KR100194113B1

KR100194113B1 - 혈병 용해 촉진 조성물

Info

Publication number: KR100194113B1
Application number: KR1019890702259A
Authority: KR
Inventors: 엘 리이드 가이; 알 메츄에다 게리; 하버 에드가
Original assignee: 어니스트 엠. 해데드; 더 제너럴 하스피털 코포레이션
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-03-15
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0336693A2; HUT56394A; JP2871775B2; JPH03504717A; HU892304D0; ZA892464B; AU628041B2; WO1989009817A1; FI102812B1; DE68919504T2; NO904294D0; EP0336693B1; EP0336693A3; FI904867A0; DK240190D0; ATE114480T1; KR900700129A; HU207349B; DK174062B1; FI102812B

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

혈병 용해 촉진 조성물

[도면의 간단한 설명]

제1도는 RWR 농도의 함수로서 항플라스민의 퍼센트 억제 그래프.

제2도는 RWR 농도의 함수로서 플라스민에 의한 퍼센트 혈병 용해의 그래프.

제3도는 RWR 농도의 함수로서 t-PA에 의한 퍼센트 혈병 용해의 그래프.

제4도는 t-PA 농도의 함수로서 용해 전후에 RWR이 가해졌을 때 퍼센트 혈병 용해의 그래프.

제5도는 혈장 혈병 용해에 있어서의 t-PA와 RWR의 상승작용효과를 나타내는 그래프.

제6도는 혈장 혈병 용해에 있어서의 RWR과 t-PA조합의 효과를 나타내는 이소볼로그램.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본발명은 심근 경색증과 환자내부의 혈병의 치료에 관한 것이며 더욱 상세하게는 알파-2-항플라스민에 대한 항체를 투여하는 것을 포함하는 혈병 용해를 향상시키는 치료법에 이용되는 조성물에 관한 것이다. 본발명은 또한 혈전붕괴제(thrombolytic agent)와 함께 알파-2-항플라스민에 대한 항체를 투여하는 것을 포함하는 혈병 용해를 향상시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

[발명의 배경]

많은 심근 경색증(심장발작)의 초기증상은 아테롬성동맥경화증 반점(plaque)으로의 출혈이다. 그러한 출혈은 종종 경색지역(즉, 혈액순환 장해로 인한 응고 괴사지역)에 공급되는 관상 동맥에 혈전(또는 혈병)이 형성되도록 한다.

이러한 혈전은 피브린과 혈소판의 조합으로 이루어진다. 피브린-혈소판 혈병의 형성은 심각한 임상적인 결과를 초래한다. 피브린-혈소판 혈병으로 인한 폐색의 정도와 지속시간은 경색지역의 질량과 손상 정도를 결정한다.

A. 심근 경색증에 대한 처치

심근경색증에 대한 통상의 처치의 주목적에는 폐색혈전의 신속한 용해와 혈류의 복귀(재용해)가 있다. 효과적이기 위해서는 성공적인 치료제는 피브린-혈소판 혈병(clot)과 피브린 선구물질인 피브리노겐을 구별할 수 있어야 한다. 그러한 특이성을 나타내지 못하는 제제를 사용하면 환자에게 일반적인 출혈의 위험을 증대시킨다. 성공적인 치료제는 치료를 중단한후에 혈병이 재생되지 않도록 효과를 지속할 수 있어야 한다. 피브린-혈소판 혈병이 재생될수 있으면 환부(affected)인 동맥은 다시 폐색된다.

순환계의 기타 부분에서는 항-응고제(헤파린과 같은)를 사용하여 피브린-혈소판 혈병의 형성을 부분적으로 억제할 수 있다. 불행히도 헤파린은 혈관 폐색 정도(협착증정도)가 70% 이상인 심근경색증환자, 특히 심한 잔류 관상 협착증이 있는 환자에 있어 폐색을 억제하는데는 통상 효과적이지 못함을 발견하였다.

개체가 의약조제를 이용하기전에 피브린-혈소판 혈병을 형성하였다면, 혈전붕괴제를 사용하여 혈병을 용해시킬 수 있다. 혈전붕괴제는 피브린-혈소판 혈전을 용해시킬 수 있는 약물이기 때문에 혈액이 환부인 혈관을 통해 다시 흐르도록 할 수 있다. 그러한 제제로는 스트렙토키나제, 프로유로키나제, 유로키나제 및 조직-형 플라스미노겐 활성인자가 포함된다(Ganz, W. et al., J. Amer. Coll. Cardiol. 1: 1247-1253 (1983); Rentrop, K.P. et al., Amer. J. Cardiol. 54: 29E-31E (1984); Gold, H.K. et al., Amer. J. Cardiol. 53: 122C-125C (1984)).

혈전붕괴제로 치료하면 종종 심근 경색증을 중단시키기에 충분하도록 신속하게 관상 혈류를 성공적으로 복원할 수 있다. 불행하게도, 상당수의 환자들에 있어서 그러한 혈전 붕괴 치료를 중단한 후에 용해된 피브린-혈소판 혈병이 재형성됨을 발견하였다. 이러한 재형성은 환부인 혈관의 폐색을 초래하고, 따라서 상당한 문제점이있다( Gold, H.K. et al., Amer. J. Cardiol. 53: 122C-125C (1984); Gold, H.K. et al., Circulation 68: I-50-I-54 (1983)). 따라서, 연구된 사례중 약 85%에서 스트렙토키나제 처리가 피브린 혈병을 용해시키는데 성공적이라는 것이 발견되었지만, 환부인 혈관의 재폐색이 조사한 환자들 중 약 25%에서 발생함을 발견하였다(Gold, H.K. et al., Circulation 68: I50-I54 (1983))

조직-형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)는 스트렙토키나제 또는 유로키나제보다 더욱 바람직한 혈전붕괴제를 생각되는데, 그것은 이러한 제제중 어느것보다 피브린에 대해 더 큰(절대적이지는 않지만) 특이성을 나타내기 때문이다(Verstrate, M., et al., Lancet, 1 : 142(1985)). 조직-형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)는 혈장으로부터 처리속도가 빠른 혈병-특이성 혈전붕괴제이다. 조직-형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)는 급성 심근경색증이 있는 환자에 있어 효과적인 혈전붕괴제이고, 연구된 환자중 약 70%에서 45-75분내에 동맥이 다시 흐르도록함을(즉, 협착증을 감소시킴) 발견하였다(Gold, H.K. et al., Circulation 73:347-352(1986)).

조직-형 플라스미노겐 활성인자 약 1-2㎎/㎏ (환자체중)/90분의 주입속도로 투여된다. 고농도의 t-PA는 피브리노겐을 파괴할 수 있기 때문에, 더 높은 투여량을 사용하는 것을 일반적인 출혈 가능성이 증가되는 것과 관련이 있다. 증가된 t-PA 투여량은 혈병 용해속도를 균일하게 증가시키지는 않는다고 알려져 있다.

t-PA를 사용하는 이점은 t-PA치료를 중단한 후 자발적인 비율의 급성 재폐색에 의해 상당히 상쇄된다. Gold, H.K.와 동료들은 t-PA 치료를 중단하면 연구 환자들 중 약 45%에 있어 환부인 혈관의 재폐색이 일어남을 발견하였다(Circulation 73: 347-352(1986)). t-PA 투여량을 증가시켜도 관상 동맥 재폐색 경향을 감소시키지 않음을 발견하였다. 중요하게도, 트롬빈 혈병 재형성 가능성은 잔류 관상협착정도(즉 혈관폐색 정도)에 밀접하게 관련되어 있다. 따라서, 높은 정도의 협착(즉 70% 정량 협착보다 크거나 80% 비-정량 협착보다 큰)이 발생한 개체에게 있어 재폐색 가능성이 더 있다. 혈관의 재폐색은 t-PA를 계속 주입함으로써 저해됨을 발견하였다(Gold, H.K. et al., Circulation 73: 347-352(1986)). 불행하게도, t-PA의 비교적 짧은 생물학적 반감기와 몇몇 환자에 있어서 심한 출혈 경향을 증가시키는 가능성 때문에 t-PA를 계속 주입하는 것은 많은 심장병 환자에서 비실제적이다.

요약하면, 용해된 혈전은 흔히 t-PA주입을 중단하고 나서 재형성되지만(Gold, H.K. et al., Circulation 73: 347-352 (1986)), 그러한 재폐색 빈도는 실제적으로 더 오랜 기간동안이지만은 실제적으로 더 낮은 투여량의 제2(유지(maintenance)) t-PA를 주입함으로써 최소화할 수 있다는 것을 임상연구를 통해서 알았다. 헤파린은 통상 그러한 유지주입을 받는 환자들을 위한 적당한 부수적인 치료제로서 인정된다. 따라서, t-PA로 관상동맥혈전(혈병)을 치료할 때는 신속한 재용해를 이루기 위해 높은 속도로 계속 주입하고, 높은 정도의 잔류 협착이 있는 환자들에 있어서 재폐색을 방지하기 위해 낮은 투여량으로 유지주입을 하는 것이 필요하다.

B. 피브린 혈병 생성 메카니즘

혈병은 다양한 비율로 피브린과 혈소판 둘다로 이루어진다. 혈병생성시 근본적인 반응에는 가용성 혈장 단백질(피브리노겐)이 불가용성 피브린으로 변환하는 것이 포함된다. 피브리노겐의 피브린으로의 변환에서 세린 프로테아제인 트롬빈이란 효소가 촉매 작용을 한다. 일반적인 혈병 형성 메카니즘은 가농, 더블유. 에프.(In : Review of Medical Physiology, 9th ed., Lange, Los Altos, CA, pp. 411-414(1979))에 의해 조사되어 있다. 혈소판은 혈액에 존재하는 원반형 구조물이다. 그것들은 피브린과 함께 불용성 덩어리로 혼입됨으로써 그리고, 피브린으로의 피브린노겐의 변환속도를 증가시킴으로써 혈병 형성에 기여한다. 혈소판은 심근경색증에 있어 혈병 생성에 기여하고, 혈전붕괴제로 처리하여 재용해된 관상 동맥을 재폐색시키는 혈병의 주성분이다. 혈소판 응집체의 형성은 피브리노겐( 및 아마도 폰 빌레브라트 인자(von Willebrand's factor) 또는 피브로넥틴)과 혈소판 표면에 존재하는 수용체 분자간의 상호작용에 좌우된다. 이러한 혈소판 피브리노겐 수용체는 GPIIb와 GPIIIa로 명명된 2개의 막 당단백질의 복합체임이 밝혀졌다.(Nachman, R.L. et al., J. Clin. Invest. 69:263-269 (1982); Coller, B.S., et al., J. Clin. Invest. 72: 325-338 (1983)). GPIIb/GPIIIa 수용체 복합체의 구체적인 역할은 당단백질 IIb와 IIIa에 결합할 수 있다고 밝혀진 쥐의 단일클론성 항체(단일클론성 항체 10E5로 알려짐)를 분리시키고, 혈소판에의 피브리노겐의 결합을 완전히 차단시킴으로써 콜러, 비. 에스. 와 동료들에 의해 밝혀졌다.

단일클론성 항체의 Fc 단편영역이 비-특이적으로 응집을 억제할 수 있는 가능성에 기인한 잠재적인 합병증을 피하기 위해, 콜러 등은 그들의 실험에서 10E5의 F(ab')₂단편을 사용하였다(Coller, B.S., et al., J. Clin. Invest. 72: 325-338 (1983)). 항체의 F(ab')₂단편에는 항체의 특이성과 항원-결합능력이 있는 항체의 영역만 포함된다. F(ab')₂단편의 특성과 그의 제조방법은 아이젠, 에취. 엔.에 의해 개시되어 있다(In: Mircrobiology, 3rd ed., Davis, B.D. et al., Harper Row N.Y., pp. 342-349(1980)).

부가의 단일클론성 항체(7E3 으로 명명됨)는 피브리노겐이 혈소판에 결합되는 것을 방지하고, GPIIb/GPIIIa 에 결합한다고 밝혀졌다(Coller, B.S., J. Clin. Invest. 76: 101-108(1985)). 이 단일클론성 항체는 비활성 혈소판에 보다 활성 혈소판에 훨씬 더 신속하게 결합되고 사람의 혈소판뿐만 아니라 개의 혈소판에도 결합될 수 있다는 점에서 항체 10E5와 달랐다(Coller, B.S., J. Clin. Invest. 76: 101-108(1985); Coller, B.S., et al., J. Lab. Clin. Med., 107 : 384-392(1986); 둘다 여기에 참고로 포함되어 있음). 단일 클론성 항체 7E3의 F(ab')₂단편은 혈소판 응집을 방해할수 있음이 발견되어, 혈전증의 치료에 있어 치료용으로 사용할수 있음의 가능성을 제시하였다.(Coller, B.S., et al., Blood 66: 1456-1459(1985)). 단일클론성항체 7E3의 F(ab')₂단편은 또한 바람직하지 못한 출혈의 위험을 초래하지 않고 다층의 혈소판의 축적을 방지할 수 있음이 발견되어, 심근경색증과 발작에서 발생할 수 있는 혈관의 전체적인 폐색을 방지하는데 사용가능성을 제시하였다(Coller, B.S., et al., Blood 66: 1456-1459(1985)).

C. 혈병 용해의 메카니즘과 그의 천연 억제

혈병 용해는 생체내에서 플라스민에 의해 조정된다. 천연조건하에서, 프라스미노겐은 조직-형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)에 의해 플라스민으로 변환된다. 활성화는 피브린 표면에서 발생하여 단백질 분해 활성을 적당한 위치에 제한한다. 플라스민이 순환계 속으로 놓여진후 그것은 천연저해제와 신속하게 결합한다. 플라스민의 비활성화는 바람직하지 않은 단백질분해를 방지하는 과정에서 최종적이고 필수적인 단계이다. 그러한 플라스민 억인자(inhibitor)에는 알파-2-항플라스민, 알파-2-마이크로글로불린보다 플라스민에 대해 친화력이 훨씬 더 높고, 플라스민 1:1의 비율로 특이적 결합을 한다. 더 큰 푸울의 알파-마크로글린불린은 저장(reservoir) 억제인자로 작용한다(Kane, K.K., Ann. Clin. Lab. Sci. 14 : 443-449 (1984)). 따라서 t-PA투여에 의한 혈병 용해는 플라스민 억제인자에 의한 플라스민의 신속하고 비가역적인 비활성화에 의해 제한된다.

알파-2-항플라스민에는 3개의 작용 도메인을 갖는다. : 플라스민에 대한 반응부위(site), 플라스민(프라스미노겐) 또는 LBS-결합부위[플라수민(플라스미노겐)의 LBS(리신-결합위치)에 상보적임] 및 피브린에 대한 가교결합부위(Mimuro, J., et al., Blood 69 :446-453(1987)). 미무로 등은 알파-2-항플라스민에 대한 항체를 개시하고 있는데 그중 하나는 (JPTI-1) 아파-2-항플라스민의 반응부위에 특이적이고, 알파-2-항플라스민-플라스민 복합체의 형성을 방지하여 항플라스민 활성을 억제하였다. 그러나 미무로 등은 혈병 용해를 향상시키는 JPTI-1 항체의 투여를 제시하지는 않는다. 알파-2-항플라스민에 특이적인 기타 항체는 Plow, E.F., et al., J. Biol. Chem. 225:2902-2906(1980); Wimen, B., et al., Scan. Clin. Lab. Invest. 43 : 27-33(1983); Hattey, E., et al., Thromb. Res. 45:485-495(1987); Collen, U.S. Patent No. 4,346,029(1980); 및 Collen, U.S. Patent No.4,198,335 (1980)에 의해 제시되어 있다.

D. 요약

요약하면, 심근 경색증을 치료하는 것을 목표로하는 치료제의 실제적인 목적에는 초기에 재용해시키고 재폐색을 방지함으로써 괴사를 제한하는 것이 포함된다. 현재, 이러한 목적은 잠재적으로 생명에 위협을 주는 피브린-혈소판 혈병을 용해시킬수 있는 혈전붕괴제를 투여함으로써 일부 이루어진다. 그러나, 그러한 제제를 사용하는 잠재적인 이점은 피브린 특이성의 결여(스트렙토키나제와 유로키나제의 경우에서 처럼) 또는 플라스민 억제인자에 의한 상대적으로 짧은 생물학적 반감기(그것은 피브린의 재생성을 초래하고 한부인 혈관에 재폐색을 수반할 수 있다)로 상당히 상쇄된다. 그런 연유로, 피브리노겐의 파괴를 최소화하고, 환부인 관상동맥의 재폐색을 방지하면서 혈병 용해를 향상시키는 혈전증 치료에 있어서의 개선점이 필요하다.

[발명의 요약]

본발명은 심근 경색증의 치료와 환자내의 혈병에 대한 개선된 혈전증 치료에 유용한 조성물을 제공한다.

본발명은 또한 플라스민 억제를 방지할 수 있는 합텐-결합분자를 그렇게 방지하기에 충분한 양으로 투여하는 것으로 이루어지는 심근 경색증과 혈병을 치료에 유용한 조성물에 관한 것이다.

본발명은 또한 그러한 치료가 필요한 환자에게;

(a) 플라스민 억제인자에 의한 플라스민의 억제를 방지하기에 충분한 양의 합텐-결합분자와,

(b) (i)피브린-혈소판 혈병을 용해시키거나, (ii) 피브린-혈소판 혈병의 형성을 억제하기에 충분한 양의 혈전붕괴제(여기서 합텐-결합 분자(a)는 혈전붕괴제(b)와 다르다)를 동시 투여하는 것을 포함하는 심근경색증의 치료에 유용한 조성물을 제공한다.

본발명은 또한;

(1) 치료학적으로 효과적인 양의 합텐-결합분자(a)를 함유한 제1용기와,

(2) 치료학적으로 효과적인 양의 혈전붕괴제(b)를 함유한 제2용기로 이루어지는, 둘 또는 그이상의 용기수단을 수용하기 위해 미접하게 칸막이로 분획된, 심근경색증 또는 혈병치료에 유용한 키트에 관련되어 있다.

[바람직한 구체예의 설명]

본 발명은 플라스민 억제를 방지할수 있는 합텐-결합분자를 그러한 억제를 방지하는데 충분한 양으로 투여하는 것이 가능토록하는 심근경색과 환자내의 혈병을 처치하는데 유용한 조성물에 관한 것이다.

본발명은 또한 합텐-결합 분자와 혈전붕괴제를 환자에게 동시 투여하여 심근경색증과 환자내의 혈병의 치료가 가능토록하는 조성물이 포함된다.

합텐-결합분자는 플라스민 억제인자에 결합할 수 있는 모든 분자를 의미한다. 그러한 분자에는 항체, 항체단편(예를 들면, F(ab')₂또는 F(ab)분자 같은)과 플라스민 억제인자에 결합할 수 있는 리간드가 포함된다.

본발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 혈병에는 폐동맥 혈전색전증에 국한되지 않고, 깊은 정맥 혈전증, 뇌색전증, 신장정맥 및 말초동맥 혈전증 등이 포함된다.

동시투여(co-administration)는 약리학적 활성의 각 주기가 겹치는 하나의 시간 프레임 동안에 각각의 합텐-결합분자와 혈전붕괴제를 투여한다는 것을 뜻하며, 현실적으로는 두 제제는 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다.

본발명의 합텐-결합분자는 단일클론성 항체 또는 그 단편일 수 있다. 면역글로불린의 Fc부분에 초래되는 모든 면역학적 반응을 최소화하기 위해 그러한 항체의 F(ab')₂단편을 이 목적에 사용하는 것이 바람직하다. 단일클론성 항체를 제조하는 방법은 카프로우스키 에. 등과(미합중국 특허 제4,172,124호), 콜러 등(Nature 256: 495-497(1975))에 의해 개시되어 있다. 플라스민 억제를 방지할 수 있는 단일클론성 항체의 제조는 미무로 제이. 등에 의해 제시되었고(Blood 69 : 446-453 (1987)) 본출원의 실시예 부분에 기재되어 있다.

여기에서 사용되는 것처럼, 합텐은 항체에 의해 결합될 수 있는 분자다. 본발명에 따라 사용하기 위해 합텐-결합분자는 플라스민 억제인자에 결합하여 그러한 억제인자가 억제인자-플라스민 복합체를 형성하는 것을 방지할 수 있어야 한다. 그러한 합텐-결합분자는 어느것이라도 본발명에 따라 사용될수 있지만, 알파-2-항플라스민의 플라스민 결합부위에 결합할 수 있는 합텐-결합분자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 목적에 특히 바람직한 단일클론성 항체는 아래에서 더 충분히 설명될 항체 RWR이다.

혈전붕괴제는 피브린-혈소판 혈병을 용해시키거나, 그러한 혈병의 형성을 억제할 수 있는 제제를 뜻한다. 혈전붕괴제의 예로는 스트렙토키나제, 프로유로키나제, 유키나제 및 조직-형 플라스미노겐 활성인자가 포함된다. 이러한 목적에는 t-PA를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 천연 t-PA가 사용될수 있지만, 재조합체 t-PA를 사용하는 것이 바람직하다. 본발명은 또한 상기 혈전붕괴제의 혼성체, 생리학적 활성 단편 또는 돌연변이체 형을 사용할 수 있다. 여기에 사용된 조직-형(tissue-type) 플라스미노겐 활성인자에는 혼성체, 단편 및 돌연변이체뿐만 아니라 천연적으로 유도된 그리고 재조합하여 유도된 조직-형 플라스미노겐 활성인자가 포함된다.

한 구체예에 있어서, 본발명의 합텐-결합분자와 혈전붕괴제는 환자에게 동시 투여된다. 혈전붕괴제를 투여하기전에 환자에게 합텐-결합분자를 공급하는 것이 바람직하다. 혈전붕괴제를 투여하기 45분전, 바람직하게는 30분전에 합텐-결합분자를 가하는 것이 가장 바람직하다.

본발명의 합텐-결합분자는 플라스민 억제인자에 의한 플라스민 억제를 방지하기 위한 것이다. 의외로, 혈전붕괴제와 함께 합텐-결합분자를 동시 투여하면 상승작용(synergistic)효과를 유발해서 합텐-결합분자 투여와 혈전붕괴제 투여효과를 단순히 합했을 때 예상되는 것보다 더 큰 정도로 혈병 용해를 향상시키는 것을 발견하였다.

단독으로 사용될 때, 환자에게 가했을 때 플라스민의 억제를 방지하여 혈병 용해를 증강시킬수 있는 합텐-결합분자의 양을 치료학적으로 효과적인양이라 한다. 혈병 용해를 증가시키고, 혈병 재형성을 방지하기 위하여 환자체중 킬로그램당 3 내지 10nmol의 합텐-결합분자를 제공하는 것이 바람직하다. 한 구체예에 있어서, 이 투여량은 0.10-1.0㎎/㎏ 분의 속도로 계속적인 정맥내 주입에 의해 60 내지 480분에 걸쳐 투여될 수 있다. 또한, 환자 체중 킬로그램당 3내지 100nmol/㎏, 가장 바람직하게는 3 내지 6nmol(합텐-결합분자의)의 투여량으로, 합텐-결합분자를 정맥내 주사가능한 볼러스(bolus ; 치료개시 시점에 혈액내 약제의 농도를 치료적 수준으로 올려주기 위하여 1회에 처방되는 다량의 약제 투여량)로 제공하는 것이 가능하다. 합텐-결합분자를 이러한 방법으로 제공하면 단일 볼러스로도 잠재적인 혈병 재생성을 방지하기에 충분하다. 본발명의 합텐-결합분자는 주사가능한 볼러스를 제조하기 위해 약리학적으로 허용되는 액체에 용해시킬수 있다. 합텐-결합분자를 통상의 식염수에 용해시켜 그러한 볼러스를 제조하는 것이 바람직하다.

플라스민의 억제를 방지할수 있는 합텐-결합분자를 혈전붕괴제와 동시투여할 때, 환자 체중 킬로그램당 합텐-결합분자 3내지 6nmol을 제공하는 것이 바람직하다. 한 구체예에 있어서, 이러한 투여량은 계속적인 정맥내 주입에 의해 60내지 480분에 걸쳐 투여될 수 있다. 또한, 환자 체중 ㎏당 3 내지 6nmol, 가장 바람직하게는 1내지 3nmol의 투여량으로 정맥내 주사가능한 볼러스 형태로 합텐-결합분자를 제공하는것도 가능하다. 그러한 용매를 일으킬수 있는 혈전붕괴제의 양이 치료학적으로 효과적인양이다. 본발명의 혈전붕괴제는 바람직하게는 환자체중 kg당 0.5 내지 1.0㎎의 투여량으로 제공된다. 한 구체예에 있어서, 혈전붕괴제는 장기간(즉, 약 180 내지 약 1440분)에 걸쳐 제공된다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 혈전붕괴제는 0.5내지 1.0㎎/㎏, 가장 바람직하게는 0.5내지 0.75㎎/㎏을 함유한, 정맥내 주사되는 볼러스에서 제공된다. 본발명의 혈전붕괴제는 주사가능한 볼러스를 제조하기 위해 약리학적으로 허용되는 어떤 액체에도 용해시킬 수 있다. 그러나 혈전붕괴제를 통상의 식염수에 용해시켜 그러한 볼러스를 제조하는 것이 바람직하다.

따라서, 바람직한 구체예에 따라 처치되는 환자는 혈전붕괴제의 정맥내 주사되는 볼러스과 함께 합텐-결합분자의 정맥내 주사되는 볼러스를 투여받는다. 이러한 바람직한 처치는 혈전붕괴에 필요한 t-PA의 양을 최소화하여 피브리노겐의 손상 정도를 감소시키고 일반적인 출혈 경향을 저하시킨다. 중요하게도 상기의 바람직한 처치에 의해 합텐-결합분자나 혈전붕괴제나 어느 한가지를 주입하여 가할때의 혈전용해 속도를 훨씬 능가하는 속도로 폐색 혈전을 용해하는 결과를 가져온다. 또한 재폐색의 위험도 상당히 감소한다.

이러한 기대하지 않았던 발견은, 출혈 경향을 증가시키지 않고 혈병 용해 속도를 가속화하는 것이 예전에는 불가능했기 때문에 중요하다. 따라서 바람직한 구체예는 혈전붕괴제의 볼러스 투여와 함께 합텐-결합분자의 볼러스를 투여하면 화합물 하나만을 투여하여 얻을 수 있는 것보다 더 빠른 속도로 폐색 혈전을 용해시킬수 있는 치료방법을 제공한다. 또한 바람직한 구체예는 피브리노겐 손상과 재폐색의 위험을 최소화하면서 이러한 목표를 성취할수 있다.

본분야 전문가들에게 명확한 것처럼, 항-합텐 결합분자 또는 혈전붕괴제의 필요한 투여량은 환자의 상태의 심각성과 환자의 키, 체중, 성별, 나이 및 진료이력과 같은 기준에 따른다.

본발명의 합텐-결하분자 또는 혈전붕괴제는 제학학적으로 허용되는 담체 비이클과의 혼합물같은, 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지의 방법에 따라 제형(formulate)될 수 있다. 예를들면, 적당한 비이클과 그의 제형은 레밍톤의 Pharmaceutical Sciences(16th Ed., Osol, A. (ed.), Mack, Easton PA(1980))에 기재되어 있다. 효과적인 투여에 적당한, 제약학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위해 그러한 조성물에는 효과적인 양의 합텐-결합분자 또는 혈전붕괴제가 단독으로, 또는 적당량의 담체 비이클과 함께 포함될 것이다.

부가적인 제약학적 방법이 작용의 지속기간을 조절하는데 사용될 수 있다. 조절된 방출제제는 본발명의 합텐-결합분자 또는 혈전붕괴제와 복합체를 형성하거나 흡수하는 중합체를 사용하여 달성될 수 있다. 조절된 공급(delivery)은 적당한 거대분자(예를들면, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌비닐 아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 또는 프로타민 술페이트)를 선택하여 할 수 있다. 약제 방출속도는 또한 그러한 거대분자의 농도를 바꾸어 조절할 수 있다. 작용 지속기간은 조절하기 위한 또다른 가능한 방법은 치료제를 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체 물질의 입자속에 혼입하는 것으로 이루어진다. 또한, 예를들면 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴- 마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크릴레이트)마이크로캡슐을 각각 사용함으로써 예를들면 코아세르베이션 방법 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐이나, 또는 예를들면 리포소옴, 알부민 중심체(microsphere), 마이크로에멀션, 나노(nano)입자, 나노(nano)캡슐과 같은 콜로이드성 약제 공급 시스템 또는 거대에멀션에 치료제를 넣는(entrap)것이 가능하다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)에 개시되어 있다.

혈전붕괴제 또는 합텐-결합분자는 본분야 공지의 방법으로 환자에게 제공될 수 있다. 그런 도입수단으로는 경구수단, 비내수단, 피하수단, 근육내수단, 정맥내수단, 동맥내 수단 또는 비경구적 수단이 포함된다. 심근경색증 치료의 가장 바람직한 방법에서는 환자에게 0.5 내지 1.0㎎/㎏을 함유한 볼러스(정맥내 주사되는)으로서 제공된다.

본발명은 일반적으로 기재하였는데, 단지 본발명은 설명하기 위한 것이며, 특별히 명시되지 않으면 본발명을 제한하지 않는 구체예를 참고로하여 더욱 잘 이해될 것이다.

[실시예 1]

[알파-2-항플라스민에 대한 항체의 제조]

A. 재료

아프로티닌과 프로테인-A 세파로스를 시그마(St. Louis, Mo)로부터 구입하였다. S2251(H-D-발릴-L-로이실-L-리신-ρ-니트로아닐리드 디하드로클로라이드)를 Helena Labs (Beaumont, TX) 로부터 구입하였다. 사람의 알파-2-항플파스민(α2AP)을 American Diagnostica, Inc.(Green-wich, CT) 로부터 구입하였다. PD-10 컬럼을 Pharmacia(Uppsala, Sweden)으로부터 구입하였다. 마이크로적정기 플레이트를 Becton Dickinson Labware(Oxnard, CA)로부터 구입하였다. 친화성으로 정제된 염소의 항-마우스(Fab')₂IgG로 Cappel Labs(Cochranville, PA)로부터 구하였다. 쥐의 항체 아이소타이프용 키트를 베링거 만하임(Indianapolis, IN)으로부터 구입하였다.

B. 알파-2-항플라스민에 대한 특이성이 있는 쥐의 단일클론성 항체의 제조

A/J 마우스들을 완전히 프로인드 보조액(Complete Freund's Adjuvant)에 함유된 사람의 α2AP 10㎍으로 복강내 및 피하 면역시켰다. 마우스들을 불완전한 프로인드 보조액에 함유된 단백질 ㎍으로 1개월후에 추가 면역시켰다. 개시 면역 2개월후에 마우스를 꼬리 정맥으로부터 피를 뽑아 항체의 적정량을 측정하였다. 최고 적정량을 나타내는 마우스를 융합 4일전에 불완전한 프로인드 보조제에 함유된 α2AP를 정맥내 5㎍(수성)과 복강내 10㎍, 융합 3일전에 정맥내 5㎍(수성) 주사하여 초면역하였다. 비장세포와 쥐(murine) SP2/10 세포를 기재한대로 융합시켰다(Kohler et al., supra). 하이브리도마를 폴리염화비닐 마이크로적정기 플레이트의 웰에 고정화된 α2AP용 고상 방상면역분석시험에 의해 선택하였다. 특이적으로 결합된 항체는 친화성으로 정제된 염소의 항-마우스(Fab')₂IgG를 사용하여 검출하였다. 21개의 하이브리도마가 특이적으로 항원에 결합하였다. 이러한 하이브리도마는 희석을 제한함으로써 단일클론성으로 서브클로닝(subcloned)되었다. 7개의 하이브리도마를 종래 기술로 복수(腹水)에 증량(expand)시켰다. 플로테인-A 세파로스를 갖는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 여과된 복수로부터 항체를 분리하였다. 퍼옥시다제에 결합된 토끼의 항-마우스, 항-유전자형(idotype) 항체를 사용하여 아이소타이프(isotyping)를 행하였다.

제조된 알파-2-항플라스민에 대해 특이적인 항체(RWR)를 생산하는 특정한 하이브리도마로는 아이소타이프 IgGl-K가 있다.

[실시예 2]

RWR에 의한 알파-2-항플라스민 억제

A. 재료와 방법

단백질 요오드화는 요오도젠(Iodogen) 방법을 사용하여 행하였다(Fraker, P.J. and Speck, J.C., Biochem. Biophys. Res. Comm. 80 : 849-857 (1978)). RWR의 비활성은 20.0μCi/㎍ 이었다.

B. 억제(inhibition)연구

억제 연구는 여러 유형으로 하였다. 먼저, 항플라스민에 의한 플라스민의 비활성화를 억제하는 RWR의 능력을 시험하기 위해 색소기질-분석법(chromogenic substrate assay)을 사용하였다. 전술한 분석(Wiman, B. Meth. Enzymol. 80 : 1395-1403(1981)) 포맷을 사용하여, 기재한 것처럼 항플라스민 활성에 대한 표준곡선을 작성하였다. 항플라스민(0내지 25nM)을 0.3mM S2251과 pH 7.3인 0.1M의 인산염 완충액중의 플라스민(100nM)과 혼합하여 총 1000㎕로 만들었다. 405 나노미터에서 광학밀도의 변화속도는 매 10 초마다 Hewlett-Packard 8451 A 분광광도계에 자동적으로 기록되었다. 항플라스민 농도를 생성물 형성속도와 선형으로 연관시키는 표준곡선을 작성하였다(Γ= 0.98). 다음에 항플라스민(25nM)을 RWR(0.875 내지 350nM)과 혼합하고 pH 7.3인 0.1M 인산염 완충액중의 S2251 0.3mM 로 25℃에서 2시간동안 배양하였다. 플라스민(100nM)을 재빨리 가하고 광학밀도를 기록하였다. 광학밀도의 변화속도를 주어진 항체수준에 의해 항플라스민 활성의 억제량을 계산하는데 사용하였다.

제1도에 도시된 바와 같이, 알파-2-플라스민의 55% 억제는 20nmol의 항체농도에서 발생하였다. 비변성 조건하에서 면역블로팅은 RWR이 α2AP의 70,000 Mr종에 결합하고 55,000Mr인 비플라스미노겐 결합 형태에는 결합하지 않는다는 것을 나타내었다. 또한 RWR은 α2AP의 변성 또는 환원된 형태에 감지할 수 있을 정도로는 결합하지 않았다.

[실시예 3]

[RWR 또는 t-PA에 의한 혈병 용해의 증가]

갓냉동된 것으로서, 임의로 선택한 8인 혈장 혼합액(pooled)을 사용하였다. 혈병을 만들기 위해 혈장을 소량의 피브린과 혼합하였다. 75× 12㎜ 시험관에서 50mM 트리스--완충식염수 pH 7.4 중의 소의 트롬빈(1 U/ml)과 염화칼슘(4mM)의 25㎕용액으로 와동(voltex)시켰다. 시험관을 37 ℃의 진동하는 수조속에 놓아 응혈을 촉진하였다. 그런후에 시험관을 감마계수기로 카운트하여 혈병에 혼입된 125-I 표지 피브린의 기준선을 결정하였다. RWR과 플라스민의 양을 변화시키면서 각 시험관 혈병에 가하고 총부피를 50mMol 트리스, 0.1M NaCl 및 2mMol의 CaCl₂로 1ml까지 만들었다. 퍼센트 용해는 방사성 표시된 가용성 피브린 펩티드의 방출을 측정하여 결정하였다. 표시된 시간 간격에서 상등액을 치환하지 않고 모아 계산하였다. 실험은 3히 행하고 퍼센트 용해를 다음식을 사용하여 계산하였다.

여기서, S_i= 상징액 계수, TV_i= 시간 i에서 시험관에 남아있는 총부피, ∑ Si는 앞에서 치환하지 않고 취한 상등액 표본의 합을 나타낸다.

제2도는 RWR 농도의 함수로서 퍼센트 혈장 혈병 용해의 그래프를 나타낸다. 제2도에서 볼 수 있듯이, RWR은 플라스민에 의한 혈병 용해의 투여량-관련된 상당한 증강을 초래한다. 4시간에 걸친 10nmol의 낮은 농도에서도(Mab : α2AP의 몰비 0.4 : 1) 상당한 혈병 용해가 관찰되었다. 따라서 α2AP의 부분적인 억제는 플라스민에 의한 피브린 용해에서 상당한 증가를 가져왔다. RWR의 농도가 증가됨에 따라 혈병 용해도 실제적으로 더 많이 관찰되었다.

[실시예 4]

[RWR과 t-PA에 의한 혈병 용해에 있어서의 상승작용 효과의 측정]

t-PA와 RWR간의 상승작용을 DV에서 정의한 것처럼 연구하였다(Loewe, S., Pharmacol. Rev. 9 : 237-242 (1957); Berenbaum, M.C., Adv. Cancer 35: 237-242(1981)). 이러한 분석에는 두제제에 대한 투여량-반응 곡선이 그려지는 것이 필요하다(Berenbaum, M.C., J. Thero. Biol. 114: 413-421(1985)). 이것을 사용하여 동등효과를 나타내는 t-PA와 RWR의 투여량이 선택된다. 그런후 두 제제의 분별 투여량을 조합하고 혈병 용해에 있어서의 연관(joint)효과를 측정하였다. 주어진 시간내에 등량의 용해를 초래하는 각 제제의 양을 단독으로 또는 조합하여 나타내는 아이소볼(isobole)을 축조하였다.

또한, 이러한 상호작용의 유형을 대수적으로 정의할수 있다. 각각의 분리된 제제 A와 B의 동등효과의 투여량이 주어지면, 조합된 각 제제의 동등효과를 나타내는 분별투여량(a_i와 b_i)은 다음과 같이 특징지울 수 있다 : a_i/A + b_i/B 1이면 상승작용이 있고, a_i/A + B_i/B = 1이면 가법(加法)적이고, a_i/A + B_i/B 1이면 길항적이다.

이것을 실험적으로 측정하기 위해 다양한 양의 t-PA와 RWR을 시험관에 분리해서 그리고 조합하여 가했다(아래 기재한 것처럼 3회씩). 그런후에 평균 퍼센트 용해를 표시한 것처럼 측정하였다.

갓 냉동된 혈장을 125-I 표지된 피브리노겐과 혼합하여 응혈시켰다. 그런후에 RWR(0 내지 250mmol, 최종) 또는 대조표준(항--디곡신) 항체(0 내지 250mmol, 최종)의 양을 변화시키면서 t-PA 0 또는 1단위를 함유한 시험관에 가했다. 시험관을 37℃에서 배양하고, 방사능 표시된 피브린 펩티드의 방출로써 퍼센트 용해를 측정하였다. 지시된 시간에 대조표준 혈병에서 RWR만이 t-PA 없이 유도된 용해량에 있어서 대조표준 항체-- 항-디곡신 Mab 40-160(Mudgett-Hunter, M., et al., Mol. Immunol. 22: 477-488(1985))-- 만과 다르지 않았다. 그러나, t-PA 존재하에서 RWR은 t-PA만으로 시험한 혈병에서 보다 더 큰 혈병 용해의 투여량-관련된 증강을 나타낸다. 제3도는 혈병 용해에 있어서의 t-PA와 RWR의 농도를 변화시켰을 때의 효과를 나타낸다.

약 30%의 항플라스민이 인자 13에 의해 피브린 가교 결합된다. 가교 결합된 항플라스민이 결합을 위한 항체에 유용하지 않다면, 혈병 용해 속도에 있어서의 항체의 효과를 크게 감소시킬 것이다. α2AP를 가교 결합시킨후 항체를 가한 사람들에서 보다 더욱 신속하게 용해시킬 것이다. 이러한 가설을 시험하기 위해 RWR로 혈장을 예비 배양한후 형성된 혈병에서의 시간-관련된 용해를 RWR이 계속해서 가해지는 형성된 혈병의 것과 비교하였다(제4도).

갓 냉동된 혈장을 방사능 표지된 피브리노겐과 혼합하였다. 그런후 RWR(25nmol, 최종)을 혈장과 혼합하고 응혈시켰다. 다른 실험에서는 RWR을 이미 형성된 혈장 혈병에 가했다. 혈병을 계속해서 완충액에서 24시간동안 4℃에서 배양시켰다. 그런후 t-PA(0, 01 또는 1 U)를 가하고 혈병을 37℃에서 배양시켰다. 용해 속도를 상기한 것처럼 측정하였다. 형성전에 RWR에 노출된 혈병에 대한 용해 속도에 있어 다만 약간의 증가만 있을뿐임을 제4도에서 알 수 있다. 이것은 항플라스민이 가교결합 피브린에 있어 MAb에 기능적으로 접근할 수 있다는 것을 제시한다.

용해에 있어 t-PA와 RWR의 조합 효과를 측정하기 이해, 아이소볼을 예전의 연구(Loewe, 1957; Berenbaum, 1981)에서 추전된 대로 축조하였다. 먼저 t-PA와 RWR의 동등효과 투여량을 특정하였다. 방사능 표지된 혈장 혈병을 t-PA(0 내지 0.03단위) 또는 RWR(0 내지 500nmol)의 양을 변화시키면서 37℃에서 배양시켰다. 48시간에서의 퍼센트 용해를 측정하였다(제6도). 대조표준 혈병(제제없이)은 이러한 연구동안에 9.36 + 0.38% 용해를 나타내었다. 이 실험에서 t-PA 0.3U와 RWR 500nmol은 동량의 용해를 나타내었다(35.5 + 3.1 대 34.3 + 5.1 ; 평균 + SEM).

동일한 실험에서, RWR과 t-PA의 다양한 경험적이고 분별적인 조합물도 시험하였다. 500nmol RWR 또는 0.03 U의 t-PA에 대해 동등한 용해를 나타내는 양제제의 분별 투여량 조합은 제6도에 플롯되어(X) 있다. 이런 제제 단독일때와 같은 양의 용해(34.2%, 34.9%)를 나타내는 RWR 과 t-PA의 투여량 조합이 X로 표시되어 있다. t-PA 와 RWR의 등위 조합은 각 제제만의 작은 단편이므로(즉, 그것들은 제5도에서 연속선으로 나타낸 합한 선 훨씬 아래에 있다) 이러한 두제제간에 강한 상승 작용이 있음이 입증된다. 본발명은 충분히 설명하였으므로 본 분야 전문가들은 본발명의 정신 또는 영역 또는 그의 구체예에서 벗어나지 않고서 광범위한 등가의 조성, 투여 방법의 변수내에서 같은 것을 수행할수 있음을 인정할 것이다.

Claims

(a) α2-항플라스민에 결합할 수 있고, 플라스민 억제를 방지할 수 있는 단일클론성 하체 또는 그의 단편 ; 및 (b) (i) 피브린 또는 피브린-혈소판 혈병을 용해시키거나, (ii) 피브린 또는 피브린-혈소판 혈병의 형성을 억제하기에 충분한 양의 상기 단일클론성 항체 또는 그의 단편(a)과는 다른 혈전붕괴제 ; 를 포함하는 것을 특징으로 심근경색증 또는 혈병 치료를 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일클론성 항체 또는 그의 단편(a)과 상기 혈전붕괴제(b)가 정맥 주사용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단일클론성 항체 또는 그의 단편(a)과 상기 혈전붕괴제(b)는 정맥내주사되는 볼러스-형(形)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단편이 F(ab')2 단편인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혈전붕괴제가 스트렙토키나제, 프로유로키나제, 유로키나제 및 조직-형 플라스미노겐 활성인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서, 상기 혈전붕괴제가 조직-형 플라스미노겐 활성인자인 것을 특징으로 하는 조성물.
(1) 치료에 효과적인 양의 제1항에 따른 단일클론성 항체 또는 그의 단편(a)을 수용하는 제1용기와; (2) 치료에 효과적인 양의 제1항에 따른 혈전붕괴제(b)를 수용하는 제2용기;를 포함하는, 둘 또는 그 이상의 용기수단을 수용하기 위해 밀접하게 칸막이로 구획된 것을 특징으로 하는 심근경색증 또는 혈병치료에 유용한 키트.