JPH07502989A - 血友病の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血友病（ｈａｅｍｏｐｈｉ　Ｉ　ｉａ）の治療に関するものであり、特 にＩＸ因子の投与に関係したものである。

ＩＸ因子は温血動物の凝血機構（ｂｌｏｏｄ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎ ｉｓｍ）の−要素である。ＩＸ因子は他の多くの凝血因子とともに血液の凝固過 程に関与し、これについてはフーリより、（Ｆｕｒｉｅ　Ｂ、）とフーリより。

Ｃ０（Ｆｕｒｉｅ　Ｂ、Ｃ，）によるレビュ（Ｃｅ　Ｉ　ｌ、５３．１９８８． ５０５−５１８頁）がある。血友病Ｂまたはクリスマス病（Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ 　ｄｉｓｅａｓｅ）は男性に発症する重篤な遺伝性の出血性の病気で、ＩＸ凝血 因子の欠損に起因する。この病気の抑制を効果的なものとするには、ＩＸ因子濃 縮物の繰り返しの注射が必要である。こうしたＩＸ因子は、従来血液提供者から 入手されており、より近年の技術では（ＥＰ−Ａ−１９５５９２に例示されてい るように）組換えＤＮＡ技術により調製できるようになっている。

ＩＸ因子は分子量およそ６０．０００の一本用糖タンパク質であることが知られ ている。従ってＩＸ因子はかなりの高分子であり、血流中に直接導入する必要性 を示している。さらに、例えば外科手術の際には、きわめて多大な投与量（例え ば５，０００国際ユニットのオーダーで）のＩＸ因子が大人に対して必要である 。従って血友病Ｂを抑制する際には、予防法としてまたは出血時に応じて、■Ｘ 因子調剤を静脈注射により患者に与えるのが従来の方法であった。たしかに、か つて１９２９年には、パイン（Ｐ　ａ　ｙ　ｎ　ｅ）とスティーン（Ｓ　ｔ　ｅ 　ｅ　ｎ）の記事”　Ｈａｅｍｏｓ　ｔａｔ　ｉｃ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　Ｈ ａｅｍｏｐｈｉ　１　ｉａ”（Ｔｈｅ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ、６月１９日　１９２９年１１５０−１１５２頁）において、クエン 酸塩加した（ｃｉｔｒａｔｅｄ）ヒト血漿による血友病に対する治療は静脈注射 時にのみ有効であり、腹腔内や筋肉内に与えても無効であると認識されていた。

こうした静脈注射の繰り返しの用法は、この病気の抑制に必要であるが、副作用 を持つ。注射を反復すると、静脈の注射部位が繊維を形成したり（ｆ　１ｂｒｏ ｓｅｄ）　、または閉塞したりする（ｏｃｃｌｕｔｅｄ）ようになり、これは年 配者の治療においては特に深刻な問題である。また赤ん坊のように静脈が細い場 合には、医師が必要な治療投与量を注射するために静脈に注射針を刺すことが難 しいこともある。

より近年の研究が注意を向けてきたのは、遺伝子治療による血友病Ｂの治療であ る。このためアンソン（Ａｎｓｏｎ）等（Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、、１９８ ８．３１５０−３１５４頁）、及びパル７−　（Ｐａ　Ｉｍａｒ）等（Ｂｌｏｏ ｄ。

７３　Ｎｏ、２．１９８９．４３８−４４５頁）により、マウス皮膚繊維芽細胞 にヒトＩＸ因子をコードするレトロウィルスベクターを感染させるとＩＸ因子を 分泌すること、この皮膚繊維芽細胞を移植したマウスの血清中にこのヒトＩＸ因 子が検出されることが示されてきた。しかし、こうした遺伝子治療の実験は有望 なものかもしれないが、将来を見据えた場合、生体外で十分量生産したＩＸ因子 を患者の血流中に速やかに導入することにより、血友病Ｂを抑制する方法が依然 として必要であることも明らかである。

驚（べきことに、ＩＸ因子を皮下注射により投与して、生理的に活性を持つ形で かつ血友病Ｂの抑制に十分な濃度で、血流中にきわめて迅速に送達できることが 本研究により発見された。

従って本発明は、ＩＸ因子、および皮下注射により有効量のＩＸ因子を血友病Ｂ 患者に送達するのに適した薬学的に受容可能な担体を含む、皮下注射に使用する キットを提供する。

本発明はまた、ＩＸ因子を血友病Ｂ患者へ皮下注射するための組成物の調製に使 用するためのＩＸ因子を供給する。

本発明はさらに、血友病Ｂ患者にＩＸ因子からなる組成物を皮下注射することを 含んだ、血友病Ｂ患者の治療法を供給する。

本発明に使用するＩＸ因子は、血液提供者から得た濃縮物の形であるか、または 組換えＤＮＡ技術で得られたものである。ＩＸ因子はヒト血友病Ｂ患者の治療で はヒトのＩＸ因子であることが望ましいが、原理的には本発明を応用して類似の 凝血機構を持つ他の温血動物に、ヒトまたは動物のＩＸ因子を導入することもで きる。ＩＸ因子はまず、脱イオン水または生理食塩水といった、薬学的に受容可 能な担体中の組成物として、供給または製造することができる。これに代えて、 固形物のＩＸ因子を懸濁して皮下投与に使用して、注射した部位からゆっくりと 血流中に放出させることもできる。池の比較的低分子量の付加物および補形薬（ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含むことも可能である。血清アルブミンのような高分子 量のタンパク質担体を用いることもできる。しかしＩＸ因子は、商業的に入手で きるＩＸ因子の供給源に含まれることがあるフィブリノーゲン、プロトロンビン 、Ｖｌｌ、ＶＩ　Ｉ　Ｌ　Ｘ、ＸＩ因子といった他の凝血因子を、実質的に含ま ないことが望ましい。ＩＸ因子の供給源として最初に不純物を用いる場合には、 例えばリーズ（Ｒｅｅｓ）等（ＥＭＢＯＪ、、７．　１９８８．　２０５３−２ ０６１頁）が記載したようなＩＸ因子特異的なモノクローナル抗体を詰めた免疫 親和性カラムを通すなどの、標準的な精製操作により他の凝血因子を取り除（こ とができる。

ｒｘ因子を利便上凍結乾燥した形（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ　ｆｏｒｍ）とし、 これと何らかの担体を一つのキットの中で別々に供給することにより、使用直前 にＩＸ因子と担体を結合させることも可能である。患者の体重および注射の状況 に応じて与える投与量および皮下注射に適当な投与量を計算するための手引き書 も、慣習としてこうしたキットに含まれる。

現在行われている患者へのＩＸ因子の静脈注射による投与法の場合と同様；こ、 皮下注射によりＩＸ因子を予防法としてまたは出血時に応じて患者に与えること ができる。皮下注射による送達法を用いることが、予防のように少なめの量を投 与せねばならない場合に、特に重要であることは明らかであろう。

皮下注射では患者に与える液体量を最小限にすることが、従って可能な限り担体 を少なくして使用することが望ましい。従ってＩＸ因子の原材料としてはかなり 高純度のものを用いるのが望ましく、特に組成物の全タンパク質含量に対して、 ＩＸ因子が少なくとも５０％、できれば７５％であることが望ましシ九〇本発明 はさらに実施例として、およびこれに付随して実施例の結果をグラフとして描い た図１から５に関してさらに記述される。

１但 凍結乾燥したヒトＩＸ因子（Ａｒｍｏｕｒ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ ｍｐａｎｙ、　Ｋａｎｋａｋｅｅ、Ｉｌ、、ＵＳＡから　＋Ｍｏｎｏｎｉｎｅ” として入手可能）を１ｍｌあたり１０から５００国際ユニット（ｉ、ｕ、）の範 囲の濃度で脱イオン水に溶解させた。調製物は、ＩＸ因子を卓越して含み池のタ ンパク質をほとんど含まないもので、ヒトへの使用に処方されたものであるが、 低分子量の付加物を含んでいる。

２５０μｇ　（５０ｉ、ｕ、）の凍結乾燥したヒトＩＸ因子（容積１００μｌ） を、ＭＦＩ系統のヌードマウス６匹それぞれに注射した。３匹対照マウスでは尾 の静脈に静脈注射を行い、他の３匹の実験マウスでは背中の４ケ所の部位に（各 部位に２５μｌ）皮下注射した。領１−０．２ｍｌの血液試料を一週間にわたっ て定期的に尾の静脈から採取し、各時点での血漿中のヒトＩＸ因子の濃度を（以 下に記載するように）ＥＬＩＳＡにより検定した。図１はその結果を表したもの であり、皮下注射により血流中にＩＸ因子が取り込まれ、その濃度は等量のＩＸ 因子を静脈注射した後の血漿中の濃度の約４０％に達していることを示している 。

別の実験では、５μｇ　（１ｉ、　ｕ、）の＋Ｘ因子（容積１００μｌ）を、２ 匹のマウスのそれぞれに皮下注射した。０．１−０．２ｍｌの血液試料を二日間 １こわたって定期的に尾の静脈から採取し、ヒトＩＸ因子を以下に記載するよう にＥＬＩＳＡにより検定した。結果を図２に示す。ＩＸ因子は皮下注射後１０分 後に１まもう血流中に検出され、注射後３−８時間後（マウスにより異なる）に 最高１度（こ達した後、減少することがわかる。

実施例２ 実施例１で記載したＩＸ因子の供給源とＭＦＩ系統のヌードマウス６匹（体重約 ２５ｇ）を用いて二つの実験を行った。第一の実験では１ｍｇ　（２００ｉ、ｕ 、）のＩＸ因子を１ｍｌの脱イオン水に溶解したものを一匹のマウスに皮下注射 し、５０μｇ（１０ｉ、ｕ、）のＩＸ因子を１００μｍの脱イオン水に溶解した ものを次のマウスに静脈注射した。第二の実験では５００μｇ　（１００ｉ、ｕ 、）のＩＸ因子を２００μＩの脱イオン水に溶解したものを一匹のマウスに皮下 注射し、１００μｇ　（２０ｉ、ｕ、）のＩＸ因子を１００μｌの脱イオン水に 溶解したものを次のマウスに静脈注射した。それぞれの実験で対照は、１００μ ｍの生理食塩水を静脈注射したマウス−匹で行った。６匹のマウスそれぞれから 心臓穿刺（ｈｅａｒｔ　ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により、血液試料的１ｍｌを採取し た。血液の採取は、実施例１からヒトＩＸ因子濃度が最大値であると予想される 時点、すなわち皮下注射約４時間後と静脈注射後可能な限りすぐに（１０分以内 に）行った。結果は以下の表１に示したが、血漿中のヒトＩＸ因子濃度（ヒト血 漿中に正常に見られる抗原に対する％濃度によって与えられ、ＥＬＩＳＡにより 決定された）、以下に述べるように決定した凝血活性、補正した凝血活性（対照 マウスの血漿の凝血活性、すなわちマウスＩＸ因子の凝血活性を引いて決定した 値）、比活性（表中に定義してあり、％で表した）が示されている。この結果は （静脈注射されたＩＸ因子の比活性が６３％および９３％であるのに対して）皮 下注射されたＩＸ因子が７４％および５１％の比活性で、生理的に活性を持った 形で血流中に達していることを示している。

対照　皮下　静脈　対照　皮下　静脈 注射　注射　注射　注射 抗原（％）　１８６　３００　１０６　７００凝血活性（％）　６３　２００　 ２５０　６６　１２０　７２０補正した凝血活性（％）　１３７　１８７　５４ 　６５４比活性（％）　７４　６３　５１　９３ＩＸ因子の検定 血漿中のヒト■Ｘ因子の濃度を決定するために、血液を回収して１０分の１体積 の３８％クエン酸ナトリウム水溶液とした。遠心分離により細胞を取り除き、血 漿試料は後の検定のため一２０°ＣＴ冷凍した。

精製試料中のＩＸ因子は、アンソ：／　（Ａｎ　ｓ　ｏ　ｎ）等の記載（Ｎａｔ ｕｒｅ。

ＩＳＡにより定量した。ＩＸ因子凝血活性はオーステン（Ａｕｓｔｅｎ）とライ ムス（Ｒｈｙｍｅｓ）の一段階凝血検定（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ、１９７５．　Ｂｌａｃｋｗ ｅｌｆ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　０ｘｆｏｒｄ、　５９）Ｉこより定量しｔコ。

どちらの場合にも、プールしである正常なヒト血漿を標準として用し＼た。

実施例３ 実施例１．２で用いたのと同様の凍結乾燥したヒトＩＸ因子を以下のよう（こ処 理して、低分子量の付加物を取り除いた。

段階１：　２０ｉ、ｕ、の■Ｘ因子を２ｍｌの脱イオン本に溶解させた。ヒトへ の使用として推奨されるＩＸ因子の濃度は２ｍｌ中↓こ１９６ｉ、ｕ、である力 ）ら、これにより付加物の濃度は９．８倍減少したことになる。

段階２．　溶液を１時間遠心分離して微量濃縮し、その結果得られた溶液（ま（ ＥＬＩＳＡによる）評価によれば３７％を損失して、８５μｌ中に１２．６ｉ。

Ｕを含んでいた。このＩＸ因子溶液中の付加物の１ａｌＪｔは、最初の溶液の濃 度力）ら変化しないままであるが、付加物の量としては２３．５倍減少したと（ すなわち２０００μ１−８５μｌ）計算される。

段階３　ＩＸ因子溶液（８５μｌ中に１２．６　ｉ、　ｕ、）を生理食塩水で希 釈して１ｍｌとして、１２．５ｉ、ｕ、ＩＸ因子／ｍｌを含んだ溶液とした。こ れにより付加物のモル濃度はさらに１１．８倍　（すなわち１０００μ１−８５ μｌ）減少したと計算される。従って、付加物の希釈は全体で９．８（段階１） Ｘｌ、１゜８（段階３）＝１１６倍である。以上からこの溶液の付加物の濃度（ よ、ＩＸ因子調剤を推奨通りに再製剤した場合よりも１１６倍低い。

上記のように処理した１、２６国際ユニットのＩＸ因子１００μｌを、４匹のヌ ードマウス（ＭＦＩ系統）のそれぞれに注射した。２匹のマウスでは尾の静脈に 静脈注射を行い、２匹のマウスでは背中に皮下注射した。それぞれの場合に１０ ０μｌの総量を１ケ所に注射した。０．１−０．２ｍｌの血液試料を２日間にわ たって定期的に尾の静脈から採取し、血漿中のヒトＩＸ因子の１度を上述のよう にＥＬＩＳＡにより検定した。結果は図３に示しであるが、図１、図２で得られ た結果と比較して、低分子量の付加物の存在はＩＸ因子の血流中への到達能力に 大きく寄与する因子ではないことがわかる。

実施例４ 本例では別のＩＸ因子の供給源を使用した。本例で使用したのは”　ｌＸＭＣ” （Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｅｌｓｔｒｅｅ、Ｈｅ ｒｔｓ、ＵＫより入手可能）というＩＸ因子で、本製品のヒトへの使用の推奨濃 度である８１国際ユニット／ｍｌの濃度（ＥＬＩＳＡにより決定）に脱イオン水 に溶解させた。この調剤は低分子量の付加物を他に含んでいると考えられる。

８．１国際ユニットのＩＸ因子（１００μｌ中）を、４匹のヌードマウスのそれ ぞれに注射した。２匹のマウスでは尾の静脈に静脈注射を行い、２匹のマウスで は背中に皮下注射した。それぞれの場合に総量を１ケ所に注射した。０．１−〇 　２ｍｌの血液試料を２日間にわたって定期的に尾の静脈から採取し、血漿中の ヒトＩＸ因子の濃度を上述のようにＥＬＩＳＡにより検定した。結果は図４に示 しであるが、（皮下注射されたマウスの結果を、静脈注射された２匹のマウスの 平均と比較して）マウスによって異なるが２５％および４３％の効率で、ＩＸ因 子が注射部位から血流中に取り込まれていることがわかる。

実施例５ より純度の低いＩＸ因子の原材料（Ｂｉｏ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　から入手可能な”Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸＡ”）　を入手した。本製品につ いて得られる情報は以下のとおりである。

Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸＡ　（ＢＰＬ）　５８５ｉ、ｕ、／瓶２０ｍ１のＨ２Ｏに溶 解させて再製剤した溶液は、リットルあたり以下に挙げるものしか含まない。２ ０ｇタンパク質、３００ｍｍｏ＋ナトリウム、２００ｍｍｏｌ塩化物、５０ｍｍ ｏ１リン酸、６０ｍｍｏ＋クエン酸、５００ｉ、ｕアンチトロンビンＩ　Ｉ　Ｉ 、５０００ｕヘパリン、並びにごく微量のＩＩ因子８ＱＱｕ、Ｘ因子４００ｕお よび治療目的では無視できるＶＩＩ因子を含む。ヒトへの使用の推奨濃度（静脈 注射時）は２０ｍ１あたり５８５ｉ、ｕ、であった。

ＩＸ因子を脱イオン水に溶解し、１０ｍ１あたり５８５ｉ、ｕ、の濃度とした。

ＥＬＩ　ＳＡ検定の結果、この製品は実際には８９．４国際ユニット／ｍ＋（４ ４７μｇ／ｍｌ）の濃度であることがわかった。

Ｑ、３ｍＩ中の２６．８ｉ、ｕ、のＩＸ因子を１匹のマウスに静脈注射した（詳 細には尾の静脈の３ケ所にそれぞれ領１ｍｌずつ注射した）。１ｍｌの体積の８ ９．４ｉ、ｕ、のＩＸ因子を２匹のマウスのそれぞれに皮下注射した　（詳細に はマウスの背の両側　２ケ所にそれぞれ０．５ｍｌずつ注射した）。ＩＸ因子の 皮下注射を受けた２匹のマウスから血液試料約１ｍｌを４時間後に（ヒトＩＸ因 子の１度が最大値になると以前に評価された時点）心臓穿刺により採取した。同 様に、静脈注射を受けたマウスから血液試料を４時間後に採取した。

結果は以下の表２に示した。

皮下注射の場合には、約４時間後に■Ｘ因子を注射した各部位の皮膚下に大きな 凝血が形成され、重篤な打ち弁状（ｂｒｕｉｓｉｎｇ）となっていた。

表２ マウス　注射の種類　注射したＴｘ因子の量　注射後の時間　血液中に検出され た（ｉ、ｕ、）　ＩＸ因子の量 １　静脈注射　２６．８　４時間　２．１８μｇ／ｍ１２　皮下注射　８９４　 ４時間　１．６５μｇ／ｍ１３　皮下注射　８９．４　４時間　０．８０μｇ／ ｍｌさらに別の実験では、上述の”　Ｆａｃｔｏｒ　ＩＸＡ”　（ＢＰＬ）：Ｉ ！ｌ剤の一部を、実質的にはリーズ（Ｒｅｅｓ）等（ＥＭＢＯＪ、、ヱ、１９８ ８．２０５３−２０６１頁）が記載したようにＡ７モノクローナル抗体カラムを 通して精製した後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　ＩＱ微量濃縮機を用いて濃縮した。最 終的な溶液は２．１国際ユニット／ｍｌのＩＸ因子を含み、付加物として１４． ７ｍｇ／ｍＩのウノ血清アルブミン、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　トリス −塩化物緩衝ＯｐＨ７，５、微量のチオシアン酸ナトリウムを含んでいた。

この調剤の０．２３国際ユニットを体積１１０μｍとしたものを２匹のマウスの それぞれに注射した。１匹は尾の静脈に静脈注射し、１匹は背中に皮下注射した 。いずれの場合にも総量（１１０μｍ）を１ケ所に注射した。、０．１−０．２ ｍｌの血液試料を２日間にわたって定期的に尾の静脈から採取した。血漿中のヒ トＩＸ因子の濃度を上述のようにＥＬＩＳＡにより検定した。結果を図５に示す 。

時　間（時間）・ 時　間（時間） 時　間（時間） １ｍ　！　ｔｌｌ　本　ｍ　＆ フロントページの続き （７２）発明者　ガーラード、アン・ジャスティーンイギリス国オックスフォー ドシャー　アールジー９・４エイエツクス、ヘンリー−オンーテームズ、ハープ スデン・コート（番地なし）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＩＸ因子、および皮下注射により有効量のＩＸ因子を血友病Ｂ患者に送達す るのに適した薬学的に受容可能な担体を含む、皮下注射に使用するキット。
2. ２．ヒトＩＸ因子を含む、請求項１に記載のキット。
3. ３．他の凝血因子を実質的に含まない、請求項１または２に記載のキット。
4. ４．ＩＸ因子が全タンパク質含量に対して少なくとも５０％の純度で存在する、 請求項１ないし３のいずれか１項に記載のキット。
5. ５．キットを皮下注射に使用するための手引き書を含んだ、請求項１ないし４の いずれか１項に記載のキット。
6. ６．予防に有効な量のＩＸ因子を与えるのに適した、請求項１ないし５のいずれ か１項に記載のキット。
7. ７．血友病Ｂ患者にＩＸ因子を皮下注射するための組成物の調製に使用するＩＸ 因子。
8. ８．ヒト血友病Ｂ患者の治療に使用するための、ヒトＩＸ因子である、請求項７ に記載のＩＸ因子。
9. ９．他の凝血因子を実質的に含まない、請求項７または８に記載のＩＸ因子。
10. １０．ＩＸ因子が全タンパク質含量に対して少なくとも５０％の純度で存在する 、請求項７、８または９に記載のＩＸ因子。
11. １１．血友病Ｂ患者に予防としてＩＸ因子を皮下注射するための組成物の調製に 使用する、請求項７ないし１０のいずれか１項に記載のＩＸ因子。
12. １２．血友病Ｂ患者にＩＸ因子を含む組成物を皮下注射することを含んだ、血友 病Ｂ患者の治療法。
13. １３．皮下注射として請求項１ないし６のいずれか１項に記載のキットを使用す る、請求項１２に記載の方法。
14. １４．血友病Ｂ患者の予防治療のための、請求項１２または１３に記載の方法。