Mensch-chimärer Antikörper oder andere Antikörperfragmente oder durch Konstruktionen mit verringerter Immunogenität.
Beispiel 25
Bestimmung der Zirkulationshalbwertszeit chimärer anti-PDGFr-beta-Antikörper bei Cynomolgus-Affen
Der Metabolismus des chimären anti-PDGFr-beta-Antikörpers wurde bei Cynomolgus-Affen bestimmt. Dies erreichte man durch Verwendung von ¹²⁵I-markiertem Antikörper. Gereinigter Antikörper wurde mit ¹²⁵Iod durch das Chloramin-T-Verfahren bis zu einer spezifischen Aktivität von ungefähr 370 KBq/μg (10 μCi/μg) des Antikörper markiert. Es wurden drei männliche Cynomolgus-Affen bei dieser Studie verwendet, die in ihrem Körpergewicht von 6,0 bis 6,6 kg reichten. An dem Morgen des Experiments wurde der radioaktiv markierte Antikörper in eine 3 ml Spritze aufgezogen und in eine Infusions pumpe gegeben. Die Affen wurden mit Ketamin anästhesiert, und die Saphena-Venen wurden mit einem 24 Gauge intravenösen Katheter (SURFLO, Terumo Medical Corp., Elkton, MD), der an eine Polyethylenleitung angebracht war, punktiert. Die den Antikörper enthaltende Spritze wurde an der Leitung angebracht und man begann die Infusion mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min, gefolgt von einer 0,5 ml Spülung mit Kochsalzlösung. Jedes Tier erhielt eine Dosis von 3,18 mg Antikörper/kg Körpergewicht.
Direkt nach der Infusion begann man mit der Blutprobenabnahme. Um die Halbwertszeit des Antikörpers zu bestimmen, zog man die Proben auf EDTA-enthaltende Vakutainer-Röhrchen nach 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 504 und 672 Stunden auf. Das Blut wurde zentrifugiert, das Plasma dekantiert und die Radioaktivität in einem Gammazähler (80% Effizienz) bestimmt. Die Antikörperkonzentrationen in dem Plasma wurden durch Vergleich der Zählungen in dem Blut mit der anfänglichen spezifischen Aktivität des radioaktiv markierten Antikörpers bestimmt, wobei die Zerfallsrate von ¹²⁵I berücksichtigt wurde. Die Analyse der Antikörperkonzentrationen in den Plasmaproben zeigte, dass die Halbwertszeit des Antikörpers ungefähr 50 Stunden betrug.
Beispiel 26
Entwicklung eines sequentiellen arteriellen Verletzungsmodells bei Pavianen zur Testung antihyperplastischer Wirkstoffe und Behandlungen nach Gefäßverletzung
Es wurde ein Modell einer sequentiellen arteriellen Verletzung im Pavian entwickelt, um die Testung der anti-PDGFr-Antikörper auf ihre Fähigkeit, experimentell induzierte intimale Hyperplasie bei Primaten zu inhibieren, zu ermöglichen. Dieses Modell wurde entworfen, um jedes Tier als seine eigene Kontrolle durch Nutzung beidseitiger arterieller Verletzungen, die in 28-tägigem Intervall zugefügt wurden, fungieren zu lassen.
Bei dieser Studie wurden Paviane, die jeweils ungefähr 10 kg wogen, verwendet. Der anfängliche operative Eingriff ähnelte sehr dem wiederherstellenden Gefäßeingriff der Ballonangioplastie, die bei klinischen Anwendungen für die Behandlung menschlicher Atherosklerose verwendet wird. Bei jedem Tier wurde eine anfängliche Ballonrückzugs-Ausschälungsverletzung in der Arteria saphena hervorgerufen. Am Tag 28 unterzogen sich die Tiere einem zweiten operativen Eingriff, wobei die anfänglich verletzte Arterie exzidiert wurde und diese exzidierte Arterie wurde ex vivo unter 100 mm Hg Druck für 1 Stunde mit einer 10%igen Formalinlösung perfusionsfixiert. Nach der Exzision der ersten Arterie erhielt die kontralaterale Arteria saphena eine Ballon-Ausschälungsverletzung. Nach dem zweiten Zeitraum von 28 Tagen wurde die zweite verletzte Arterie exzidiert und ex vivo auf eine ähnliche Weise wie die erste Arterie perfusionsfixiert.
Beide exzidierten Arterien wurden in zahlreiche Abschnitte geteilt und in Paraffin eingebettet. Es wurden Abschnitte aus mehreren Gewebeblöcken geschnitten, mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, dann durch morphometrische Analyse hinsichtlich der intimalen Läsionsbildung unter Verwendung eines computerisierten Bildgebungsanalysesystems analysiert (Ferns et al., Science 253: 1129, 1991).
Die Ergebnisse der Studie, dargestellt in Tabelle 20, zeigen, dass die intimalen/medialen Verhältnisse (I/M) für die kontralateralen Arterien sehr ähnlich waren, obwohl die anfänglichen arteriellen Verletzungen sogar 28 Tage voneinander getrennt durchgeführt wurden. Dies legt nahe, dass das Vorliegen einer anfänglichen arteriellen Verletzung und die darauffolgende Entfernung des verletzten arteriellen Segmentes die Antwort der zweiten verletzten Arterie nicht beeinflusst. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass das Ausmaß der arteriellen Verletzung wie durch das intimale/mediale Verhältnis gemessen, ähnlicher innerhalb eines Tieres als zwischen Tieren ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, ein sequentielles Verletzungsmodell zur Bewertung der Effizienz therapeutischer Verbindungen für die Verhinderung intimaler Läsionsbildung beim Pavian zu verwenden, wobei jedes Tier als seine eigene Kontrolle fungiert.
Beispiel 27
Bewertung der anti-PDGF-Rezeptorantikörper/Heparintherapie zur Inhibition intimaler Hyperplasie bei Primaten
Es wurden Paviane, die jeweils 6 bis 10 kg wogen, verwendet, um die Effizienz von anti-PDGFr-MAks und Heparin zu untersuchen. Es wurde eine anfängliche Ballonrückzugs-Ausschälungsverletzung in einer Arteria saphena von jedem Tier unter Verwen dung eines 2F-Embolektomiekatheters (Fogarty) hervorgerufen. Zum Zeitpunkt der Verletzung wurden Femoralvenenkatheter und subkutane (SQ) osmotische Pumpen (Alzet) eingebracht (28 Tage-Pumpen, zwei Pumpen pro Tier). Die Pumpen gaben zusammen in einer Geschwindigkeit von 5 μl/h an die Femoralvene ab. Während des ersten 28 Tage-Kontrollzeitraumes wurden die Pumpen mit Placebo-Kochsalzlösung befüllt. Während des 28 Tage-Zeitraumes nach der Ballonverletzung erhielten die Tiere i. v.-Injektionen von Placebopuffer an den Untersuchungstagen 1, 4, 8, 15 und 22.
Am Untersuchungstag 29 wurde ein zweiter operativer Eingriff durchgeführt, wobei die zuvor verletzte Arterie exzidiert und unter 100 ml Hg Druck für 1 Stunde mit einer 10%igen Formalinlösung perfusionsfixiert wurde. Die Arterien wurden dann 10 Abschnitte von ungefähr 0,5 cm Länge aufgeteilt. Jedes Gewebestück wurde in Paraffin eingebettet und es wurden Abschnitte von jedem Gewebeblock zur morphometrischen Analyse geschnitten, wie durch Geary et al. offenbart (Circulation 91: 2972, 1995). Es wurden fünf μm dicke Abschnitte von jedem Block geschnitten und mit Verhoeff's-van Gieson's-Färbung gefärbt. Querschnitte wurden mit einem Mikroskop und einer Camera lucida auf einen computerisierten Digitalisiertisch projiziert, und die intimalen und medialen Bereiche von jedem Querschnitt wurden ausgemessen. Es wurden die Mittelwerte für jede verletzte Arterie durch Mittelung der Querschnittsmessungen von 6–8 Gewebeblöcken für jede Arterie bestimmt. Die distalsten Gewebeblöcke wurden aus der Datenanalyse entfernt, um zu vermeiden, dass man Abschnitte aus Bereichen erhielt, die nicht vom Ballon erfasst worden waren.
Nach der Exzision der ersten Arterie erhielt die kontralaterale Arteria saphena eine Ballon-Ausschälungsverletzung. Es wurden dann Femoralvenenkatheter und SQ-osmotische Pumpen eingebracht. Die Pumpen wurden mit Schweineheparin, Grad II (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) befüllt, das mit einer Geschwindigkeit von 0,13 mg/kg/h abgegeben wurde. Die zirkulierenden Spiegel an Heparin wurden durch APTT-Analyse unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (HEPTEST Assay #803, American Diagnostica, Greenwich, CT) in einem MLA (Pleasantville, NY) Electra 800-Gerinnungsgerät überwacht. Die bei der Studie verwendete Dosis von Heparin rief eine ungefähr 2-fache Zunahme bei der APTT hervor.
Die Tiere erhielten i. v.-Injektionen von Maus/Mensch-chimärem anti-PDGF-Rezeptorantikörper (10 mg/ml in 50 mMol Natriumacetat, 125 mMol NaCl, pH 5,0) an den Untersuchungstagen 1, 4, 8, 15 und 22. Es wurde eine Dosis von 10 mg/kg des anti-PDGF-Rezeptorantikörpers verwendet, um zirkulierende Antikörperspiegel von ungefähr 50 μg/ml bereitzustellen.
Blutabnahmen wurden kurz vor dem Zeitpunkt jeder Antikörperinjektion durchgeführt, um die zirkulierenden Spiegel des anti-PDGF-Rezeptorantikörpers und zirkulierenden Spiegel von Heparin zu bestimmen. Die zirkulierenden Antikörperspiegel wurden unter Verwendung eines ELISA bestimmt. Lösliches PDGF-beta-Rezeptor/IgG-Fusionsprotein wurde auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen geschichtet. Die Platten wurden mit PBS, das 0,1% BSA und 0,05% Tween-20^® enthielt, blockiert, um unspezifische Bindung zu eliminieren. Verdünnungen von Pavianserum, hergestellt in dem gleichen Puffer, wurden zu den Vertiefungen zusammen mit einer Verdünnungsserie von gereinigtem chimären Antikörper, verdünnt in Kontroll-Pavianserum, zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert, dann gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Es wurde dann mit Meerrettichperoxidase (Zymed, So. San Francisco, CA) konjugierter Ziegen-anti-Mensch-IgG₄-Antikörper zu den Vertiefungen für eine Stunde bei 37°C zugegeben. Die Vertiefungen wurden mit PBS, das 0,05% Tween-20 enthielt, gewaschen, dann mit OPD-Substratlösung inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 1 N H₂SO₄ beendet und die Platten wurden in einem Dynatech ELISA-Plattenlesegerät bei 490 nm gelesen. Die zirkulierenden Antikörperspiegel wurden durch Vergleich der Datenpunkte mit einer Standardkurve bestimmt. Die Heparinspiegel wurden wie oben beschrieben bestimmt. Zusätzlich wurden die Tiere durch ELISA unter Verwendung eines Ziegen-anti-Affen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Cappel, Durham, NC) hinsichtlich des Auftretens irgendeiner Pavian-Antikörperantwort, die gegen den chimären Antikörper gerichtet war, überwacht.
Nach dem zweiten 28-Tage-Zeitraum wurde die zweite verletzte Arterie exzidiert und ex vivo auf eine ähnliche Weise wie die erste Arterie perfusionsfixiert.
Insgesamt 15 Tiere wurden in die Studie aufgenommen. Vorangehende Studien, die oben offenbart wurden, zeigten unter Verwendung des sequentiellen Verletzungsmodells, dass eine geringe Variabilität zwischen den Arterien, die in 28-tägigem Abstand verletzt wurden, bestand. Die Analyse der vorangehenden Studien legt nahe, dass ein n = 15 erforderlich sein würde, um eine 50%ige Abnahme bei der Läsionsentwicklung mit einer 95% Konfidenzgrenze zu beobachten. Zur Vereinfachung der operativen Behandlung wurden die Tiere in drei Gruppen von fünf eingeteilt. Die Seite des ersten Eingriffes wurde für jedes Tier randomisiert, um jede Seit-zu-Seit-Variation zu eliminieren.
Man erhielt Gewebeabschnitte von mehreren Blöcken für jede Testarterie wie oben beschrieben und die absoluten intimalen und medialen Bereiche für jeden Gewebeabschnitt wurden bestimmt. Die Daten für die zahlreichen Abschnitte für jede Arterie wurden dann gemittelt, um Mittelwerte für den intimalen Bereich, den medialen Bereich und das intimale/mediale Verhältnis zu ergeben. Drei Tiere wurden aufgrund der Gegenwart von Verschlussthromben an dem Ort der Angioplastie aus der Studie entfernt. Photomikrographien der arteriellen Querschnitte zeigten eine verdickte Intima in Kontrollarterien im Vergleich zu den Antikörper-behandelten Arterien. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den linken und rechten Beinen für den Level der intimalen Hyperplasie bei den Antikörper-behandelten Tieren festgestellt. Die Daten werden in Tabelle 21 zusammengefasst.
Der Spiegel an zirkulierendem Antikörper wurde für jedes der Tiere vor der Behandlung und an den Untersuchungstagen 4, 8, 15, 22 und 29 bestimmt. Im Allgemeinen lagen die Antikörperspiegel über 50 μg/ml an den Untersuchungstagen 4 und B. An Tag 15 wiesen drei der Tiere Antikörperspiegel auf, die auf unter 5 μg/ml gefallen waren, während die übrigen Spiegel aufwiesen, die in dem Bereich von 14–70 μg/ml lagen. An Tag 22 wiesen nur fünf der Tiere Antikörperspiegel über 17 μg/kg auf. Daten zur Immunantwort (nicht gezeigt) legen nahe, dass der Abfall der zirkulierenden chimären Antikörperspiegel ein direktes Ergebnis der Clearance des Antikörpers durch das Immunsystem der Tiere war. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Spiegel an zirkulierendem Antikörper und dem Ausmaß der intimalen Läsionsbildung beobachtet, was nahe legt, dass die anfänglich vorliegenden Spiegel an Antikörper ausreichend waren, um die Bildung ausgedehnter intimaler Läsionen zu inhibieren und was weiter nahe legt, dass ein kürzerer Zeitraum der Antikörperverabreichung günstige Ergebnisse bereitstellen sollte.
Das oben beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die anti-PDGF-Rezeptorantikörper einzeln, in Kombination oder in der Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Dosierungen von Heparin zu beurteilen. Zum Beispiel kann ein ähnliches Protokoll zur Beurteilung eines gepoolten anti-PDGF-alpha-Rezeptor- (MAk 169.3.1) und anti-PDGF-beta-Rezeptor- (MAk 163.3.1) Antikörperpräparates wie auch für die zwei chimären Antikörper einzeln verwendet werden. Zusätzlich zur Verwendung morphometrischer Analyse, um nach Änderungen in der intimalen Hyperplasie Ausschau zu halten, schliessen zusätzliche Analysetypen, die verwendet werden können, um die Läsionsbildung zu überwachen, Angiographie, intravaskulären Ultraschall und Magnetresonanz-Tomographie mit ein. Zusätzlich kann man Gewebeproben von dem Ort der Verletzung zu zahlreichen Zeitpunkten nach der Induktion der Verletzung durch Reduktionsarteriektomie erhalten.

Claims

Die Verwendung eines Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF)-Antagonisten für die Herstellung eines Medikamentes, das zusammen mit Heparin für die Behandlung von vaskulären hyperproliferativen Krankheiten verabreicht werden soll.
Eine Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Medikament auch Heparin umfasst.
Eine Verwendung gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Medikament für die Inhibition intimaler Hyperplasie im Gefässsystem eines Säugetieres verwendet wird.
Eine Verwendung gemäss Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Antagonist und Heparin effektiv zusammenwirken, um einen intimalen hyperplastischen Prozess, ausgewählt aus der Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen, der Migration vaskulärer glatter Muskelzellen und der neointimalen Ablagerung von extrazellulärer Substanz, am Ort einer vaskulären Verletzung, zu inhibieren.
Eine Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der PDGF-Antagonist ein nicht-peptidischer PDGF-Antagonist oder ein anti-PDGF-Rezeptorantikörper, zum Beispiel ein monoklonaler anti-PDGF-Rezeptorantikörper oder ein anti-PDGF-beta-Rezeptorantikörper, ist.
Eine Verwendung gemäss Anspruch 5, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper, ein einkettiger Antikörper oder ein chimärer Antikörper, zum Beispiel ein Mensch-Maus-chimärer Antikörper, ist, wobei wahlweise der chimäre Antikörper variable Mausdomänen umfasst, die operabel an konstante menschliche Domänen gebunden werden.
Produkte, die Heparin und einen PDGF-Antagonisten als kombiniertes Präparat für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verwendung in der Behandlung vaskulärer hyperproliferativer Krankheiten enthalten.
Produkte gemäss Anspruch 7, wobei der PDGF-Antagonist durch die spezifische(n) Eigenschaften) gemäss einem oder mehrerer der Ansprüche 5 oder 6 näher definiert wird oder wobei die vaskuläre hyperproliferative Krankheit durch die spezifischen intimalen hyperplastischen Prozesse gemäss Anspruch 4 näher definiert wird.
Produkte gemäss Anspruch 8, wobei der Antikörper und Heparin in einem Antikörper eingeschlossen sind: Heparingewichtsquotient zwischen annähernd 0,01 : 1 und 100 : 1, vorzugsweise zwischen ca. 0,05 : 1 und 20 : 1.
Produkte gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Heparin ein Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, das eine reduzierte antithrombotische Aktivität besitzt, umfasst oder wobei das Heparin ein Heparinsulphat umfasst.
Ein Produkt gemäss Anspruch 7, wobei das Produkt in Form eines pharmazeutischen Kits für die Verwendung in der Behandlung intimaler Hyperplasie im Gefässsystem eines Säugetierpatienten vorliegt und das pharmazeutische Kit umfasst: einen anti-Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF)-Rezeptorantikörper in einem pharmakologisch geeigneten Träger und Heparin in einem pharmakologisch geeigneten Träger, wobei der Antikörper und das Heparin vorzugsweise in einem einzelnen Träger vorkombiniert sind.