HU207349B - Process for producing pharmaceutical composition for quickly eliminating trombus - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás gyógyszerkészítmény előállítására vérrögök gyors elroncsolására. A találmány tárgya közelebbről eljárás a miokardiális infarktus és a vérrögök szervezeten belüli kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, amely lehetővé teszi a vérrögök elroncsolását α-2-antiplazminra vonatkozó antitestek alkalmazásával.

A legtöbb miokardiális infarktus (szívroham) arteroszklerotikus erek vérzésével indul. A vérzés gyakran trombus vagy vérrög képződéséhez vezet a szívkoszorúérben, amely ellátja az infarktusos zónát, vagyis a vérkeringés megzavarásával kialakult koagulációs elhalt zónát. Ez a vérrög fíbrin és vérlemezkék elegyéből áll. A fibrin/vérlemezke rög képződése súlyos klinikai következményekkel jár. Ezek fajtája és időtartama határozza meg az infarktusos zóna kiterjedését és a károsodás mértékét.

A) Miokardiális infarktus kezelése

A miokardiális infarktus kezelésének elsődleges célja a képződött rög gyors feloldása, és a vérkeringés visszaállítása (reperfuzió). A hatékony terápiának meg kell különböztetni a fibrin/vérlemez rögöt aTibrin rekuizortól, vagyis a fibrinogéntől. Ha az alkalmazott készítmény fajlagossága nem kielégítő, a betegnél általános vérzékenység léphet fel. A hatékony terápiával szemben támasztott további követelmény, hogy megakadályozza a vérrög ismételt kialakulását a terápia megszüntetése után. Ha a fibrin/vérlemezke rög újra kialakulhat, a megtámadott artéria ismét elzáródhat. A fibrin/vérlemezke rögöknek a vérkeringési rendszer más részeiben történő kialakulása részben megelőzhető antikoagulánsok, így heparin alkalmazásával. A kísérletek szerint azonban a heparin nem fejt ki általános hatást az ismételt elzáródás megakadályozásában olyan miokardiális infarktus esetében, ahol a véredény elzáródásának mértéke eléri a 70%-ot, elsősorban súlyos maradék koszorúér elzáródással rendelkező betegeknél.

Orvosi segítség hiányában a képződött fibrin/vérlemezke rög feloldható trombolitikus szerek alkalmazásával is, A trombolitikus szerek olyan anyagok, amelyek képesek elroncsolni a fibrin/vérlemezke rögöt, és ezáltal az adott véredényben visszaállítják a véráramlást. Ilyen anyagok például a sztreptokináz, a prourokináz, az urokináz és a szövet-típusú plazminogén aktivátor (Ganz W. és munkatársai: J. Amer. Coll. Cardiol. 1, 1247-1253 [1983]; Rentrop K. P. és munkatársai: Amer. J. Cardiol. 54, 29E-31E [1984]; Gold Η. K. és munkatársai: Amer, J. Cardiol., 53, 122C-125C [1984]).

Trombolitikus szerekkel a koszorúér véráramlása gyakran hatékonyan visszaállítható, és így megszüntethető a miokardiális infarktus. A kísérletek szerint azonban a feloldott fibrin/vérlemezke rög a trombolitikus terápia megszüntetése után a betegek legtöbbjében újra képződik. Az újraképződött rög ismét elzárja az adott véredényt, ami súlyosbítja a beteg állapotát (Gold H. K. és munkatársai: Amer. J. Cardiol. 53, 122C-125C [1984]; Gold Η. K. és munkatársai: Circulation, 68, 150-154 [1983]). így a sztreptokináz hatékonyan oldja a fibrinrögöt a vizsgált betegek mintegy 85%-ában, de a megtámadott véredény ismét elzáródik a vizsgált betegek 25%-ánál (Gold Η. K. és munkatársai: Circulation, 68,150-154 [1983]).

Ismereteink szerint a szövet típusú plazminogén aktivátor (t-PA) sokkal előnyösebb trombolitikus szer, mint akár a sztreptokináz, akár az urokináz, mivel nagyobb, bár nem teljes fajlagosságot mutat a fíbrin vonatkozásában, mint a két fenti anyag bármelyike (Verstrate M. és munkatársai: Láncét., 7, 142 [1985]). A szövet típusú plazminogén aktivátor (t-PA) egy nem-rög specifikus trombolitikus szer, amely a plazmából gyorsan felszívódik. A kísérletek szerint a szövet típusú plazminogén aktivátor hatékony trombolitikus szer akut miokardiális infarktussal rendelkező betegeknél, ahol a betegeknek mintegy 70%-ánál 45-75 percen belül viszszaállítja a koszorúér áramlását, vagyis lecsökkenti az elzáródást (Gold Η. K. és munkatársai: Circulation, 73, 347-352 [1986]).

A szövet típusú plazminogén aktivátort infúzión keresztül mintegy í-2 mg/kg testtömeg dózisban adagolják 90 percen keresztül. Mivel a t-PA nagy koncentrációban lebontja a fibrinogént, nagy dózis alkalmazása esetén számolni kell az általános vérzés veszélyével. A kísérletek szerint a t-PA dózisának növelése nem jár együtt a rög oldásának javulásával.

A t-PA kezelés előnyeit jelentősen lerontja a kezelés megszüntetése után jelentkező spontán, akut, ismételt elzáródás. A t-PA kezelés megszüntetése után ugyanis a kezelt betegek mintegy 45%-ában jelentkezik a megtámadott véredény ismételt elzáródása (Gold Η. K. és munkatársai: Circulation, 73, 347-352 [1986]). A szívkoszorúér ismételt elzáródását nem csökkenti a t-PA megnövelt dózisa sem. A vérrög ismételt képzésének a valószínűsége összefügg a koszorúér rendszer elzáródásának maradékával, vagyis a véredény blokkolásának kiterjedésével. Ezért az ismételt elzáródás sokkal valószínűbb olyan betegeknél, ahol az elzáródás kiterjedt, vagyis a kvantitatív elzáródás nagyobb mint 70%, vagy a nem kvantitatív elzáródás nagyobb mint 80%. A véredények ismételt elzáródása megakadályozható folyamatos t-PA infúzióval (Gold Η. K. és munkatársai: Circulation 73, 347-352 [1986]). A t-PA viszonylag rövid biológiai felezési ideje és a néhány betegnél jelentkező fokozott vérzékenység miatt a folyamatos t-PA infúzió a szívroham kezelésében nem mindig alkalmazható.

Összefoglalva megállapítható, hogy a klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a feloldott vérrög gyakran újraképződik a t-PA infúzió megszüntetése után (Gold Η. K. és munkatársai: Circulation 73,347-352 [1986]), de az ismételt elzáródás gyakorisága csökkenthető egy második (fenntartó) t-PA infúzióval, amelynek dózisa jóval kisebb, de időtartama jóval hosszabb. Újabban felismerték, hogy a heparinnal megfelelő kiegészítő kezelés végezhető olyan betegeknél, akik ilyen fenntartó infúziót kapnak. A szívkoszorúér artériás trombózis t-PA-val végzett kezelése tehát egy nagy mennyiségű folyamatos infúziót igényel a keringés gyors helyreállítása érdekében, és egy alacsony dózisú fenntartó infű1

HU 207 349 Β ziót igényel a nagymértékű maradék elzáródással rendelkező betegeknél az ismételt elzáródás megakadályozása érdekében.

B) Afibrinrög képződésének mechanizmusa

A rögök fibrinből és vérlemezkékből képződnek különböző arányban. A vérrög képződés alapvető folyamata, hogy egy oldható plazma fehérje, a fibrinogén oldhatatlan fibrinné alakul. A fibrinogén fibrinné történő átalakulását a trombin nevű enzim katalizálja, amely egy szerin-proteáz. A vérrög képződés általános folyamatát Ganong W. F. ismerteti (Review of Medical Physiology, 9. kiadás, Lángé, Los Altos, CA, 411-414 [1979]). A vérlemezék a vérben jelen lévő különböző lemez alakú szerkezetek. A rögképződés során vagy beépülnek a fibrinnel együtt a vérrögbe, vagy elősegítik a fíbrinogén-fíbrin átalakulást. A vérlemezék részt vesznek a vérrög képzésben a miokardiális infarktus során, és a fő komponensét képezik azoknak a rögöknek, amelyek a szívkoszorúeret a véráramlás trombolitikus szerrel történő visszaállítása után ismét elzárják. A vérlemezke aggregátumok képződése a fibrinogén (és talán a von Willebrand’s faktor vagy fibronektin), és a vérlemezke felületén jelen lévő receptor molekula közötti kölcsönhatástól függ. Ez a vérlemezke fibrinogén receptor két membrán glikoprotein a GPIIb és GPIIIa komplexe (Nachman R. L. és munkatársai: J. Clin. Invest. 69,263-269 [1982]; CollerB. S. és munkatársai: J. Clin. Invest. 72,325-338 [1983]). A GPIIb/GPIIla receptor komplex speciális szerepét Coller B. S. és munkatársai vizsgálták, amelynek során azt találták, hogy egy patkány monoklón antitest (a 10E5 monoklón antitest) a Hb és Illa glikoproteinekhez kötődik, és teljesen megakadályozza a fibrinogénnek a vérlemezkékhez történő kötődését. Annak elkerülésére, hogy a monoklón antitest Fc fragmens szakasza nem specifikus módon gátolja az aggregációt, Coller és munkatársai a 10E5 antitest F(ab’)₂ fragmensét alkalmazták (Coller B. S. és munkatársai: J. Clin. Invest., 72, 325-338 [1983]). Az antitest F(ab’)₂ fragmense csak olyan szakaszokat tartalmaz, amelyek felelősek az antitest fajlagossága és antigénkötőképessége szempontjából. Az F(ab’)₂ fragmens tulajdonságait és előállítását Eisen Η. N. ismerteti (Microbiology, 3. kiadás, Davis B. D. és munkatársai, Harper and Row, New York, 342-349 [1980]).

Egy másik monoklón antitest (jelzése 7E3) gátolja a fibrinogénnek a vérlemezkékhez történő kötődését, és a GPIIb/GPIIla rendszerhez kapcsolódik (Coller B. S.: J. Clin. Invest. 76,101-108 [1985]). Ez a monoklón antitest abban különbözik a 10E5 antitesttől, hogy sokkal gyorsabban kötődik az aktivált vérlemezkékhez, mint az aktiválatlan vérlemezkékhez, és egyaránt kötődik a kutya vérlemezkékhez és a humán vérlemezkékhez (Coller B. S.: J. Clin. Invest. 76, 101-108 [1985]; Coller B. S. és munkatársai: J. Láb. Clin. Med. 107, 384—392 [1986]). A 7E3 monoklón antitest F(ab’)₂ fragmense beavatkozik a vérlemezkék aggregációjába, ezért potenciálisan felhasználható a trombotikus betegségek kezelésére (Coller B. S. és munkatársai: Blood

66, 1456-1459 [1985]). A 7E3 monoklón antitest F(ab’)₂ fragmense gátolja továbbá a vérlemezkék egyszeres rétegben történő felhalmozódását anélkül, hogy elfogadhatatlanul megnövelné a vérzés veszélyét, és így potenciálisan felhasználható a véredények miokardiális infarktus és gutaütés esetén bekövetkeződő teljes elzáródását (Coller B. S. és munkatársai: Blood 66, 1456-1459 [1985]).

C) A vérrög elroncsolásának és természetes gátlásának mechanizmusa

A rög elroncsolását in vivő körülmények között a plazmin közvetíti. Természetes körülmények között a plazminogén a szövet plazminogén aktivátor (t-PA) hatására alakul át plazminná. Az aktiválás a fibrin felületén következik be, így a proteolitikus aktivitás a megfelelő helyre koncentrálódik. Miután a plazmin bekerül a vérkeringésbe, gyorsan természetes inhibitorokkal egyesül. A plazmin inaktiválása a nemkívánatos proteolízis elleni védekezés végső és elengedhetetlen lépése. Ilyen plazmin-inhibitor például az α-2-antiplazmin, az α-2-makroglobulin és az α-1-antitripszin, valamennyien glikoproteinek. Az α-2-antiplazmin a plazminnal szemben sokkal nagyobb affinitást mutat, mint az α-2-makroglobulin és 1:1 arányban specifikusan a plazminhoz kötődik. Az α-makroglobulin nagyméretű bemélyedése tartalék inhibitorként működik (Kané K. K.: Ann. Clin. Láb. Sci. 14,443-449 [1984]). így a t-PA adagolásával kiváltott vérrög roncsolást a plazmin plazmin-inhibitorok által végrehajtott gyors és irreverzíbilis aktiválása korlátozza.

Az α-2-antiplazmin háromfunkciós részből áll: a plazmin reaktív része, a plazmin(ogén) vagy LBS kötő hely [komplementer a plazmin(ogén) LBS részével, vagyis lizinkötő részével], valamint a fibrin keresztkötéssel történő megkötésére alkalmas hely (Mimuro J. és munkatársai: Blood 69, 446-453 [1987]). Mimuro és munkatársai az α-2-antiplazmin antitestjeit ismertetik, amelyek közül az egyik (JPTI-1) az α-2-antiplazmin reaktív részére specifikus, és megakadályozza az a-2antiplazmin/plazmin komplex képződését, és így gátolja az antiplazmin aktivitását. Mimuro és munkatársai azonban nem említik a JPTI-1 antitestnek a vérrög roncsolás gyorsítására történő felhasználását. Ismertek egyéb, α-2-antiplazminra specifikus antitestek is (Plow E. F. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 2902-2906 [1980]; Wimen B. és munkatársai: Scan. J. Clin. Láb. Invest. 43, 27-33 [1983]; Hattey E. és munkatársai; Thromb. Rés. 45, 485-495 [1987]; 4346029 számú USA-beli szabadalmi leírás és 4198 335 számú USAbeli szabadalmi leírás).

A Thrombosis Rés. 36, 153-163 (1984) olyan poliklón antitesteket ismertet, amelyek a vérkeringésben lévő, oldható α-2-plazmin-inhibitorhoz (α-2-antiplazminhoz) kötődnek, és eltávolítják azokat a plazmából, amely ezáltal α-2-plazmin-inhibitor-hiányos lesz. Ennek célja tehát a plazmában lévő α-2-plazmin-inhibitor megkötése és eltávolítása a keringésből. Ennek hátránya, hogy az α-2-antiplazmin hiánya vérzékenységet okoz.

HU 207 3 49 Β

D) Összefoglalás

Összefoglalva megállapítható, hogy a miokardiális infarktus kezelésére alkalmas terápia lényeges célja az elhalás csökkentése a véráram korai visszaállításával és az ismételt elzáródás megakadályozásával. A technika állása szerint ezt a célt részben trombolitikus szerek adagolásával érik el, amelyek képesek a potenciális életveszélyt jelentő fibrin/vérlemezke rög feloldására. Az ilyen szerek felhasználását korlátozza azonban, hogy a fibrinre nézve nem specifikusak, például a sztreptokináz és az urokináz, valamint biológiai felezési idejük a plazmin-inhibitorok miatt viszonylag rövid, és ezért bekövetkezhet a fibrinrög újraképzése, és az adott véredény ismételt elzáródása. Szükség van tehát a trombolitikus terápia olyan értelmű javítására, amely elősegíti a vérrög roncsolását, emellett minimalizálja a fibrinogén lebontását, és megakadályozza a megtámadott szívkoszorúér ismételt elzáródását.

A találmány feladata tehát új trombolitikus terápiára alkalmas gyógyszerkészítmény kidolgozása a miokardiális infarktus és a vérrög szervezeten belüli kezelésére. A találmány értelmében a miokardiális infarktus és a vérrög kezelésére haptént megkötő molekulát adagolunk, amely hatékony mennyiségben alkalmas a plazmin gátlásának megakadályozására.

A találmány tárgya tehát eljárás miokardiális infarktus kezelésére vagy vérrög szervezeten belüli elroncsolására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, amelynél egy specifikus keresztkötéssel a fibrinhez vagy a vérröghöz kötött α-2-antiplazminra specifikus antitestet vagy ennek egy fragmensét és adott esetben valamely trombolitikus szert, ahol az antitest vagy annak fragmense és a trombolitikus szer tömegaránya 30-0,05:1, gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverünk össze, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

A találmány értelmében a miokardiális infarktus kezelésére a betegnek együttesen adagoljuk

a) egy haptént megkötő és a plazmin gátlását megakadályozó molekula hatékony mennyiségét, és

b) adott esetben egy trombolitikus szer hatékony mennyiségét, amely (i) feloldja a fibrin/vérlemezke rögöt vagy (ii) gátolja a fibrin/vérlemezke rög képződését, ahol az a) haptént megkötő molekula eltér a b) trombolitikus szertől.

Mint fent említettük, a miokardiális infarktus kezelésére és a vérrögök szervezeten belüli elroncsolására a találmány értelmében egy haptént megkötő molekulát alkalmazunk, amely képes a plazmin gátlásának megakadályozására.

Eljárhatunk úgy is, hogy a haptént megkötő molekulával együtt egy trombolitikus szert is adagolunk. Haptént megkötő molekula alatt olyan vegyületet értünk, amely alkalmas valamely plazmin-inhibitor megkötésére. Az ilyen molekula lehet antitest, antitest fragmens, például F(ab’)₂ vagy F(ab) molekula, valamint bármely olyan ligandum, amely alkalmas valamely plazmin inhibitor megkötésére.

A találmány szerinti megoldással bármely vérrög kezelhető, példaként említhető a tüdőembólia, a mély vénás trombózis, az agy embólia, a vese véna és a perifériás artériás trombózis.

Az „együttes adagolás” kifejezés azt jelenti, hogy a haptént megkötő molekulát és a trombolitikus szert olyan időeloszlásban adagoljuk, hogy a farmakológiai aktivitás időtartama egymást átfedi, A két szer adagolható egyszerre vagy egymás után is.

A találmány értelmében haptént megkötő molekulaként alkalmazható monoklón antitest vagy ennek fragmense. Előnyösen alkalmazható az ilyen antitestek F(ab’)₂ fragmense, mert így lecsökkentjük az immunoglobulin Fc szakasza által okozott immunológiás reakciót. Monoklón antitestek előállítását ismerteti a 4172124 számú USA-beli szabadalmi leírás és Kohler és munkatársai: Natúré 256, 495-497 (1975). A plazmin gátlásának megakadályozására alkalmas monoklón antitestek előállítását ismerteti Mimuro J. és munkatársai: Blood 69, 446-453 (1987), valamint a jelen bejelentés néhány példája.

A fenti meghatározásban a haptén olyan molekula, amelyet egy antitest képes megkötni. A találmány szerinti felhasználás feltétele, hogy a haptént megkötő molekula képes legyen valamely plazmin-inhibitor megkötésére, és így megvédje az inhibitort attól, hogy inhibitor/plazmin komplexet képezzen. Bár a találmány értelmében bármely, fenti feltételnek megfelelő haptént megkötő molekula felhasználható, előnyösen olyan haptént megkötő molekulát alkalmazunk, amely az α-2-antiplazmin plazminmegkötő helyéhez kapcsolódik. Ebből a szempontból különösen előnyös monoklón antitest az RWR antitest.

Trombolitikus szerként bármely olyan készítmény felhasználható, amely oldja a fibrin/vérlemezke rögöt, vagy gátolja az ilyen rög képződését. Példaként említhető a sztreptokináz, prourokináz, urokináz és szövet típusú plazminogén aktivátor. Ebből a szempontból előnyösen alkalmazható a t-PA, például a természetes t-PA vagy előnyösen a rekombináns t-PA. A találmány értelmében trombolitikus szerként alkalmazhatók a fent említett trombolitikus szerek hibridjei, fiziológiailag aktív fragmensei vagy mutánsai is. A fenti értelmezésben a szövet típusú plazminogén aktivátor megjelölés kiterjed a természetes eredetű és a rekombináns szövet típusú plazminogén aktivátorokra, valamint ezek hibridjeire, ffagmenseire és mutánsaira.

A találmány egyik megvalósítási formája szerint a haptént megkötő molekulát és a trombolitikus szert együttesen adagoljuk. Ebből a szempontból előnyös, ha a haptént megkötő molekulát a trombolitikus szer adagolása előtt alkalmazzuk. Ez közelebbről azt jelenti, hogy a haptént megkötő molekulát 45 perccel, előnyösen 30 perccel a trombolitikus szer adagolása előtt adagoljuk.

A haptént megkötő molekula feladata a plazmin valamely plazmin-inhibitor által történő - gátlásának megakadályozása. Meglepő módon azt találtuk, hogy a haptént megkötő molekula és valamely trombolitikus szer együttes adagolása szinergetikus hatást fejt ki, vagyis az együttes vérrög roncsoló hatás nagyobb, mint

HU 207 349 Β a haptént megkötő molekula és a trombolitikus szer hatásainak összege.

Önmagában történő alkalmazás esetén a terápiásán hatékony mennyiség olyan mennyiségű haptént megkötő molekulát jelent, amely képes a plazmin gátlásának megakadályozására, és ezáltal a vérrög roncsolás javítására. A vérrög roncsolás javítására és a vérrög újraképződésének megakadályozására a haptént megkötő molekulát általában 3-100 nmól/kg, vagyis 75-14400 pg/kg testtömeg mennyiségben alkalmazzuk. Ez a mennyiség adagolható például 0,10-1,0 mg/kg/perc dózisú folyamatos intravénás infúzió formájában 60-480 percen keresztül. Eljárhatunk úgy is, hogy a haptént megkötő molekulát intravénás injekció formájában adagoljuk 3100 nmól/kg, előnyösen 3-6 nmól/kg testtömeg dózisban. Az utóbbi adagolási forma esetén az egyszeres injekció megfelelő védelmet biztosít a vérrög potenciális újraképződése ellen..A találmány szerinti alkalmazáshoz a haptént megkötő molekulát valamely fiziológiailag alkalmazható folyadékban oldjuk, és injektálható készítménnyé alakítjuk. Oldószerként általában normál sóoldatot alkalmazunk.

Ha a plazmin gátlásának megakadályozására alkalmas haptént megkötő molekulát valamely trombolitikus szerrel együtt adagoljuk, akkor a haptént megkötő molekula dózisa 3-6 nmól/kg testtömeg. Ez a dózis adagolható például 60-480 percen keresztül folyamatos intravénás infúzió, vagy egyszeri intravénás injekció formájában. Ez utóbbi esetben a dózis 36 nmól/kg, előnyösen 1-3 nmól/kg testtömeg. A trombolitikus szer terápiásán hatékony mennyisége olyan mennyiség, amely alkalmas a rög elroncsolására. A trombolitikus szert a találmány értelmében általában 0,5-1,0 mg/kg testtömeg dózisban alkalmazzuk. A trombolitikus szer adagolását előnyösen hosszabb időn keresztül, például 180-1440 percen keresztül végezzük. Előnyösen úgy járunk el, hogy a trombolitikus szert intravénás injekció formájában alkalmazzuk 0,51,0 mg/kg, előnyösen 0,5-0,75 mg/kg testtömeg dózisban. Az alkalmazáshoz a trombolitikus szert fiziológiailag alkalmazható folyadékban oldjuk, és injekciós készítménnyé alakítjuk. Oldószerként előnyösen normál sóoldatot alkalmazunk.

A kezelt beteg a találmány előnyös megvalósítási módja szerint haptént megkötő molekulát tartalmazó intravénás injekciót kap valamely trombolitikus szer intravénás injekciójával kombinálva. Ez a kezelési mód minimalizálja a trombolízishez szükséges t-PA mennyiséget, és így lecsökkenti a fibrinogén lebontását, és ezáltal az általános vérzékenységre való hajlamot. Az előnyös alkalmazási mód egyik fontos előnye, hogy az elzáródást okozó trombus feloldásának sebessége jelentős mértékben meghaladja az infúzió formájában önmagában alkalmazott haptént megkötő molekulával vagy trombolitikus szerrel elérhető oldási sebességet. További előny, hogy az újraelzáródás veszélye minimális.

Ez a váratlan hatás előre nem volt látható, mert az ismert eljárások nem teszik lehetővé a vérrög roncsolási sebességének felgyorsítását az általános vérzékenység veszélyének fokozása nélkül. A fenti megoldás tehát olyan kezelési módot javasol, ahol a haptént megkötő molekulát tartalnazó injekció valamely trombolitikus szer injekciójával kombinálva az elzáródást okozó trombust sokkal gyorsabban feloldja, mint a két hatóanyag egyikének önmagában történő adagolása esetén. Ezen célkitűzés megvalósítása mellett további előny, hogy a megoldás minimalizálja a fibrinogén lebontását és az újraelzáródás veszélyét.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a haptént megkötő molekula és/vagy a trombolitikus szer szükséges dózisa a betegség súlyosságától és egy sor más kritériumtól függ, például a kezelt beteg magassága, testtömege, neme, kora és korábbi gyógykezelése.

A haptént megkötő molekulát vagy trombolitikus szert tartalmazó gyógyszerkészítmény a szokásos módon előállítható, amelynek során például a hatóanyagot gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverjük össze, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

Az alkalmazható készítményeket, gyógyszerészeti hordozóanyagokat és segédanyagokat ismerteti például: Remington’s Pharmaceutical Sciences (16. kiadás, Osol A, Mack Easton PA, [1980]). A kezelés során előnyösen alkalmazható az a készítmény, amely farmakológiailag hatékony mennnyiségű haptént megkötő molekulát vagy trombolitikus szert tartalmaz a hordozóanyag és/vagy segédanyag mellett.

A hatás időtartamának szabályozásához nyújtott hatóanyag-leadású készítményt alkalmazunk. Ebből a célból a haptént megkötő molekulát vagy a trombolitikus szert valamely polimerrel komplexszé alakítjuk, vagy abszorbeáljuk. A nyújtott hatóanyag-leadás biztosításához makromolekulákként felhasználhatók például poliészterek, poliaminosavak, polivinil-pirrolidon, etilén-vinilacetát, metil-cellulóz, karboximetil-cellulóz vagy protamin-szulfát. A hatóanyag felszabadulásának sebessége befolyásolható továbbá a makromolekula koncentrációjának változtatásával. A hatás időtartama szabályozható úgy is, hogy a hatóanyagot valamely polimer anyagba, így poliészterbe, poliaminosavba, hidrogélbe, politejsavba vagy etilén-vinil-acetát kopolimerbe építjük be. Eljárhatunk úgy is, hogy a hatóanyagot mikrokapszulába építjük be, például koacervátumos technikával, vagy határfelületű polimerizálással, például hidroxi-metil-cellulóz, zselatin mikrokapszula vagy polimetil-metakrilát mikrokapszula alkalmazásával, illetve valamely kolloid hatóanyagfelszabadító rendszerbe építjük be, például liposzóma, albumin mikrogyöngy, mikroemulzió, nanoszemcse, nanokapszula vagy makroemulzió formájában. Ezeket a megoldásokat ismerteti a Remington’s Pharmaceutical Sciences 1980.

A haptént megkötő molekulát vagy a trombolitikus szert tartalmazó készítményt a szokásos módon adagoljuk. Példaként említhető az orális, intranazális, szubkután, intramuszkuláris, intravénás, intraartériás és parenterális adagolás. A miokardiális infarktus kezelésére előnyösen intravénás injekciót alkalmazunk 0,51,0 mg/kg dózisban.

HU 207 349 Β

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna. Az ábrákat a leírás végén ismertetjük.

1. példa

α.-2-Antiplazminra specifikus antitest előállítása

A) Felhasznált anyagok

Aprotinin és protein-A szefaróz (Sigma, St. Louis, MO, USA), H-D-valil-L-leucil-L-lizin-p-nitroaniliddihidroklorid, röviden S2251 (Helena Labs, Beaumont, TX, USA), humán α-2-antiplazmin, röviden a2AP (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, USA), PD-10 oszlop (Pharmacia, Upsala, Svédország), mikrotitráló lemez (Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA, USA), affinitív úton tisztított kecske antiegér F(ab’)₂ IgG (Cappel Labs, Cochranville, PA, USA) és egér antitest típusmeghatározó készlet (Boehringer Mannheim, Indianapois, IN, USA).

B) A fehérjék előállítása

Az a2AP-t több donortól származó és megfagyasztott plazmából tisztítjuk affinitás kromatográfiával Wiman módszerével (Wiman B.: Method Enzymol 80, 395-408 [1981]), majd gyors fehérje folyadék-kromatográfiát végzünk Superose-12 oszlopon. A tisztítás során SDS-PAGE vizsgálatban (Laemmli V. K.: Natúré 227, 680-685 [1970]) egyetlen sávot adó terméket kapunk. A plazminogént a plazmából Deutsch és Mertz módszerével (Deutsch D. G. és munkatársai: Science 170, 1095-1096 [1970]) izoláljuk, és urokinázzal aktiváljuk (Wiman B.: Method Enzymol. 80,395-408 [1981]). Az a2AP és a plazminogén koncentrációját az abszorpciós koefficiens (A^{1 cm} 28 ohm) alapján 1 tömeg% koncentrációjú 7,03 és 17,0 oldatban (Moroi M. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 251, 5956-5965 (1976); Robbins K. C. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 240, 541-550 [1965]) határozzuk meg.

C) α-2-Antiplazminra specifikus egér monoklonális antitestek előállítása

AJJ típusú egereket i.p. és s.c. adagolt komplett Freund adjuvánsban felvett 10 pg humán a2AP-vel immunizáljuk. Az egereket 1 hónap elteltével inkomplett Freund adjuvánsban felvett 2 mg fehérjével felerősítjük. A kezdeti immunizálástól számított 2 hónap elteltével a farokvénán keresztül vért veszünk, és meghatározzuk az antitest mennyiségét. A legnagyobb értéket mutató egeret 5 pg i.v. adagolt vizes és 10 pg i.p. adagolt inkomplett Freund adjuvánsban felvett a2APvel hiperimmunizáljuk 4 nappal az egyesítés, és 5 pg i.v. adagolt vizes ct2AP-vel hiperimmunizáljuk 3 nappal az egyesítés előtt. Lépsejteket és SP2/0 egérsejteket egyesítünk az ismert módon (Kohler és munkatársai idézett műve). A hibridómákat szilárd fázisú radioimmunoassay eljárással válogatjuk ki polivinil-klorid mikrotitráló lemez mintavételi helyein immobilizált a2AP-vel szemben. A specifikusan megkötött antitestet affinitás kromatográfiával tisztított kecske antiegér

F(ab’)₂ IgG felhasználásával mutatjuk ki. Specifikus antigén megkötést 21 hibridóma mutat. Ezeket a hibridómákat korlátozott oldással monoklón állapotig szubklónozzuk. 7 hibridómát a szokásos módon ascitesbe viszünk be. A hibridómát a szűrt ascitesből izoláljuk affinitás kromatográfiásan protein-A szefaróz felhasználásával.

A típus meghatározást peroxidázhoz kapcsolt nyúl antiegér, antiidiotipikus antitestek segítségével végezzük.

Az IgGl-K izotípus egyik hibridómája α-2-antiplazminra specifikus antitestet (RWR) termel.

D) Az antitest jellemzése

A fúzióval kapott 21 monoklonális antitest közül a szilárd fázisú radioimmunoassay vizsgálatban mutatott kötődés alapján kiválasztunk hetet, és bevisszük az ascitesbe. Protein A felhasználásával végzett affinitáskromatográfiás tisztítás után az antitesteken vizsgáljuk a humán a2AP plazminnal történő inaktiválásának gátlásában kifejtett hatékonyságát. Az antitestek egyike az RWR (Ig-gamma^X szerotípus) a dózistól függő mértékben gátolja az a2AP és a plazmin közötti kölcsönhatást (1. ábra), amikor is 14 nanomól/1 koncentrációban vagy RWR: α2ΑΡ-0,7:1 mólarány mellett 50%ban gátolja az oŰAP-t.

2. példa

O.-2-Antiplazmin gátlása RWR seqítségével

A) Felhasznált anyagok és módszerek

A fehérjék jódozását jodogén módszerrel (Fraker P. J. és Speck J. C.: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 80, 849-857 [1978]) végezzük. Az RWR specifikus aktivitása 20,0 pCi/gg.

B) A gátlás vizsgálata

A gátlás vizsgálatához különböző kísérleteket végzünk. Először, kromogén szubsztrátum vizsgálatot végzünk, amellyel vizsgáljuk, hogy az RWR milyen mértékben gátolja a plazmin antiplazminnal történő inaktiválását. A vizsgálat során (Wiman B.: Meth. Enzymol. 80,1395-1403 [1981]) egy standard görbét veszünk fel az antiplazmin aktivitásra. Az antiplazmint (025 nmól/1) 0,3 mmól/1 S2251-gyei és 100 nmól/1 plazminnal keverjük 0,1 mól/lpH-7,3 foszfát puffer jelenlétében, ahol az össztérfogat 1000 μΐ. Az optikai sűrűség változásának arányát 405 nm-en automatikusan mérjük 10 másodpercenként egy Hewlet-Packard 8451A spektrofotométeren. A standard görbén az antiplazmin koncentrációt a termék képződés arányában lineárisan ábrázoljuk (r-0,98). Ezután 25 nmól/1 antiplazmint keverünk 0,875-350 nmól/1 RWR-rel, és 0,3 mmól/1 S2251 jelenlétében 0,1 mól/1 pH=7,3 foszfát pufferben 25 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáljuk. Gyorsan 100 nmól/1 plazmint adunk hozzá, és az optikai sűrűséget detektáljuk. Az optikai sűrűség változásának aránya egy adott antitest szintnél az antiplazmin aktivitás gátlását mutatja.

Mint a 2. ábrán látható, 55%-os α-2-antiplazmin gát1

HU 207 349 Β lás jelentkezik 20 nmól/1 antitest koncentrációnál. A nemdenaturáló körülmények között végzett immunovizsgálat szerint az RWR az a2AP 70000 Mr fajtáját köti, és nem a nem-plazminogénkötő 55000 Mr formát Emellett, az RWR nem köti meg kimutatható módon-az a2AP denaturált vagy redukált formáját.

C) Az antitest kötődése a plazma röghöz

100 μΐ frissen fagyasztott humán plazmát gyűjtünk négy véletlenszerűen kiválasztott donortól, és 100 pl olyan oldattal keverjük, amely 50 mmól/1 trisz-pufferolt sóoldatban (pH-7,4) egy egység/ml trombint és 4 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz. Az elegyet 75x12 mm-es vizsgálati csövekbe töltjük, és vízfürdőn 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A rögöket ezután 100 pl 0,1 tömeg% jód-acetamid oldattal kezeljük 15 percen keresztül, majd 2 ml 10 mmól/1 foszfát-pufferolt sóoldattal (pH - 7,4) mossuk, és a meg nem kötött fehéijék kicsapásához préseljük. A rögöket ezután egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten monoklón RWR antitesttel vagy azonos izo-típusú kontroll antitesttel (antidigoxin antitest 40-160, MudgettHunter és munkatársai: Mól. Immunoi. 22, 477-488 [1985]) inkubáljuk, ismét pufíerrel mossuk, majd órán keresztül szobahőmérsékleten ¹²⁵I-jelölt GAMFab-vel (100000 cpm) inkubáljuk. Mosás után a plazma röghöz kötött antitest mennyiségét gamma emissziós számlálással határozzuk meg.

D) Plazma rög t-PA roncsolása az idő függvényében pl frissen fagyasztott, és különböző donoroktól származó humán plazmát nyomnyi mennyiségű ¹²⁵I-jelölt fibrinogénnel keverünk 75x12 mm-es vizsgálati csövekben, és 50 pl olyan oldattal, amely 10 mmól/1 triszpufferolt sóoldatban (pH-7,4) egy egység/ml trombint és 50 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz, vízfürdőn órán keresztül 37 °C hőmérsékleten kezelve kicsapjuk. A rögöket gamma számlálóban megszámláljuk, majd RWR-t (0 vagy 250 nanomól/1), kontroll antidigoxin 40160-at (0 vagy 250 nanomól/1) vagy t-PA-t (0 vagy 1 nemzetközi egység) adunk minden csőhöz. A cső térfogatát 10 mmól/1 trisz, 0,11 mól/l nátrium-klorid és 2 mmól/1 kalcium-klorid elegyével 1 ml-re töltjük. Különböző időközökben 200 pl felülúszót gyűjtünk és gamma-számlálón vizsgáljuk. A százalékos roncsolást a rögben mérhető kezdeti radioaktivitás és a felülúszóban az oldható fibrin bomlási termék által felszabadított radioaktivitás alapján számoljuk.

Az RWR-nek „endogén plazminogén aktivátor által kiváltott roncsolásra gyakorolt hatásának vizsgálatához radioaktív jelölésű plazma rögöket állítunk elő a fent leírt módon. Ezután 500 nanomól/1 végkoncentrációban RWR-t vagy kontroll antitestet adunk minden csőhöz (négy párhuzamos), és a vizsgált elegyet 2 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmazó trisz-pufferolt sóoldattal 500 pl térfogatra töltjük. Különböző időközökben mintát veszünk a felülúszóból és gamma számlálón vizsgáljuk. Az eredményből számoljuk a százalékos roncsolást.

3. példa

A vérrög roncsolásának RWR-rel vagy t-PA-val történő gyorsítása

A) Anyagok és módszerek

Nyolc, véletlenszerűen kiválogatott donortól vett és frissen fagyasztott és egyesített humán plazmát kevés fibrinnel keverve rögöket képzünk. 75x12 mmes kémcsőben 25 pl plazmát elkeverünk 2 pl borjútrombin (1 U/ml) és kalcium-klorid (4 mmól/1) 50 mmól/1 trisz-pufferben (pH-7,4) felvett oldatával. A kémcsöveket 37 °C hőmérsékletű mozgó vízfürdőbe helyezzük a vérrögképződés meggyorsítása érdekében. Ezután a ¹²⁵I jelölésű fibrinnek a vérrögbe történő beépülését gamma-számlálóval ellenőrizzük. Minden kémcső mintához különböző mennyiségű RWR-t és plazmint adagolunk, és az össztérfogatot 50 mmól/1 trisz, 0,11 mmól/1 nátrium-klorid és 2 mmól/1 kalcium-klorid segítségével 1 ml-re egészítjük ki. A roncsolás mértékét százalékban kifejezve a radioaktív jelölésű oldható fibrin peptid felszabadulásával mérjük, A megadott idő elteltével a felülúszóból mintát veszünk, és gamma-számlálón vizsgáljuk. A vizsgálatokat három párhuzamossal végezzük, és az i időpontban mért százalékos kumulatív roncsolást az alábbi egyenlettel számoljuk:

Lj— 100x(SjXTVj/SVj + Zomax(0j-l)^i·

ahol Sj	a felülúszónál számolt érték,
TVj	az i időpontban mérhető ossz térfogat,
SVj	az i időpontban vizsgált felülúszó térfogata és
ZSi	a pótlás nélkül korábban kivett felülúszó minták összege.

A 3. ábra a százalékos plazmarög roncsolást mutatja az RWR koncentráció függvényében. Mint a 3. ábráról látható, az RWR dózisfüggő mértékben javítja a vérrög plazminnal történő roncsolását. Jelentős mértékű rögroncsolás észlelhető 4 óra elteltével 10 nmól koncentrációnál is (Mab:a2AP mólarány 0,4:1). Ez azt jelenti, hogy az a2AP részleges gátlása jelentős módon növeli a plazminnal végzett fibrinolízist. Az RWR koncentrációjának növekedésével jelentős mértékben nő a vérrög roncsolása is.

B) Keresztkötéssel plazma röghöz kötött a2AP-re specifikus antitest kötődése

Mivel az RWR antitest képes az oldatban lévő a2AP megkötésére és gátlására, vizsgáljuk az olyan a2AP-hez történő kötődés képességét, amely aktivált ΧΙΠ faktorral kialakított keresztkötéssel fibrinhez van kötve. Az aktivált XHI faktort (amely katalizálja az a2AP és a fibrin közötti reverzibilis keresztkötést, Mimuro és munkatársai: J. Clin. Invest. 77, 1006-1013 [1986]) 0,1 tömeg% jód-acetamiddal gátoljuk, majd a plazma rögöket mossuk, és különböző mennyiségű

HU 207 349 Β

RWR-rel vagy azonos izotípushoz tartozó kontroll antitesttel (antidigoxin monoklonális antitest 40-160, Mudgett-Hunter és munkatársai idézett műve) inkubáljuk. A plazma röghöz kötött antitestet ¹²⁵I jelölésű GaMFab segítségével detektáljuk. A 4. ábra a kontroll antitesthez viszonyítva a keresztkötéssel fibrin röghöz kötött a2AP-hez történő kötődés dózis függvényét mutatja.

C) Az „endogén roncsolás’’ fokozása RWR antitesttel

A humán a2AP hiány klinikai próbája a vérrög in vivő spontán roncsolása (Aoki és munkatársai: J. Clin. Invest. 63, 877-884 [1979]). Ez feltehetően az endogén plazminogén aktivátor által kiváltott plazmán gátlás nélküli hatásából ered (Miles és munkatársai: Blood 59, 1246-1251 [1982]). Mivel az RWR az oldhatatlan és a keresztkötéssel fibrinhez kötött αΑΡ-hez kötődik, vizsgálható az RWR-nek a spontán rög roncsolás reprodukálására gyakorolt hatása. Az 5. ábra azt mutatja, hogy a kontroll antitesthez (antidigoxin 40-160) hasonlítva az RWR növeli az „endogén” vagy spontán roncsolást. Az RWR tehát reprodukálja a humán elégtelenség esetén jelentkező spontán rög roncsolást.

D) A rög roncsolása t-PA és RWR segítségével

Mivel a t-PA a fibrinhez kötött plazminogént könnyen plazminná aktiválja, és a fibrinhez kötött plazmin viszonylag ellenáll az ct2AP gátló hatásának (Matsuo és munkatársai: Thromb. Haemort. 45, 225229 [1981]), feltételezhető volt, hogy a t-PA rög roncsoló hatását jelentős módon nem befolyásolja az O.2AP által kiváltott gátló hatás. A feltételezés ellenőrzéséhez összehasonlítjuk az RWR-rel vagy kontroll antitesttel kezelt plazma rögben és az RWR-rel vagy kontroll antitesttel és t-PA-val kezelt plazma rögben mérhető fibrinolízis mértékét. A vizsgálat viszonylag rövid ideje alatt (5 óra, lásd 5. ábrát) az RWR önmagában nem eredményez nagyobb roncsolást, mint a kontroll antitest önmagában (6. ábra). A kontroll antitest és a t-PA kombinációja kismértékben fokozza a vérrög roncsolását. Az RWR és a t-PA kombinációja azonban szinte teljesen elroncsolja a rögöt. Az RWR és t-PA kombinációjával a rög roncsolásában elérhető jelentős fokozás azt sugallja, hogy a két hatóanyag szinergetikus kölcsönhatást vált ki.

4. példa

Az RWR és t-PA vérrög roncsolásra kifejtett szinergetikus hatásának meghatározása A t-PA és RWR szinergetikus hatását a fent ismertetett módon vizsgáljuk (Loewe S.: Pharmacol. Rév. 9, 237-242 [1957]; Berenbaum M. C.: Adv. Cancer 35, 237-242 [1981]). A vizsgálathoz mindkét hatóanyagnál dózis/válasz görbét veszünk fel (Berenbaum M. C.: J. Theor. Bioi. 114, 413-421 [1985]). Ennek segítségével kiválasztjuk az azonos hatást mutató t-PA és RWR dózist. A két hatóanyag adott dózisát egyesítjük, és meghatározzuk a vérrög roncsolásra kifejtett együttes hatásukat. Izobol görbét veszünk fel, amely a hatóanyagok mennyiségét mutatja önmagukban vagy kombinációkban, amely adott időtartam alatt azonos mértékű roncsolási eredményez. A szinergetikus additív és antagonista hatás grafikus meghatározását a 7B. ábra mutatja.

Ez a típusú kölcsönhatás algebrai úton is meghatározható. Az A és B hatóanyag azonos hatást mutató dózisa kombinációban (Ai és Bi) szinergetikus, ha Ai/A + Bi/B 1, additív, ha Ai/A + Bi/B = 1, vagy antagonista, ha Ai/A + Bi/B > 1.

Az empirikus meghatározáshoz különböző mennyiségű t-PA-t és RWR-t adagolunk egymástól elkülönítve és kombinációban a vizsgálati kémcsőben lévő jelölt vérröghöz (a kísérletet három párhuzamosban végezzük). Az átlagos roncsolás százalékos értékét meghatározzuk a 3. példában leírt módon.

Frissen fagyasztott plazmát 125-1-vei jelölt fíbrinogénnel keverjük, és vérrögöt képzünk. Különböző mennyiségű RWR-t (0-250 mmól) vagy antidigoxin kontroll antitestet (0-250 nmól) adunk a 0 vagy 1 egységnyi t-PA-t tartalmazó kémcsőhöz. A kémcsöveket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és a százalékos roncsolást a radioaktív jelölésű fibrin peptid felszabadulása alapján határozzuk meg. A kontroll mintában az RWR a megadott időben önmagában nem tért el a kontrollként alkalmazott antidigoxin Mab 40-160 (Mudgett-Hunter M. és munkatársai: Mól. Immunoi. 22, 477-488 [1985]) antitesttől a t-PA nélkül indukált roncsolás mértékében. t-PA jelenlétében azonban az RWR dózistól függő mértékben javítja a vérrög roncsolását, ahol a roncsolás mértéke nagyobb, mint az önmagában t-PA-val kezelt rög esetében. A 8. ábra különböző koncentrációjú t-PA és RWR hatását mutatja.

Mintegy 30% antiplazmint keresztkötéssel 13 faktor segítségével fibrinhez kapcsolunk. Ha az antitest kötődése során keresztkötődéses antiplazmin nincs jelen, az jelentős mértékben csökkenti az antitestnek a vérrög roncsolási sebességre kifejtett hatását. Mivel az a2AP-hez kötött antitesttel képzett rögök gyorsabban roncsolódnak, mint az antitest klónozás, vagyis az a2AP-nek keresztkötéssel a fibrinhez történő kapcsolása után történő adagolása esetén. Ennek igazolására, az RWR-rel előinkubált plazmával képzett rögök időtől függő roncsolódását az RWR utólagos adagolása mellett képzett rögökhöz hasonlítjuk (9. ábra).

Frissen fagyasztott plazmát radioaktív jelölésű fibrinogénnel keverünk. A plazmához 25 nmól RWR-t keverünk, és vérrögöt képzünk. Egy másik kísérletben, az RWR-t a már kialakult plazmaröghöz adagoljuk. A rögöket pufferben 4 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül inkubáljuk. Ezután 0,0,1 és 1 egység t-PA-t adagolunk, és 37 °C hőmérsékleten tovább inkubáljuk. A roncsolás mértékét a fent leírt módon határozzuk meg. A 9. ábráról látható, hogy csak kismértékű növekedés figyelhető meg olyan rögök roncsolásában, amelyeket a képződés előtt kezeltük az RWR-rel. Ez alapján feltételezhető, hogy az antiplazmin funkcionálisan kötődik a keresztkötéses fibrinben található Mab-hoz.

A t-PA és RWR kombinációjának a roncsolásra

HU 207 349 Β gyakorolt hatásának vizsgálatához a fent leírt módon ízobolt veszünk fel (Loewe idézett műve és Berenbaum idézett műve). Először meghatározzuk a t-PA és az RWR azonos hatást mutató dózisát. Radioaktív jelölésű plazmarögöket 37 °C hőmérsékleten különböző mennyiségű t-PA-val (0-0,03 egység) vagy RWR-rel (0-500 nmól) inkubálunk. A roncsolás százalékos értékét 48 óra elteltével határozzuk meg (10. ábra). A kontroll rög (hatóanyag nélkül) 9,36 + 0,38%-os roncsolódást mutat. A kísérletben 0,03 egység t-PA és 500 nmól RWR mutat azonos mértékű roncsolást (35,5 + 3,1%, illetve 34,3 + 5,1%).

Ugyanebben a kísérletben vizsgáljuk az RWR és t-PA különböző arányú kombinációit. Az 500 nmól RWR vagy 0,03 egység t-PA hatásával azonos mértékű roncsolást mutató különböző arányú kombinációkat a 11. ábrán X jellel jelöljük. A nagyobb átlagos roncsolást (41,3-100%) mutató kombinációkat kis kőnél jelöljük. Mivel a t-PA és RWR ekvipotenciális kombinációja a két szer önmagában történő alkalmazásának szűk frakciójába esik (vagyis a 11. ábrán folyamatos vonallal jelölt additív hatás értéke alatt helyezkednek el), nyilvánvaló a két anyag között jelentkező erős szinergizmus.

A t-PA és az RWR dózistól függő görbéjével kapcsolatos matematikai feltételezések elkerülése érdekében mindkét hatóanyagnál meg kell határozni az azonos hatást eredményező dózist, vagyis az azonos hatást eredményező hatóanyag mennyiséget. A 7A. ábra a t-PA dózistól függő görbéjét mutatja az RWR-hez hasonlítva. Eszerint azonos hatást mutat 0,03 nemzetközi egység/ml t-PA (l,2xl0“³ nanomól/1) és 500 nanomól/1 RWR.

A vizsgálat következő lépésében különböző arányú RWR és t-PA kombinációknak a vérrög roncsolására gyakorolt hatását mérjük. Az eredményeket izobol görbén ábrázoljuk, amely megmutatja az önmagában és kombinációban alkalmazott két hatóanyag azonos hatást eredményező dózisát. A 7B. ábrán az elméleti izobol görbét mutatjuk. Ha a hatóanyag kombináció azonos hatást mutató dózisa az önmagában alkalmazott két hatóanyagnál mérhető azonos hatást eredményező dózist összekötő egyenesen fekszik, a szerek hatása additív. Ha az azonos hatást eredményező dózis egy olyan konvex görbén helyezkedik el, amelynek távolsága az eredetitől mérve nagyobb, mint az additív egyenestől, a szerek hatása antagonista. Ha azonban a két hatóanyag kombinációja egy olyan konkáv görbén helyezkedik el, amely közelebb van az eredetihez, mint az additív egyeneshez, a szerek hatása szinergetikus.

A vizsgálat során felvett kísérleti izobol görbét a 7C. ábra mutatja. A betöltött körök a t-PA és az RWR önmagában vagy kombinációban alkalmazott dózisát mutatja, amelyek ekvivalens értékű roncsolást eredményeznek (35±1%). A nyílt körök, a szemléltetés kedvéért, az RWR és t-PA kombinációjának azt a dózisát mutatják, amely nagyobb átlagos roncsolást eredményez (41-100%). Az a tény, hogy a két hatóanyag kombinációja ilyen alacsony dózisban azonos vagy nagyobb értékű roncsolást eredményez, mint az önmagában alkalmazott két hatóanyag jóval nagyobb dózisa, arra enged következtetni, hogy az RWR és a t-PA között szinergetikus kölcsönhatás van.

5. példa

A) Plazma rög roncsolása plazminogén aktivátorok segítségével

100 pl rádió jelzésű plazmarögöt állítunk elő a fent leírt módon. A rögöket préseljük és mossuk a meg nem kötött fehérjék eltávolítása érdekében. A rögökhöz csövenként 200 pl frissen fagyasztott plazmát, 75 pl plazminogén aktívátort (0,31-160 nemzetközi egység urokináz, 0,31-120 nemzetközi egység t-PA vagy 0,41100 egység sztreptokináz) és 1,15 nanomól RWR-t adunk trisz-pufferolt sóoldatban (pH=7,4) és az össztérfogatot 325 pl-re töltjük fel. A kontrolihoz trisz-pufferolt sóoldatot alkalmazunk. A csöveket egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 75 pl jéghideg foszfát-pufferolt sóazidot adunk minden csőhöz, amely ml-enként 5000 kallikrein-inhibitor-egység aprotinint tartalmaz, és így megállítjuk a plazminolízist. A felülúszóból vett mintán gamma számlálást végzünk, és ez alapján meghatározzuk a rög roncsolásának százalékos mértékét. A maradék fibrinogén koncentrációt csövenként a nátrium-szulfit módszenei (Rampling és munkatársai: Clin. Chim. Acta 67, 43-52 [1976]) három párhuzamosban haladéktalanul meghatározzuk. A kapott fibrinogén-szint ellenőrzése érdekében a t-PA kísérletben is elvégezzük a mérést a módosított Clauss-módszerrel (Vermylen és munkatársai: Clin. Chim. Acta 8,418-424 [1963]).

A t-PA és az urokináz specifikus aktivitása 4,05xl0~⁵ nanomól/nemzetközi egység és 12,1x1ο^-5 nmól/nemzetközi egység a gyártó cég előírásainak megfelelően elvégzett S-2288 vizsgálat szerint. A sztreptokinázt a gyártó előírásai szerint alkalmazzuk.

B) Az RWR hatása a plazminogén aktivátor potenciájára

Az ct2AP gátlás és az urokináz, sztreptokináz és t-PA hatás közötti összefüggést kvantitatív rög roncsolási vizsgálattal mérjük. Az eredmények szerint az a2AP gátlása mindhárom plazminogén aktivátor hatását jelentős mértékben növeli. A12. ábra a rög roncsoláshoz szükséges aktivátor mennyiséget (logaritmikus skála) mutatja RWR jelenlétében és távollétében. Az 50%-os roncsoláshoz szükséges urokináz mennyiség összehasonlítása azt mutatja, hogy az RWR az urokináz aktivitását mintegy nyolcvanszorosra növeli. A t-PA és a sztreptokináz esetén végzett hasonló összehasonlításból az következik, hogy az aktivátorok hatékonysága mintegy huszonhétszeresére és hússzorosára növekszik.

Az a2AP gátlás és a humán fibrinogén bomlás közötti kölcsönhatás vizsgálatakor abból a feltételezésből indulhatunk ki, hogy a rögképző faktorok, így a fibrinogén nem specifikus proteolízise növeli a vérzés veszélyét a trombolitikus terápia során (Verstraete M. és munkatársai: Blood 67, 1529-1541 [1986]). Az

HU 207 349 Β α2ΑΡ gátlásának a fibrin specifikus bomlására gyakorolt hatásának a fibrinogén nem specifikus bomlásához történő hasonlítása érdekében a fibrinolízis függvényében meghatározzuk a fibrinogén fogyasztás mennyiségét. A 13. ábra az RWR-nek és a három plazminogén aktivátomak (RWR jelenlétében és távollétében) a fibrinogén szintre gyakorolt hatását mutatja. Az önmagában urokinázzal kezelt rögökben a fibrinogén szint a roncsolás függvényében gyorsan csökken (13A. ábra). Ha azonban a rögöt urokinázzal kezeljük, és a fibrinogént megvédjük, gyorsabb roncsolás érhető el. Hasonló, de kevésbé kifejezett fibrinogén védelem látható a t-PA esetén (13B. ábra) még akkor is, ha a fibrinogént ellenőrzés céljából különböző módszerekkel mérjük (Vermylen C. és munkatársai: Clin. Chim. Acta 8,418— 424 [1963]) (az adatok nem szerepelnek). A sztreptokináz esetében is megfigyelhető a fibrinogén fokozott védelme a roncsolás függvényében az RWR antitest jelenlétében (13C. ábra).

6. példa

In vivő trombolízis gyorsítása

A) Anyagok és módszerek

Fehérjék

580000 nemzetközi egység/mg specifikus aktivitású t-PA (Genentech, Dél-San Francisco, CA, USA), Mab RWR (monoklonális RWR) és Mab 40-160 (antidigoxin, kontroll antitest) (Reed G. L. III. és munkatársai: Trans. Am. Assoc. 101, 250-256 [1988]; Mudgett-Hunter M. és munkatársai: Mól. Immunoi. 22,477-488 [1985]), amelyeket ascitesből ammóniumszulfátos kicsapással és DEAE-Affigel Blue oszlopon (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) végzett ioncserés kromatográfiával tisztítunk. Az Mab RWR koncentrációját kompetitív radioimmunoassay vizsgálattal (Mariani és munkatársai: J. Immunoi. Meth. 92, 189-193 [1986]) határozzuk meg, az Mab 40-160 antidigoxin koncentrációját spektrofotometriásán 1,43 értékű extinkciós koefficiens (1 tömeg%-os oldat, 1 cm rétegvastagság) mellett határozzuk meg. Az a2AP-t humán és nyúl plazmából tisztítjuk (Wiman B.: Meth. Enzymol. 80,395-408 [1981]).

In vitro kísérletek

Az antitestkötő vizsgálattal a Mab humán és nyúl a2AP-hez történő kötődését vizsgáljuk. A mikrotiíráló lemez mérőhelyeit 25 pl 10 pg/ml humán vagy nyúl ct2AP-oldattal töltjük meg, és 1 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A mérőhelyeket ezután átöblítjük, és 100 pl 1 tömeg%-os borjúszérum albumin (RIA fokozat) foszfát pufferolt sóoldatban felvett oldatával kezeljük, amely 0,02 tömeg% azidot tartalmaz (PBSA), és így telítjük a nem-specifikus fehérjekötő helyeket. A lemezeket ismét mossuk és szárítjuk. A humán vagy borjú a2AP-t vagy kontrollként csak borjúszérum albumint tartalmazó mérőhelyekhez érett hibridóma tenyészet felülúszóból származó Mab oldatot adunk. 1 órán keresztül inkubáljuk, majd a mérőhelyeket nyolcszor mossuk és szárítjuk. Ezután 25 pl (mintegy 50000 cpm) radioaktív jóddal jelölt kecskeantiegér (Fab’) antitestet (Cappel Laboratories, West Chester, PA, USA) adunk minden mérőhelyhez, és 1 órán keresztül inkubáljuk. Ezután eltávolítjuk a meg nem kötött radioaktív antitestet, és a lemezeket mossuk, és szárítjuk. A mérőhelyeket gamma számlálóval vizsgálva meghatározzuk a kötött antitestek mennyiségét.

Az in vitro rögroncsoló vizsgálatot négy egészséges nyúlból gyűjtött és citráton tárolt frissen fagyasztott nyúlplazmával végezzük. A nyúlplazmát nyomnyi mennyiségű radioaktív jóddal jelölt humán fibrinogénnel (Ibrin, Amersham, Arlington Heights, IL, USA) elegyítjük. 50 pl keveréket (mintegy 15000 cpm) a vizsgálati csőben 50 pl trisz-pufferolt sóoldattal, amely azidot (TBSA) és 30 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz, elegyítjük. A plazmakeveréket 1,5 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubálva gyorsítjuk a rögképződést. A rögöket 1 ml normál sóoldattal mossuk, majd a mosófolyadékot leszívatjuk. Ezután 37,5 pg Mab RWR 50 pl TBSA-ban felvett oldatát vagy csak TBSA-t adagolunk minden csőhöz. A csöveket gamma számlálóval vizsgáljuk és mindegyikhez lOOpl TBSA-t adunk. A kísérlet megindításához különböző mennyiségű (0-10 nemzetközi egység) 100 pl t-PA-t adunk a rögökhöz. 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 250 pl jéghideg TBSA oldatot adunk a csövekhez, amely 100 kallikrein-inhibitoregység/ml mennyiségben aprotinint tartalmaz. Közvetlen ezután 100 pl folyékony felülúszót eltávolítunk, és gamma számlálóval vizsgáljuk. A rög roncsolódás százalékos arányát a folyékony felülúszóban kimutatható cpm és a rögben visszamaradó cpm arányában fejezzük ki.

A fibrinogén szintet a nátrium-szulfit módszerrel (Rampling N. W.: Clin. Chim, Acta 67, 43-52 [1976]) és módosított Clauss módszerrel (Vermylen C. és munkatársai: Clin. Chim. Acta 8, 418-424 [1963]) mérjük. A maradék a2AP aktivitást kromogén szubsztrát módszerrel (Edy J. és munkatársai: Thromb. Rés. 8, 513518 [1976]) Stachrom készlettel (Asniéres, Franciaország) mérjük.

In vivő trombolízis kísérlet

A trombolízist elaltatott nyulakon Colién és munkatársai módszerével (J. Clin. Invest. 71, 368-376 [1983]) vizsgáljuk. A kísérleteket a fent leírt módon (Runge M. S. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7659-7662 [1987]) az alábbi módosításokkal végezzük. A nyaki vénában 30 percen keresztül rögöt képezünk ¹²⁵I-jelölésű fibrinogén, humán plazma és vörös vérsejtek felhasználásával, majd t-PA-t vagy kontrollként sóoldatot adagolunk állandó infúzióval az ellenoldali szélső fül vénán keresztül 1 órán át. Az Mab-vel vagy kontroll Mab-vel (antidigoxin 40-1607) kezelt nyulaknak az antitestet egy adagban (1,4 mg/kg, 1-2 ml) adagoljuk közvetlenül a t-PA vagy kontroll infúzió előtt. 2 órával a t-PA vagy kontroll infúzió befejezése után a nyaki vénát elkötjük, kivágjuk, és gamma számlálóval vizsgáljuk. A százalékos roncsolást az eredeti véna cpm és a végső véna cpm arányában fejezzük ki (Collen D. és munkatársai: J. Clin.

HU 207 349 Β

Invest. 71,368-376 [1983]); Runge M. S. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA 84,7659-7662 [1987]). A hatóanyagok adagolása előtt és a vizsgálat befejezése után 1 ml-es vérmintákat gyűjtünk. A mintákat 0,38 tömeg%-os nátrium-citráton és 10,4 pg/ml koncentrációjú P-PACK elegyen (Sigma, St. Louis, MO, USA) összegyűjtjük, azonnal centrifugáljuk, és a fibrinogén és (X2AP vizsgálatáig -80 °C hőmérsékleten fagyasztjuk.

Az in vivő kísérleteket végig ugyanaz a személy végzi, aki nem ismeri az antitest és/vagy a t-PA dózisát. A fenti előírás szerint 40 trombolízis kísérletet végeztünk, ebből 13 használhatatlan (8 a sikertelen véna vagy rög preparáció miatt, 4 a hatóanyag sikertelen infúziója miatt és 1 a kísérleti állat mozgása miatt), a fennmaradó 27 vizsgálat eredményét analizálva kiértékeljük az eredményeket. A sorozatok befejezése után két további kontrolikísérletet végeztünk, amelynek során a nyulaknak inért antidigoxin antitestet (Mab 40160) adunk.

A kiértékeléskor az átlag értéket és a standard szórást adjuk meg, amikor is az átlag érték megállapításához két párhuzamost használunk.

B) Vizsgálati eredmények

Az Mab RWR-t a humán a2AP-hez történő kötődési képessége alapján szelektáljuk, amit radioimmunoassay vizsgálattal határozunk meg. A 14. ábrán összehasonlítjuk a Mab RWR-nek a humán és nyúl a2AP és a kontroll esetében mért kötődését. Az eredményekből látható, hogy koncentrációtól függő kötődés mutatható ki a humán <x2AP esetében, de nincs szignifikáns kötődés a nyúl a2AP esetében.

Mivel az Mab RWR önmagában nem kötődik megfelelő módon a tisztított nyúlmintához, vizsgáltuk, hogy az Mab RWR kötődik-e és gátolja-e a keresztkötéssel a fibrinhez vagy a röghöz kötött nyúl a2AP-t, amelyhez in vitro nyúl plazma rög roncsolási vizsgálatot végeztünk. A korábbi vizsgálatok szerint az RWR a humán a2AP-hez kötődve és azt gátolva jelentős mértékben gyorsítja a humán plazma rögök t-PA-val történő roncsolódását (20-30-szoros gyorsítás) (Reed G. L. és munkatársai: J. Am. Coll. Cardiol. 73(2):2A [1989]). A nyúlplazmával végzett hasonló kísérletben (15. ábra) az RWR annak ellenére nem gyorsítja a nyúl plazma rögök t-PA-val történő roncsolását, hogy a nyúl a2APhez viszonyítva moláris feleslegben van jelen. Emiatt a radioimmunoassay és rög roncsoló vizsgálatok nem igazolják a nyúl a2AP jelentős megkötését vagy gátlását.

Mivel az Mab RWR kötődik és gátolja a humán a2AP-t, de nem kötődik és nem gátolja a nyúl a2APt, egy kísérleti modellt állítunk össze annak igazolására, hogy a vérröghöz kötött <x2AP gátlása gyorsítja az in vivő trombolízist. Rádió jelölésű humán rögöket képzünk nyúl nyaki vénában, és így összehasonlítjuk a kontroll (sóoldat vagy inért kontroll antitest), a t-PA, az RWR és a t-PA/RWR kombináció trombolítikus hatását. Mivel az Mab RWR csak a humán a2AP-t gátolja, az antitest trombolitikus hatása csak a röghöz kötött (vagyis humán) a2AP gátlásán keresztül nyilvánul meg. A 16. ábra az önmagában tPA-val vagy t-PA/Mab RWR kombinációval kezelt nyálban kimutatható százalékos roncsolást mutatja. Az RWR-rel és t-PA-val kezelt nyulakban lényegesen nagyobb roncsolás mutatható ki, mint az ekvivalens dózisú t-PA-val önmagában kezelt nyulakban (p < 0,05). A t-PA önmagában felvett dózis/válasz görbéjével összehasonlítva az RWR/t-PA kombináció dózis/válasz görbéje balra és felfelé eltolódik, ami azt jelenti, hogy a t-PA trombolitikus potenciája két-háromszorosára nőtt.

A 17. ábrán a sóoldattal, kontroll antitesttel (antidigoxin) és önmagában vizsgált nyálban mérhető roncsolás mértékét hasonlítjuk össze. A sóoldattal kezelt nyúlban az átlagos roncsolás 16,1+3,1%. A kontroll Mab-vel kezelt nyúlban az átlagos roncsolás 10,3±3,8%. Az RWR-rel önmagában (t-PA nélkül) kezelt nyúlban az átlagos roncsolás 25,9+2,8%, ami lényegesen nagyobb a sóoldattal vagy kontroll antitesttel kezelt állatnál mérhető értéknél (p < 0,05). Ez azt jelenti, hogy az exogén (adagolt) t-PA trombolitikus hatása mellett megnőtt a nyúl endogén plazminogén aktivátorának trombolízise is.

Annak meghatározásához, hogy az a2AP rög specifikus gátlása befolyásolja-e a t-PA fibrin szelektivitását, mérjük az RWR és t-PA kombináció, valamint a t-PA adagolása esetén megfigyelhető maradék fibrinogén szintet (18A. és B. ábra). A rög roncsolás függvényében a fibrinogén szint lényegében változatlan maradt mind a kombináció, mind az egyedüli hatóanyag alkalmazása esetén. Ugyanígy nem mutatható ki lényeges különbség a maradék a2AP szint esetén (19. ábra), ami igazolja azt a korábbi eredményt, hogy az Mab RWR nem gyakorol mérhető gátló hatást a nyúl a2APre (15. ábra).

7. példa

Monoklonális RWR antitest kötődése a fibrinhez kötött a2-antiplazminhoz

A) Anyagok és módszerek

Rádió jelölésű (¹²⁵I) fibrinogént adunk humán szérumhoz amely I pmól/l antiplazmint tartalmaz. Ezután trombint, kalcium-kloridot és XIII faktort adunk az elegyhez a ¹²⁵I fibrin és az antiplazmin közötti keresztkötés kialakításához. Az elegyen, amely mintegy 1 pmól/l szabad antiplazmint, és mintegy 1 nanomól/1 ¹²⁵I fibrinhez kötött antiplazmint tartalmaz, immunoprecipitatív kísérletet végzünk a keresztkötéssel a fibrinhez kötött antiplazminra specifikus különböző antitestek és kontroll inért antitest (antidigoxin) adagolásával. A specifikusan kötött ¹²⁵I fibrin antiplazmin mennyiségét gamma szcintillációs számlálással a kontroll antitesttel meghatározott háttér vagy nem specifikus érték figyelembevételével határozzuk meg.

B) Eredmények és értékelés

A kontroll antitesttel és a keresztkötéssel a fibrinhez kötött antiplazminra specifikus egyéb antitestekkel

HU 207 349 B összehasonlítva az RWR mutatja a legnagyobb kötődést a ¹²⁵I fibrinogénhez kötött antiplazminnal (20. ábra).

Megjegyezzük, hogy a szérumban található szabad antiplazmin koncentrációja legalább ezerszerese a fibrinnel keresztkötést képzett antiplazmin koncentrációjának. Ez azt jelenti, hogy az RWR specifikusan kötődik a keresztkötéssel a fibrinhez kapcsolt antiplazminhoz, annak ellenére, hogy nagy mennyiségű oldható antiplazmin található az elegyben.

Kimutattuk továbbá, hogy az RWR hatékonyabban gátolja a fibrinhez vagy a röghöz kötött antiplazmint. A humán plazma vizsgálata során kimutattuk, hogy az antiplazminnak mintegy 20%-a keresztkötést képez a fibrinnel. A 21. ábrán az RWR-nek az urokinázos fibrinogenolízisre, illetve fibrinolízisre gyakorolt hatását hasonlítjuk össze. 100 pl normál humán plazmában vagy 100 μΐ megakasztott humán plazmában lévő különböző mennyiségű urokinázhoz RWR-t vagy puffért adunk. Ezután dózis/válasz görbét veszünk fel úgy, hogy összehasonlítjuk az RWR-nek az urokinázos fibrinolízisre (rögök), illetve fibrinogenolízisre (plazma) gyakorolt hatását. A kontroll rögökhöz viszonyítva az RWR mintegy kilencszeresére növeli a fibrinolízist. Ez azt jelenti, hogy az antitest kétszer olyan hatékony a rög roncsolás növelésében, mint a fibrinogenolízis kiváltásában.

A roncsolásban kimutatható fenti különbség annak az eredménye, hogy az antitest hatékonyabban gátolja a fibrinhez kötött (vérröghöz kötött) antiplazmint, mint a plazmában található oldott antiplazmint.

Megjegyezzük, hogy a fibrinhez kötött antiplazmin a vizsgált mintában található ossz antiplazminnak mintegy 20%-át teszi ki, és így az antitest a röghöz kötött antiplazmint közel tízszer olyan hatékonyan gátolja, mint a fibrinhez nem kötött antiplazmint. A röghöz kötött antiplazmin vonatkozásában hasonló specifikus gátlás mutatható ki a sztreptokinázt és szövetplazminogén aktivátort alkalmazó hasonló kísérletben (Proc. Natl. Acad. Sci. 87,1117-1118 [1990]).

A fenti ismertetés a találmány teljes körű leírását tartalmazza, de szakember számára nyilvánvaló, hogy ugyanez a találmány készítmények, körülmények és adagolási módok paramétereinek széles határain belül megvalósítható anélkül, hogy eltérnénk a találmány lényegétől.

Az ábrák ismertetése:

Az 1. ábra az antiplazmin (a2AP) RWR-rel történő gátlását mutatja S2251 tesztben. Az a2AP-t (végső koncentráció 20 nanomól/1) különböző mennyiségű RWR-rel és S2251-gyel (végső koncentráció 0,3 mmól/1) keverjük 2 órán keresztül 25 °C hőmérsékleten. Ezután plazmint (végső koncentráció 100 nanomól/1) adunk hozzá, és a maradék <*2AP százalékos mennyiségét 14 nanomól/1 antitest koncentráció mellett vizsgáljuk.

A 2. ábra az antiplazmin százalékos gátlását ismerteti az RWR koncentrációjának függvényében.

A 3. ábra a vérrög plazminnal végzett százalékos roncsolását ismerteti az RWR koncentrációjának függvényében.

A 4. ábra az RWR kötődését mutatja a keresztkötéssel a fibrinhez kötött a2AP-hez plazma rög vizsgálatban. A mosott plazma rögöket különböző mennyiségű RWR-rel (telített kör) vagy kontroll antidigoxin antitesttel (nyílt körök), amelynek izotípusa azonos, inkubáljuk. Mosás után a röghöz kötött monoklonális antitestet ^12SI jelölésű GAMFab segítségével detektáljuk. A mérési eredmények három párhuzamos átlagát jelölik.

Az 5. ábra a rög endogén roncsolásának javítását mutatja monoklonális RWR antitest segítségével. A plazmában nyomnyi mennyiségű ¹²⁵I jelölésű fibrinogénnel rögöt képzünk, majd a rögöket RWR-rel (pontozott oszlop) vagy kontroll antidigoxin 40-160 antitesttel (nyílt oszlop) inkubáljuk. A megadott időben meghatározzuk a rög százalékos roncsolását. Az átlagértéket és a szórást négy párhuzamos alapján számoljuk.

A 6. ábra a plazma rög t-PA és monoklonális RWR antitest vagy kontroll antitest segítségével végzett roncsolását mutatja. A rögöket 250 nmól/1 RWR (nyílt kör), kontroll antitest (nyitott négyzet) (ez a két görbe átfedést mutat) vagy 250 nmól/1 RWR-rel és 5 nemzetközi egység t-PA-val (telített körök) vagy kontroll antitesttel és 5 nemzetközi egység t-PA-val (feltöltött négyzet) inkubáljuk. A megadott időben a rög százalékos roncsolását meghatározzuk. Az átlagot és a szórást három párhuzamosból számoljuk.

A 7. ábra a t-PA és az RWR szinergetikus hatását mutatja a plazma rög roncsolásra. A t-PA és RWR kombinációjának a roncsolásra gyakorolt hatása vizsgálatához izobol görbét veszünk fel (Loewe S.: Pharmacol. Rév. 9, 237-242 [1957]; Berenbaum M. C.: Adv. Cancer Rés. 35, 269-335 [1981]; Berenbaum M. C.: J. Theor. Bioi. 114, 413-431 [1985]).

(A) Először meghatározzuk a t-PA és RWR azonos hatást eredményező dózisát. Ebben a vizsgálatban 0,03 nemzetközi egység/ml (l,2xl0“³ mmól/1) t-PA (nyílt kör) és 500 nmól/1 RWR (telített kör) eredményez azonos mértékű roncsolást (35,5±3,1% és 34,3±5,1% három párhuzamos alapján).

(B) A belső ábra elméleti izobol görbét mutat (Berenbaum M. C.: J. Theor. Bioi. 114, 413-431 [1985]), amely a szinergetikus, additív és antagonista hatást reprezentálja. A (C) ábra a kísérleti izobol görbe a t-PA és az RWR rög roncsolásban kifejtett kölcsönhatását mutatja. A feltöltött körök az RWR és t-PA kombinációt mutatja, amelyek a hatóanyagokkal önmagában elérhető roncsolással azonos átlagos roncsolást eredményez. A nyílt körök azokat a kombinációkat mutatják, amelyek hatékonyabb roncsolást (40-100%) eredményeznek. Az önmagában alkalmazott hatóanyagokkal összehasonlítva az RWR és a t-PA kombinációja erős szinergetikus hatást mutat.

A 8. ábra a vérrög t-PA-val végzett százalékos roncsolását ismerteti az RWR koncentrációjának és az időnek a függvényében.

A 9. ábra a vérrög százalékos róncsolását ismerteti,

HU 207 349 Β ahol a rögképződés előtt vagy után RWR-t adagolunk, a t-PA koncentrációjának és az időnek a függvényében.

A10. ábra a t-PA és az RWR azonos hatást eredményező dózisait mutatja.

A 27. ábra az RWR és t-PA kombinációjának a plazma vérrög roncsolásra kifejtett hatását bemutató izobologram.

A12. ábra a monoklonális RWR antitestnek a plazminogén aktivátor potenciájára kifejtett hatását mutatja a plazma vérrög roncsolása során. A radioaktív jelölésű plazma vénögöket különböző mennyiségű urokinázt (háromszög), t-PA-t (négyszög) vagy sztreptokinázt (kör) tartalmazó plazmában szuszpendáljuk monoklonális RWR antitest jelenlétében (feltöltött jelek) vagy távollétében (nyílt jelek). Az ábra az átlagértéket és a szórást mutatja.

A13. ábra a maradék fibrinogén koncentrációt mutatja a plazma vérrög roncsolásának függvényében az a2AP RWR-rel történő gátlásával együtt vagy nélkül. A plazma vérrög roncsolás vizsgálatát a 12. ábra ismertetésénél leírt módon különböző mennyiségű urokinázzal (háromszög, A görbe), t-PA-val (négyszög, B görbe) vagy sztreptokinázzal (kör, C görbe) végezzük monoklonális RWR antitest jelenlétében (feltöltött jelek) vagy távollétében (nyílt jelek). Egy óra elteltével a maradék fibrinogén koncentrációt nátrium-szulfit kicsapásos módszerrel (Rampling M. W. és munkatársai: Clin. Chim. Acta 67, 43-52 [1976]) három párhuzamosban mérjük. Ábrázoljuk az átlagértéket és a szórást.

A14. ábra az Mab RWR és a humán és nyúl a2AP közötti kötődést mutatja. Az Mab RWR és a humán a2AP (feltöltött kör) nyúl a2AP (nyílt kör) és kontroll borjú albumin (négyzet) közötti kötést szilárd fázisú radioimmunoassay vizsgálattal mérjük. A kontroll Mab-vel összehasonlítva az RWR specifikusan humán a2AP-hez kötődik, de nem kötődik a nyúl a2AP-hez. A megadott értékek három párhuzamos átlagértékét (és szórását) mutatják.

A 75. ábra az Mab RWR hatását mutatja a t-PA-val végzett in vitro nyúl vérrög roncsolásban. Az összegyűjtött és frissen fagyasztott nyúl plazmát ¹²⁵I-fibrinogénnel jelöljük és vérrögöket képzünk. Különböző mennyiségű t-PA-t (0,123-10 nemzetközi egység) adunk a rögökhöz, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A százalékos roncsolást az Mab RWR jelenlétében (feltöltött kör) és távollétében (nyílt kör) inkubált rögökhöz viszonyítjuk. A megadott adatok a három párhuzamosból kapott átlagot és szórást mutatják.

A16. ábra a t-PA és Mab RWR segítségével végzett in vivő tronbolízist mutatja. Az ábrán a t-PA önmagában történő adagolásával (nyílt kör) és a t-PA/Mab RWR kombináció adagolásával (feltöltött kör) kapott dózis/válasz görbét adjuk meg. Zárójelben a kísérleti állatok száma szerepel. Az azonos dózisú t-PA-val kezelt nyulakhoz viszonyítva a t-PA/RWR kombinációjával kezelt nyulak lényegesen jobb vérrög roncsolást mutatnak (p < 0,05). A megadott adatok átlagértéket és szórást jelentenek.

A 17. ábra az Mab RWR segítségével végzett in vivő trombolízist mutatja. A vérrög roncsolás mértékét (átlag és szórás) kontrollként sóoldattal és inért monoklonális antitest kontrollal, valamint Mab RWR-rel kezelt nyulaknál mutatja. A kontrolihoz viszonyítva az Mab RWR lényegesen jobb roncsolást eredményez (p < 0,05). Nincs lényeges különbség (p=0,32) a kontroll Mab-vel elért és a sóoldattal elért roncsolás között

A 18. ábra a t-PA és az Mab RWR fibrinogén fogyasztását mutatja. A maradék fibrinogén szintet a szulfit kicsapásos módszerrel (A) vagy a módosított Clauss-módszerrel (B) határozzuk meg. A görbék az átlagértéket és a szórást mutatják t-PA (nyílt kör), valamint Mab RWR/t-PA kombináció (feltöltött kör) esetén.

A 29. ábra a t-PA és az Mab-RWR hatását mutatja a nyúl a2AP fogyasztásra. Az átlagos maradék a2ÁP szintet t-PA (nyílt kör) és t-PA/Mab RWR kombináció (feltöltött kör) adagolása esetén adjuk meg.

A 20. ábra a ¹²⁵I-fibrin a2-antiplazmint megkötő képességét mutatja felesleges mennyiségű szabad a2antiplazmin jelenlétében.

A 21. ábra a monoklonális RWR antitest fibrinogenolízisre gyakorolt viszonylagos hatását mutatja a fibrinolízissel összehasonlítva urokináz jelenlétében.

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás miokardiális infarktus kezelésére vagy vérrög szervezeten belüli elroncsolására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy specifikus keresztkötéssel a fibrinhez vagy a vérröghöz kötött a2-antiplazminra specifikus antitestet vagy ennek egy fragmensét és adott esetben valamely trombolitikus szert, ahol az antitest vagy annak fragmense és a trombolitikus szer tömegaránya 30-0,05:1, gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverünk össze és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy trombolitikus szerként 0,5-1,0 mg mennyiségben sztreptokinázt, prourokinázt, urokinázt vagy szövet típusú plazminogén aktivátort alkalmazunk,
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezye, hogy a keveréket 75-14400 gg hatóanyagot tartalmazó folyamatos intravénás infúzióvá alakítjuk.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keveréket 75-14400 gg intravénás injekciós készítménnyé alakítjuk.