DE68919504T2

DE68919504T2 - Beschleunigung der Lyse von Gerinnsel.

Info

Publication number: DE68919504T2
Application number: DE68919504T
Authority: DE
Inventors: Edgar Haber; Gary Matsueda; Guy L Reed
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2009-04-05
Also published as: DK240190D0; EP0336693A2; NO301374B1; GR3015182T3; KR900700129A; DK240190A; EP0336693B1; AU3284589A; ES2064435T3; EP0336693A3; NO904294D0; CA1341377C; ATE114480T1; JP2871775B2; HUT56394A; JPH03504717A; FI102812B1; HU207349B; AU628041B2; WO1989009817A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG:

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Myokardinfarkt und Blutgerinnseln bei einem Patienten und insbesondere eine Therapie, welche die Lyse von Gerinnseln verstärkt und das Verabreichen eines Antikörpers umfaßt, der gegen Alpha-2-Antiplasmin gerichtet ist. Die Erfindung betrifft auch eine Behandlung zur Verstärkung der Lyse von Blutgerinnseln, welche das Verabreichen eines Antikörpers, der gegen Alpha-2-Antiplasmin gerichtet ist, gemeinsam mit einem thrombolytischen Mittel umfaßt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das auslösende Ereignis vieler Myokardinfarkte (Herzanfälle) ist die Blutung in eine atherosklerotische Plaque. Eine solche Blutung führt häufig zur Bildung eines Thrombus (oder Blutgerinnsels) in der Koronararterie, welche die Infarktzone versorgt (d.h. einen Bereich von Koagulationsnekrose, der sich aus einer Behinderung des Blutkreislaufes ergibt). Dieser Thrombus besteht aus einer Kombination von Fibrin und Blutplättchen. Die Bildung eines Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsels hat ernsthafte klinische Konsequenzen. Das Ausmaß und die Dauer des Verschlusses, der durch das Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel hervorgerufen wird, bestimmt die Masse der Infarktzone und das Schadensausmaß.

A. Behandlung von Myokardinfarkt

Das primäre Ziel der gegenwärtigen Behandlung eines Myokardinfarkts beinhaltet die rasche Auflösung des verschließenden Thrombus und die Wiederherstellung des Blutstromes ("Reperfusion"). Eine erfolgreiche Therapie muß, um wirksam zu sein, zwischen einem Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel und dem Fibrin-Vorläufer Fibrinogen unterscheiden können. Die Verwendung eines Mittels, dem eine solche Spezifität fehlt, kann das Risiko einer allgemeinen Blutung für den Patienten erhöhen. Eine erfolgreiche Therapie muß eine anhaltende Wirkung haben, so daß nach Beendigung der Therapie keine Neubildung des Gerinnsels eintritt. Wenn sich das Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel wieder bilden kann, kann die betroffene Arterie wieder verschlossen werden.
Die Bildung von Fibrin/Blutplättchen-Gerinnseln in anderen Teilen des Blutkreislaufsystems kann teilweise durch Verwendung von Antikoagulantien (wie Heparin) verhindert werden. Leider hat sich Heparin als nicht allgemein wirksam erwiesen, einen neuerlichen Verschluß bei Myokardinfarkt-Patienten zu verhindern, bei welchen der Grad des Blutgefäßverschlusses (der Grad der "Stenose") größer oder gleich 70% ist, insbesondere bei jenen Patienten mit schwerer remanenter Koronarstenose.
Wenn sich bei einem Patienten ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel gebildet hat, bevor medizinische Hilfe zur Verfügung stand, kann das Gerinnsel durch Verwendung thrombolytischer Mittel aufgelöst werden. Ein thrombolytisches Mittel ist ein Medikament, das zur Lyse des Fibrin/Blutplättchen-Thrombus in der Lage ist und dadurch den Blutstrom durch das befallene Blutgefäß wieder ermöglichen kann. Zu solchen Mitteln zählen Streptokinase, Prourokinase, Uroklnase und Gewebsplasminogen-Aktivator (Ganz, W. et al., J. Amer. Coll. Cardiol. 1:1247-1253 (1983); Rentrop, K.P. et al.. Amer. J. Cardiol. 54:29E-31E (1984); Gold, H.K. et al., Amer. J. Cardiol. 53:122C-125C (1984)).
Die Behandlung mit thrombolytischen Mitteln kann häufig den koronaren Blutstrom erfolgreich rasch genug herstellen, um einen Myokardinfarkt zu unterbrechen. Leider hat sich gezeigt, daß sich das aufgelöste Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel nach Beendigung einer solchen thrombolytischen Therapie bei einer großen Zahl von Patienten wieder bildet. Diese Neubildung kann zu einem neuerlichen Verschluß der befallenen Blutgefäße führen und ist daher von großer Bedeutung (Gold, H.K. et al.. Amer. J. Cardiol. 53:122C-125C (1984); Gold, H.K. et al.. Circulation 68:I-50-I-54 (1983)). Obwohl sich die Streptokinase-Behandlung bei der Auflösung von Fibrin-Gerinnseln bei etwa 85% der untersuchten Fälle als erfolgreich erwiesen hat, zeigte sich somit, daß ein neuerlicher Verschluß der befallenen Gefäße bei etwa 25% der untersuchten Patienten eintrat (Gold, H.K. et al.. Circulation 68:I50-I54 (1983)).
Gewebsplasminogen-Aktivator (t-PA) wird als thrombolytisches Mittel sowohl gegenüber Streptokinase als auch gegenüber Urokinase bevorzugt, da er eine größere (wenn auch nicht absolute) Spezifität für Fibrin besitzt als jedes dieser Mittel (Verstrate, M., et al., Lancet, 1:142 (1985)). Gewebsplasminogen-Aktivator (t-PA) ist ein gerinnselspezifisches thrombolytisches Mittel mit einer hohen Dispositionsrate aus Plasma. Es hat sich gezeigt, daß Gewebsplasminogen-Aktivator (t-PA) bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt ein wirksames thrombolytisches Mittel ist, welches bei etwa 70% der untersuchten Patienten in 45-75 Minuten einen koronaren Rückfluß (d.h. eine abnehmende Stenose) bewirkt (Gold, H.K. et al., Circulatjon 73:347-352 (1986)).
Gewebsplasminogen-Aktivator wird bei einer Infusion mit einer Geschwindigkeit von etwa 1-2 mg/kg Körpergewicht des Patienten/90 Minuten verabreicht. Da t-PA bei hoher Konzentration in der Lage ist, Fibrinogen zu zersetzen, ist die Verwendung höherer Dosierungen mit einer größeren Wahrscheinlichkeit einer allgemeinen Blutung verbunden. Es wurde nicht festgestellt, daß erhöhte t-PA Dosierungen das Ausmaß der Gerinnselauflösung konstant erhöhten.
Der Nutzen der Verwendung von t-PA wird durch das spontane Ausmaß eines akuten neuerlichen Verschlusses signifikant ausgeglichen, der auf die Beendigung der t-PA Therapie folgt. Gold, H.K. und Mitarbeiter haben festgestellt, daß die Beendigung der t-PA Therapie bei etwa 45% der untersuchten Patienten zu einem neuerlichen Verschluß der befallenen Blutgefäße führte (Circulation 73:347-352 (1986)). Es wurde nicht festgestellt, daß erhöhte t-PA Dosierungen die Neigung für einen neuerlicben Verschluß der Koronararterie senken. Bezeichnenderweise hängt die Wahrscheinlichkeit einer Neubildung des Thrombingerinnsels eng mit dem Ausmaß der remanenten koronaren Stenose zusammen (d.h. dem Ausmaß der Blutgefäßblocklerung). Daher ist ein neuerlicher Verschluß bei Patienten wahrscheinlicher, bei welchen eine hochgradige Stenose (d.h. mehr als 70% quantitative Stenose oder mehr als 80% nicht quantitative Stenose) aufgetreten ist. Es hat sich gezeigt, daß der neuerliche Verschluß von Blutgefäßen durch eine Dauerinfusion von t-PA verhindert wird (Gold, H.K. et al., Circulation 73:347-352 (1986)). Leider ist die Dauerinfusion von t-PA für viele Herzanfall-Patienten wegen der verhältnismäßig kurzen biologischen Halbwertszeit von t-PA und der Möglichkeit, die Neigung für schwere Blutung bei einigen Patienten zu erhöhen, nicht durchführbar.
Zusammenfassend haben klinische Untersuchungen gezeigt, daß sich der aufgelöste Thrombus häufig nach Beendigung der t-PA Infusion wieder bildet (Gold, H.K. et al., Circulation 73:347-352 (1986)), daß aber die Häufigkeit eines solchen neuerlichen Verschlusses durch Gabe einer zweiten ("Erhaltungs-") tPA-Infusion mit einer deutlich geringeren Dosis jedoch über einen wesentlich längeren Zeitraum auf ein Mindestmaß verringert werden kann. Gegenwärtig wird Heparin als geeignete begleitende Therapie bei Patienten erachtet, die eine solche Erhaltungsinfusion bekommen. Die Behandlung einer Koronararterienthrombose (Gerinnung) mit t-PA erfordert daher eine Dauerinfusion bei einer hohen Geschwindigkeit, um die rasche Reperfusion zu erzielen, und eine Erhaltungsinfusion bei einer geringeren Geschwindigkeit, um einen neuerlichen Verschluß bei Patienten mit hochgradiger remanenter Stenose zu verhindern.

B. Mechanismus der Fibringerinnselbildung

Gerinnsel bestehen sowohl aus Fibrin als auch Blutplättchen in verschiedenen Anteilen. Die grundlegende Realnion bei der Blutgerinnung umfaßt die Umwandlung eines löslichen Plasmaproteins (Fibrinogen) zu unlöslichem Fibrin. Die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin wird durch das Enzym Thrombin katalysiert, das eine Serinprotease ist. Der allgemeine Mechanismus der Blutgerinnselbildung wurde von Ganong, W.F. zusammengefaßt (in: Review of Medical Physiology, 9. Auflage, Lange, Los Altos, CA, S. 411-414 (1979)). Blutplättchen sind scheibenförmige Strukturen, die im Blut vorhanden sind. Sie tragen sowohl durch ihre Verbindung mit Fibrin zu einer unlöslichen Masse als auch durch ihre Erhöhung der Umwandlungsrate von Fibrinogen zu Fibrin zu der Gerinnselbildung bei. Blutplättchen tragen bei Myokardinfarkt zu der Gerinnselbildung bei und sind eine Hauptkomponente von Gerinnseln, die Koronararterien neuerlich verschließen, welche durch die Behandlung mit einem thrombolytischen Mittel reperfundiert wurden. Die Bildung des Blutplättchenaggregats hängt von einer Wechselwirkung zwischen Fibrinogen (und vielleicht dem von Willebrand-Faktor oder Fibrinonectin) und einem Rezeptormolekül ab, das an der Oberfläche der Blutplättchen vorhanden ist. Dieser Blutplättchen-Fibrinogen-Rezeptor hat sich als ein Komplex aus zwei Membran-Glycoproteinen erwiesen, die als GPIIb und GPIIIa bezeichnet werden (Nachman, R.L. et al., J. Clin. Invest. 69:263-269 (1982); Coller, B.S. et al., J. Clin. Invest 72:325-338 (1983)). Die besondere Rolle des GPIIb/GPIIIa-Rezeptorkomplexes wurde von Coller, B.S. und Mitarbeitern durch ihre Isolierung eines murinen monoklonalen Antikörpers (bekannt als monoklonaler Antikörper 10E5) deutlich gemacht, der sich als imstande erwies, an die Glycoproteine IIb und IIIa zu binden und die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen vollständig zu blockieren. Zur Vermeidung etwaiger Komplikationen aufgrund der Möglichkeit, daß die Fc-Fragment-Region des monoklonalen Antikörpers die Aggregation nicht spezifisch hemmen könnte, verwendeten Coller etal. in ihren Experimenten das F(ab')&sub2;-Fragment des 10E5 Antikörpers. (Coller, B. S. et al.. J. Clin. Invest. 72:325-338 (1983)). Das F(ab')&sub2;-Fragment eines Antikörpers enthält nur jene Regionen des Antikörpers, die für die Spezifität des Antikörpers und die Antigen-Bindungskapazität verantwortlich sind. Die Beschaffenheit der F(ab')&sub2;-Fragmente und Verfahren zu deren Herstellung sind von Eisen, H.N. offenbart (in: Microbiology, 3. Auflage, Davis, B.D. et al., Harper & Row, N.Y., S. 342-349 (1980)).
Es wurde festgestellt, daß ein weiterer monoklonaler Antikörper (als 7E3 bezeichnet) die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen blocklert und an GPIIb/GPIIIa bindet (Coller, B. S., J. Clin. Invest. 76:101-108 (1985)). Dieser monoklonale Antikörper unterscheidet sich von Antikörper 10E5 darin, daß er rascher an aktivierte Blutplättchen als an nicht aktivierte Blutplättchen bindet, und in der Lage ist, an Blutplättchen sowohl des Hundes als auch des Menschen zu binden (Coller, B. S., J. Clin. Invest. 76:101-108 (1985); Coller, B. S. et al., J. Lab. Clin. Med., 107:384-392 (1986), welche beide hierin durch Bezugnahme eingeführt werden). Die F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen Antikörpers 7E3 erwiesen sich als in der Lage, die Blutplättchenaggregation zu stören, woraus sich eine mögliche therapeutische Verwendung in der Behandlung von thrombotischen Erkrankungen ableiten ließ (Coller, B. S. et al., Blood 66:1456-1459 (1985)). Das F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers 7E3 erwies sich auch bei der Blockierung der Akkumulierung von mehreren Blutplättchenschichten als wirksam, ohne ein unannehmbares Risiko einer Blutung zu erzeugen, was eine mögliche Verwendung zur Vermeidung eines Totalverschlusses von Blutgefäßen nahelegt, der bei Myokardinfarkt und Schlaganfall eintreten kann (Coller, B. S. et al., Blood 66:1456-1459 (1985)).

C. Mechanismus der Lyse und natürlichen Vermeidung eines Gerinnsels

Die Lyse eines Gerinnsels wird durch Plasmin in vivo vermittelt. Unter natürlichen Bedingungen wird Plasminogen durch den Gewebsplasminogen-Aktivator (t-PA) zu Plasmin umgewandelt. Die Aktivierung erfolgt an der Fibrinoberfläche, wodurch die proteolytische Aktivität an der richtigen Stelle begrenzt wird. Nach dem Freisetzen von Plasmin in den Kreislauf wird es rasch mit natürlichen Inhibitoren vereint. Die Inaktivierung von Plasmin ist der letzte und notwendige Schritt in dem Ablauf zum Schutz gegen unerwünschte Proteolyse. Zu solchen Plasmin-Inhibitoren zählen Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2-Makroglobulin und Alpha-1-Antitrypsin, alles Glycoproteine. Alpha-2-Antiplasmin hat eine viel höherer Affinität für Plasmin als Alpha-2-Makroglobulin und bindet spezifisch an Plasmin in einem 1:1 Verhältnis. Der größerer Pool von Alpha-Makroglobulin dient als Inhibitorreserve. Kane, K.K., Ann. Clin. Lab. Sci. 14:443-449 (1984). So wird die Lyse von Gerinnseln durch die Verabreichung von t-PA durch die rasche und irreversible Inaktivierung von Plasmin durch Plasmininhibitoren eingegrenzt.
Alpha-2-Antiplamsin hat drei funktionelle Domänen die reaktionsfähige Stelle für Plasmin, die Plasmin(ogen) oder LBS-Bindungsstelle [komplementär zu der LBS (Lysin-Bindungsstelle) von Plasmin(ogen)] und die Vernetzungsstelle für Fibrin. Mimuro, I. et al., Blood, 69:446-453 (1987). Mimuro etal. offenbaren Antikörper zu Alpha-2-Antiplasmin, von welchen einer (JPTI-1) spezifisch für die reaktionsfahige Stelle von Alpha-2-Antiplasmin ist und die Bildung von Alpha-2-Antiplasmin-Plasmin-Komplexen verhindert, und somit Antiplasmin-Aktivität verhindert. Mimuro et al. lehren jedoch nicht die Verabreichung des JPTI-1 Antikörpers zur Verstärkung der Lyse von Gerinnseln. Andere Antikörper, die für Alpha-2-Antiplasmin spezifisch sind, lehren Plow, E.F., et al., J. Biol. Chem. 255:2902-2906 (1980); Wimen, B., et al., Scan. J. Clin. Lab. Invest. 43:27-33 (1983); Hattey, E., et al., Thromb. Res. 45:485-495 (1987); Collen, U.S. Patent Nr. 4.346.029 (1980); und Collen, U.S. Patent Nr. 4.198.335 (1980). Kumada et al., Thromb. Res. 36:153-163,1984, offenbaren die Verwendung polyklonaler Antikörper zur Herbeiführung eines α-2-Plasmininhibitor Mangels bei Ratten durch Immunschwächung. Die Verarmung an α-2-Plasmininhibitor führte zu einer deutlichen Beschleunigung der durch Urokinase herbeigeführten Plasmagerinnsellyse und auch zu einer schwachen Blutungsneigung an den Stelle der Venenpunktion.

D. Zusammenfassung

Zusammenfassend war eine wesenfliche Zielsetzung von Therapien, die auf die Behandlung von Myokardinfarkten gerichtet waren, die Begrenzung einer Nekrose durch Ermöglichen einer frühen Reperftision und Verhindern eines neuerlichen Verschlusses. Gegenwärtig wird diese Zielsetzung durch die Verabreichung von thrombolytischen Mitteln teilweise erfüllt, die in der Lage sind, die möglicherweise lebensbedrohenden Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen. Der mögliche Nutzen der Verwendung solcher Mittel wird jedoch durch den Mangel an Fibrinspezifität (wie im Falle von Streptokinase und Urokinase) oder durch ihre verhältnismäßig kurze biologische Halbwertszeit, die durch Plasmininhibitoren verursacht wird (was zu der Neubildung des Fibringerinnsels und dem begleitenden neuerlichen Verschluß der befallenen Blutgefäße führen kann) signifikant ausgeglichen. Daher ist eine Verbesserung der thrombolytischen Therapie erforderlich, welche die Lyse von Gerinnseln verstärkt während die Zersetzung des Fibrinogens auf ein Mindestmaß verringert und ein neueriicher Verschluß der befallenen Koronararterie verhindert wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft eine verbesserte thrombolytische Therapie für die Behandlung von Myokardinfarkt und Blutgerinnseln bei Patienten. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Myokardinfarkt und Blutgerinnseln, welches die Verabreichung eines Hapten-Bindungsmoleküls umfaßt, das in der Lage ist, die Hemmung von Plasmin zu verhindern, in einer ausreichenden Menge, um eine solche Hemmung zu verhindern.
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Behandlung von Myokardinfakt, welches die gemeinsame Verabreichung
(a) eines Hapten-Bindungsmoleküls, das in der Lage ist, die Hemmung von Plasmin durch einen Plasminogeninhibitor zu verhindern, in einer ausreichenden Menge, um eine solche Hemmung zu verhindern; und
(b) eines thrombolytischen Mittels in einer ausreichenden Menge, um entweder (i) ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen oder (ii) die Bildung eines Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsels zu hemmen; wobei sich das Hapten-Bindungsmolekül (a) von dem thrombolytischen Mittel (b) unterscheidet, an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
Die Erfindung betrifft weiters einen Satz, der zur Durchführung des obengenannten Verfahrens zweckmäßig und dicht verschlossen in Fächer geteilt ist, um darin zwei oder mehrere Behältermittel aufzunehmen, umfassend:
(1) einen ersten Behälter, der eine therapeutisch wirksame Menge des Hapten-Bindungsmoleküls (a) enthält; und
(2) einen zweiten Behälter, der eine therapeutisch wirksame Menge des thrombolytischen Mittels (b) enthält.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt eine Graphik der prozentualen Hemmung von Antiplasmin als Funktion der RWR-Konzentration.
Figur 2 zeigt eine Graphik der prozentualen Gerinnsellyse durch Plasmin als Funktion der RWR-Konzentration.
Figur 3 zeigt eine Graphik der prozentualen Gerinnsellyse durch t-PA als Funktion der RWR-Konzentration.
Figur 4 zeigt eine Graphik der prozentualen Gerinnsellyse, worin RWR vor und nach der Gerinnung zugegeben wird, als Funktion der t-PA Konzentration.
Figur 5 zeigt eine Graphik, welche die synergistischen Wirkungen von t-PA und RWR auf die Plasmagerinnsellyse zeigt.
Figur 6 zeigt ein Isobologramm, welches die Wirkungen von Kombinationen von RWR und t-PA auf die Plasmagerinnsellyse zeigt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELB

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Myokardinfarkt und Blutgerinnseln bei einem Patienten, welches die Verabreichung eines Hapten-Bindungsmoleküls umfaßt, das in der Lage ist, die Hemmung von Plasmin zu verhindern, in einer ausreichenden Menge, um eine solche Hemmung zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine Behandlung für Myokardinfarkt und Blutgerinnseln bei einem Patienten, welche die gemeinsame Verabreichung eines Hapten-Bindungsmoleküls und eines thrombolytischen Mittels an einen Patienten umfaßt. Als "Hapten-Bindungsmolekül" wird jedes Molekül bezeichnet, das in der Lage ist, an einen Plasmininhibitor zu binden. Solche Moleküle können Antikörper, Antikörperfragemente (wie zum Beispiel F(ab')&sub2;- oder F(ab)-Moleküle), wie auch jeden Liganden umfassen, der in der Lage ist, an einen Plasmininhibitor zu binden.
Blutgerinnsel, die nach den Verfahren der Erfindung behandelt werden können, umfassen Lungenthromboembolien, tiefe venöse Thrombosen, Hirnembolie, Nierenvenenthrombose und periphere Arterienthrombose und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Unter dem Begriff "gemeinsame Verabreichung" wird verstanden, daß sowohl das Hapten-Bindungsmolekül als auch das thrombolytische Mittel während eines Zeitrahmens verabreicht werden, in dem sich die jeweiligen Perioden der pharmakologischen Aktivität überlappen. Die beiden Mittel können gleichzeitig oder aufeinanderfolgend verabreicht werden.
Die Hapten-Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper oder Fragmente davon sein. Vorzugsweise wird das F(ab')&sub2;-Fragment eines solchen Antikörpers für diesen Zweck verwendet, um jede immunologische Reaktion, die durch den Fc-Teil des Immunglobulins hervorgerufen wird, auf ein Minimum zu verringern. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind von Kaprowski, H. et al. offenbart (U.S.-Patent Nr. 4.172.124); und Kohler et al. (Nature 256:49S-497 (1975)). Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, die Hemmung von Plasmin zu verhindern, werden von Mimuro, J. et al., Blood 69:446-453 (1987) gelehrt und sind in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Wie hierin verwendet ist ein "Hapten" ein Molekül, das in der Lage ist, von einem Antikörper gebunden zu werden. Dieses Hapten-Bindungsmolekül muß in der Lage sein, an einen Plasmininhibitor zu binden und dadurch verhindern, daß ein solcher Inhibitor Inhibitor-Plasmin-Komplexe bildet, um in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden. Obwohl jedes solche Hapten-Bindungsmolekül in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird die Verwendung eines Hapten-Bindungsmoleküls bevorzugt, das in der Lage ist, an die Plasmin-Bindungsstelle von Alpha-2-Antiplasmin zu binden. Ein besonders bevorzugter monoklonaler Antikörper für diesen Zweck ist der Antikörper RWR, der in der Folge ausführlicher beschrieben wird.
Die Begriffe "thombolytisches Mittel" sollen jedes Mittel bezeichnen, das in der Lage ist, entweder ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen oder die Bildung eines solchen Gerinnsels zu hemmen. Beispiele für thrombolytische Mittel umfassen Streptokinase, Prourokinase, Urokinase und Gewebsplaminogen-Aktivator. Die Verwendung von t-PA wird für diese Zwecke besonders bevorzugt. Obwohl natürlicher t-PA verwendet werden kann, wird die Verwendung von rekombinantem t-PA bevorzugt. Die Erfindung kann zusätzlich Hybride, physiologisch aktive Fragmente oder mutante Formen der obengenannten thrombolytischen Mittel verwenden. Der Begriff "Gewebsplasminogen-Aktivator", wie hierin verwendet, soll solche Hybride, Fragmente und Mutanten umfassen, u. zw. wie auch sowohl den natürlich abgeleiteten als auch rekombinant abgeleiteten Gewebsplasminogen-Aktivator.
In einem Ausführungsbeispiel sollen das Hapten-Bindungsmolekül und das thrombolytische Mittel der vorliegenden Erfindung gemeinsam an den Empfänger verabreicht werden. Es wird bevorzugt, das Hapten-Bindungsmolekül vor der Verabreichung des thrombolytischen Mittels dem Patienten zu geben. Es wird besonders bevorzugt, das Hapten-Bindungsmolekül 45 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, vor der Verabreichung des thrombolytischen Mittels zu geben.
Das Hapten-Bindungsmolekül der vorliegenden Erfindung ist für den Zweck vorgesehen, die Hemmung des Plasmins durch einen Plasmin-Inhibitor zu verhindern. Völlig unerwartet wurde entdeckt, daß die gemeinsame Verabreichung des Hapten-Bindungsmoleküls mit einem thrombolytischen Mittel eine synergistische Wirkung besitzt und dadurch die Lyse von Gerinnsel auf ein höheres Maß verstärkt als zu erwarten wäre, wenn die Wirkungen der Verabreichung eines Hapten-Bindungsmoleküls und der Verabreichung eines thrombolytischen Mittels bloß additiv sind.
Bei alleiniger Verwendung ist eine Menge des Hapten-Bindungsmoleküls, die bei Verabreichung an einen Patienten in der Lage ist, die Hemmung von Plasmin zu verhindern und somit die Lyse von Gerinnseln zu verstärken, eine "therapeutische wirksame" Menge. Zur Verstärkung der Lyse von Gerinnseln und zur Vermeidung einer Gerinnselneubildung ist es wünschenswert, zwischen 3 und 100 nmol des Hapten-Bindungsmoleküls pro Kilogramm des Gewichts des Patienten zu geben. Diese Dosierung kann in einem Ausführungsbeispiel über einen Zeitraum zwischen 60 und 480 Minuten durch intravenöse Dauerinfusion bei einer Geschwindigkeit von 0,10 - 1,0 mg/kg/min verabreicht werden. Als Alternative ist es möglich, das Hapten-Bindungsmolekül in einem intravenös injizierbaren Bolus mit einer Dosis zwischen 3 und 100 nmol/kg und insbesondere zwischen 3 und 6 nmol/kg (des Hapten-Bindungsmoleküls) pro Kilogramm des Gewichts des Patienten zu geben. Wenn das Hapten-Bindungsmolekül auf diese Weise verabreicht wird, reicht ein einziger Bolus zur Verhinderung einer möglichen Gerinnselneubildung. Das Hapten-Bindungsmolekül der vorliegenden Erfindung kann in jeder physiologisch verträglichen Flüssigkeit aufgelöst werden, um einen injizierbaren Bolus herzustellen. Es wird bevorzugt, einen solchen Bolus durch Auflösung des Hapten-Bindungsmoleküls in normaler Kochsalzlösung herzustellen.
Wenn das Hapten-Bindungsmolekül, das in der Lage ist, die Hemmung von Plasmin zu verhindern, gemeinsam mit einem thrombolytischen Mittel verabreicht wird, ist es wünschenswert, 3 bis 6 nmol des Hapten-Bindungsmoleküls pro Kilogramm des Gewichts des Patienten zu geben. Diese Dosierung kann in einem Ausführungsbeispiel über einen Zeitraum zwischen 60 und 480 Minuten durch intravenöse Dauerinfusion verabreicht werden. Als Alternative ist es möglich, das Hapten-Bindungsmolekül in einem intravenös injizierbaren Bolus mit einer Dosis zwischen 3 und 6 nmol/kg und insbesondere zwischen 1 und 3 nmol/kg des Gewichts des Patienten zu geben. Eine Menge des thrombolytischen Mittels, die in der Lage ist, eine solche Lyse herbeizuführen, ist eine "therapeutisch wirksame" Menge. Das thrombolytische Mittel der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in einer Dosis zwischen 0,5 bis 1,0 mg pro kg des Gewichts des Patienten gegeben. In einem Ausführungsbeispiel wird das thrombolytische Mittel über einen längeren Zeitraum gegeben (d.h. über etwa 180 bis etwa 1440 Minuten). In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das thrombolytische Mittel der vorliegenden Erfindung als intravenos injlzierter Bolus gegeben, der zwischen 0,5 und 1,0 mg/kg und insbesondere zwischen 0,5 und 0,75 mg/kg enthält. Das thrombolytische Mittel der vorliegenden Erfindung kann in jeder physiologisch verträglichen Flüssigkeit aufgelöst werden, um einen injizierbaren Bolus herzustellen. Es wird jedoch bevorzugt, einen solchen Bolus durch Auflösung des thrombolytischen Mittels in normaler Kochsalzlösung herzustellen.
Ein Patient, der nach dem bevorzugten Ausführungsbeispiel behandelt wird, erhält daher einen intravenös injizierten Bolus des Hapten-Bindungsmoleküls in Kombination mit einem intravenös injizierten Bolus des thrombolytischen Mittels. Diese bevorzugte Behandlung verringert die Menge an t-PA auf ein Minimum, die zur Thrombolyse erforderlich ist, wodurch das Ausmaß der Fibrinogenzersetzung verringert und die Neigung zu einer allgemeinen Blutung gesenkt wird. Es ist von Bedeutung, daß die Verwendung der bevorzugten Behandlung zu der Auflösung des verschließenden Thrombus bei einer Geschwindigkeit führt, die deutlich höher ist als die Geschwindigkeit der Thrombusauflösung, wenn entweder das Hapten-Bindungsmolekül oder das thrombolytische Mittel durch Infusion verabreicht werden. Zusätzlich ist das Risiko eines neuerlichen Verschlusses deutlich verringert.
Diese unerwarteten Erkenntnisse sind wichtig, da es zuvor nicht möglich war, die Geschwindigkeit der Lyse von Gerinnseln zu beschleunigen, ohne die Blutungsneigung zu erhöhen. Das bevorzugte Ausführungsbeispiel liefert daher ein Behandlungsverfahren, bei dem die Verabreichung eines Bolus eines Hapten-Bindungsmoleküls in Kombination mit der Verabreichung eines Bolus eines thrombolytischen Mittels bewirkt, daß ein verschließender Thrombus schneller aufgelöst wird, als möglich ist, wenn jede Verbindung alleine verabreicht wird. Ferner erfüllt dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel diese Zielsetzung, während sowohl die Fibrinogenzersetzung als auch das Risiko eines neuerlichen Verschlusses auf ein Minimum verringert wird.
Wie für den Fachmann offensichflich ist, hängt die erforderliche Dosierung des Anti-Hapten-Bindungsmoleküls oder thrombolytischen Mittels von der Schwere des Zustandes des Patienten und von solchen Kriterien wie Größe, Gewicht, Geschlecht, Alter und Krankengeschichte des Patienten ab.
Das Hapten-Bindungsmolekül oder thrombolytische Mittel der vorliegenden Erflndung kann nach bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch zweckmäßiger Zusammensetzungen hergestellt werden, wie durch Versetzen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Geeignete Träger und ihre Formulierung sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflage, Osol, A. (Hrsg.), Mack, Easton PA (1980)) beschrieben. Zur Bildung einer pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzung, die zur wirksamen Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Hapten-Bindungsmoleküls oder thrombolytischen Mittels entweder alleine oder mit einer geeigneten Menge eines Trägervehikels.
Zur Regulierung der Wirkungsdauer können zusätzliche pharmazeutische Verfahren verwendet werden. Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Absorption des Hapten-Bindungsmoleküls oder der thrombolytischen Mittel der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die kontrollierte Freisetzung kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle erzielt werden (zum Beispiel Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat). Die Rate der Arneimittelfreisetzung kann auch durch Veränderung der Konzentration solcher Makromoleküle reguliert werden. Eine weitere mögliche Methode zur Regulierung der Wirkungsdauer umfaßt die Einarbeitung der therapeutischen Mittel in Partikel einer polymeren Substanz wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(Milchsäure) oder Ethylen-Vinylacetat-Copolymere. Als Alternative ist es möglich, die therapeutischen Mittel in Mikrokapseln einzuschließen, die zum Beispiel durch Koazervierungstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, wie zum Beispiel unter Verwendung von Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln oder in einem Kolloid-Arzneimittelfreisetzungssystem, zum Beispiel Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln, Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Lehren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart.
Das thrombolytische Mittel oder Hapten-Bindungsmolekül kann an einen Patienten durch Mittel verabreicht werden, die in der Wissenschaft allgemein bekannt sind. Solche Mittel zur Verabreichung umfassen orale Mittel, intranasale Mittel, subkutane Mittel, intramuskuläre Mittel, intravenöse Mittel, intraarterielle Mittel oder parenterale Mittel. Bei der bevorzugtesten Behandlungsmethode für Myokardinfarkt wird einem Patienten ein Bolus (intravenös injiziert) verabreicht, der zwischen 0,5 und 1,0 mg/kg enthält.
Nachdem diese Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie mit Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele näher erklärt, die hierin nur zum Zwecke der Veranschaulichung angeführt werden und, falls nicht anders angegeben, nicht als Einschränkung der Erfindung gedacht sind.

BEISPIEL 1

Herstellung eines Antikörpers, der gegen Alpha-2-Antiplasmin gerichtet ist

A. Materialien

Aprotinin und Protein-A Sepharose wurden von Sigma (St. Louis, MO) gekauft. S2251 (H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysin-p-nitroanilid-dihydrochlorid) wurde von Helena Labs (Beaumont, TX) erhalten. Human-Alpha-2-Antiplasmin (a2AP) wurde von American Diagnostica, Inc. (Greenwich, CT) erhalten. PD-10-Säulen wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) gekauft. Mikrotiterplatten wurden von Becton Dickinson Labware (Oxnard, CA) erhalten. Affinitätsgereinigtes Ziegen-Anti-Maus (Fab')&sub2; IgG wurde von Cappel Labs (Cochranville, PA) erhalten. Ein Murinantikörper-Isotypisierungskit wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) gekauft.

B. Herstellung von murinen monoklonalen Antikörpern, die fiir Alpha-2-Antiplasmin spezifisch sind

A/J-Mäuse wurden i.p. und s.c. mit 10 ug Human-a2AP in vollständigem Freund'schem Adjuvans immunisiert. Die Immunität der Mäuse wurden 1 Monat später mit 2 ug Protein in unvollstandigem Freund'schem Adjuvans verstärkt. Zwei Monate nach der anfänglichen Immunisierung wurde den Mäuse von einer Schwanzvene Blut abgezapft und die Antikörper-Titer bestimmt. Die Maus, welche den höchsten Titer hatte, wurde mit 5 ug i.v. (wässerig) und 10 ug i.p. a2AP in unvollständigem Freund'schen Adjuvans vier Tage vor und mit 5 ug (wässerig) i.v. 3 Tage vor der Fusion hyperimmunisiert. Splenozyten und murine SP2/0 Zellen wurden wie beschrieben verschmolzen (Kohler et al., supra). Hybridome wurden durch einen Festphasen-Radioimmunoassay auf a2AP selektiert, das in Vertiefungen von Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten immobilisierte. Spezifisch gebundener Antikörper wurde unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Maus F(ab')&sub2; IgG nachgewiesen. Einundzwanzig Hybridome banden spezifisch Antigen. Diese Hybridome wurden durch limitierende Verdünnung zur Monoklonalität subkloniert. Sieben Hybridome wurden unter Verwendung herkömmlicher Techniken in Aszites expandiert. Antikörper wurde von gefiltertem Aszites unter Verwendung von Affinitätsehromatographie mit Protein-A-Sepharose isoliert.
Die Isotypisierung wurde unten Verwendung von Kaninchen-Anti-Maus, anti-iodiotypischen, an Peroxidase gekoppelten Antikörpern durchgeführt.
Ein bestimmtes Hybridom erzeugte einen Antikörper (RWR), der für Alpha-2-Antiplasmin des Isotyps IgG1-K spezifisch war.

BEISPIEL 2

Hemmung von Alpha-2-Antiplasmin durch RWR

A. Materialien und Methoden

Die Jodierung von Proteinen wurde unter Verwendung der Jodogen-Methode durchgeführt. Fraker, P.J. und Speck, J.C., Biochem. Biophys. Res. Comm. 80:849-857 (1978). Die spezifische Aktivität von RWR betrug 20,0 uCi/ug.

B. Inhibierungsstudien

Die Inhibierungsstudien waren verschiedenartig. Erstens wurde ein chromogener Substrattest zur Testung der Fähigkeit von RWR, die Inaktivierung von Plasmin durch Antiplasmin zu hemmen, verwendet. Unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Testformats (Wiman, B. Meth. Enzymol. 80:1395-1402 (1981) wurde eine Standardkurve flir die Antiplasmin-Aktivität wie beschrieben erstellt. Antiplasmin (0 bis 25 nM) wurde mit 0,3 mM S2251 und Plasmin (100 nM) in 0,1 M, pH 7,3, Phosphatpuffer zu ingeSamt 1000 ul vermischt. Die Veränderungsrate der optischen Dichte bei 405 Nanometer wurde automatisch alle 10 Sekunden auf einem Hewlett-Packard 8451A Spektrophotometer aufgezeichnet. Es wurde eine Standardkurve erstellt, welche die Antiplasminkonzentration auf die Produktbildungsrate in einer linearen Weise bezog (r = 0,98). Danach wurde Antiplasmin (25 nM) mit RWR (0,875 bis 350 nM) vermischt und mit 0,3 mM S2251 in 0,1 M, pH 7,3, Phosphatpuffer 2 Stunden bei 25ºC inkubiert. Plasmin (100 nM) wurde rasch zugegeben und die optische Dichte aufgezeichnet. Die Veränderungsrate der optischen Dichte wurde zur Berechnung des Hemmungsausmaßes der Antiplasminaktivität durch einen bestimmten Antikörper-Wert herangewgen.
Wie in Figur 1 dargestellt, kam es bei einer Antikörperkonzentration von 20 nmol zu einer 55% Inhibierung des Alpha-2-Antiplasmins. Das Immunblotten unter nicht denaturierenden Bedingungen zeigte, daß RWR die 70000 Mr Spezies von a2AP und nicht die 55000 Mr Nicht-Plasminogen-Bindungsform bindet. Zusätzlich band RWR nicht wesentlich an denaturierte oder reduzierte Formen von a2AP.

BEISPIEL 3

Verstärkung der Lyse von Gerinnseln mit RWR oder-PA

Es wurde frischgefrorenes, gepooltes (8 zufällige Spender) Humanplasma verwendet. Zur Bildung von Gerinnseln wurde das Plasma mit geringen Mengen Ibrin vermischt. In 75 x 12 mm Teströhrchen wurden 25 ul Plasma mit 25 ul Lösung aus Rinderthrombin (1 U/ml) und Kalziumchlorid (4 mM) in 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, verwirbelt. Die Röhrchen wurden zur Erleichterung der Gerinnung in ein 37ºC vibrierendes Wasserbad eingebracht. Die Röhrchen wurden dann in einem Gamma-Zähler zur Bestimmung der Basislinien-Menge von 125-1 markiertem Fibrin, das in das Gerinnsel eingegliedert war, gezählt. Es wurden unterschiedliche Mengen von RWR und Plasmin jedem Röhrchen-Gerinnsel zugegeben und das Gesamtvolumen wurde mit 50 mmol Tris, 0,11 M NaCl und 2 mmol CaCl&sub2; auf 1 ml gebracht. Die prozentuale Lyse wurde durch Messung der Freisetzung von radiomarkiertem löslichen Fibrinpeptid bestimmt. Bei den angegebenen Zeitintervallen wurde der Überstand ohne Ersatz entnommen und gezählt. Die Experimente wurden dreifach ausgeführt, und die prozentuale Lyse wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
Kumulative prozentuale Lyse zum Zeitpunkt i = Li = 100*(Si*TVi/SVi + Σ0max(0,i-1)Si)
wobei Si = Überstandszählungen, TVi = Gesamtvolumen, das in dem Röhrchen zum Zeitpunkt i verbleibt, SVi = Volumen des Überstandes, der zum Zeitpunkt i entnommen wird, und ΣSi stellt die Summe der früheren Überstandsproben dar, die ohne Ersatz entnommen wurden.
Figur 2 zeigt eine Graphik der prozentualen Plasmagerinnsellyse als Funktion der RWR Konzentration. Wie aus Figur 2 ersichtlich ist, bewirkt RWR eine dosisabhängige signifikante Verstärkung der Gerinnsellyse durch Plasmin. Die signifikante Gerinnsellyse wurde selbst bei einer geringen Konzentration von 10 nmol (Molarverhältnis von Mab:a2AP von 0,4:1) über 4 Stunden beobachtet. Somit führt eine teilweise Inhibierung von a2AP zu einer signifikanten Erhöhung der Fibrinolyse durch Plasmin. Bei Erhöhung der RWR-Konzentration wurde eine wesentlich stärkere Lyse der Gerinnsel beobachtet.

BEISPIEL 4

Bestimmung der synergistischen Wirkung auf die Lyse von Gerinnseln durch RWR und t-PA

Der Synergimus zwischen t-PA und RWR wurde wie zuvor definiert untersucht (Loewe, S., Pharmacol. Rev. 9:237-242 (1957); Berenbaum, M.C. Adv. Cancer 35:237-242 (1981)). Diese Analyse erfordert, daß die Dosis-Reaktionskurven für beide Mitteln erstellt werden (Berenbaum, M.C.J. Theor. Biol., 114:413-421(1985)). Unter Verwendung dieser werden die Dosen von t-PA und RWR gewählt, die isoeffektiv sind. Dann werden Teildosen der beiden Mittel kombiniert und ihre gemeinsame Wirkung auf die Lyse von Gerinnseln bestimmt. Ein Isobol wird konstruiert, das die Menge jedes Mittels, alleine oder in Kombination, darstellt, welche ein äquivalentes Ausmaß der Lyse in einem bestimmten Zeitraum erzeugt.
Als Alternative können diese Art von Wechselwirkungen algebraisch bestimmt werden. Bestimmte isoeffektive Dosen jedes einzelnen Mittels A & B, die isoeffektiven Teildosen von jedem Mittel in Kombination (ai und bi). können wie folgt charakterisiert werden: synergistisch, wenn ai/A + bi/B < 1, additiv, wenn ai/A + Bi/B = 1 oder antagonistisch, wenn ai/A + Bi/B > 1.
Zur empirischen Bestimmung wurden verschiedene Mengen von t-PA und RWR getrennt und in Kombination zu markierten Teströhrchen-Gerinnseln zugegeben (in dreifacher Ausführung, wie in der Folge beschrieben). Dann wurde die mittlere prozentuale Lyse wie angegeben bestimmt.
Frischgefrorenes Plasma wurde mit 125-I markiertem Fibrinogen vermischt und geronnen. Dann wurden verschiedene Mengen von RWR (0 bis 250 mmol, Endwert) oder ao Kontroll- (Anti-Digoxin-) Antikörper (0 bis 250 mmol, Endwert) den Röhrchen zugegeben, die 0 oder 1 Einheit t-PA enthielten. Die Röhrchen wurden bei 37ºC inkubiert, und die prozentuale Lyse wurde durch die Freisetzung von radiomarklerten Fibrinpeptiden bestimmt. Bei den Kontrollgerinnseln unterschied sich in der angegebenen Zeit RWR alleine nicht von einem Kontrollantikörper alleine - einem Anti-Digoxin Mab40-160 (Mudgett-Hunter, M., et al.. Mol. Immunol. 22:477-488 (1985)) - in dem Ausmaß der Lyse, die ohne t-PA herbeigeführt wurde. In Gegenwart von t-PA jedoch zeigt RWR eine dosisbedingte Verstärkung der Lyse von Gerinnseln, die größer war als jene, die bei den Gerinnseln beobachtet wurde, die nur mit t-PA getestet wurden. Figur 3 zeigt die Wirkung der verschiedenen Konzentrationen von t-PA und RWR auf die Lyse von Gerinnseln.
Etwa 30% des Antiplasmins ist mit dem Fibrin durch Faktor 13 vernetzt. Wenn vernetztes Antiplasmin dem Antikörper nicht zur Bindung zur Verfiigung steht, würde dies die Wirkung des Antikörpers auf die Rate der Lyse von Gerinnseln deutlich senken. Solche Gerinnseln, die mit Antikörper gebildet wurden, der bereits an a2AP gebunden war, sollten sich rascher auflösen als jene, welchen der Antikörper nach dem Klonen zugegeben wurde, d.h. nach der Vernetzung von a2AP mit Fibrin. Zur Testung dieser Hypothese wurde die zeitabhängige Lyse bei Gerinnseln, die nach der Präinkubation des Plasmas mit RWR gebildet wurden, mit jener von gebildeten Gerinnseln verglichen, denen anschließend RWR zugegeben wurde (Figur 4).
Frischgefrorenes Plasma wurde mit radiomarkiertem Fibrinogen vermischt. Dann wurde RWR (25 nmol, Endwert) mit Plasma vermischt und geronnen. In anderen Experimenten wurde RWR bereits gebildeten Plasmagerinnseln zugegeben.
Die Gerinnsel wurden danach in Puffer über 24 Stunden bei 4ºC inkubiert. Dann wurde t-PA (80, 0,1 oder 1 u) zugegeben und die Gerinnsel wurden bei 37ºC inkubiert. Die Rate der Lyse wurde wie oben beschrieben bestimmt. Aus Figur 4 ist ersichtlich, daß es nur zu einem leichten Anstieg der Rate der Lyse bei Gerinnseln kam, die vor der Bildung RWR ausgesetzt worden waren. Dies läßt darauf schließen, daß Antiplasmin dem MAb in vernetztem Fibrin funktionell zugänglich ist.
Zur Bestimmung der Wirkung von Kombinationen aus t-PA und RWR auf die Lyse wurde ein Isobol konstruiert, wie in früheren Studien empfohlen worden war (Loewe, 1957; Berenbaum, 1981). Zunächst wurden die isoeffektiven Dosen von t-PA und RWR bestimmt. Radiomarkierte Plasmagerinnsel wurden mit unterschiedlichen Mengen von t-PA (0 bis 0,03 Einheiten) oder RWR (0 bis 500 nmol) bei 37ºC inkubiert. Die prozentuale Lyse nach 48 Stunden wurde bestimmt (Figur 6). Kontrollgerinnsel (mit keinem der Agenzien) wiesen 9,36 + 0,38% Lyse während dieser Studie auf. In diesem Experiment ergaben 0,3 U t-PA und 500 nmol RWR ein äquivalentes Ausmaß der Lyse (35,5 + 3,1 gegenüber 34,3 + 5,1; Mittel + SEM).
Bei demselben Experiment wurden auch verschiedene empirische Teilkombinationen von RWR und t-PA getestet. Teildosiskombination beider Mittel, welche eine äquivalente Lyse zu 500 nmol RWR oder 0,03 U t-PA zeigten, sind in Figur 6 eingetragen (X). Dosiskombinationen von RWR und t-PA, welche dasselbe Ausmaß der Lyse (34,2%, 34,9%) wie diese Mittel alleine erzeugten, sind mit X bezeichnet. Dosiskombinationen, die eine höhere mittlere Lyse ergaben (41,3% bis 100%) sind mit 0 bezeichnet. Da die äquipotenten Kombinationen von t-PA und RWR eine kleine Fraktion jedes Mittels alleine sind (d.h. weit unter der Additivitätslinie liegen, die durch die durchgehende Linie in Figur 5 dargestellt ist), stellt dies einen Beweis für eine starke Synergie zwischen diesen beiden Mitteln dar.

Claims

1. Zusammensetzung, enthaltend:

a. einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, welcher(s) in der Lage ist, an α-2-Antiplasmin zu binden und die Inaktivierung von Plasrnin zu verhindem; und

b. ein thrombolytisches Mittel in einer Menge, welche dazu ausreicht, um entweder (i) ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufrulösen oder (ii) die Bildung eines Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsels zu hemmen, welches Mittel sich vom Antikörper oder dessen Fragment gemäß (a) unterscheidet;

als ein kombiniertes Präparat zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Myokardinfarkt undloder Blutgerinnseln.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung, bei welcher

b. ein thrombolytisches Mittel in einer Menge, welche dazu ausreicht, um entweder (i) ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufrulösen oder (ii) die Bildung eines Fibrin/Blutplättchen-Gerirnsels zu hemmen, welches Mittel sich vom Antikörper oder dessen Fragment gemäß (a) unterscheidet;

mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel versetzt ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei sowohl der Antikörper oder ein Fragment davon (a) als auch das thrombolytische Mittel (b) zubereitet sind, um einem Patienten durch intravenöse Inftision verabreicht zu werden.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei sowohl der Antikörper oder ein Fragment davon (a) als auch das thrombolytische Mittel (b) zubereitet sind, um einem Patienten mittels eines intravenös injizierten Bolus verabreicht zu werden.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, welche zubereitet ist, um oral verabreicht zu werden.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Fragment des Antikörpers ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das thrombolytische Mittel Streptokinase, Prourokinase, Urokinase und/oder vorzugsweise Gewebsplasminogen-Aktivator umfaßt.

8. Verwendung:

a. eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments davon, welcher(s) in der Lage ist, an α-2-Antiplasmin zu binden und die Inaktivierung von Plasmin zu verhindern; und

b. eines thrombolytischen Mittels in einer Menge, welche dazu ausreicht, um entweder (i) ein Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsel aufzulösen oder (ii) die Bildung eines Fibrin/Blutplättchen-Gerinnsels zu hemmen, welches Mittel sich vom Antikörper oder dessen Fragment gemäß (a) unterscheidet;

bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Myokardinfarkt oder Blutgerinnseln.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei:

(1) der Antikörper oder das Fragment davon (a) zubereitet ist, um einem Patienten in einer Dosierung zwischen 3 und 6 nMol je kg Körpergewicht des Patienten zur Verfügung gestellt zu werden; und

(2) das thrombolytische Mittel (b) zubereitet ist, um einem Patienten in einer Dosierung zwischen 0,5 und 1,0 mg je kg Körpergewicht des Patienten, und vorzugsweise in einer Dosierung zwischen 0,5 und 0,75 mg je kg Körpergewicht des Patienten, zur Verfllgung gestellt zu werden.

10. Medikamentensatz, welcher dicht verschlossen in Fächer geteilt ist, um darin zwei oder mehrere Behaltermittel aufzunehmen, welche:

(1) einen ersten Behälter, welcher eine therapeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers oder ein Fragment davon enthält, welcher(s) in der Lage ist, an α-2-Antiplasmin zu binden und die Inaktivierung von Plasmin zu verhindern; und

(2) einen zweiten Behälter, welcher eine therapeutisch wirksame Menge eines thrombolytischen Mittels (b) enthält;

umfusen.

11. Satz nach Anspruch 10, wobei das thrornbolytische Mittel Streptokinase, Prourokinase, Urokinase und/oder vorzugsweise Gewebsplasminogen-Aktivator umfaßt.

12. Satz nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Fragment des Antikörpers ein F(ab')&sub2;-Fragment ist.