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Diese
Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin oder Heilkunde, insbesondere
die Behandlung von thrombotischen Störungen mit aktiviertem Humanprotein
C in Kombination mit antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern.
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Protein
C ist eine Serinprotease und ein natürlich auftretendes Antikoagulans,
das ein Rolle spielt bei der Regulation der Hämostase durch Inaktivierung
der Faktoren Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade. Humanprotein
C zirkuliert als ein zweikettiges Zymogen, das in vivo durch Thrombin
und Thrombomodulin auf Phospholipidoberflächen aktiviert wird, was zu
aktiviertem Protein C (aPC) führt.
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Die
Blutgerinnung ist ein hochkomplexer Prozess, der reguliert wird
durch das Gleichgewicht zwischen gerinnungsfördernden und gerinnungshemmenden
Mechanismen. Dieses Gleichgewicht bestimmt einen Zustand von entweder
normaler Hämostase
oder abnormaler pathologischer Thrombusbildung, was zu Vorfällen führt wie
Schlaganfall, Myokardinfarkt und Venenthrombose. Zwei Hauptfaktoren
kontrollieren oder steuern dieses Gleichgewicht, die Bildung von
Fibrin und die Aktivierung und die nachfolgende Aggregation von
Blutplättchen.
Ein entscheidender Faktor, der beide Prozesse kontrolliert oder
steuert, ist die Erzeugung des Enzyms Thrombin, das in der Folge
auf die Aktivierung der Gerinnungskaskade auftritt. Thrombin ist
ein gerinnungsförderndes
Enzym, das Blutplättchen
aggregiert und zirkulierendes Fibrinogen in unlösliches Fibrin überführt, was
zur Bildung von einem Blutgerinnsel führt. Thrombin wirkt auch als
ein wirksames Antikoagulans, da es Protein C-Zymogen aktiviert zu
aktiviertem Protein C, was umgekehrt die Erzeugung von Thrombin
hemmt oder inhibiert. Auf diese Weise, durch die Rückkopplungsregulierung
der Thrombinerzeugung, wirkt aPC vielleicht als der wichtigste Abwärtsregulator
der Blutgerinnung, was zum Schutz gegen Thrombose führt.
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Die
kritische oder entscheidende Rolle von Protein C bei der Kontrolle
oder Steuerung der Hämostase wird
beispielhaft veranschaulicht durch die erhöhte Rate an Thrombose bei heterozygotem
Mangel, Protein C Resistenz (z.B. aufgrund der üblichen Faktor V Leiden Mutation)
und der fatalen Folge von unbehandeltem homozygotem Protein C Mangel.
Humanes aktiviertes Protein C, sowohl vom Plasma abstammend als
auch rekombinant, zeigten, dass sie wirksame und sichere antithrombotische
Mittel sind bei einer Vielzahl von Tiermodellen von sowohl Venen-
als auch Arterienthrombosen.
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In
der aktuellen klinischen Praxis ist die Blutplättchenhemmung oder Thrombozytenaggregationshemmung,
z.B. unter Verwendung von Aspirin (ASS) gut dokumentiert hinsichtlich
der Wirksamkeit sowohl bei der Prävention als auch Behandlung
von thrombotischen Erkrankungen. Außerdem wurde die Plättchenhemmung bei
Zuständen
wie Myokardinfarkt und Schlaganfall der Standard der Behandlung.
Die Verwendung von antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern,
wie ASS, erhöht
jedoch das Risiko einer Blutung oder Ausblutung, was die Dosis des
Mittels und die Dauer der Behandlung beschränkt. Um den Effekt oder die
Wirkung von Thrombin bei der Fibrinbildung zu blockieren, bleibt
Heparin das Standardantikoagulans bei der akuten Behandlungssituation.
Heparin weist jedoch einen schmalen therapeutischen Index auf und
ist verbunden mit einem beträchtlichen
Blutungsrisiko insbesondere in Kombination mit antithrombotischen
Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern.
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Eine
Kombinationstherapie mit Aspirin und einem synthetischen Thrombinhemmer,
Gewebeplasminogenaktivator oder einem monoklonalen antithrombotischen
Glykoprotein IIb/IIIa Antikörper
wurde untersucht in einem Kaninchenkoronararterienthrombosemodell
[Yasuda et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16: 714 bis 722 (1990)].
Aspirin in Kombination mit diesen Mitteln verlängerte die Blutungszeit und
verhinderte die Reokklusion der Koronararterie nicht. Außerdem wurde
eine Kombinationstherapie vorgeschlagen für aPC mit Thrombolysemitteln,
wie Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase oder Streptokinase [Griffin
et al., US Patent
US 5 350 578 ].
Diese Kombinationen erwiesen sich jedoch nicht als erfolgreich.
Daher bleibt der Bedarf bestehen, eine wirksame Therapie für die Behandlung
von thrombotischen Störungen
aufzuzeigen.
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Die
vorliegende Erfindung ist die erste, welche die Kombination von
aPC mit antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern
bei der Behandlung von Thrombose beschreibt. Demzufolge stellt die
vorliegende Erfindung die Verwendung von aPC in Kombination mit
antithrombotischen Mitteln für
die Behandlung von thrombotischen Störungen bereit. Diese Kombinationstherapie
führt zu
erhöhter
Wirksamkeit bei einer Vielzahl von thrombotischen Störungen,
einschließlich
Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss
folgend auf Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose
als Folge einer peripher vaskulären
Operation, ist aber nicht darauf beschränkt. Außerdem führt die Kombination von aPC
und antithrombotischen Mitteln zu einem Synergismus, der die Reduzierung
der Dosierungen von sowohl aPC als auch dem antithrombotischen Mittel
erlaubt. Die Reduktion der Dosierungen der Mittel in der Kombinationstherapie
führt umgekehrt
zu reduzierten Nebenwirkungen, wie erhöhtem Risiko in Bezug auf eine
Blutung, die oft beobachtet wird bei der Kombinations-Antikoagulans-/Tfhrombozytenaggregationshemmungs-Therapie.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung bereit, von einer pharmazeutisch
wirksamen Menge von aktiviertem Protein C in Kombination mit einem
antithrombotischen Mittel zur Behandlung einer thrombotischen Störung bei
einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. Außerdem wird
durch die Erfindung die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen
Menge von einem antithrombotischen Mittel und aktiviertem Protein
C an den Patienten erreicht, so dass ein Plasmawert an aktiviertem
Protein C von 10 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml erreicht wird.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin offenbart und beansprucht
wird, sind die folgenden Begriffe wie unten definiert.
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aPC
oder aktiviertes Protein C, ob rekombinant oder aus dem Plasma abgeleitet.
aPC schließt
ein und steht vorzugsweise für
humanes Protein C, obwohl aPC auch andere Spezies oder Derivate
einschließen kann,
die Protein C proteolytische, amidolytische, esterolytische und
biologische (antikoagulante oder profibrinolytische) Aktivitäten oder
Wirksamkeiten aufweisen. Beispiele von Protein C Derivaten sind
beschrieben von Gerlitz et al, US Patent
US 5 453 373 und Foster et al., US
Patent
US 5 516 650 .
- APTT
- aktivierte Teilthromboplastinzeit.
HPC – Humanprotein
C-Zymogen.
- r-hPC
- rekombinantes Humanprotein
C-Zymogen, hergestellt in prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen
oder transgenen Tieren.
- r-aPC
- rekombinantes humanes
aktiviertes Protein C, hergestellt durch Aktivierung von r-hPC in
vitro oder durch direkte Sekretion der aktivierten Form von Protein
C aus prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen oder transgenen
Tieren [Cottingham, WO 97 20 043] einschließlich z.B. Sekretion aus humanen
Nierenzellen 293 als Zymogen, das dann gereinigt und aktiviert wird
durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie gezeigt in Yan,
US Patent US 4 981 952 ,
und dessen gesamte Lehre hierin durch Bezugnahme einverleibt ist.
- Zymogen
- bezieht sich auf eine
sekretierte oder abgeschiedene, inaktive Form, ob aus einer Kette
oder zwei Ketten von Protein C.
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Antithrombotisches
Mittel oder Thrombozytenaggregationshemmer – ein oder mehr Mittel allein
oder in Kombination, das das Vermögen von Blutplättchen verringert
oder reduziert, zu aggregieren. Mittel, die im Stand der Technik
darunter verstanden werden und anerkannt sind, schließen solche
ein, die darin zitiert sind (antiplatelet agent), z.B. in Remington,
The Science and Practice of Pharmacy, 19. Ausgabe, Band II, Seiten 924
bis 925, Mack Publishing Co., was durch Bezugnahme hierin einverleibt
ist. Solche Mittel schließen
Aspirin (ASS), Clopidogrel, ReoPro® (Abciximab),
Dipyridamol, Ticlopidin und IIb/IIIa Antagonisten ein, sind aber
nicht darauf beschränkt.
- Behandlung
- beschreibt die Organisation
und Behandlung von einem Patienten zum Zweck der Bekämpfung der
Krankheit, des Zustands, oder Störung
und schließt
die Verabreichung von einer Verbindung der vorliegenden Erfindung
ein, um den Beginn oder Ausbruch der Symptome oder Komplikationen
zu vermeiden, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die
Erkrankung, den Zustand oder die Störung zu beenden oder zu beseitigen.
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Kontinuierliche
Infusion -fortwährende
im Wesentlichen nicht unterbrochene Einleitung oder Einführung einer
Lösung
in eine Vene über
einen spezifizierten Zeitraum.
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Bolusinjektion – die Injektion
von einem Arzneimittel in einer definierten Quantität (genannt
ein Bolus) über
einen Zeitraum bis zu etwa 120 min.
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Pharmazeutisch
wirksame Menge – steht
für eine
Menge von einer Verbindung der Erfindung, die in der Lage ist, eine
thrombotische Störung
bei Säugern
zu hemmen. Die besondere Dosis der Verbindung, die gemäß dieser
Verbindung verabreicht wird, wird natürlich bestimmt sein durch den
behandelnden Arzt, der die besonderen Umstände, die den Fall umgeben,
bewertet, einschließlich
der verabreichten Verbindung, dem besonderen Zustand, der behandelt
wird und ähnlichen Überlegungen.
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Thrombotische
Störung – eine Störung, die
im Zusammenhang steht mit der Bildung oder Anwesenheit von einem
Blutgerinnsel innerhalb eines Blutgefäßes oder die Bildung oder Anwesenheit
von einem Blutgerinnsel innerhalb eines Blutgefäßes betrifft. Thrombotische
Störungen
schließen
Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss
folgend auf eine Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose
als Folge einer peripher vaskulären
Operation ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die Verwendung von aktiviertem
Protein C in Kombination mit einem antithrombotischen Mittel für die Behandlung
von thrombotischen Störungen.
Das verwendete aPC in einer solchen Kombination kann gemäß bekannten
Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen
zu erhalten. Das aPC wird parenteral verabreicht, um seinen Zuführung in den
Blutstrom in einer wirksamen Form durch Injektion der geeigneten
Dosis als kontinuierliche Infusion über etwa 24 h bis etwa 144
h zu gewährleisten.
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In
Verbindung mit der Behandlung mit einem antithrombotischen Mittel
wird die Menge von verabreichtem aPC so sein, dass sie etwa 4 mg/70
kg/24 h bis 160 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,1 mg/m2 bis 4 mg/m2 oder
2 μg/kg/h
bis 96 μg/kg/h
beträgt.
Besonders bevorzugt beträgt
die verabreichte Menge von aPC etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 120 mg/70
kg/24 h oder eine äquivalente
Abgabe von 0,1 mg/m2 bis 3 mg/m2 oder
2,4 μg/kg/h
bis 72 μg/kg/h.
Noch bevorzugter beträgt
die Menge von verabreichtem aPC etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 80 mg/70
kg/24 h oder eine äquivalente
Abgabe von 0,1 mg/m2 bis 2 mg/m2 oder
2,4 μg/kg/h
bis 48 μg/kg/h.
Noch mehr bevorzugt beträgt
die verabreichte Menge von aPC von etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 60 mg/70
kg/24 h oder eine äquivalente
Abgabe von 0,1 mg/m2 bis 1,5 mg/m2 oder 2,4 μg/kg/h bis 36 μg/kg/h. Sogar
noch bevorzugter ist, dass die verabreichte Menge von aPC von etwa
10 mg/70 kg/24 h bis 50 mg/70 kg/24 h beträgt oder eine äquivalente
Abgabe von 0,25 mg/m2 bis 1,25 mg/m2 oder 6 μg/kg/h
bis 30 μg/kg/h. Sogar
noch bevorzugter beträgt
die Menge von verabreichtem aPC von etwa 20 mg/70 kg/24 h bis 40
mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente
Abgabe von 0,5 mg/m2 bis 1,0 mg/m2 oder 12 μg/kg/h
bis 24 μg/kg/h.
Die am meisten bevorzugte Menge von verabreichtem aPC beträgt etwa
40 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente
Abgabe von 1,0 mg/m2 oder 24 μg/kg/h. Die
geeignete Dosis von verabreichtem aPC mit einem antithrombotischen
Therapeutikum führt
entweder zu einer verbesserten Wirksamkeit oder Reduktion in der
Dosis von entweder einem Mittel oder beiden.
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Die
Bereiche der Plasmawerte, die erhaltenen werden von der Menge von
verabreichtem aPC werden 2 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml betragen.
Die bevorzugten Plasmawertebereiche betragen von etwa 20 ng/ml bis
80 ng/ml. Die am meisten bevorzugten Plasmawertebereiche betragen
von etwa 30 ng/ml bis etwa 60 ng/ml und noch bevorzugter etwa 50
ng/ml.
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Bei
einer weiteren Ausführungsform
oder alternativ wird das aPC durch Injektion eines Drittels der
geeigneten oder entsprechenden Dosis pro Stunde als eine Bolusinjektion
verabreicht, gefolgt von den verbleibenden zwei Dritteln der stündlichen
Dosis als kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum von 1 h,
gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion der geeigneten Dosis über 23 h,
was zu der geeigneten Verabreichungsdosis über den Zeitraum von 24 h führt.
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Der
Begriff "in Kombination
mit" bezieht sich
auf die Verabreichung von antithrombotischen Mitteln mit aPC entweder
simultan, nacheinander oder einer Kombination davon. Die Verabreichung
von Plättchenhemmern
oder -inhibitoren in Kombination mit aPC führt zu einer gesteigerten Wirksamkeit
bei einer Vielzahl von thrombotischen Störungen, die Schlaganfall, Venenthrombose,
Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf
Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose als Folge
einer peripher-vaskulären
Operation einschließen,
aber nicht darauf beschränkt
sind. Die Synergie ergibt sich auch als Ergebnis in dem Vermögen, die
Dosierungen der Mittel in der Kombinationstherapie zu reduzieren,
was zu reduzierten Nebeneffekten führt, wie Erhöhungen des
Risikos beim Bluten, was oft beobachtet wird in der Kombinations-Antikoagulans-/Thrombozytenaggregationshemmungs-Therapie.
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Das
eingesetzten antithrombotischen Mittel und die geeignete Dosis oder
Dosierungswerte werden in der Technik verstanden und geschätzt. Ein
Fachmann erkennt den geeigneten Dosierungswert oder die geeignete
Dosis, die zu verwenden ist für
jedes antithrombotische Mittel, um eine pharmazeutisch wirksame
Menge zu erreichen zur Behandlung von thrombotischen Störungen.
Antithrombotische Mittel, die geeignet sind zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung, schließen
klinisch anerkannte und kommerziell erhältliche Mittel ein, wie Aspirin
(ASS), Clopidogrel, ReoPro
® (Abciximab), Dipyridamol,
Ticlopidin und IIb/IIIa-Antagonisten, sind aber nicht darauf beschränkt. Die
Menge des antithrombotischen Mittel Aspirin (ASS), das verabreicht wird
zusammen oder in Verbindung mit aPC wird etwa 10 mg bis 1000 mg
betragen, die einmal täglich
gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels Ticlopidin,
die verabreicht wird in Verbindung mit aPC wird etwa 50 mg bis 1250
mg betragen, die zweimal täglich
(B.I.D.) gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels
Dipyridamol, das in Verbindung mit aPC verabreicht wird, wird etwa
15 mg bis 500 mg betragen, die viermal täglich gegeben wird. Die Menge
des antithrombotischen Mittels Clopidogrel, das zusammen mit aPC
verabreicht wird, wird etwa 40 mg bis 1000 mg betragen, die einmal
täglich
gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels ReoPro
® (Abciximab),
das in Verbindung mit aPC verabreicht wird, wird etwa 0,025 μg/kg/min
bis 1 μg/kg/min
verabreicht, die als eine Infusion über einen Zeitraum von 12 h
gegeben wird. Bei einer anderen Ausführungsform oder alternativ
kann ReoPro
® in
Verbindung mit aPC als eine Bolusinjektion verabreicht werden mit
etwa 0,05 mg/kg bis 1,0 mg/kg. Außerdem kann ReoPro
® in
Verbindung mit aPC als eine Bolusinjektion verabreicht werden, gefolgt
von einer Infusion über
einen Zeitraum von 12 h. Die Menge des IIb/IIIa-Antagonisten, der
in Verbindung mit aPC verwendet wird, wird etwa 0,1 mg/kg bis etwa
100 mg/kg betragen, in Abhängigkeit
von dem speziell eingesetzten Mittel [s. z.B. Fischer et al., US
Patent
US 5 618 843 , dessen
gesamte Lehre durch Bezugnahme hierin einverleibt ist]. Ein Fachmann
wird in der Lage sein, den geeigneten Dosierungswert oder die geeignete
Dosiskonzentration zu bestimmen, um eine pharmazeutisch wirksame
Menge zu erreichen.
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Das
aPC kombiniert mit den antithrombotischen Mitteln verbessert den
antithrombotischen Effekt des antithrombotischen Mittels allein.
Daher kann diese Kombinationstherapie die therapeutischen Dosierungen oder
Dosen von aPC reduzieren, sowie die Dosierung oder Dosen von antithrombotischen
Mitteln, die benötigt werden
für die
therapeutische Behandlung von Thrombose, wodurch die Komplikationen
vermieden werden, wie die Neigung zum Bluten, Toxizität und allgemeine
Nebeneffekte von hohen Dosierungen von antithrombotischen Mitteln.
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Präparation 1
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Herstellung von Humanprotein
C
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Rekombinantes
Humanprotein C (r-hPC) wurde in humanen Nierenzellen 293 hergestellt
nach Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, solchen wie sie
gezeigt sind in Yan, US Patent
US
4 981 952 , dessen gesamte Lehre durch Bezugnahme hierin
einverleibt ist. Das Gen, das Humanprotein C kodiert, ist offenbart
und beansprucht in Bang et al., US Patent
US 4 775 624 , dessen Lehre durch Bezugnahme
hierin einverleibt ist. Das Plasmid, das verwendet wird, um Humanprotein
C in 293 Zellen zu exprimieren war das Plasmid pLPC, das offenbart
ist in Bang et al., US Patent
US
4 992 373 . Der Aufbau oder die Konstruktion des Plasmids
pLPC wird auch beschrieben in der europäischen Patentveröffentlichung
EP 0 445 939 und in Grinnell
et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189 bis 1192, deren Lehren ebenfalls
durch Bezugnahme hierin einverleibt sind. Kurz zusammengefasst wird
das Plasmid in die Zellen 293 transfiziert, dann wurden stabile
Transformanten identifiziert, subkultiviert und in serumfreien Medien
gezüchtet.
Nach Fermentation wurde zellfreies Medium erhalten durch Mikrofiltration.
Das Humanprotein C wurde abgetrennt aus der Kulturflüssigkeit
durch eine Anpassung der Techniken von Yan, US Patent
US 4 981 952 , dessen gesamte Lehre
durch Bezugnahme hierin einverleibt ist. Das geklärte Medium
wurde auf 4 mM in EDTA eingestellt, bevor es auf ein Anionenaustauschharz
(Fast-Flow Q, Pharmacia) absorbiert wurde. Nach einem Waschen mit
4 Säulenvolumina
von 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina von 20 mM Tris,
150 mM NaCl, pH 7,4 wurde das gebundene rekombinante Humanprotein
C Zymogen eluiert mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl
2, pH 7,4. Das eluierte Protein war mehr
als 95 % rein nach der Elution, wie beurteilt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
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Eine
weitere Reinigung des Proteins wurde erreicht durch Hineingeben
des Proteins in 3 M NaCl, gefolgt von einer Adsorption auf ein hydrophobes
Wechselwirkungs- oder Interactionharz (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) äquilibriert
in 20 mM Tris, 3 NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4.
Nach einem Waschen mit 2 Säulenvolumina
des Äquilibrierungspuffers
ohne CaCl2, wurde das rekombinante Humanprotein
C eluiert mit 20 mM Tris, pH 7,4.
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Das
eluierte Protein wurde hergestellt zur Aktivierung durch Entfernung
des restlichen Calciums. Das rekombinante Humanprotein C wurde über eine
Metallaffinitätssäule (Chelex-100,
BioRad) geleitet, um Calcium zu entfernen und es wieder an einen
Anionenaustauscher (Fast Flow Q, Pharmacia) zu binden. Beide dieser
Säulen
wurden in Reihe angeordnet und äquilibriert
in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Nach der Beladung
des Proteins wurde die Chelex-100 Säule gewaschen mit einem Säulenvolumen
mit dem gleichen Puffer, bevor es aus der Reihe herausgenommen wurde.
Die Anionenaustauschsäule
wurde mit 3 Säulenvolumina
des Äquilibrierungspuffers
gewaschen vor einem Eluieren des Proteins mit 0,4 M NaCl, 20 mM
Trisacetat, pH 6,5. Die Proteinkonzentrationen von Lösungen von
rekombinantem Humanprotein C und rekombinantem aktivierten Protein
C wurden gemessen durch UV 280 nm Extinktion E0,1% =
1,81 bzw. 1,85.
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Präparation 2
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Aktivierung
von rekombinantem Humanprotein C
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Rinderthrombin
wurde an aktvierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von
50 mM HEPES, pH 7,5 bei 4°C
gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wurde ausgeführt in einem bereits gepackten
Harz in einer Säule
unter Verwendung von etwa 5000 Einheiten Thrombin/ml Harz. Die Thrombinlösung wurde
etwa 3 h lang durch die Säule
zirkuliert vor der Zugabe von MEA bis zu einer Konzentration von
0,6 ml/l der zirkulierenden Lösung.
Die MEA enthaltende Lösung
wurde zusätzliche
10 bis 12 h zirkuliert, um eine vollständige Blockierung der nicht
umgesetzten Amine auf dem Harz zu gewährleisten. Nach der Blockierung
wurde das mit Thrombin gekuppelte oder beladene Harz gewaschen mit
10 Säulenvolumina
von 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, um das gesamte nicht spezifisch
gebundene Protein zu entfernen, und wurde in Aktivierungsreaktionen verwendet
nach Äquilibrierung
in Aktivierungspuffer.
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Gereinigtes
r-hPC wurde hergestellt in 5 mM in EDTA (um beliebiges Restcalcium
zu chelatisieren) und verdünnt
auf eine Konzentration von 2 mg/ml mit 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20
mM Trisacetat, pH 6,5. Dieses Material wurde durch eine Thrombinsäule geleitet,
die equilibriert war mit 50 mM NaCl bei 37°C und entweder 20 mM Tris, pH
7,4 oder 20 mM Trisacetat pH 6,5. Die Flussrate wurde eingestellt,
um etwa 20 min Kontaktzeit zu erlauben zwischen dem r-hPC und dem
Thrombinharz. Der Ausfluss wurde gesammelt und unmittelbar nach
amidolytischer Aktivität
in einem Test oder Assay untersucht. Wenn das Material keine spezifische
(amidolytische) Aktivität
vergleichbar zu einem bekannten Standard von aPC aufwies, wurde
es über
die Thrombinsäule
recycelt, um das r-hPC bis zur Vollständigkeit zu aktivieren. Darauf
folgte eine 1:1 Verdünnung
des Materials mit 20 mM Puffer wie oben, mit einem pH von irgendwo
zwischen 7,4 oder 6,0 (ein niedriger pH ist bevorzugt, um eine Autodegradation
oder einen Selbstabbau zu verhindern), um das aPC bei niedrigeren
Konzentrationen zu halten, während
der nächste
Verarbeitungsschritt abgewartet wird.
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Die
Entfernung von ausgelaugtem Thrombin aus dem aPC Material wurde
erreicht durch Bindung des aPC an ein Anionenaustauschharz (Fast
Flow Q, Pharmacia), äquilibriert
in einem Aktivierungspuffer (entweder 20 mM Tris, pH 7,4 oder vorzugsweise
20 mM Trisacetat, pH 6,5) mit 150 mM NaCl. Thrombin läuft durch die
Säule und
eluiert während
eines Waschens mit 2 bis 6 Säulenvolumina
mit 20 mM Äquilibrierungspuffer. Gebundenes
aPC wird eluiert mit einem Stufengradienten unter Verwendung von
0,4 M NaCl in entweder mM Trisacetat, pH 6,5 oder 20 mM Tris, pH
7,4. Ein Waschen der Säule
mit größeren Volumina
erleichterte eine vollständigere
Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das eluiert wurde von
dieser Säule,
wurde entweder in einer gefrorenen Lösung (–20°C) aufbewahrt oder als ein lyophilisiertes
Pulver.
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Die
amidolytische Aktivität
(AU) von aPC wurde bestimmt durch Freisetzung von p-Nitroanilin
aus dem synthetischen Substrat H-D-Phe-Pip-Arg-p-Nitroanilid (S-2238),
erworben von Kabi Vitrum unter Verwendung eines Beckman DU-7400
Diodenarrayspektrophotometers. Eine Einheit von aktiviertem Protein
C wurde definiert als die Menge von Enzym, die benötigt wird
zur Freisetzung von 1 μmol
von p-Nitroanilin
in 1 min bei 25°C, pH
7,4, unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für p-Nitroanilin
bei 405 nm von 9620 M–1cm–1.
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Die
Antikoagulansaktivität
von aktiviertem Protein C wurde bestimmt durch Messung der Verlängerung der
Gerinnungszeit in dem aktivierten Teilthromboplastinzeit (APTT)-Gerinnungsassay.
Eine Standardkurve wurde hergestellt in einem Verdünnungspuffer
(1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) mit Radioimmunoassayqualität, 20 mM
Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3),
der in Bereichen der Protein C Konzentration von 125 bis 1000 ng/ml
lag, während
Proben hergestellt wurden bei verschiedenen Verdünnungen in diesem Konzentrationsbereich.
Zu jeder Probenküvette
wurden 50 μl
von kaltem Pferdeplasma und 50 μl
von rekonstituiertem aktivierten Teilthromboplastinzeitreagens (APTT
Reagens, Sigma) zugegeben und bei 37°C 5 min lang inkubiert. Nach
der Inkubation wurden 50 μl
der geeigneten Proben oder Standards zu jeder Küvette gegeben. Der Verdünnungspuffer
wurde verwendet anstelle der Probe oder des Standards, um die Grundgerinnungszeit zu
bestimmen. Der Zeitmesser des Fibrometers (CoA Screener Hemostasis
Analyzer, American Labor) wurde gestartet bei der Zugabe von 50 μl, 37°C, 30 mM
CaCl2 zu jeder Probe oder jedem Standard.
Die Konzentration an aktiviertem Protein C in den Proben wurde berechnet
aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve. Die hier
berichteten Gerinnungszeiten sind der Mittelwert von einem Minimum
von drei Wiederholungen, einschließlich der Standardkurvenproben.
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Präparation 3
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Formulierung von aktiviertem
Protein C
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Eine
stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C wurde
hergestellt nach einem Verfahren, das umfasst ein Lyophilisieren
einer Lösung,
die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose,
etwa 20 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer, der einen pH von
größer als
5,5 aber weniger als 6,5 aufwies, umfasste. Zusätzlich umfasst die stabile
lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C die Lyophilisierung
einer Lösung,
die etwa 5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 30 mg/ml Saccharose,
etwa 38 mg/ml NaCl und einen Citratpuffer, der einen pH von größer als
5,5, aber kleiner als 6,5 aufweist, umfasst.
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Das
Verhältnis
von aPC:Salz:Zusatzstoff (w:w:w (Gew:Gew:Gew)) ist ein wichtiger
Faktor bei einer Formulierung, die geeignet ist für das Gefriertrocknungsverfahren.
Das Verhältnis
ist verschieden in Abhängigkeit
von der Konzentration von aPC, Salzauswahl und Konzentration und
Zusatzstoffauswahl und -konzentration. Insbesondere ist ein Verhältnis von
etwa einem Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7,6 Teilen Salz zu
etwa 6 Teilen Zusatzstoff bevorzugt.
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Eine
Einheitsdosierungsformulierung von aktiviertem Protein C, geeignet
zur Verabreichung durch kontinuierliche Infusion wurde hergestellt
durch Mischen von aktiviertem Protein C, NaCl, Saccharose und Natriumcitratpuffer.
Nach dem Mischen wurden 4 ml der Lösung in einen Einheitsdosierungsbehälter überführt und
lyophilisiert. Der Einheitsdosierungsbehälter, der etwa 5 mg bis etwa
20 mg an aktiviertem Protein C enthielt, geeignet zur Verabreichung
von einer Dosierung von etwa 0,01 mg/kg/h bis etwa 0,05 mg/kg/h
an Patienten, die einer solchen Verabreichung bedürfen, wurde
verschlossen und bis zum Gebrauch gelagert.
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Beispiel 1
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Versuchskaninchen AV Shunt-Modell
für Thrombose
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Da
die Plättcheninhibierung
oder Thrombozytenaggregationshemmung klinische Wirksamkeit gezeigt hat,
und aPC eine entscheidende Rolle spielt bei der Kontrolle oder Steuerung
der Hämostase,
wurde die mögliche
Synergie zwischen aPC und ASS untersucht in dem Versuchskaninchen
Arterien/Venen (AV) Shunt-Thrombosemodell. In diesem Modell der
Thrombose zeigte aPC, dass es ein wirksames antithrombotisches Mittel
ist, was dosisabhängige
Inhibierung der Thrombusbildung verursacht.
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Um
den Effekt von aPC und Aspirin zu untersuchen, wurden Versuchskaninchen
(etwa 500 g) mit 20 mg/kg Rompun und 125 mg/kg Ketaset anästhesiert,
und ein Shunt wurde eingesetzt, der die rechte Halsschlagader (Arteria
carotis) und die linke Halsvene (Jugularis) verband. Der Shunt enthielt
einen Baumwolfaden der die Thrombusbildung stimuliert. aPC wurde
verabreicht, um die Thrombusbildung zu inhibieren mit einer Bolus-
plus einer Infusionsdosierungskur (0,5 mg/kg Bolus plus 3 mg/kg/h).
Zusätzlich
wurde aPTT des gesamten Bluts durchgeführt vor und während der
Dosierungskur, und zirkulierende aPC Plasmawerte wurden gemessen
durch einen amidolytischen Immuneinfangtest. Aspirin wurde mit 10 mg/kg
intravenös
verabreicht, und bei Untersuchungen mit Heparin wurde eine Dosis
von 30 Einheiten/kg Bolus, gefolgt von einer Infusion von 40 Einheiten/kg/h
verwendet. Die Bolusdosierung wurde durchgeführt durch Kanülisierung
der linken Jugularis, und ein Sammeln des Bluts wurde durchgeführt über eine
Kanüle
der rechten Jugularis. Blutproben wurden entnommen an aufeinandenolgenden
Zeitpunkten in 3,8 % Na3 Citrat gegeben,
das 300 mM Benzamidin HCl enthielt (9 Volumina Blut zu 1 Volumen
Citrat/Benzamidinlösung).
Das Blutvolumen wurde ersetzt in dem Tier durch Salzlösung nach
jeder Entnahme. Plasma wurde abgetrennt durch Zentrifugation und
bei –20°C gefroren.
Die Plasmakonzentration von aPC wurde bestimmt durch einen amidolytischen
Immuntest.
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Um
einen potentiellen antithrombotischen Synergismus zwischen aPC und
dem antithrombotischen Mittel ASS zu untersuchen, wurde die Dosis
von ASS ausgewählt,
um nahezu vollständige
Inhibierung von Plättchencyclooxygenase
zu ergeben, wie gemessen durch Inhibierung von Thromboxan B2 Freisetzung.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, hemmte eine Dosis von 10 mg/kg ASS wirksam
die Plättchencyclooxygenase,
hatte jedoch keinen beträchtlichen
Effekt auf das Thrombusgewicht. Unter Verwendung dieser Dosis von
ASS, die keinen Effekt auf das Thrombusgewicht hatte, wurden Experimenten
in Verbindung mit aPC durchgeführt.
Für Vergleichszwecke
wurde auch Heparin, das klinische Standardantikoagulans, verglichen.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden die Dosierungen von aPC und Heparin
gewählt,
um jeweils etwa den gleichen antithrombotischen Effekt in dem Modell
zu ergeben (45,9 bzw. 43,4 % Inhibierung). Die Kombination von ASS
und aPC führte
zu einer beträchtlich
größeren Hemmung
oder Inhibierung der Thrombusbildung, als dies beobachtet wurde
bei aPC allein (p = 0,01). Im Gegensatz dazu zeigte die Kombination
des Antikoagulans Heparin mit ASS keinen beträchtlich größeren Effekt als der, der mit
Heparin alleine beobachtet wurde. Diese Daten zeigen einen Synergismus
zwischen antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern
und aPC und schlagen vor, dass (a) Patienten auf entweder einer
ASS- oder anderen Therapie mit antithrombotischen Mitteln erhöhte Wirksamkeiten
erreichen durch Kombinationstherapie mit aPC und (b) therapeutische
Dosen oder Dosierungen von aPC verringert werden können in
Gegenwart einer Antiplättchen-
oder Thrombozytenaggregationstherapie.
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Tabelle 1
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Der
Effekt oder die Wirksamkeit von ASS auf die Blutplättchen Thromboxan
B2 Freisetzung und das Thrombusgewicht in dem Versuchskaninchen
AV Shunt Modell. Die Daten zeigen, dass trotz fast maximaler Inhibierung
der Thromboxan B2 Freisetzung ASS keinen Effekt auf das Thrombusgewicht
hatte.
Tabelle
2 Antithrombotischer
Synergismus zwischen aPC, aber nicht Heparin, und ASS.
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Beispiel 2
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Der
Effekt von aPC und IIb/IIIa Antagonisten in dem Versuchskaninchen
AV Shunt Modell der Thrombose Um den Effekt der Kombinationstherapie
von aPC und einem repräsentativen
synthetischen IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten zu untersuchen, wurde
das Versuchskaninchen AV Shunt Modell der Thrombose, wie im Beispiel
1 beschrieben, verwendet. 2-([6-Carboxy-n-hexyl]carboxamidyl)-5-amidinobenzofurantrifluoracetat, hergestellt
wie beschrieben in Fischer et al., US Patent
US 5 618 843 , wurde verwendet. Die
Kombination von aPC und dem IIb/IIIa Antagonisten führte zu
einer beträchtlich
größeren Inhibierung
der Thrombusbildung als sie mit aPC alleine beobachtet wurde (Tabelle
3). Diese Daten zeigen einen Synergismus zwischen aPC und einem
synthetischen IIb/IIIa-Antagonisten. Tabelle
3 Antithrombotischer
Synergismus zwischen aPC und einem IIb/IIIa-Antagonisten.
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Beispiel 3
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Der
Effekt von aPC und Abciximab bei der Behandlung von thrombotischen
Störungen
Abciximab (RheoPro®) ist ein Mittel, das
die Blutplättchenaggregation
inhibiert oder hemmt durch Bindung an IIb/IIIa-Rezeptoren auf der
Plättchenzelloberfläche. Die
Kombinationstherapie mit aPC und Abciximab ist wirksam bei der Hemmung
oder Inhibierung der Thrombose durch Abwärts- oder Herabregulierung
des Blutgerinnungsprozesses und der Inhibierung der Blutplättchenaggregation.
Abciximab wird verabreicht als eine Bolusinjektion bei etwa 0,05
mg/kg bis etwa 1,0 mg/kg, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion
von etwa 0,025 μg/kg/min bis
etwa 1 μg/kg/min über einen
Zeitraum von 12 h. aPC wird als eine Bolusinjektion verabreicht,
gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion oder als eine kontinuierliche
Infusion von etwa 2 μg/kg/min
bis etwa 96 μg/kg/min
während
eines Zeitraums von etwa 24 bis etwa 144 h.
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Diese
Kombinationstherapie führt
zu einem Synergismus, der sicherer ist und wirksamer ist und die Dosierungen
reduziert von sowohl aPC als auch Abciximab, die notwendig sind
zur Behandlung von thrombotischen Störungen.