JP2002515447A - 抑制されない血管内フィブリンクロット形成の予防および治療のための組成物および方法 - Google Patents

抑制されない血管内フィブリンクロット形成の予防および治療のための組成物および方法

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アブド アル−ルーフ ヒガジ，
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ダグラス サインズ，
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Abstract

(57)【要約】 抑制されない血管内フィブリンクロットの予防および治療のための、線維素溶解性または抗凝血性薬剤が赤血球キャリアに対して生物適合的に結合されていることを特徴とする組成物および方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 血管内クロットによる血管閉塞は、心筋梗塞、卒中、および肺動脈塞栓症を含
む種々の病状を引き起こすかまたは／およびその病理発生に寄与しており、従っ
て重要な医学上の問題の一つを代表するものである。これらの病気または状態の
治療においては、プラスミノーゲンアクチベーター等の線維素溶解薬が最近使用
されているが、それらの有効性および安全性は、特に深静脈血栓症および肺動脈
塞栓症等の、特異的なプロトロンビンの状態下では、なお大いに関心が持たれて
いる。
【０００２】 肺動脈血栓塞栓症は主な死因の一つであり、最もしばしば深静脈血栓症の合併
症である。統計学は肺動脈血栓症の９５％より多くが、下肢の深静脈の血栓の結
果として生ずることを示している。医学の進歩にもかかわらず、塞栓症および深
静脈血栓症の発生率および／または認知は増加しているようである。この増加は
、損傷患者のより高い生存と、関節置換のための整形外科手術の増加と、さらに
留置カテーテルの広範囲な使用、ならびに特に老年の患者における医学的および
外科手術的手技における全体的な増加に帰されてきた。結果として、肺動脈塞栓
症の発生率を減じるためには、深静脈血栓症の予防および治療法が必要である。
【０００３】 深静脈血栓症を促進する因子は早くも１９世紀に定義されており、鬱血、血管
壁の異常、および血液凝固システムの変化を含む。 深静脈血栓症の最も危険性の高いグループは、３０分間またはそれ以上の全身
麻酔を必要とする外科手術患者、分娩後の患者、左右の心室不全のある患者、下
肢を含めて骨折または損傷をもつ患者、脚部に慢性深静脈機能不全のある患者、
長期間ベッドで療養している患者、癌患者、肥満の人、およびエストロゲンを使
用している患者である。深静脈血栓症の治療は、ヘパリン等の抗凝血剤の使用を
最もよく含む。しかしながら、この周知の薬剤を以てしても、安全性と有効性の
両者を与える抗凝血剤治療の最適領域に関しての一致はまだない。抗凝血剤治療
に加えて、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ等の血栓溶解薬が、急性の深
静脈血栓症の管理に用いられてきた。
【０００４】 ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベー
ターまたはｔＰＡ、およびウロキナーゼは、プラスミノーゲンアクチベーターと
して知られる一群の薬剤のなかまである。これらの化合物は、フィブリンを消化
するプロテアーゼであるプラスミンを活性化することにより、血管内クロットを
溶解する。プラスミンの不活性先駆物質であるプラスミノーゲンは、一つのペプ
チド結合の切断によりプラスミンに変わる。プラスミン自体は非特異的なプロテ
アーゼであり、フィブリンクロットならびに、いくつかの凝固因子を含む他の血
漿タンパク質を消化する。
【０００５】 心筋梗塞および卒中の治療においては、プラスミノーゲンアクチベーターを用
いる線溶療法が有用であることが示されている。しかしながらこれらの薬剤を、
深静脈領域等の他の血管領域において形成されるかまたは位置するクロットの溶
解に適用することは、ボーラス投与後の極めて迅速な消失および不活性化により
制限される（Plow, E. 等、1995. FASEB J. 9 : 939 - 945 ; Narita, M. 等
、1995. J. Clin. Invest. 96 : 1164 - 1168）。ｔＰＡおよびウロキナーゼは
共に、循環しているプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターにより迅速な
不活性化を受け、プラスミン自体は、循環している糖タンパク質であるα−２ア
ンチプラスミンにより不活性化される（Collen, D. 1996. Circulation 93 : 85
7 - 865 ; Reilly, C. 等、1991. Arterioscl. Thromb. 11 : 1276 - 1286 )。
α−２−アンチプラスミンはスタフィロキナーゼを不活性化するが、一方ストレ
プトキナーゼはこの内在性の糖タンパク質インヒビターに対してより抵抗性があ
る（Collen, B. 等、1993. Eur. J. Biochem. 216 : 307 - 314）。プラスミノ
ーゲンアクチベーターの治療用線量は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビターならびにα−２−アンチプラスミンの潜在的な阻害活性を圧倒することが
可能ではあるが、他のプラスミノーゲンアクチベーターのインヒビターも存在し
（Ｃ１−インヒビター、α−２−マクログロブリン、アンチトリプシン）、プラ
スミノーゲンアクチベーターを用いた治療にあたり、血栓溶解反応を通じて経時
的にその減少に寄与している（Collen, D. 1996. Circulation 93 : 857 - 865
）。かかる不活性化、またはプラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミン
の分解は、線溶療法の有効性を減少させ、従って血管の再閉塞の予防に失敗する
。
【０００６】 この問題を克服するべく、プラスミノーゲンアクチベーターを静脈内に長期間
にわたって注入することが試みられたが、ほとんど成功していない；失敗は、プ
ラスミノーゲンアクチベーターの血管外沈着の後に起こりやすい、出血および抑
制されない組織タンパク質分解等の、有害な副作用に帰された。
【０００７】 そこで、深静脈血栓症におけるこれらの薬剤の有効性を改良するべく、プラス
ミノーゲンアクチベーターの血中の半減期の延長、インヒビターによる不活性化
からのプラスミノーゲンアクチベーターの防御、プラスミノーゲンアクチベータ
ーのフィブリンおよびthrombiへのターゲッチング、を含むいくつかの異なるア
プローチが試みられた。たとえば、化学修飾およびリポソームへのプラスミノー
ゲンアクチベーターの取り込みが、循環におけるプラスミノーゲンアクチベータ
ーの半減期を延長させるべく用いられた（Kajihara, J. 等、1994. Biochim. Bi
ophys. Acta 1199 : 202 - 208 ; Heeremans, J. 等、1995. Thromb. Haemost.
73 : 488 - 494）。しかしながらこれらの研究は、リポソームに封入されたプラ
スミノーゲンアクチベーターの活性が、立体制限により強度に弱められることを
示した。また、改変された薬物動態学的性質と、インヒビターに対する増強され
た抵抗性と、より高い線維素溶解能とを有する遺伝学的に設計されたｔＰＡ化合
物も産生された（Collen, D. 1996. Circulation 93 : 857 - 865 ; Collen, D.
1993. Lancet 342 : 34 - 36 ; Krishnamurti, C. 等、1996. Blood 87 : 14 -
19 ; Lijnen, R. およびD. Collen. 1992. Ann. NY Acad. Sci. 667 : 357 - 3
64）。いくつかの研究室は、プラスミン産生をクロットに局在化させるべく、フ
ィブリンまたは活性化された血小板を認識する抗体を用いてプラスミノーゲンア
クチベーターの結合を探究してきた（Halvoet, P.等、1993. Circulation 87 :
1007 - 1016 ; Runge, M. 等、1996. Circulation 94 : 1412 - 1422 ; Fears,
R.およびG. Poste. 1994. Fibrinolysis 8 : 203 - 213）。しかしながら、クロ
ット成分に対する親和性をもつかかる結合されたプラスミノーゲンアクチベータ
ーは、クロットの表層にのみ結合し、クロット内部に侵入しない（Sakharov, D.
およびD. Rijken. 1995. Circulation 92 : 1883 - 1890）。さらに、形成され
たクロットの限られた表面積が故に、クロットは注入された「フィブリンに特異
的な」プラスミノーゲンアクチベーターのごく一部としか結合しない。
【０００８】 さらに、現在までのところ、これらのプラスミノーゲンアクチベーター修飾法
は、いずれもプラスミノーゲンアクチベーターの組織における沈着を予防せず、
このことが有害な副作用の増加に導く可能性がある；それらはすべて血液タンパ
ク質の大きさを超えない大きさをもつ分子または分子複合体を表わす。かかる沈
着は、組織におけるプラスミンの活性化に導く。活性化されたプラスミンは細胞
外マトリックスを分解し、従って血管のリモデリング、異常な血管透過性の上昇
、および内皮下層の部分的な露出までも引き起こす（Plow等、1995. FASEB J. 9
: 939 - 945 ; Shreiber等、1995. J. Cell. Physiol. 165 : 107 - 118）。 従って、プラスミノーゲンアクチベーターの除去および分解の速度を減じるだ
けでなく、組織におけるプラスミノーゲンアクチベーターの沈着を予防するプラ
スミノーゲンアクチベーターの修飾法が必要である。
【０００９】 赤血球（ＲＢＣ）は、通常１２０日間の寿命を持ち、それゆえ薬物および生体
分子についての天然のキャリアとして役立つことが可能である。自己のＲＢＣは
患者の血液から容易に取得可能であり、薬剤が負荷され、そして再注入される。
ＲＢＣは、ＲＢＣの内部容積に負荷された薬剤のへの担体として用いられてきた
（Poznansky, Mおよび R. Juliano. 1984. Pharmacol. Rev. 36 : 277 - 324 ;
Kirch, M. 等、1994. Biotechnol. App. Biochem. 19 : 331 - 363 ; Kinoshit
a, K. およびT. Tsong. 1978. Nature 272 : 258 - 260）。さらに、ストレプト
アビジン−ビオチンペアをクロスリンカーとして 用いる方法を含め、ＲＢＣへ
のタンパク質の結合法が開発された。
【００１０】 ストレプトアビジンは６０ｋＤａのタンパク質であり、４つの高親和性ビオチ
ン結合部位を有しており、またストレプトアビジン−ビオチン対は架橋結合剤と
して生物医学において広く用いられている（Wilchek, M.およびE. Bayer. 1988.
Anal. Biochem. 171 ; 1 - 32）。いくつかのグループは、ストレプトアビジン
−ビオチン技術のインヴィヴォにおける適用を、ガンマイムノシンチグラフィー
について（Kalofonos, H. 等、1990. J. Nucl. Med. 31 : 1791 - 1796）、また
薬剤ターゲッチングについて（Pardridge, W. 等、1995. Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 92 : 5592 - 5596 ; Muzykantov, V. 等、1996. Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 93 : 5213 - 5218）報告した。さらに、ストレプトアビジンは動物または
ヒトにおいて何ら既知の有害反応を誘導しない（Kalofonos, H. 等、1990. J. N
ucl. Med. 31 : 1791 - 1796）。ＲＢＣのビオチニル化は、動物におけるこれら
の細胞のインヴィヴォでの寿命および生物適合性に何ら影響をもたない方法で行
なうことができる（Suzuki, T. およびG. Dale. 1987. Blood 70 : 791 - 1795
; Muzykantov, V. 等、1991. Blood 78 : 2611 - 2618）。
【００１１】 プラスミノーゲンアクチベーターを含め、プラスミノーゲンアクチベーターの
機能活性を有意に減じることのない、タンパク質のビオチニル化が報告されてい
る（Muzykantov, V. 等、1986. Biochem. Biophys. Acta, 884 : 355 - 363 ; M
uzykantov, V. 等、1995. Anal. Biochem. , 226 : 279 - 287 ; Muzykantov, V
. 等、1996. J. Pharm. Exp. Ther. , 279 : 1026 - 1043。インヴィトロの研究
では、抗体、酵素ペルオキシダーゼ、およびフィブリン溶解性ストレプトキナー
ゼ等の種々のビオチニル化されたタンパク質と、ストレプトアビジンを結合され
たビオチニル化したＲＢＣとの多価結合(ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ）が行なわれ、イン
ヴィトロにおいてＳＡ／ｂ−ＲＢＣに結合するこれらのタンパク質の高度に機能
的な活性が報告された（Muzykantov, V. 等、1985. FEBS Lett. 182 : 62 - 66
; Muzykantov, V. 等、1986. Biochim. Biophys. Acta 884 : 355 - 363 ; Muzy
kantov, V. 等、1987. Am. J. Pathol. 128 : 226 - 234）。
【００１２】 しかしながら、ビオチニル化されたタンパク質の、 ｂ−ＲＢＣに対するスト
レプトアビジンクロスリンカーを介する多価結合は、キャリアＲＢＣの生物適合
性を大いに悪化させる。ｂ−ＲＢＣに対するストレプトアビジンの結合は、補体
の古典および第二経路の両者の同種拘束の排除に導き、それにより血漿内でのＳ
Ａ／ｂ−ＲＢＣの溶解を引き起こす（Muzykantov, V. 等、1991. Blood 78 : 26
11 - 2618 ; Muzykantov, V. 等、1992. Int. J. Artif. Organs 15 : 620 - 62
7 ; Muzykantov, V. 等、1993. FESE Lett. 318 : 108 - 112）。ストレプトア
ビジンに誘導される架橋結合と、ビオチニル化されたＲＢＣ膜における補体抑制
因子、ＤＡＦおよびＣＤ５９の膜再分布とは、補体の活性化および溶解の最もあ
りそうなメカニズムを表わしている（Muzykantov, V. 等、1992. Biochem. Biop
hys. Acta, 1107 : 119 - 125 ; Zaltman, A. 等、1995. Biochem. J. 305 : 65
1 - 656）。さらに、Ｃ３ｂ補体成分の固定が、肝臓および脾臓の取り込みを介
した、血流からのＳＡ／ｂ−ＲＢＣの排除の速度の増加に導くことが示された（
Muzykantov, V. 等、1992. Int. J. Artif. Organs 15 : 620 - 627 ; Muzykant
ov, V. 等、1996. Anal. Biochem. 214 : 109 - 119）。
【００１３】 従って、ストレプトアビジンを介してＲＢＣキャリアに多価に結合された薬剤
は、インヴィヴォではそれらのターゲットにデリバーされることはあり得ない。
ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアの、この生物適合性の欠如は、結合法の修正によって
克服されることが可能である。たとえば、ＲＢＣ当りビオチニル化されたモデル
タンパク質１０５個までの分子と結合可能な、血清に安定性のあるキャリアＳＡ
／ｂ−ＲＢＣを産生するべく、ｂ−ＲＢＣへのストレプトアビジンの１価性の結
合が証明された（Muzykantov, V. 等、1991. Biochem. J. 273 : 393 - 397 ; M
uzykantov, V. 等、1992. Biochim. Biophys. Acta 1107 : 119 - 125; Muzykan
tov, V. 等、1993. Anal. Biochem. 208 : 338 - 342 ; Muzykantov, V. および
R. Taylor. 1994. Anal. Biochem. 223 : 142 - 148 ; Muzykantov, V. 等、199
6. Anal. Biochem. 214 : 109 - 119;）。ストレプトアビジンを介して、ビオ
チニル化されたモデルタンパク質（ｂ−ＩｇＧ）と1価性に結合されたｂ−ＲＢ
Ｃキャリアは、動物における静脈注射の後、少なくとも１日は安定な複合体とし
て循環し、溶解または肝臓による摂取の証拠はなかった（Muzykantov, V. 等、1
996. Anal. Biochem. 214 : 109 - 119）。また、これらの研究において、ＳＡ
／ｂ−ＲＢＣと１価性に結合されたｂ−ＩｇＧの半減期は、未結合 ｂ−ＩｇＧ
のそれを有意に上回ることも発見された（ Muzykantov, V. 等、1996. Anal. Bi
ochem. 214 : 109 - 119）。
【００１４】 ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリアに対するビオチニル化されたプラスミノーゲンアク
チベーターの１価性の結合が、血流中のプラスミノーゲンアクチベーターの循環
の延長と、組織におけるプラスミノーゲンアクチベーターの沈着の減少という結
果に終わることが、現在では証明されている。また、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣキャリア
に対しての、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター用のビオチニル化さ
れた可溶性リセプター（ｂ−ｓｕＰＡｒ）の１価性の結合と、ビオチニル化され
た組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の１価性の結合とは、これら
のビオチニル化されたプラスミノーゲンアクチベーターの血流における循環が、
リセプター／ＲＢＣ複合体（ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体）、およ
びｔＰＡ／ＲＢＣ複合体の形で各々延長される結果に終わることも、現在発見さ
れている。さらに、 ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体が、血流中にお
ける延長された循環の後においても、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｓｃｕＰＡ）との結合能を保持していること、およびＲＢＣキャリア
に結合されたリセプターに対するこの線維素溶解性先駆物質（ｓｃｕＰＡ）の非
共有結合が、ｓｃｕＰＡの活性化および血漿インヒビターに対するより大きい抵
抗性に導き、従ってクロット自体に対する亢進された線維素溶解活性を提供する
ことが現在発見されている。また、ｔＰＡ／ＲＢＣを形成するべく、ｔＰＡをビ
オチニル化されたＲＢＣに対して架橋結合することにより、肺の血管によるｔＰ
Ａの摂取が増加し、より大きい血管におけるｔＰＡ／ＲＢＣ複合体のレベルを上
回るレベルまで、その増加が見られることも発見された。従って、本発明はキャ
リアである赤血球細胞の分子に生物適合的に結合された線維素溶解性または抗凝
血性薬剤を含む組成物と、これらの組成物を深静脈血栓症を含む抑制されない血
管内クロット形成の治療に用いる方法とに関する。
【００１５】 （発明の概要） 本発明の目的は、赤血球細胞キャリアの表面に生物適合的に結合された線維素
溶解性または抗凝血性薬剤を含む組成物を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、赤血球キャリアに対して当該薬剤を生物適合的に
結合することにより、血液からの線維素溶解性または抗凝血性薬剤の除去速度を
減じるための、また組織における当該薬剤の沈着を減じるための方法を提供する
ことである。 本発明のもう一つの目的は、血液中において線維素溶解性のある単鎖ウロキナ
ーゼプラスミノーゲンアクチベーター（ｓｕｃＰＡ）の先駆物質を活性化する方
法であって、ｓｕｃＰＡの、赤血球キャリアに生物適合的に結合されたそのリセ
プターへの結合を含む方法を提供することである。
【００１６】 本発明のもう一つの目的は、肺血管による組織プラスミノーゲンアクチベータ
ーの摂取を亢進する方法であって、ビオチニル化された組織プラスミノーゲンア
クチベーターを、ストレプトアビジンを介し、ビオチニル化された赤血球に架橋
結合することと、前期架橋結合された組織プラスミノーゲンアクチベーターを動
物に投与することとを含む方法を提供することである。 本発明のもう一つの目的は、患者の血液中において、存在している血管内フィ
ブリンクロットの分解を、線維素溶解性薬剤により亢進する方法であって、赤血
球キャリアへ生物適合的に結合された線維素溶解性薬剤を含む組成物を患者へ投
与することを含む方法を提供することである。
【００１７】 本発明のさらにもう一つの目的は、患者の抑制されない血管内クロット形成を
予防および治療する方法であって、血管内クロットの抑制されない形成を罹患し
ている患者に、赤血球キャリアに対し生物適合的に結合された線維素溶解性また
は抗凝血性薬剤を含む組成物を投与することを含む方法を提供することである。
【００１８】 （発明の詳細な説明） 本発明は、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症、および血管内フィブリンクロットの
抑制されない形成によって特徴づけられる他の病気または症候群の予防および治
療のための組成物および方法を提供する。本発明は、薬剤、好ましくは線維素溶
解性または抗凝血性薬剤、さらに好ましくはプラスミノーゲンアクチベーターの
、キャリアとして作用するＲＢＣに対する生物適合性の結合に基づくものであり
、当該薬剤の循環の延長および組織による摂取の制限を提供する。ビオチニル化
されたＲＢＣに対するストレプトアビジンを介したプラスミノーゲンアクチベー
ターの１価性結合（本文ではＳＡ／ｂ−ＲＢＣと呼ぶ）は、生物適合性結合法に
ついての本発明の一つの例となる。ビオチニル化されたプラスミノーゲンアクチ
ベーターは、本文ではｂ−ＰＡと呼ぶ。 ｂ−ＰＡの、ビオチニル化されたＲＢＣに対するストレプトアビジンを介した
結合を調べるべく、実験を行なった。インヴィトロでの検査の結果は、ストレプ
トアビジンが、ビオチニル化されたＲＢＣに対してｂ−ＰＡの特異的かつ有効な
結合を提供することを示した（表１）。
【００１９】
【表１】
【００２０】 フィブリンプレート溶解分析法において、またフィブリンクロット（１２５Ｉ
−フィブリノーゲンから形成された）からの放射能標識されたヨウ素の放出分析
法において検査された場合には、ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ結合体は安定であ
って、高い線維素溶解活性を発揮することが示された。フィブリンクロットの形
成に先立ち、１２５Ｉ−フィブリノーゲン溶液にｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ結
合体が添加された場合には、その後の線維素溶解は７１±１２％に達した。未結
合ＰＡは、フィブリンクロットの９６±５．５％の溶解を誘導した。従って、ｂ
−ＰＡをＳＡ／ｂ−ＲＢＣに対して結合することは、ＰＡの線維素溶解活性を有
意に悪化させることはない。
【００２１】 また、ＲＢＣ−結合プラスミノーゲンアクチベーターの半減期（すなわち、分
解および血液からの除去）を、インヴィヴォにおいてラットで検定した。１２５ Ｉ−ｓｃｕＰＡ、１２５Ｉ−ウロキナーゼ、１２５Ｉ−ストレプトキナーゼ、ま
たは１２５Ｉ−ｔＰＡの血液クリアランスの動態を、ｓｃｕＰＡまたはｔＰＡの
５μg／ｋｇの線量での静脈内注射に続いて測定した。注射後１時間以内に、ｓ
ｕｃＰＡの血中レベルは注入された線量の５％未満に低下した。対照的に、ＳＡ
／ｂ−ＲＢＣが結合されたｓｃｕＰＡの血中レベルは１時間の時点で１０倍高く
、その後２４時間まで高いレベル（注射された線量の２０％）に存続した。同様
の結果がｔＰＡ、ウロキナーゼ、およびストレプトキナーゼについても見られた
。静脈内注射後の２４時間にわたり、プラスミノーゲンアクチベーターの血中レ
ベルの曲線の下の部分の面積を、ＲＢＣに対して生物適合的に結合されたそれら
に対して薬物動態分析し、ＲＢＣに結合されたＰＡの半減期が未結合ＰＡのそれ
を数倍程度の大きさで上回ることが示された。
【００２２】 さらに、ビオチニル化されたプラスミノーゲンアクチベーターの、ＳＡ／ｂ−
ＲＢＣキャリアとの結合は、５１Ｃｒで標識されたキャリアＲＢＣの血管内溶解
を引き起こさず、また脾臓を除く全ての組織において、ＲＢＣの生体内分布を変
えることはなかった。脾臓によるｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣの摂取は、約４倍
に高められた。しかしながら、脾臓による化学的に修飾されたＲＢＣの摂取のか
かる増加は、文献においては周知である。重要なことは、ｂ−ＰＡ／ＳＡ／ｂ−
ＲＢＣ結合体の注射後に、プラスミノーゲンアクチベーターの組織による摂取が
著しく減少したことである。たとえば、脳組織における１２５Ｉ−ｔＰＡのレベ
ル（血液中のそれの百分率として表わされた）は、１８．３±１．１％であるの
に対し、１２５Ｉ−ｂ−ｔＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣのパラメータは１．８±０．
５％であった。従って、ＲＢＣキャリアとの結合は、脳における摂取を１０倍減
少させた。
【００２３】 ｔＰＡの場合には、組織分布のデータは、ＲＢＣへのｔＰＡの結合により、循
環中のその生物学的利用能が引き伸ばされるだけでなく、肺の血管によるその摂
取も劇的に増加することを示した。注射の１時間後では、２０％の放射能標識ｔ
ＰＡが１２５Ｉ− ｔＰＡ ／ ＲＢＣを注射されたラットの肺において検出され
、その値は可溶性の１２５Ｉ−ｔＰＡの注射の後に見られるものより１００倍高
い。しかし、肺によるｔＰＡ／５１Ｃｒ−ＲＢＣの摂取は、未修飾ＲＢＣのそれ
よりほんのわずか高いにすぎない（３．８％対１．２％）。従って、ｔＰＡ／Ｒ
ＢＣを注射されたラットの肺は、放射能標識されたＲＢＣよりも５倍多くの放射
能標識ｔＰＡを含むが、一方血液を含めた他の全ての組織においては、放射能標
識されたＲＢＣに対する放射能標識されたｔＰＡの比は１に等しかった。このこ
とは、肺すなわち、肺の血管系へのｔＰＡの有意な転移があったことを示唆して
おり、この結果は他の器官では見られなかった（器官特異的効果）。キャリアＲ
ＢＣからのｔＰＡのこの転移は急速におこり、数時間続いた。さらに、１２５Ｉ
− ｔＰＡ ／ ＲＢＣの肺対血液比は、放射標識されたｔＰＡのそれよりも２０
倍高かったのに対し、腎臓、脳、および心臓では、これらの器官対血液比は１０
倍低く、データはＲＢＣへのｔＰＡの結合が肺以外の器官による摂取を強く制限
することを示している。
【００２４】 また、血液中の不活性プラスミノーゲンアクチベーターを活性化するための戦
略を決定するための実験も行なわれた。可溶型のウロキナーゼリセプター（ｓｕ
ＰＡｒ）はｓｃｕＰＡと結合し、不活性ｓｃｕＰＡを活性ｕＰＡに変えること、
ならびに血漿インヒビターによる阻害からそれを保護することが報告されている
（Higazi, A. 等、1995. J. Biol. Chem. 270 : 17375 - 17380 ；Higazi, A.
等、1996. Blood 87 : 3545 - 3549）。しかしながら、血液中でのｓｕＰＡｒの
半減期は短く、静脈注射後数分間の範囲にある。従って、インヴィヴォにおける
ｓｕＰＡｒの半減期を延長するべく、ビオチニル化されたｓｕＰＡｒをＳＡ／ビ
オチニル化ＲＢＣに結合した。この結合は、 ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ分子当り１．３
ｘ１０５個までのｓｕＰＡｒ分子をもつ、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣと
呼ばれる複合体を生じた。ビオチニル化されたＲＢＣに結合されたストレプトア
ビジンがない場合には、ＲＢＣキャリアへのｓｕＰＡｒの結合は低めの大きさで
あった（１．２ｘ１０４個のｓｕＰＡｒ分子／ＲＢＣ）。
【００２５】 ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体の、単鎖ウロキアーゼプラスミノー
ゲンアクチベーター（ｓｃｕＰＡ）に対する結合能を、１２５Ｉ−標識されたｓ
ｃｕＰＡをｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣか、またはインタクトなＲＢＣｓ
（ｓｃｕＰＡの非特異的な結合の対照として用いられた）と共にインキュベート
することにより、インヴィトロにおいて検定した。ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−
ＲＢＣ当りでは１．５＋０．１ｘ１０４分子の１２５Ｉ−ｓｃｕＰＡが結合した
のに対し、ＲＢＣ当りではわずかに０．０６＋０．０１ｘ１０４の１２５Ｉ−ｓ
ｃｕＰＡが結合したにすぎなかった。従って、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢ
Ｃ複合体は、有効かつ特異的にｓｃｕＰＡに結合する。
【００２６】 次に、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体に結合されたｓｃｕＰＡ（ｓ
ｃｕＰＡ／ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ）の線維素溶解活性を調べた。１２５ Ｉ−フィブリンと、リン酸緩衝化生理食塩水（対照クロット）か、ＲＢＣ
キャリアのみか、ｂ−ｓｕＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体か、ｓｃｕＰＡ／ｂ−
ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体か、またはｓｃｕＰＡのみのいずれかとを
含むフィブリンクロットを調製した。対照のクロットでは、３７℃にて１２０分
間のインキュベーションの後、放射能標識の５％未満が上清に放出された。ＲＢ
Ｃキャリアのみでも、ｂ−ｓｕＰＡ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体（ＳＡ／ｂ−ＲＢ
Ｃに直接結合されたｂ−ｓｃｕＰＡ）でも、検出可能な線維素溶解は引き起こさ
れなかった。遊離のｓｃｕＰＡは約１０％の線維素溶解を引き起こした。しかし
ながら、同様の線量のｓｃｕＰＡ／ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体は
、９５±４％の線維素溶解を引き起こした。これらの結果は、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ
と結合したｂ−ｓｕＰＡｒ結合体に対するｓｃｕＰＡの結合が、実際にｓｃｕＰ
Ａの線維素溶解活性を刺激することと、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合
体に線維素溶解薬としての活性があることとを示している。
【００２７】 インヴィヴォにおけるｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体の動態を決定
するため、ラットに１２５Ｉ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣを静脈
内注射し、当該複合体の血中レベルおよび生体内分布を調べた。キャリアＲＢＣ
に対するｓｕＰＡｒの結合は、血流中のｓｕＰＡｒの半減期を有意に増加させた
。未結合ｓｕＰＡｒの血中レベルは、３時間までは検出不能であったが、ｂ−ｓ
ｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体の２０％が注射の２４時間後まで測定可能で
あった。
【００２８】 生体内分布の研究により、ｓｕＰＡｒの結合は溶血、またはキャリアＲＢＣの
細網内皮細胞による摂取を導かないことが示された。事実、結合されたｂ−ｓｕ
ＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣの分布は、対照の５１Ｃｒ− ＲＢＣの分
布のものと同様であった。 ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／５１Ｃｒ−ｂ−ＲＢＣのラ
ットへの注射の１時間後に、血液細胞に対する１２５Ｉ−ｓｃｕＰＡの結合を測
定するため、血液サンプルを取得した。ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合
体を注射されたラットから取得された血液は、対照動物から取得された血液より
３倍多くのｓｃｕＰＡを結合した。これらのデータは、ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／
ｂ−ＲＢＣが循環において機能的に活性があり、ｓｃｕＰＡとの結合が可能であ
ることを示している。この結合の定量化により、血流中において１時間循環した
後に、各ｂ−ｓｕＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ複合体が約１０４分子のｓｃｕＰＡ
と結合することが明らかにされた。この値は、ラットに注射する前の、ｂ−ｓｕ
ＰＡｒ／ＳＡ／ｂ−ＲＢＣのｓｃｕＰＡ結合の開始レベルと同様である。従って
、血流内での循環は、この複合体の結合能を変化させなかった。
【００２９】 架橋結合されたプラスミノーゲンアクチベーターの線維素溶解活性を、ラット
においてインヴィヴォで調べた。２５０μgの未結合ｔＰＡか、またはキャリア
ＲＢＣに結合された５０μgのｔＰＡをラットに静脈内注射し、１０分、６０分
、および１８０分後に血液を採集した。１２５Ｉ−フィブリノーゲンをすべての
試料に添加し、室温にて血液を凝固させた。ｔＰＡもｔＰＡ／ＲＢＣも、調べた
濃度においてはクロット形成を抑制せず、このことは、本発明の安全性の見地か
ら重要な考察である。次いで、クロットを３７℃にてインキュベートし、クロッ
ト溶解の速度を調べた。自発的に生じる線維素分解は、生理食塩水を注射された
ラットにおいて、１０分または６０分後のどちらでも、１０％を超えなかった。
線維素溶解は、未結合ｔＰＡの注射の１０分後に増加した。しかしながら、血液
からのｔＰＡの迅速な除去の観点から期待されたように、ｔＰＡ注射の６０分後
に取得された血液中の線維素溶解速度は、対照動物のそれをごくわずかに上回る
のみであった。驚くべきことには、ｔＰＡ／ＲＢＣの注射の３時間後に取得され
た血液であっても、注射されたｔＰＡの線量が５倍低くても、有意な線維素溶解
活性（４０％のクロット溶解）が保持されていた。これらのデータは、キャリア
ＲＢＣに対するｔＰＡの結合が、酵素学的に活性のあるプラスミノーゲンアクチ
ベーターの循環をインヴィヴォにおいて有意に増加させ、血液中のプラスミノー
ゲンアクチベーターのインヴィヴォにおける半減期を、ＲＢＣへの結合によって
負荷されるはずのいかなる立体化学的制限をも克服するレベルにまで引き伸ばし
たことを示している。
【００３０】 従って本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター等の線維素溶解薬と、抗凝
血剤とを含む薬剤の、ヒトを含めた動物の血流における半減期を、血流中におけ
る当該薬剤の分解および除去を減じることにより延長するための、新規な組成物
を提供する。本発明はまた、患者の血液中のプラスミノーゲンアクチベーターに
よるフィブリンクロットの溶解を亢進するための方法であって、赤血球キャリア
に対し生物適合的に結合されたプラスミノーゲンアクチベーターを含む組成物を
患者に投与することを含む方法を提供する。従って、本発明の当該組成物は、抑
制されない血管内クロット形成を罹患している患者に、赤血球キャリアに対し生
物適合的に結合された線維素溶解性または抗凝血性薬剤を含む組成物を投与する
ことにより、患者の抑制されない血管内クロット形成を予防および治療すること
において有用である。
【００３１】 生物適合性の赤血球キャリアを含む組成物の調製は、既知の結合法に従って行
なわれ、ビオチンおよびストレプトアビジンを介する１価性の架橋結合によって
例示される。しかしながら、この開示に対し、当業者には明らかなように、他の
生物適合的結合、すなわち化学的結合、結合されたリセプターを介する非共有結
合、または溶解および亢進された食作用に例示される、ＲＢＣキャリアの生物適
合性の悪化に導かない、他の付加手段もまた使用することができる。好ましい態
様においては、本発明の組成物はさらに、深静脈血栓症を含む抑制されない血管
内フィブリンクロット形成によって特徴づけられる病気または状態にある患者に
静脈内投与するための、製薬上許容される賦形剤を含む。プラスミノーゲンアク
チベーターに加えて、このデリバリーシステムは、抗凝血剤等の他の薬剤のデリ
バリーにも有用と考えられる。本発明の組成物は、好ましくは当該薬剤の単回の
治療線量の静脈内ボーラス注射として体系的に投与される（たとえば、プラスミ
ノーゲンアクチベーターについては０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ）。 本発明をさらに説明するため、以下の制限しない例が提供される。
【００３２】
【例】
例１：結合されたプラスミノーゲンアクチベーターの調製 − ビオチニル化、タンパク質の放射能標識、ＲＢＣへのタンパク質の結合、およ
び線維素溶解活性の評価 ビオチンエステル、６−ビオチニルアミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステル（ＢｘＮＨＳ）を、１００％ジメチルホルムアミドに溶解し、最
終濃度を１０mMまたは１mMとした。組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰ
Ａ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、および可溶性ウロキナーゼプラスミ
ノーゲンアクチベーターリセプター（ｓｕＰＡｒ）を、１０倍過剰のモル比のＢ
ｘＮＨＳにおいてビオチニル化した。新鮮な１mMＢｘＮＨＳの８マイクロリット
ルを１００μlのタンパク質溶液（ホウ酸緩衝食塩水、ＢＢＳ、pH８．１中に１m
g／ml）に添加した。氷上で１時間インキュベートした後、過剰な未反応ＢｘＮ
ＨＳを一晩透析して除去した。ビオチニル化されたタンパク質を、アイオドゲン
コートチューブ（Iodogen-coated tubes) を使用し、製造業者（Pierce）の忠告
に従って１２５ヨウ化物を用いて放射能標識した。１００μgのアイオドゲンを
用いてコートしたチューブ内で、１００μgのビオチニル化されたタンパク質と
、１００μＣｉの１２５ヨウ化ナトリウムとを、氷上にて２０分間インキュベー
トし、ｎｇあたり約５００ｃｐｍの比放射能を有するストレプトアビジンを生じ
た。過剰のヨウ素を透析により除去した。放射能標識されたタンパク質の９５％
より多くがＴＣＡにより沈殿可能であった。
【００３３】 次いで、２ミリリットルの新鮮なヘパリン添加血を１，５００ｒｐｍにて５分
間遠心分離し、上清（すなわち血漿）を除去した。次いで、ＰＢＳを用いてペレ
ットを再懸濁し、標準的な遠心分離により洗浄し（１mｌのペレット当り１０mｌ
のＰＢＳ、１，５００ｒｐｍ、５分間、４回）、洗浄されたＲＢＣの１００％懸
濁液とした。次に、０．１ｍｌのＲＢＣペレットにＰＢＳ（０．９ｍｌ）を加え
た（すなわち、洗浄されたＲＢＣの１０％懸濁液を作成）。１００マイクロリッ
トルの３００mMホウ酸（ｐＨ９．０）を、１．０ｍｌの１０％ＲＢＣに加えた。
次いでこの懸濁液に、反応混合物中のＢｘＮＨＳの、１０μMに等しい最終濃度
を取得するべく、またｂ１０−ＲＢＣを取得するべく、ＤＭＦＡ中のＢｘＮＨＳ
を加えた。まず、ストック溶液である０．１Ｍ ＢｘＮＨＳ／ＤＭＦＡの１μl
を、９９μlのＤＭＦＡに加えた。次いで、この新鮮な１ｍＭ ＢｘＮＨＳ／Ｄ
ＭＦＡ溶液の１０μlを、１ｍｌの１０％ＲＢＣに添加し、十分に混合した。周
期的に穏やかに振盪しながら２０℃にて３０分間インキュベートした後、過剰な
未反応のＢｘＮＨＳを、２mｇ／ｍｌのＢＳＡを含んでいるＰＢＳ（ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳ）を用いた標準的な遠心分離により、反応混合物から除去した。 ＢＳＡ−
ＰＢＳ中のビオチニル化されたＲＢＣの１０％懸濁液が調製された。
【００３４】 ｂ−ＲＢＣにストレプトアビジンを付加するため、２０μlのＳＡストック溶
液（ＰＢＳ中に１mｇ／ｍｌ）を、１００μlのｂ−ＲＢＣ１０％懸濁液に添加し
、十分に混合した。これにより、５x１０６個のｂ−ＲＢＣ当り、１μgのＳＡの
添加（ｂ−ＲＢＣ当り約２ｘ１０６分子）が供給される。周期的に穏やかに振盪
しながら３０分間２０℃にてインキュベートした後、未結合のＳＡを、ＢＳＡ−
ＰＢＳ中での標準的な遠心分離により除去した。
【００３５】 ＳＡ／ｂ−ＲＢＣに対し、ビオチニル化されたプラスミノーゲンアクチベータ
ーまたはｓｕＰＡｒを付加するため、５μlのｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒの
ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＳＡ／ｂ−ＲＢＣの１０％懸濁液
１００μlに添加し、十分に混合した。これは、２x１０７個のＳＡ／ｂ−ＲＢＣ
当り、１μgのｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒの添加（ＳＡ／ｂ−ＲＢＣ当り約
３．５ｘ１０５分子）を供給する。次いで、ｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒを、
ＳＡ／ｂ−ＲＢＣの１０％懸濁液と共に１時間インキュベートした（周期的に
穏やかに振盪、２０℃）。未結合タンパク質を、ＢＳＡ−ＰＢＳを用いた標準的
な遠心分離により除去した。ＳＡ／ｂ−ＲＢＣに対するｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕ
ＰＡｒの結合を定量するため、放射能標識されたｂ−ＰＡまたはｂ−ｓｕＰＡｒ
をトレーサーとして使用した。
【００３６】 例２：結合されたプラスミノーゲンアクチベーターのインヴィヴォでの投与 放射能標識された標品の生体内分布をラットにおいて研究するため、放射能標
識された１μgのＰＡまたはｓｕＰＡｒを含んでいる０．５ｍｌの生理食塩水か
、またはキャリアＲＢＣに結合されたこれらのタンパク質を、麻酔下に尾部の静
脈内に注射した。インヴィヴォでの投与の後、ＲＢＣに結合されたプラスミノー
ゲンアクチベーターを追跡するため、２０〜５０μｌの１２５Ｉ−ｂ−ＰＡ／Ｓ
Ａ／ｂ−ＲＢＣの１０％懸濁液を、麻酔されたラットの尾部静脈から注射した。
注射後の指示された時間（５分〜２４時間）に、麻酔されたラットを瀉血により
犠牲にした。血液および内部の器官を収集した。器官は、生理食塩水を用いて血
液がなくなるまですすぎ、秤量した。次いで、血液および内部器官のアリコート
中の１２５Ｉの放射能を、ガンマカウンターを用いて測定した。次に、血液の遠
心分離により血液から血漿を分離し、血漿中の放射能を測定した。結果を、組織
、血液、または血漿のグラム当りのｃｐｍとして，平均値±標準誤差（Ｍ±ＳＥ
）として計算した。統計学的な比較は、均等分散の片方向分析（ＡＮＯＶＡ）と
、それに続くスチューデント・ニューマン・ケウルス（Student-Newman-Keuls)
法を用い、ｐ＜０．０５の統計学的有意性の水準において行なった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒガジ， アブド アル−ルーフ アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 19004、バラ−シンワイド、ベルモント アベニュー ＃502 50 (72)発明者 ムルシアノ， ファン カルロス アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 19139、フィラデルフィア、スプルース ストリート 4641、アパートメント ４ (72)発明者 サインズ， ダグラス アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 19096、ワインウッド、トレント ロード 101 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 BA03 CA36 DC05 NA14 ZA362 ZA542 ZC192 4H011 AA02 BB19 DH11

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 赤血球キャリアに対し生物適合的に結合された線維素溶解性
    または抗凝血性薬剤を含む組成物。
  2. 【請求項２】 ビオチニル化されたプラスミノーゲンアクチベーターか、ま
    たはプラスミノーゲンアクチベーター前駆体に対するストレプトアビジンを介し
    てビオチニル化された赤血球キャリアに１価性に架橋結合されたビオチニル化さ
    れたリセプターを含む組成物。
  3. 【請求項３】 血液中の先駆型のウロキナーゼを活性化する方法であって、
    血液中の前記不活性ウロキナーゼを、赤血球キャリアに生物適合的に結合された
    可溶型のウロキナーゼリセプターを含む組成物と接触させることを含む、前記方
    法。
  4. 【請求項４】 動物の血流中からの線維素溶解性または抗凝血性薬剤の除去
    の速度を減じるため、および前記動物の組織における当該薬剤の沈着を減じるた
    めの方法であって、請求項１に記載の組成物を前記動物に投与することを含む、
    前記方法。
  5. 【請求項５】 動物の血液中に存在しているフィブリンクロットの分解を亢
    進する方法であって、請求項１に記載の組成物を前記動物に投与することを含む
    、前記方法。
  6. 【請求項６】 動物の血管内クロットの抑制されない形成を予防および治療
    するための方法であって、血管内クロットの抑制されない形成に罹患している動
    物に、請求項１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
  7. 【請求項７】 組織プラスミノーゲンアクチベーターの肺による摂取を亢進
    する方法であって、ビオチニル化された組織プラスミノーゲンアクチベーターを
    、ビオチニル化された赤血球に、ストレプトアビジンを介して架橋結合すること
    と、前記架橋結合された組織プラスミノーゲンアクチベーターを動物に投与する
    ことを含むことを特徴とする、前記方法。
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