DE69828462T2

DE69828462T2 - Verwendung von APC, in Kombination mit Blutplättchenaggregationshemmer, zur Behandlung thrombothischer Störungen

Info

Publication number: DE69828462T2
Application number: DE69828462T
Authority: DE
Inventors: Brian William Indianapolis Grinnell; Joseph Anthony Indianapolis Jakubowski
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2018-06-03
Also published as: NO995776D0; DK0882453T3; CA2293429A1; BR9809932A; CN1347734A; JP2002502421A; DE69828462D1; EP0882453B1; AU741983B2; US6071514A; TR199903020T2; HUP0003964A2; CN1265598A; ES2235291T3; NO995776L; ZA984698B; EP0882453A3; PT882453E; AU7710098A; PL337223A1

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin oder Heilkunde, insbesondere die Behandlung von thrombotischen Störungen mit aktiviertem Humanprotein C in Kombination mit antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern.
Protein C ist eine Serinprotease und ein natürlich auftretendes Antikoagulans, das ein Rolle spielt bei der Regulation der Hämostase durch Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa in der Gerinnungskaskade. Humanprotein C zirkuliert als ein zweikettiges Zymogen, das in vivo durch Thrombin und Thrombomodulin auf Phospholipidoberflächen aktiviert wird, was zu aktiviertem Protein C (aPC) führt.
Die Blutgerinnung ist ein hochkomplexer Prozess, der reguliert wird durch das Gleichgewicht zwischen gerinnungsfördernden und gerinnungshemmenden Mechanismen. Dieses Gleichgewicht bestimmt einen Zustand von entweder normaler Hämostase oder abnormaler pathologischer Thrombusbildung, was zu Vorfällen führt wie Schlaganfall, Myokardinfarkt und Venenthrombose. Zwei Hauptfaktoren kontrollieren oder steuern dieses Gleichgewicht, die Bildung von Fibrin und die Aktivierung und die nachfolgende Aggregation von Blutplättchen. Ein entscheidender Faktor, der beide Prozesse kontrolliert oder steuert, ist die Erzeugung des Enzyms Thrombin, das in der Folge auf die Aktivierung der Gerinnungskaskade auftritt. Thrombin ist ein gerinnungsförderndes Enzym, das Blutplättchen aggregiert und zirkulierendes Fibrinogen in unlösliches Fibrin überführt, was zur Bildung von einem Blutgerinnsel führt. Thrombin wirkt auch als ein wirksames Antikoagulans, da es Protein C-Zymogen aktiviert zu aktiviertem Protein C, was umgekehrt die Erzeugung von Thrombin hemmt oder inhibiert. Auf diese Weise, durch die Rückkopplungsregulierung der Thrombinerzeugung, wirkt aPC vielleicht als der wichtigste Abwärtsregulator der Blutgerinnung, was zum Schutz gegen Thrombose führt.
Die kritische oder entscheidende Rolle von Protein C bei der Kontrolle oder Steuerung der Hämostase wird beispielhaft veranschaulicht durch die erhöhte Rate an Thrombose bei heterozygotem Mangel, Protein C Resistenz (z.B. aufgrund der üblichen Faktor V Leiden Mutation) und der fatalen Folge von unbehandeltem homozygotem Protein C Mangel. Humanes aktiviertes Protein C, sowohl vom Plasma abstammend als auch rekombinant, zeigten, dass sie wirksame und sichere antithrombotische Mittel sind bei einer Vielzahl von Tiermodellen von sowohl Venen- als auch Arterienthrombosen.
In der aktuellen klinischen Praxis ist die Blutplättchenhemmung oder Thrombozytenaggregationshemmung, z.B. unter Verwendung von Aspirin (ASS) gut dokumentiert hinsichtlich der Wirksamkeit sowohl bei der Prävention als auch Behandlung von thrombotischen Erkrankungen. Außerdem wurde die Plättchenhemmung bei Zuständen wie Myokardinfarkt und Schlaganfall der Standard der Behandlung. Die Verwendung von antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern, wie ASS, erhöht jedoch das Risiko einer Blutung oder Ausblutung, was die Dosis des Mittels und die Dauer der Behandlung beschränkt. Um den Effekt oder die Wirkung von Thrombin bei der Fibrinbildung zu blockieren, bleibt Heparin das Standardantikoagulans bei der akuten Behandlungssituation. Heparin weist jedoch einen schmalen therapeutischen Index auf und ist verbunden mit einem beträchtlichen Blutungsrisiko insbesondere in Kombination mit antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern.
Eine Kombinationstherapie mit Aspirin und einem synthetischen Thrombinhemmer, Gewebeplasminogenaktivator oder einem monoklonalen antithrombotischen Glykoprotein IIb/IIIa Antikörper wurde untersucht in einem Kaninchenkoronararterienthrombosemodell [Yasuda et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16: 714 bis 722 (1990)]. Aspirin in Kombination mit diesen Mitteln verlängerte die Blutungszeit und verhinderte die Reokklusion der Koronararterie nicht. Außerdem wurde eine Kombinationstherapie vorgeschlagen für aPC mit Thrombolysemitteln, wie Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase oder Streptokinase [Griffin et al., US Patent US 5 350 578 ]. Diese Kombinationen erwiesen sich jedoch nicht als erfolgreich. Daher bleibt der Bedarf bestehen, eine wirksame Therapie für die Behandlung von thrombotischen Störungen aufzuzeigen.
Die vorliegende Erfindung ist die erste, welche die Kombination von aPC mit antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern bei der Behandlung von Thrombose beschreibt. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von aPC in Kombination mit antithrombotischen Mitteln für die Behandlung von thrombotischen Störungen bereit. Diese Kombinationstherapie führt zu erhöhter Wirksamkeit bei einer Vielzahl von thrombotischen Störungen, einschließlich Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose als Folge einer peripher vaskulären Operation, ist aber nicht darauf beschränkt. Außerdem führt die Kombination von aPC und antithrombotischen Mitteln zu einem Synergismus, der die Reduzierung der Dosierungen von sowohl aPC als auch dem antithrombotischen Mittel erlaubt. Die Reduktion der Dosierungen der Mittel in der Kombinationstherapie führt umgekehrt zu reduzierten Nebenwirkungen, wie erhöhtem Risiko in Bezug auf eine Blutung, die oft beobachtet wird bei der Kombinations-Antikoagulans-/Tfhrombozytenaggregationshemmungs-Therapie.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung bereit, von einer pharmazeutisch wirksamen Menge von aktiviertem Protein C in Kombination mit einem antithrombotischen Mittel zur Behandlung einer thrombotischen Störung bei einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. Außerdem wird durch die Erfindung die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von einem antithrombotischen Mittel und aktiviertem Protein C an den Patienten erreicht, so dass ein Plasmawert an aktiviertem Protein C von 10 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml erreicht wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin offenbart und beansprucht wird, sind die folgenden Begriffe wie unten definiert.
aPC oder aktiviertes Protein C, ob rekombinant oder aus dem Plasma abgeleitet. aPC schließt ein und steht vorzugsweise für humanes Protein C, obwohl aPC auch andere Spezies oder Derivate einschließen kann, die Protein C proteolytische, amidolytische, esterolytische und biologische (antikoagulante oder profibrinolytische) Aktivitäten oder Wirksamkeiten aufweisen. Beispiele von Protein C Derivaten sind beschrieben von Gerlitz et al, US Patent US 5 453 373 und Foster et al., US Patent US 5 516 650 .

APTT: aktivierte Teilthromboplastinzeit. HPC – Humanprotein C-Zymogen.
r-hPC: rekombinantes Humanprotein C-Zymogen, hergestellt in prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen oder transgenen Tieren.
r-aPC: rekombinantes humanes aktiviertes Protein C, hergestellt durch Aktivierung von r-hPC in vitro oder durch direkte Sekretion der aktivierten Form von Protein C aus prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen oder transgenen Tieren [Cottingham, WO 97 20 043] einschließlich z.B. Sekretion aus humanen Nierenzellen 293 als Zymogen, das dann gereinigt und aktiviert wird durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie gezeigt in Yan, US Patent US 4 981 952 , und dessen gesamte Lehre hierin durch Bezugnahme einverleibt ist.
Zymogen: bezieht sich auf eine sekretierte oder abgeschiedene, inaktive Form, ob aus einer Kette oder zwei Ketten von Protein C.

Antithrombotisches Mittel oder Thrombozytenaggregationshemmer – ein oder mehr Mittel allein oder in Kombination, das das Vermögen von Blutplättchen verringert oder reduziert, zu aggregieren. Mittel, die im Stand der Technik darunter verstanden werden und anerkannt sind, schließen solche ein, die darin zitiert sind (antiplatelet agent), z.B. in Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19. Ausgabe, Band II, Seiten 924 bis 925, Mack Publishing Co., was durch Bezugnahme hierin einverleibt ist. Solche Mittel schließen Aspirin (ASS), Clopidogrel, ReoPro^® (Abciximab), Dipyridamol, Ticlopidin und IIb/IIIa Antagonisten ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

Behandlung: beschreibt die Organisation und Behandlung von einem Patienten zum Zweck der Bekämpfung der Krankheit, des Zustands, oder Störung und schließt die Verabreichung von einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ein, um den Beginn oder Ausbruch der Symptome oder Komplikationen zu vermeiden, die Symptome oder Komplikationen zu lindern oder die Erkrankung, den Zustand oder die Störung zu beenden oder zu beseitigen.

Kontinuierliche Infusion -fortwährende im Wesentlichen nicht unterbrochene Einleitung oder Einführung einer Lösung in eine Vene über einen spezifizierten Zeitraum.
Bolusinjektion – die Injektion von einem Arzneimittel in einer definierten Quantität (genannt ein Bolus) über einen Zeitraum bis zu etwa 120 min.
Pharmazeutisch wirksame Menge – steht für eine Menge von einer Verbindung der Erfindung, die in der Lage ist, eine thrombotische Störung bei Säugern zu hemmen. Die besondere Dosis der Verbindung, die gemäß dieser Verbindung verabreicht wird, wird natürlich bestimmt sein durch den behandelnden Arzt, der die besonderen Umstände, die den Fall umgeben, bewertet, einschließlich der verabreichten Verbindung, dem besonderen Zustand, der behandelt wird und ähnlichen Überlegungen.
Thrombotische Störung – eine Störung, die im Zusammenhang steht mit der Bildung oder Anwesenheit von einem Blutgerinnsel innerhalb eines Blutgefäßes oder die Bildung oder Anwesenheit von einem Blutgerinnsel innerhalb eines Blutgefäßes betrifft. Thrombotische Störungen schließen Schlaganfall, Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf eine Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose als Folge einer peripher vaskulären Operation ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise die Verwendung von aktiviertem Protein C in Kombination mit einem antithrombotischen Mittel für die Behandlung von thrombotischen Störungen. Das verwendete aPC in einer solchen Kombination kann gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen zu erhalten. Das aPC wird parenteral verabreicht, um seinen Zuführung in den Blutstrom in einer wirksamen Form durch Injektion der geeigneten Dosis als kontinuierliche Infusion über etwa 24 h bis etwa 144 h zu gewährleisten.
In Verbindung mit der Behandlung mit einem antithrombotischen Mittel wird die Menge von verabreichtem aPC so sein, dass sie etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 160 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,1 mg/m² bis 4 mg/m² oder 2 μg/kg/h bis 96 μg/kg/h beträgt. Besonders bevorzugt beträgt die verabreichte Menge von aPC etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 120 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,1 mg/m² bis 3 mg/m² oder 2,4 μg/kg/h bis 72 μg/kg/h. Noch bevorzugter beträgt die Menge von verabreichtem aPC etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 80 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,1 mg/m² bis 2 mg/m² oder 2,4 μg/kg/h bis 48 μg/kg/h. Noch mehr bevorzugt beträgt die verabreichte Menge von aPC von etwa 4 mg/70 kg/24 h bis 60 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,1 mg/m² bis 1,5 mg/m² oder 2,4 μg/kg/h bis 36 μg/kg/h. Sogar noch bevorzugter ist, dass die verabreichte Menge von aPC von etwa 10 mg/70 kg/24 h bis 50 mg/70 kg/24 h beträgt oder eine äquivalente Abgabe von 0,25 mg/m² bis 1,25 mg/m² oder 6 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h. Sogar noch bevorzugter beträgt die Menge von verabreichtem aPC von etwa 20 mg/70 kg/24 h bis 40 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 0,5 mg/m² bis 1,0 mg/m² oder 12 μg/kg/h bis 24 μg/kg/h. Die am meisten bevorzugte Menge von verabreichtem aPC beträgt etwa 40 mg/70 kg/24 h oder eine äquivalente Abgabe von 1,0 mg/m² oder 24 μg/kg/h. Die geeignete Dosis von verabreichtem aPC mit einem antithrombotischen Therapeutikum führt entweder zu einer verbesserten Wirksamkeit oder Reduktion in der Dosis von entweder einem Mittel oder beiden.
Die Bereiche der Plasmawerte, die erhaltenen werden von der Menge von verabreichtem aPC werden 2 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml betragen. Die bevorzugten Plasmawertebereiche betragen von etwa 20 ng/ml bis 80 ng/ml. Die am meisten bevorzugten Plasmawertebereiche betragen von etwa 30 ng/ml bis etwa 60 ng/ml und noch bevorzugter etwa 50 ng/ml.
Bei einer weiteren Ausführungsform oder alternativ wird das aPC durch Injektion eines Drittels der geeigneten oder entsprechenden Dosis pro Stunde als eine Bolusinjektion verabreicht, gefolgt von den verbleibenden zwei Dritteln der stündlichen Dosis als kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum von 1 h, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion der geeigneten Dosis über 23 h, was zu der geeigneten Verabreichungsdosis über den Zeitraum von 24 h führt.
Der Begriff "in Kombination mit" bezieht sich auf die Verabreichung von antithrombotischen Mitteln mit aPC entweder simultan, nacheinander oder einer Kombination davon. Die Verabreichung von Plättchenhemmern oder -inhibitoren in Kombination mit aPC führt zu einer gesteigerten Wirksamkeit bei einer Vielzahl von thrombotischen Störungen, die Schlaganfall, Venenthrombose, Myokardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf Angioplastie oder Stent-Plazierung und eine Thrombose als Folge einer peripher-vaskulären Operation einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die Synergie ergibt sich auch als Ergebnis in dem Vermögen, die Dosierungen der Mittel in der Kombinationstherapie zu reduzieren, was zu reduzierten Nebeneffekten führt, wie Erhöhungen des Risikos beim Bluten, was oft beobachtet wird in der Kombinations-Antikoagulans-/Thrombozytenaggregationshemmungs-Therapie.
Das eingesetzten antithrombotischen Mittel und die geeignete Dosis oder Dosierungswerte werden in der Technik verstanden und geschätzt. Ein Fachmann erkennt den geeigneten Dosierungswert oder die geeignete Dosis, die zu verwenden ist für jedes antithrombotische Mittel, um eine pharmazeutisch wirksame Menge zu erreichen zur Behandlung von thrombotischen Störungen. Antithrombotische Mittel, die geeignet sind zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, schließen klinisch anerkannte und kommerziell erhältliche Mittel ein, wie Aspirin (ASS), Clopidogrel, ReoPro^® (Abciximab), Dipyridamol, Ticlopidin und IIb/IIIa-Antagonisten, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Menge des antithrombotischen Mittel Aspirin (ASS), das verabreicht wird zusammen oder in Verbindung mit aPC wird etwa 10 mg bis 1000 mg betragen, die einmal täglich gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels Ticlopidin, die verabreicht wird in Verbindung mit aPC wird etwa 50 mg bis 1250 mg betragen, die zweimal täglich (B.I.D.) gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels Dipyridamol, das in Verbindung mit aPC verabreicht wird, wird etwa 15 mg bis 500 mg betragen, die viermal täglich gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels Clopidogrel, das zusammen mit aPC verabreicht wird, wird etwa 40 mg bis 1000 mg betragen, die einmal täglich gegeben wird. Die Menge des antithrombotischen Mittels ReoPro^® (Abciximab), das in Verbindung mit aPC verabreicht wird, wird etwa 0,025 μg/kg/min bis 1 μg/kg/min verabreicht, die als eine Infusion über einen Zeitraum von 12 h gegeben wird. Bei einer anderen Ausführungsform oder alternativ kann ReoPro^® in Verbindung mit aPC als eine Bolusinjektion verabreicht werden mit etwa 0,05 mg/kg bis 1,0 mg/kg. Außerdem kann ReoPro^® in Verbindung mit aPC als eine Bolusinjektion verabreicht werden, gefolgt von einer Infusion über einen Zeitraum von 12 h. Die Menge des IIb/IIIa-Antagonisten, der in Verbindung mit aPC verwendet wird, wird etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg betragen, in Abhängigkeit von dem speziell eingesetzten Mittel [s. z.B. Fischer et al., US Patent US 5 618 843 , dessen gesamte Lehre durch Bezugnahme hierin einverleibt ist]. Ein Fachmann wird in der Lage sein, den geeigneten Dosierungswert oder die geeignete Dosiskonzentration zu bestimmen, um eine pharmazeutisch wirksame Menge zu erreichen.
Das aPC kombiniert mit den antithrombotischen Mitteln verbessert den antithrombotischen Effekt des antithrombotischen Mittels allein. Daher kann diese Kombinationstherapie die therapeutischen Dosierungen oder Dosen von aPC reduzieren, sowie die Dosierung oder Dosen von antithrombotischen Mitteln, die benötigt werden für die therapeutische Behandlung von Thrombose, wodurch die Komplikationen vermieden werden, wie die Neigung zum Bluten, Toxizität und allgemeine Nebeneffekte von hohen Dosierungen von antithrombotischen Mitteln.
Präparation 1
Herstellung von Humanprotein C
Rekombinantes Humanprotein C (r-hPC) wurde in humanen Nierenzellen 293 hergestellt nach Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, solchen wie sie gezeigt sind in Yan, US Patent US 4 981 952 , dessen gesamte Lehre durch Bezugnahme hierin einverleibt ist. Das Gen, das Humanprotein C kodiert, ist offenbart und beansprucht in Bang et al., US Patent US 4 775 624 , dessen Lehre durch Bezugnahme hierin einverleibt ist. Das Plasmid, das verwendet wird, um Humanprotein C in 293 Zellen zu exprimieren war das Plasmid pLPC, das offenbart ist in Bang et al., US Patent US 4 992 373 . Der Aufbau oder die Konstruktion des Plasmids pLPC wird auch beschrieben in der europäischen Patentveröffentlichung EP 0 445 939 und in Grinnell et al., 1987, Bio/Technology 5: 1189 bis 1192, deren Lehren ebenfalls durch Bezugnahme hierin einverleibt sind. Kurz zusammengefasst wird das Plasmid in die Zellen 293 transfiziert, dann wurden stabile Transformanten identifiziert, subkultiviert und in serumfreien Medien gezüchtet. Nach Fermentation wurde zellfreies Medium erhalten durch Mikrofiltration. Das Humanprotein C wurde abgetrennt aus der Kulturflüssigkeit durch eine Anpassung der Techniken von Yan, US Patent US 4 981 952 , dessen gesamte Lehre durch Bezugnahme hierin einverleibt ist. Das geklärte Medium wurde auf 4 mM in EDTA eingestellt, bevor es auf ein Anionenaustauschharz (Fast-Flow Q, Pharmacia) absorbiert wurde. Nach einem Waschen mit 4 Säulenvolumina von 20 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7,4 und 2 Säulenvolumina von 20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 wurde das gebundene rekombinante Humanprotein C Zymogen eluiert mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Das eluierte Protein war mehr als 95 % rein nach der Elution, wie beurteilt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.
Eine weitere Reinigung des Proteins wurde erreicht durch Hineingeben des Proteins in 3 M NaCl, gefolgt von einer Adsorption auf ein hydrophobes Wechselwirkungs- oder Interactionharz (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) äquilibriert in 20 mM Tris, 3 NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,4. Nach einem Waschen mit 2 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers ohne CaCl₂, wurde das rekombinante Humanprotein C eluiert mit 20 mM Tris, pH 7,4.
Das eluierte Protein wurde hergestellt zur Aktivierung durch Entfernung des restlichen Calciums. Das rekombinante Humanprotein C wurde über eine Metallaffinitätssäule (Chelex-100, BioRad) geleitet, um Calcium zu entfernen und es wieder an einen Anionenaustauscher (Fast Flow Q, Pharmacia) zu binden. Beide dieser Säulen wurden in Reihe angeordnet und äquilibriert in 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 6,5. Nach der Beladung des Proteins wurde die Chelex-100 Säule gewaschen mit einem Säulenvolumen mit dem gleichen Puffer, bevor es aus der Reihe herausgenommen wurde. Die Anionenaustauschsäule wurde mit 3 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers gewaschen vor einem Eluieren des Proteins mit 0,4 M NaCl, 20 mM Trisacetat, pH 6,5. Die Proteinkonzentrationen von Lösungen von rekombinantem Humanprotein C und rekombinantem aktivierten Protein C wurden gemessen durch UV 280 nm Extinktion E^0,1% = 1,81 bzw. 1,85.
Präparation 2
Aktivierung von rekombinantem Humanprotein C
Rinderthrombin wurde an aktvierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) in Gegenwart von 50 mM HEPES, pH 7,5 bei 4°C gekuppelt. Die Kupplungsreaktion wurde ausgeführt in einem bereits gepackten Harz in einer Säule unter Verwendung von etwa 5000 Einheiten Thrombin/ml Harz. Die Thrombinlösung wurde etwa 3 h lang durch die Säule zirkuliert vor der Zugabe von MEA bis zu einer Konzentration von 0,6 ml/l der zirkulierenden Lösung. Die MEA enthaltende Lösung wurde zusätzliche 10 bis 12 h zirkuliert, um eine vollständige Blockierung der nicht umgesetzten Amine auf dem Harz zu gewährleisten. Nach der Blockierung wurde das mit Thrombin gekuppelte oder beladene Harz gewaschen mit 10 Säulenvolumina von 1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 6,5, um das gesamte nicht spezifisch gebundene Protein zu entfernen, und wurde in Aktivierungsreaktionen verwendet nach Äquilibrierung in Aktivierungspuffer.
Gereinigtes r-hPC wurde hergestellt in 5 mM in EDTA (um beliebiges Restcalcium zu chelatisieren) und verdünnt auf eine Konzentration von 2 mg/ml mit 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20 mM Trisacetat, pH 6,5. Dieses Material wurde durch eine Thrombinsäule geleitet, die equilibriert war mit 50 mM NaCl bei 37°C und entweder 20 mM Tris, pH 7,4 oder 20 mM Trisacetat pH 6,5. Die Flussrate wurde eingestellt, um etwa 20 min Kontaktzeit zu erlauben zwischen dem r-hPC und dem Thrombinharz. Der Ausfluss wurde gesammelt und unmittelbar nach amidolytischer Aktivität in einem Test oder Assay untersucht. Wenn das Material keine spezifische (amidolytische) Aktivität vergleichbar zu einem bekannten Standard von aPC aufwies, wurde es über die Thrombinsäule recycelt, um das r-hPC bis zur Vollständigkeit zu aktivieren. Darauf folgte eine 1:1 Verdünnung des Materials mit 20 mM Puffer wie oben, mit einem pH von irgendwo zwischen 7,4 oder 6,0 (ein niedriger pH ist bevorzugt, um eine Autodegradation oder einen Selbstabbau zu verhindern), um das aPC bei niedrigeren Konzentrationen zu halten, während der nächste Verarbeitungsschritt abgewartet wird.
Die Entfernung von ausgelaugtem Thrombin aus dem aPC Material wurde erreicht durch Bindung des aPC an ein Anionenaustauschharz (Fast Flow Q, Pharmacia), äquilibriert in einem Aktivierungspuffer (entweder 20 mM Tris, pH 7,4 oder vorzugsweise 20 mM Trisacetat, pH 6,5) mit 150 mM NaCl. Thrombin läuft durch die Säule und eluiert während eines Waschens mit 2 bis 6 Säulenvolumina mit 20 mM Äquilibrierungspuffer. Gebundenes aPC wird eluiert mit einem Stufengradienten unter Verwendung von 0,4 M NaCl in entweder mM Trisacetat, pH 6,5 oder 20 mM Tris, pH 7,4. Ein Waschen der Säule mit größeren Volumina erleichterte eine vollständigere Entfernung des Dodecapeptids. Das Material, das eluiert wurde von dieser Säule, wurde entweder in einer gefrorenen Lösung (–20°C) aufbewahrt oder als ein lyophilisiertes Pulver.
Die amidolytische Aktivität (AU) von aPC wurde bestimmt durch Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem synthetischen Substrat H-D-Phe-Pip-Arg-p-Nitroanilid (S-2238), erworben von Kabi Vitrum unter Verwendung eines Beckman DU-7400 Diodenarrayspektrophotometers. Eine Einheit von aktiviertem Protein C wurde definiert als die Menge von Enzym, die benötigt wird zur Freisetzung von 1 μmol von p-Nitroanilin in 1 min bei 25°C, pH 7,4, unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten für p-Nitroanilin bei 405 nm von 9620 M^–1cm^–1.
Die Antikoagulansaktivität von aktiviertem Protein C wurde bestimmt durch Messung der Verlängerung der Gerinnungszeit in dem aktivierten Teilthromboplastinzeit (APTT)-Gerinnungsassay. Eine Standardkurve wurde hergestellt in einem Verdünnungspuffer (1 mg/ml BSA (Rinderserumalbumin) mit Radioimmunoassayqualität, 20 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃), der in Bereichen der Protein C Konzentration von 125 bis 1000 ng/ml lag, während Proben hergestellt wurden bei verschiedenen Verdünnungen in diesem Konzentrationsbereich. Zu jeder Probenküvette wurden 50 μl von kaltem Pferdeplasma und 50 μl von rekonstituiertem aktivierten Teilthromboplastinzeitreagens (APTT Reagens, Sigma) zugegeben und bei 37°C 5 min lang inkubiert. Nach der Inkubation wurden 50 μl der geeigneten Proben oder Standards zu jeder Küvette gegeben. Der Verdünnungspuffer wurde verwendet anstelle der Probe oder des Standards, um die Grundgerinnungszeit zu bestimmen. Der Zeitmesser des Fibrometers (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) wurde gestartet bei der Zugabe von 50 μl, 37°C, 30 mM CaCl₂ zu jeder Probe oder jedem Standard. Die Konzentration an aktiviertem Protein C in den Proben wurde berechnet aus der linearen Regressionsgleichung der Standardkurve. Die hier berichteten Gerinnungszeiten sind der Mittelwert von einem Minimum von drei Wiederholungen, einschließlich der Standardkurvenproben.
Präparation 3
Formulierung von aktiviertem Protein C
Eine stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C wurde hergestellt nach einem Verfahren, das umfasst ein Lyophilisieren einer Lösung, die etwa 2,5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 15 mg/ml Saccharose, etwa 20 mg/ml NaCl und einen Natriumcitratpuffer, der einen pH von größer als 5,5 aber weniger als 6,5 aufwies, umfasste. Zusätzlich umfasst die stabile lyophilisierte Formulierung von aktiviertem Protein C die Lyophilisierung einer Lösung, die etwa 5 mg/ml aktiviertes Protein C, etwa 30 mg/ml Saccharose, etwa 38 mg/ml NaCl und einen Citratpuffer, der einen pH von größer als 5,5, aber kleiner als 6,5 aufweist, umfasst.
Das Verhältnis von aPC:Salz:Zusatzstoff (w:w:w (Gew:Gew:Gew)) ist ein wichtiger Faktor bei einer Formulierung, die geeignet ist für das Gefriertrocknungsverfahren. Das Verhältnis ist verschieden in Abhängigkeit von der Konzentration von aPC, Salzauswahl und Konzentration und Zusatzstoffauswahl und -konzentration. Insbesondere ist ein Verhältnis von etwa einem Teil aktiviertem Protein C zu etwa 7,6 Teilen Salz zu etwa 6 Teilen Zusatzstoff bevorzugt.
Eine Einheitsdosierungsformulierung von aktiviertem Protein C, geeignet zur Verabreichung durch kontinuierliche Infusion wurde hergestellt durch Mischen von aktiviertem Protein C, NaCl, Saccharose und Natriumcitratpuffer. Nach dem Mischen wurden 4 ml der Lösung in einen Einheitsdosierungsbehälter überführt und lyophilisiert. Der Einheitsdosierungsbehälter, der etwa 5 mg bis etwa 20 mg an aktiviertem Protein C enthielt, geeignet zur Verabreichung von einer Dosierung von etwa 0,01 mg/kg/h bis etwa 0,05 mg/kg/h an Patienten, die einer solchen Verabreichung bedürfen, wurde verschlossen und bis zum Gebrauch gelagert.
Beispiel 1
Versuchskaninchen AV Shunt-Modell für Thrombose
Da die Plättcheninhibierung oder Thrombozytenaggregationshemmung klinische Wirksamkeit gezeigt hat, und aPC eine entscheidende Rolle spielt bei der Kontrolle oder Steuerung der Hämostase, wurde die mögliche Synergie zwischen aPC und ASS untersucht in dem Versuchskaninchen Arterien/Venen (AV) Shunt-Thrombosemodell. In diesem Modell der Thrombose zeigte aPC, dass es ein wirksames antithrombotisches Mittel ist, was dosisabhängige Inhibierung der Thrombusbildung verursacht.
Um den Effekt von aPC und Aspirin zu untersuchen, wurden Versuchskaninchen (etwa 500 g) mit 20 mg/kg Rompun und 125 mg/kg Ketaset anästhesiert, und ein Shunt wurde eingesetzt, der die rechte Halsschlagader (Arteria carotis) und die linke Halsvene (Jugularis) verband. Der Shunt enthielt einen Baumwolfaden der die Thrombusbildung stimuliert. aPC wurde verabreicht, um die Thrombusbildung zu inhibieren mit einer Bolus- plus einer Infusionsdosierungskur (0,5 mg/kg Bolus plus 3 mg/kg/h). Zusätzlich wurde aPTT des gesamten Bluts durchgeführt vor und während der Dosierungskur, und zirkulierende aPC Plasmawerte wurden gemessen durch einen amidolytischen Immuneinfangtest. Aspirin wurde mit 10 mg/kg intravenös verabreicht, und bei Untersuchungen mit Heparin wurde eine Dosis von 30 Einheiten/kg Bolus, gefolgt von einer Infusion von 40 Einheiten/kg/h verwendet. Die Bolusdosierung wurde durchgeführt durch Kanülisierung der linken Jugularis, und ein Sammeln des Bluts wurde durchgeführt über eine Kanüle der rechten Jugularis. Blutproben wurden entnommen an aufeinandenolgenden Zeitpunkten in 3,8 % Na₃ Citrat gegeben, das 300 mM Benzamidin HCl enthielt (9 Volumina Blut zu 1 Volumen Citrat/Benzamidinlösung). Das Blutvolumen wurde ersetzt in dem Tier durch Salzlösung nach jeder Entnahme. Plasma wurde abgetrennt durch Zentrifugation und bei –20°C gefroren. Die Plasmakonzentration von aPC wurde bestimmt durch einen amidolytischen Immuntest.
Um einen potentiellen antithrombotischen Synergismus zwischen aPC und dem antithrombotischen Mittel ASS zu untersuchen, wurde die Dosis von ASS ausgewählt, um nahezu vollständige Inhibierung von Plättchencyclooxygenase zu ergeben, wie gemessen durch Inhibierung von Thromboxan B2 Freisetzung. Wie in Tabelle 1 gezeigt, hemmte eine Dosis von 10 mg/kg ASS wirksam die Plättchencyclooxygenase, hatte jedoch keinen beträchtlichen Effekt auf das Thrombusgewicht. Unter Verwendung dieser Dosis von ASS, die keinen Effekt auf das Thrombusgewicht hatte, wurden Experimenten in Verbindung mit aPC durchgeführt. Für Vergleichszwecke wurde auch Heparin, das klinische Standardantikoagulans, verglichen. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden die Dosierungen von aPC und Heparin gewählt, um jeweils etwa den gleichen antithrombotischen Effekt in dem Modell zu ergeben (45,9 bzw. 43,4 % Inhibierung). Die Kombination von ASS und aPC führte zu einer beträchtlich größeren Hemmung oder Inhibierung der Thrombusbildung, als dies beobachtet wurde bei aPC allein (p = 0,01). Im Gegensatz dazu zeigte die Kombination des Antikoagulans Heparin mit ASS keinen beträchtlich größeren Effekt als der, der mit Heparin alleine beobachtet wurde. Diese Daten zeigen einen Synergismus zwischen antithrombotischen Mitteln oder Thrombozytenaggregationshemmern und aPC und schlagen vor, dass (a) Patienten auf entweder einer ASS- oder anderen Therapie mit antithrombotischen Mitteln erhöhte Wirksamkeiten erreichen durch Kombinationstherapie mit aPC und (b) therapeutische Dosen oder Dosierungen von aPC verringert werden können in Gegenwart einer Antiplättchen- oder Thrombozytenaggregationstherapie.
Tabelle 1
Der Effekt oder die Wirksamkeit von ASS auf die Blutplättchen Thromboxan B2 Freisetzung und das Thrombusgewicht in dem Versuchskaninchen AV Shunt Modell. Die Daten zeigen, dass trotz fast maximaler Inhibierung der Thromboxan B2 Freisetzung ASS keinen Effekt auf das Thrombusgewicht hatte.
Tabelle 2 Antithrombotischer Synergismus zwischen aPC, aber nicht Heparin, und ASS.
Beispiel 2
Der Effekt von aPC und IIb/IIIa Antagonisten in dem Versuchskaninchen AV Shunt Modell der Thrombose Um den Effekt der Kombinationstherapie von aPC und einem repräsentativen synthetischen IIb/IIIa-Rezeptorantagonisten zu untersuchen, wurde das Versuchskaninchen AV Shunt Modell der Thrombose, wie im Beispiel 1 beschrieben, verwendet. 2-([6-Carboxy-n-hexyl]carboxamidyl)-5-amidinobenzofurantrifluoracetat, hergestellt wie beschrieben in Fischer et al., US Patent US 5 618 843 , wurde verwendet. Die Kombination von aPC und dem IIb/IIIa Antagonisten führte zu einer beträchtlich größeren Inhibierung der Thrombusbildung als sie mit aPC alleine beobachtet wurde (Tabelle 3). Diese Daten zeigen einen Synergismus zwischen aPC und einem synthetischen IIb/IIIa-Antagonisten. Tabelle 3 Antithrombotischer Synergismus zwischen aPC und einem IIb/IIIa-Antagonisten.
Beispiel 3
Der Effekt von aPC und Abciximab bei der Behandlung von thrombotischen Störungen Abciximab (RheoPro^®) ist ein Mittel, das die Blutplättchenaggregation inhibiert oder hemmt durch Bindung an IIb/IIIa-Rezeptoren auf der Plättchenzelloberfläche. Die Kombinationstherapie mit aPC und Abciximab ist wirksam bei der Hemmung oder Inhibierung der Thrombose durch Abwärts- oder Herabregulierung des Blutgerinnungsprozesses und der Inhibierung der Blutplättchenaggregation. Abciximab wird verabreicht als eine Bolusinjektion bei etwa 0,05 mg/kg bis etwa 1,0 mg/kg, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion von etwa 0,025 μg/kg/min bis etwa 1 μg/kg/min über einen Zeitraum von 12 h. aPC wird als eine Bolusinjektion verabreicht, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion oder als eine kontinuierliche Infusion von etwa 2 μg/kg/min bis etwa 96 μg/kg/min während eines Zeitraums von etwa 24 bis etwa 144 h.
Diese Kombinationstherapie führt zu einem Synergismus, der sicherer ist und wirksamer ist und die Dosierungen reduziert von sowohl aPC als auch Abciximab, die notwendig sind zur Behandlung von thrombotischen Störungen.

Claims

Aktiviertes Protein C in Kombination mit ein oder mehr antithrombotischen Mitteln zur Verwendung als Arzneimittel bei der Behandlung einer thrombotischen Störung bei einem Patienten, der eine solche Behandlung nötig hat.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 2,4 μg/kg/h bis 48 μg/kg/h beträgt.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 2,4 μg/kg/h bis 36 μg/kg/h beträgt.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 6 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h beträgt.
Kombination nach Anspruch 1, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C 24 μg/kg/h beträgt.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das aktivierte Protein C für die Verabreichung ist an einen Patienten, erst als ein Bolus und dann als eine kontinuierliche Infusion.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das aktivierte Protein C für die Verabreichung ist an einen Patienten durch kontinuierliche Infusion während etwa 24 bis 144 h.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das antithrombotische Mittel ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Aspirin (ASS), Clopidogrel, Abciximab, Dipyridamol, Ticlopidin, Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten oder eine Kombination davon.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten in einer pharmazeutisch wirksamen Menge ist, so dass ein Plasmawert an aktiviertem Protein C von 10 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml erreicht wird.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten in einer pharmazeutisch wirksamen Menge ist, so dass ein Plasmawert an aktiviertem Protein C von etwa 50 ng/ml erreicht wird.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Clopidogrel stehen.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Ticlopidin stehen.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Dipyridamol stehen.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Abciximab stehen.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und einen Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten stehen.
Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die thrombotische Störung steht für akuten thrombotischen Schlaganfall, Venenthrombose, Myocardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf Angioplastie oder Stent-Platzierung, oder eine Thrombose als Folge einer periphervaskulären Operation.
Verwendung von aktiviertem Protein C in Kombination mit ein oder mehr antithrombotischen Mitteln zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer thrombotischen Störung.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 2,4 μg/kg/h bis 48 μg/kg/h beträgt.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 2,4 μg/kg/h bis 36 μg/kg/h beträgt.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C von 6 μg/kg/h bis 30 μg/kg/h beträgt.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Dosierung von aktiviertem Protein C 24 μg/kg/h beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das Arzneimittel, das das aktivierte Protein C enthält, für die Verabreichung an einen Patienten ist, erst als ein Bolus und dann als eine kontinuierliche Infusion.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das Arzneitmittel, das das aktivierte Protein C enthält, für die Verabreichung ist an einen Patienten durch kontinuierliche Infusion während etwa 24 bis 144 h.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, wobei das antithrombotische Mittel ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus Aspirin (ASS), Clopidogrel, Abciximab, Dipyridamol, Ticlopidin, Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten oder eine Kombination davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten in einer pharmazeutisch wirksamen Menge ist, so dass ein Plasmawert an aktiviertem Protein C von 10 ng/ml bis weniger als 100 ng/ml erreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei das Arzneimittel zur Verabreichung an einen Patienten in einer pharmazeutisch wirksamen Menge ist, so dass ein Plasmawert an aktiviertem Protein C von etwa 50 ng/ml erreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Clopidogrel stehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Ticlopidin stehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Dipyridamol stehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und Abciximab stehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei die antithrombotischen Mittel für Aspirin (ASS) und einen Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor-Antagonisten stehen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 31, wobei die thrombotische Störung steht für akuten thrombotischen Schlaganfall, Venenthrombose, Myocardinfarkt, instabile Angina, abrupter Verschluss folgend auf Angioplastie oder Stent-Platzierung, oder eine Thrombose als Folge einer periphervaskulären Operation.